UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

Studii asupra drojdiei Saccharomyces cerevisiae utilizata in vinificatie.

Cuprins
1. Clasificarea si obiectivele stiintelor microbiene applicative 2. Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme cu importanta in industria alimentara 2.1. Raspandire 2.2. Caractere morfofiziologice 2.3. Forma si aspectul coloniei 2.4. Caractere fiziologice generale 2.5. Stari ale celulelor de drojdie 3. Progrese ale ingineriei metabolice la Saccharomyces cerevisiae 4. Polimorfismul genomului drojdiilor de vin 5. Influenta factorilor de mediu asupra metabolismului drojdiilor de vin 6. Multiplicarea si dezvoltarea drojdiilor 7. Principalele genuri si specii utilizate la obtinerea drojdiilor selectionate 8. Tulpini de drojdii folosite in industria vinului 9. Culturi de drojdii destinate vinificatiei 10. Obiectivele ingineriei genetice la Saccharomyces cerevisiae pentru productia de vin 10.1. Utilizarea ingineriei genetice 10.2. Proprietati biologice 10.3. Impactul strategiilor de inginerie genetica 11. Bibliografie

CLASIFICAREA I OBIECTIVELE STIINELOR MICROBIOLOGICE APLICATIVE

MICROBIOLOGIA o stiin biologic fundamental care studiaz morfologia, fiziologia i sistematica microorganismelor, originea i evolutia lor, fenomene de ereditate i variabilitate microbian i reprezint un sistem organizat de cunostine privind legile dup care se desfoar viaa microorganismelor. MICROORGANISMELE sisteme complexe, mono- sau pluricelulare, cu celule de tip procariot sau eucariot, nzestrate cu un metabolism propriu i continuitate genetic, foarte diversificate ca form, dimensiuni i activitate metabolic. Dezvoltarea microbiologiei generale a condus la apariia unor discipline microbiologice cu caracter aplicativ: virusologia studiul virusurilor; bacteriologia studiul bacteriilor; micologia studiul micromicetelor. Numeroase discipline microbiologice s-au dezvoltat pe mai multe domenii de cercetare: microbiologia chimic, microbiologia acvatic, microbiologia solului, microbiologia cosmic; dintre acestea s-au desprins cele cu caracter aplicativ: microbiologia produselor alimentare, microbiologia industriala, biotehnologia. MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE tiina cu caracter aplicativ care studiaz structura, proprietile, morfofiziologia organismelor cu implicaii n industria alimentar pentru cunoaterea urmtoarelor grupe de microorganisme : microorganisme utile folosite sub form de culturi starter pentru procese fermentative care stau la baza dezvoltrii subramurilor industriilor alimentare: drojdiile fermentative folosite la fabricarea berii, a vinului, a alcoolului etilic, n panificatie; bacteriile lactice i propionice folosite n industria laptelui i la conservarea produselor alimentare; microorganisme duntoare care produc alterri ale alimentelor sau care prin consum de alimente contaminate produc mbolnaviri ale consumatorului. Microbiologia produselor alimentare st la baza controlului microbiologic i igienico-sanitar n diferite procese tehnologice pentru a asigura obinerea unor produse de calitate, prin respectarea normelor i standardelor microbiologice. MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL tiina de investigare i control a fermentaiilor, respectiv a acelor procese industriale catalizate de ctre microorganisme selecionate sau de enzime produse de acestea, procese industriale din care rezult un produs cu valoare economic, un produs eficient.

n prezent, cu ajutorul microorganismelor, se obin peste 200 de produse la scara industrial, avantajos, numai pe cale microbian: alcooli: etilic, metilic, butilic, izopropilic; acizi: citric, lactic, gluconic, acetic, kojic, ustilagic; proteine; aminoacizi; enzime; vitamine; antibiotice; insecticide biologice. n cantiti mici se obtin hormoni, interferon, insulin. BIOTEHNOLOGIA un sistem integrativ i multidisciplinar care integreaz biochimia, biologia molecular, microbiologia (cea industrial n special), informatic, microelectronic, prin care microorganisme ca atare, esuturi de celule vegetale sau animale, enzime sau microorganisme obinute prin inginerie genetic, sunt dirijate la tehnologii care includ un coeficient mare de inteligen i care permit dezvoltarea industriilor alimentare, farmaceutice, medicale i de protecie a mediului nconjurtor. Domeniul agroalimentar este unul dintre marii beneficiari ai dezvoltrii biotehnologiei, fiind capabil ca ntr-un viitor apropiat s asigure majoritatea materiilor prime necesare hranei omenirii. Procesele tehnologice de obinere a produselor alimentare, cu unele excepii (industria zahrului, industria uleiurilor, industria morritului), sunt biotehnologii care se bazeaz pe folosirea microorganismelor sau metaboliilor acestora. Implementarea biotehnologiilor avansate n industria alimentar urmrete realizarea urmtoarelor obiective: obinerea unor alimente sigure i de calitate, a alimentelor probiotice i nutraceutice; realizarea unor bioproduse alimentare cu rol terapeutic pentru diferite segmente int de consumatori (copii, btrni, persoane hipertensive, diabetici) dar i a unor alimente cu rol n prevenirea unor maladii sau utilizabile ca adjuvani n tratamentul unor boli; obinerea de ingrediente i aditivi alimentari prin procedee biotehnologice; crearea unor biotehnologii mai puin energofage dect tehnologiile clasice; ecologizarea proceselor tehnologice din industria alimentar prin folosirea unor biotehnologii avansate.

CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME CU IMPORTAN N INDUSTRIA ALIMENTAR

Drojdiile - organite monocelulare de tip eucariot care se nmultesc prin mitoz (nmugurire), sau prin meioz (sporulare) i au drept caracteristic principal calitatea de a produce fermentarea zaharurilor simple cu formare, n condiii anaerobe, de alcool etilic i dioxid de carbon. - au rol foarte important i sunt folosite n industria alimentar la fabricarea vinului, a berii, a spirtului de fermentaie, a pinii i produselor derivate, a drojdiei comprimate. - au o compozitie chimic valoroas i sunt folosite n microbiologia industrial la obinerea de proteine ce pot fi folosite n alimentaia omului (de tip SCP single cell protein), la obinerea de drojdii furajere pentru alimentaia animalelor, drojdii care conin 5,5% protein, vitamine din grupul B, aminoacizi. - pot conduce la extracte lizate, plasmolizate, folosite ca aditivi alimentari sau care mbogesc mediile de cultur destinate cultivarii microorganismelor selecionate.

Prin mari poluri genetice sau hibridizri, cu ajutorul drojdiilor se pot obine substane valoroase cum ar fi: interferon, cu efect citostatic i antiviral; vitamine din grupul B, cu efect terapeutic complex.

Raspandire
Drojdiile sunt rspndite n 4 mari habitaturi naturale reprezentate de: sol, aer, suprafaa plantelor, ap. n sol sunt rspndite n stratul superficial unde ajung n mod natural de pe fructe, rdcini de leguminoase i se gsesc n special n solul grdinilor, al vielor de vie. n aer se rspndesc datorit curenilor de aer.Pe suprafaa plantelor i fructelor drojdiile alctuiesc microflora epifit. n acest habitat rspndirea e favorizat de insecte. Drojdiile rezist n tractul digestiv al insectelor i iarna, iar primvara, cu primul drum al acestora, sunt depuse pe suprafaa vegetal. n organismul animal drojdiile sunt componente ale microflorei intestinale i aparin genului Candida care poate cuprinde i specii patogene: Candida albicans care produce candidoze. n ap sunt raspndite chiar pna la 4000 m adncime.

Caractere morfofiziologice
Forma celulei de drojdie: oval, rotund, elipsoidal (drojdiile de fermentaie din genul Saccharomyces), sferic (drojdiile din genul Torulopsis), de lmie (drojdiile din genurile Hanseniaspora, Kloeckera), sau cilindric. Cultivarea n mediu lichid, de must de mal, a drojdiilor fermentative face posibil observarea n timp a unei tulbureli, urmat de formarea de spum i, n finalul fermentaiei, are loc depunerea celulelor de drojdie i limpezirea mediului. Drojdiile oxidative i micodermice, cultivate n acelai tip de mediu, se dezvolt la suprafaa mediului formnd un voal cutat, gros, alb glbui, destul de persistent (drojdii ce dau floarea vinului). Colonia biomasa de celule ce rezult n urma cultivarii pe mediu solid i a nmulirii unei singure celule.

Forma i aspectul coloniei

- depinde de specie i gen; - profilul poate fi lenticular, triunghiular sau bombat cu gurgui central; - perimetrul coloniei poate fi circular, neregulat i uneori triunghiular; - aspectul coloniilor variaz de la alb strlucitor la mat, cenuiu i exist i colonii de drojdii colorate n roz, roz-portocaliu (Rhodotorula) datorit pigmenilor carotenoidici.

Caractere fiziologice generale

Drojdiile sunt facultativ anaerobe. n condiii de aerobioz zaharurile sunt asimilate pn la dioxid de carbon i ap, obinnd-se astfel o cantitate mare de energie necesar creterii i nmultirii rapide. Domeniul de temperatura: 0-35C; Temperatura optima de nmultire: 28-32C; Temperatura de fermentare: 30C pentru drojdii de fermentaie superioar (pine); 6 -12C pentru drojdii de fermentaia inferioar (bere); PH-ul optim: 4,5 6,5.

Stari ale celulelor de drojdie

Metabioz: stare activ n care drojdiile cresc i se nmultesc prin nmugurire; Anabioz: stare n care celula i menine caracterele vitale dar nu se mai poate nmulti; Autoliz: are loc solubilizarea compuilor intracelulari sub aciunea enzimelor proprii, stare ce conduce la moartea fiziologic a celulei. Plasmoliz: stare dependent de presiunea osmotic a mediului hipertonic; celula pierde apa, membrana citoplasmatica se zbrcete, celula trece n stare de anabioz care dac se menine conduce la moartea celulei (proprietatea este folosit la conservarea alimentelor n sirop de zahr sau saramur). Turgescen: starea celulei imersate n mediu hipotonic (ap distilat) care, pentru a realiza izotonia, i mrete volumul i se produc fisuri la nivelul peretelui celular.

Progrese ale ingineriei Saccharomyces cerevisiae

metabolice

la

Saccharomyces cerevisiae este fr ndoial cel mai investigat microorganism eucariot care a permis nu numai nelegerea biologiei celulei eucariote, ci i pe cea a celulei umane. Saccharomyces cerevisiae reprezint un microorganism preferat n cercetare deoarece este nepatogen, uor de cultivat n laborator, implicat n obinerea unor numeroase produse alimentare pe cale fermentativ (vin, bere, pine, etanol), definit drept GRAS (Generally Recognized as Safe) adic ca un organism sigur, netoxic, de ctre U.S. Food and Drug Administration (Byrne i colab., 2005; Hahn-Hagerdal i colab., 2001). Un alt motiv important al aplicabilitii sale n afar de cel biotehnologic, l constitue susceptibilitatea la modificri genetice prin tehnologia ADN-ului recombinant, proprietate care a fost facilitat i de cunoaterea ntregului su genom (Goffeau i colab., 1996). Baze de date precum Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org) i Comprehensive Yeast Genome Database (http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast) conin o cantitate enorm de informaii referitoare la cadrele deschise citirii (Open Reading Frames) ale drojdiei Saccharomyces cerevisiae sau despre produii de expresie ai genelor. Ca o completare, bazele de date ofer accesul la rezultatele studiilor de DNA microarray (http://transcriptome.ens.fr/ymg/index.php) i la informaiile legate de relaiile dintre reelele proteice. Totodat Saccharomyces cerevisiae are un rol major n cercetarea aplicat datorit remarcabilei sale capaciti de a produce etanol i dioxid de carbon din glucoz. Aceast drojdie este relativ tolerant la valori sczute ale pH-ului i la concentraii nalte de glucide i etanol, aspect pozitiv pentru industria fermentativ prin riscul sczut de contaminare. Mai mult dect att, aceast drojdie este extrem de rezistent la inhibitorii prezeni n biomasa vegetal hidrolizat i este capabil de a crete n condiii anaerobe realiznd astfel fermentaia. Aceste elemente constitue principalele motive pentru care Saccharomyces cerevisiae a fost explorat i la nivel industrial, accentul fiind pus pe obinerea prin fermentaie a unor importani compui biochimici precum: glicerolul, propandiolul, acizii organici, alcoolii steroizi sau izoprenoizi. Aceste substane sunt utilizate fie direct n industria farmaceutic sau chimic, fie reprezint precursori pentru viitoarele sinteze chimice sau enzimatice. Ingineria genetic a tulpinilor de drojdii utilizate n diferite industrii a ridicat numeroase provocri pentru cercettori deoarece calitatea senzorial a pinii sau a buturilor alcoolice este determinat de numeroi compui, care trebuie s fie prezenin cantiti foarte bine echilibrate.

Saccharomyces cerevisiae este capabil s fermenteze glucoza, manoza, fructoza, maltoza i zaharoza, dar nu poate fermenta celobioza, xiloza, sau arabinoza, principalele glucide din resursele lignocelulozice derivate din plante. Extinderea gamei de substraturi asupra crora poate aciona Saccharomyces cerevisiae reprezint o opiune important n utilizarea materialelor neprelucrate, precum produii nefolositori din agricultur sau pentru sinteza unor compui biotehnologici la scal industrial. Un organism optim pentru producerea de etanol din biomas lignocelulozic ar trebui s fie capabil s hidrolizeze poliglucide i s utilizeze toi compuii fermentabili pe care s-i transforme n etanol. Nici un microorganism cunoscut pn n prezent nu prezint toate aceste caracteristici. De exemplu, Saccharomyces cerevisiae nu poate utiliza celuloza sau hemiceluloza. Mai mult dect att, nu poate utiliza multe din componentele rezultate n timpul hidrolizei biomasei lignocelulozice precum xiloz, arabinoz, acid glucuronic sau alte oligozaharide.

POLIMORFISMUL GENOMULUI DROJDIILOR DE VIN

Pe lnga cei 16 cromozomi, genomul S. cerevisiae conine ADN mitocondrial, retrotranspozoni Ty (35- 55 copii per genom haploid), 50- 100 copii ale plasmidului de 2 m, si elemente genetice citoplasmatice. Aproximativ 70% din secvena ADN este organizat n ORF-uri (un ORF la fiecare 2Kb), genomul lui S. cerevisiae coninnd aprox. 6000 de gene, dintre care 275 pentru ARNt, 140 pentru ARNr, 20 pentru ARNsn i restul pentru proteine. Doar 4% dintre ORF-uri conin introni. Tulpinile implicate n vinificaie manifest un nalt polimorfism, aproape c nu exist dou izolate care s prezinte cariotipuri i modele de restricie a ADN mitocondrial identice, existnd doar un anume grad de similaritate ntre tulpinile aparinnd aceleiai specii. Acest fapt s-ar datora influenei factorilor din mediul de fermentaie, fapt susinut prin aceea c tulpinile de laborator sunt haploide sau diploide i manifest o constant a cariotipului, prin opoziie cu tulpinile de vin, care sunt diploide, aneuploide, diploide, homotalice i nalt heterozigote, cu un polimorfism cromozomial pronunat. S-au constatat variaii semnificative ale microbiotei, funcie de microregiune i de condiiile de mediu, la rndul lor variabile, de la an la an. Totodat, s-a observat substituia treptat a tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae, care se realizeaz pe msur ce crete concentraia alcoolului n mediul de fermentaie. Nu s-a putut stabili o corelaie ntre similaritile de nivel genetic i distribuia geografic a drojdiilor de vin- a rmas neclar dac prezena unui grup de tulpini asemntoare ntr-o anumit regiune este rezultatul rspndirii lor pe cale fie natural, fie antropic.

Necesitatea identificarii izolatelor naturale- cazul drojdiilor de vin

Exista, in domeniul vinificatiei, biotehnologie traditionala, bine intemeiata, doua tendinte aparent contradictorii. Producerea anumitor soiuri constituie monopolul anumitor viticultori. Prin urmare, pentru producatorii de vinuri superioare, nobile, rare, identitatea tulpinii este, in ultima instanta, un secret profesional. Pe de alta parte, exista o sumedenie de vinuri de consum, de calitate satisfacatoare, care se produc in cantitati mari si pentru care aspectul identificarii drojdiilor implicate este foarte important. Faptul ca productia de vin este, totusi, majoritar reprezentata de soiuri de consum, de masa a oferit campul necesar de actiune pentru cercetare. S-a constatat ca identificarea precisa a microorganismelor

implicate in vinificatie nu aduce prejudicii, din contra, poate contribui la imbunatatirea calitatii produselor. Practic, se trece de la metoda traditionala, de fermentatie necontrolata, la metode moderne, care presupun supunerea fermentatiei unui anumit control, prin introducerea unor tulpini de drojdii bine caracterizate, care sporesc, prin activitatea lor, calitatile vinului obtinut.

Influen a factorilor de mediu metabolismului drojdiilor de vin

asupra

Echipamentul enzimatic al drojdiilor de vin. n must sunt active numeroase enzime produse de drojdiile vii sau eliberate dup autoliz. Acestea se caracterizeaz prin mrirea capacitii de biosintez, de reglare a metabolismului i a realizrii unei permeabilitii a melaninei citoplasmatice. Drojdiile mpreun cu enzimele din struguri vor cataliza reaciile de oxidoreducere care condiioneaz transformarea mustului n vin. Absorb ia i fermenta ia zaharurilor. Drojdiile fermenteaz D-glucoza, Dfructoza, maltoza, zaharoza, galactoza i 1/3 din rafinoz. Nu sunt fermentate lactoza, melibioza, dextrinele. Absoria zaharurilor se face la nivelul membranei citoplasmatice, prin difuzie sau prin transport activ, sub forma esterilor fosforici, cu consum energetic din partea celulei, necesar pentru activizarea transportorului. Viteza de fermentare este mare n intervalul de transformare a concentraiei de zahr, de la 85% la 15% n alcool, dup care aceasta scade. Substan ele de metabolism ale drojdiilor cu efect inhibitor asupra fermenta iei zaharurilor reziduale. Hexozele fac parte din zaharurile reductoare i se gsesc n vinul tnr. Ele sunt fermentate lent de ctre drojdii din cauza substanelor inhibitoare (alcoolul etilic i acizii grai) din mediu. Cauzele stagnrii procesului de fermentaie sunt urmtoarele: condiiile de desfurare a fermentaiei, cu formarea condiiilor de anaerobioz i temperaturi ridicate de fermentaie, care inhib biosinteza sterolilor care particip la reglarea strii fiziologice a membranei; concentraia excesiv de zahr; carena mediului n vitamine; carena mediului n surse de azot; prezena substanelor cu efect antilevuric (reziduuri de pesticide) Substane produse de: Aspergillus, Penicillium, Mucor i bacterii: Acetobacter, Gluconobacter; concentraia n alcool etilic; acumularea n mediul de fermentaie a acizilor grai cu 8 i 10 atomi de carbon n molecul. Concentra ia n celule i starea fiziologic a drojdiilor. Viteza de fermentaie crete prin creterea numrului de celule de drojdie. Pentru fermentarea complete a zahrului din must este necesar un numr mare de celule de drojdii, aproximativ 107/cm3 must, cu condiia ca acestea s fie viabile. Fermentaia nedirijat a mustului de struguri se produce datorit a trei factori i anume: creterea numrului de celule; capacitatea de supravieuire a populaiei de drojdii; activitatea metabolic a biomasei de celule. n cazul fermentaiei dirijate se recomand adugarea de culturi pure de drojdii, astfel nct s

Depeasc numeric microflora spontan, adic 100 milioane celule de drojdii la 1litru must fermentat. Formarea spumei n timpul fermentrii mustului. Formarea spumei este datorat prezenei unor tulpini de drojdii n mediu, care ader la suprafaa bulelor de dioxid de carbon degajate prin fermentaie alcoolic. Spuma stabil se formeaz datorit altor tupini de drojdii controlate genetic i se datoreaz prezenei unor proteine specifice, localizate la suprafaa celulelor de drojdii. Se recomand selecionarea de drojdii care nu formeaz spum pentru a mrii capacitatea de ocupare a vaselor. Efectul pere ilor celulari ai drojdiilor. O dat obinute preparatele de drojdii, rezult o fraciune de pereii celulari, care adugat n must previne oprirea fermentaiei, acionnd ca un factor de supravieuire a drojdiilor. Adugarea de 0,5 g/l dintr-un preparat de drojdie care conine fragmente de perei celulari, este util n dou cazuri: cnd coninutul n zaharuri iniial este ridicat; cnd mustul conine substane chimice reziduale. n aceste cazuri are loc o absorbie selectiv a unor substane toxice pentru drojdii, n special a esterilor etilici ai acizilor grai cu 8 i 10 atomi de carbon n molecul i a pesticidelor. Factorii de cre tere i supravieuire a drojdiilor de vin. n dezvoltarea drojdiilor se disting trei etape i anume: faza de multiplicare; faza de staionare; faza de declin. n funcie de concentraia n zaharuri, fermentaia mustului poate dura de la 8 pn la 40 zile, din care faza de multiplicare dureaz, 2-5 zile. n aceast perioad cnd s-a pornit de la un inocul natural de 105-106 celule/cm3, se ajunge la 106-108 celule/cm3.

Cauzele terminrii fazei de multiplicare sunt urmtoarele: epuizarea mediului n substane indispensabile dezvoltrii drojdiilor; acumularea de alcooli i alte substane inhibitoare dezvoltrii drojdiilor; modificarea structural a celulei de drojdie. Adugarea unor factori de cretere (tiamin 100mg/l sau de sruri de amoniu) se favorizeaz multiplicarea celulelor de drojdii, care duc la dublarea biosintezei componentelor i mrind viteza de fermentaie din cadrul primei etape. Dintre substanele cu rol de factori de supravieuire fac parte: sterolii (ergosterolul, colesterolul i lanasterolul); acidul oleooleic prezent n ceara cuticular a bobului de strugure; hormonul peptidic, ocitocina. Biosinteza sterolilor n celul este stimulat prin aerarea moderat a mustului.

Multiplicarea i dezvoltarea drojdiilor

Drojdiile se nmulesc prin nmugurire. n timpul nmuguririi se formeaz, prin diviziune, din celula mam, o mic bul, sub form de protuberan, n citoplasma crei a trece nucleul fiic. Dup separarea celulei fiice de celula mam, de la nmugurire rmne o urm, iar alte celule fiice rmn ataate de celula mam i formeaz lanuri. Cnd microorganismele sunt transferate ntr-o soluie nutritiv proaspt, ele ncep s se dezvolte. Creterea este coordonat de unele legi fixe. Creterea drojdiilor este divizat n ase faze:

 faza latent sau de inducie sau de lag, n care are loc activarea metabolismului. Lungimea fazei de inducie variaz foarte mult, depinznd de tipul organismelor, de vrsta culturii i de condiiile de cultivare. Faza latent se sfrete cu prima diviziune; faza de accelerare are loc nmulirea continu a celulelor cu dublarea numrului de celule; faza exponenial sau creterea logaritmic, are loc continuarea ratei de cretere, care este constant i maxim i are loc ntr-o perioad limitat de timp. Pentru drojdii, n condiii optime de multiplicare, timpul este de aproximativ 90.120 minute; faza de decelerare, n timpul creia rata descreterii graduale are loc din cauza reduceri cantitii de substane nutritive i a creterii cantitii de metabolii inhibitori; faza staionar, n aceast faz numrul microorganismelor rmne constant, exist o balan ntre celule noi, care se formeaz i a celor care mor; faza de declin, n aceast ultim faz, rata de celule moarte exced ratei de celule noi formate, din aceast cauz numrul celulelor descrete. Durata i mrimea fiecrei faze este influenat de substrat, temperatura mediului i de starea fiziologic a drojdiilor. Substratul trebuie s conin toi nutrienii necesari creterii. Coninutul de ap, pH ul i concentraia de oxigen sunt, de asemenea, decisive pentru cretere. Trebuie s se in seama de: calitatea de drojdie din mediu; pH-ul mediului; temperatura mediului; rolul oxigenului; influena presiunii; influena aciditii; influena alcoolului; aciune dioxidului de sulf; influena azotului. Apa este compusul cel mai important din materiile vii i joac un rol important n procesul vital al microorganismelor. Microorganismele se dezvolt ntr-un substrat care conine cel puin 15% ap. Ele difer considerabil unele de altele din punctul de vedere al optimului de pH. Drojdiile prefer un mediul acid, iar creterea lor este asigurat prin aerare. Temperatura are un efect foarte important asupra dezvoltrii microorganismelor. Fiecare microorganism are o temperatur optim de dezvoltare caracteristic, la care faza de lag este mai scurt. Creterea nu este restricionat de temperatura optim dar poate avea loc ntr-un domeniu mai larg. Pentru drojdiile din genul Saccharomyces aceast temperatur este ntre 25 i 30C. Starea fiziologic a celulei - vrsta i starea nutriional - joac un rol determinant asupra duratei fazei de lag. n cazul drojdiilor, o activare rapid a metabolismului se petrece dac acestea sunt transferate ntr-un substrat proaspt, n timpul fazei de cretere exponenial. De aceea, la fabricarea drojdiei de panificaie, o pornire rapid a fermentrii se obine cu drojdii preluate din stadiul de fermentare avansat i adugate melas proaspt i aerat.

Principalele genuri i specii utilizabile la ob inerea drojdiilor selec ionate

De la nceputul utilizrii lor i pn n prezent drojdiile selecionate au fost i sunt folosite n scopul obinerii unor vinuri calitativ mai bune dect cele fermentate spontan.Un vin corect i sntos se realizeaz cu drojdii din genul Saccharomyces, cele mai frecvent folosite sunt speciile: Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces oviformis i Saccharomyces bayanus.

De curnd au nceput s se foloseasc i drojdii selecionate din genul Schizosaccharomyces i anume din specia Schizosaccharomyces pombe. Drojdii din specia Saccharomyces ellipsoideus De la nceput, de cnd se folosesc n vinificaie, s-au preferat levurile selecionate din specia Saccharomyces ellipsoideus. Operaiunea pentru drojdiile eliptice a fost i este justificat de faptul c acestea, comparativ cu drojdiile slbatice, au o putere alcooligen suficient de mare, suport concentraii de dioxid de sulf relativ ridicate, dau un randament ridicat n alcool, pun rapid stpnire pe mediu i conduc ntotdeauna la realizarea unui vin corect i sntos. Prin drojdii slbatice se neleg celelalte drojdii, prezente n mod natural pe strugure, care dau rezultate mai puin satisfctoare la fermentarea mustului. Majoritate drojdiilor slbatice aparin speciei Kloeckera apiculata, care n comparaie cu Saccharomyces ellipsoideus formeaz mai mult aciditate volatil i d i un randament mai sczut n alcool. Cu toate avantajele artate, exist i situaii cnd fermentarea cu drojdii din specia Saccharomyces ellipsoideus nu este apreciat pozitiv. Un exemplu n aceast direcie l constituie vinurile destinate distilrii n vederea preparrii coniacului. Rezultatele sunt cu mult mai bune cnd fermentarea unor astfel de vinuri se face spontan. Prezena drojdiilor apiculate n mediul de fermentare joac un rol deosebit n dezvoltarea mirosului fructuos al buchetului de coniac. n prezent este unanim recunoscut c folosirea drojdiilor selecionate din specia Saccharomyces ellipsoideus trebuie s fie considerat ca o msur oenologic indispensabil la vinificarea recoltelor avariate, a celor provenite din podgorii recent nfiinate, n care predomin drojdii slbatice, la cele rezultate din plantaii care au primit numeroase tratamente cu fungicide i insecticide, precum i n procesul producerii vinurilor spumante. Folosirea drojdiilor de Saccharomyces ellipsoideus prezint o serie de avantaje: fermentaia se poate regla mai uor, dup dorin, deoarece ea nu este provocat de drojdii necunoscute ajunse n must n mod ntmpltor, ci numai de o anumit clon cu nsuiiri cunoscute; garania obinerii unui vin corect i sntos este mai mare, parte din cauzele care duc la apariia unor defecte sunt ndeprtate sau atenuante cu ocazia deburbrii prin sulfitare, fermentaia alcoolic nu este nsoit de alte fermentaii, introduse n must drojdiile eliptice se nmulesc rapid i pun stpnire pe mediu, nlturnd posibilitatea apariiei altor fermentaii datorate bacteriilor i n mare parte drojdiilor slbatice ce eventual au mai rmas dup deburbare; faza prefermentativ este mult redus, procesul se declaneaz rapid, la 1-2 zile de la nsmnare, decurge normal, iar pericolul ntreruperii este de obicei exclus. Pentru o mai mare garanie se impune ca drojdiile s fie s fie nmulite ntr -un mediu sulfitic, nct la introducerea lor n must, ele fie deja adaptate la un asemenea mediu; vinul se limpezete mai uor i ntr-un timp mai scurt, creindu-se posibilitatea de a fi dat n consum mai devreme dect ce a fermentat spontan. La aceasta din urm, microflora i diferitele precipitate, prin sedimentare, formeaz un depozit pulverulent care se separ mai greu dect cel care rezult din fermentarea cu levuri eliptice, care de obicei este granular; gustul de pmnt care apare la unele vinuri, datorit naturii solului i soiului din care provin, nu se reliefeaz pregnant ca la cele fermentate spontan, ci din contra este ceva mai atenuat; tria alcoolic a vinului este mai ridicat cu cteva zecimi de grad (pn la 0,5% vol. alcool) fa de cel fermentat sub influena microflorei naturale, iar parfumul de vin tnr este mai agreabil. Folosirea drojdiilor eliptice este necesar ori de cte ori se aplic sulfitarea. Aceste dou operaii, respectiv sulfitarea i inoculare, se completeaz reciproc. Drojdiile din specia Saccharomyces oviformis Obinerea de vinuri seci din musturi bogate n zahr necesit prezena n mediul de fermentare a drojdiilor din specia Saccharomyces oviformis. Avnd o putere alcooligen

superioar drojdiilor din specia Saccharomyces ellipsoideus pot fermenta zahrul dintr-un mediu care deja este bogat n alcool. La fermentaia spontan, ndeosebi n prima parte, pn ce gradul alcoolic n-a atins 10% vol. alcool, datorit competiiei, este posibil ca numrul drojdiilor de Saccharomyces oviformis s se diminueze foarte mult, iar uneori acestea chiar dispar complet. Pentru a putea evita astfel de situaii favorabile apariiei diferitelor boli bacteriene, se recomand folosirea drojdiilor selecionate din specia Saccharomyces oviformis. Adaosul acestor drojdii se poate face nainte de pornirea n fermentaie sau ulterior. n primul caz, preferabil la producerea vinurilor albe, reuita este asigurat numai n condiiile n care nsmnarea este masiv. Numrul acestor drojdii, n momentul cnd vinul a atins tria alcoolic de 10% vol. alcool este cu att mai mare cu ct numrul iniial a fost mai mare. De obicei un adaos de 10 ori mai mare dect adausul de drojdii din specia ellipsoideus d certitudine c la sfritul fermentaiei zgomotoas se mai gsesc suficiente drojdii de Saccharomyces oviformis, care prin multiplicare s pun stpnire pe mediu. Din acest moment, cnd ele devin predominante, fermentarea trece pe seama lor. Cnd adaosurile se fac n cantiti egale, Saccharomyces ellipsoideus predomin mediul aa de tare, nct Saccharomyces oviformis nu mai poate supravieui pentru ca s-i ndeplineasc rolul de drojdii finisoare. Dat fiind faptul c n practica vinicol, un adaos masiv de maia este greu de realizat, s-a preconizat ca introducerea maialei s se fac i dup declanarea fermentaiei, mai precis n momentul cnd mediul de fermentare are tria alcoolic de 10% vol. alcool. La producerea vinurilor roii, acest moment coincide, aproximativ, cu termenul de tragere a vinului de pe botin. Un adaos de Saccharomyces oviformis efectuat n acest moment s-a dovedit suficient pentru ca fermentaia s se desvreasc complet. De altfel i noile orientri opineaz ca adaosul de drojdii, n astfel de cazuri, s nu se fac dintr-odat ci succesiv, adic drojdii de Saccharomyces ellipsoideus la nceputul fermentaiei i drojdii de Saccharomyces oviformis spre sfritul ei. Drojdii din specia Schizasaccharomyces pombe Drojdiile responsabile de fermentaia alcoolic, pe lng transformarea zahrului, produc i o descompunere parial a acidului malic n produse neacide. Prin aceast degradarea, independent de fermentaia malolactic, 15-25% din cantitatea iniial de acid malic este transformat n alcool etilic i dioxid de carbon. Drojdiile Schizasaccharomyces, prin natura particularitilor lor fiziologice, pot degrada, n aceleai condiii, cantiti mult mai mari, ajungnd pn la 95% din acidul malic iniial. De aici s-a nscut ideea folosirii lor la dezacidifierea recoltelor prea acide. Dintre speciile genului, s-a constatat c Schizasaccharomyces pombe d cele mai bune rezultate. Degradnd acidul malic drojdia poate diminua aciditatea fix fr formare de acizi volatili. Deci, din acest punct de vedere, specia Schizasaccharomyces pombe are un rol deosebit la fermentaia recoltelor acide, unde poate s nlocuiasc fermentaia malolactic. Folosirea drojdiilor Schizasaccharomyces prezint ns i unele dificulti. Astfel, datorit competiiei, acestea sunt foarte uor eliminate de celelalte specii. Un rezultat bun se poate obine fie prin utilizarea lor n cantiti foarte mari, fie prin sterilizarea complet a mediului de fermentare n care sunt introduse. Pentru a supravieui n timpul fermentaiei ele trebuie s reprezinte minimum 30% fa de drojdiile iniiale, iar ca s produc dezacidifierea dorit, proporia lor trebuie s fie cu mult mai mare. Este suficient ca Saccharomyces oviformis reclam nsmnri att de masive nct devin irealizabile. O micorare a cantitii de drojdiilor Schizasaccharomyces poate fi acceptat numai dac recolta este n prealabil sterilizat prin nclzire la 75oC. Dar cum aceast operaie necesit un consum ridicat de energie, fiind i foarte greu de efectuat, mai ales la vinificaia n rou, nseamn c pentru utilizarea, la scar industrial, a

proprietilor dezacidifiate ale drojdiilor Schizasaccharomyces mai sunt necesare noi cercetri. Un alt inconvenient, nu mai puin important , pe care-l prezint ntrebuinarea drojdiilor Schizasaccharomyces. n vinificaie, const n faptul c ele modific nefavorabil calitatea vinurilor. Sub influena lor se formeaz cantiti apreciabile de histamin. Vinurile rezultate coninnd frecvent hidrogen sulfurat, sunt mai puin plcute.

Tulpini de drojdii folosite n industria vinului

Printre drojdiile din genul Saccharomyces cerevisiae se disting numeroase tulpini de drojdii care sunt clasificate n dou grupe mari: tulpini de drojdie de fermentare superioar, produc fermentarea plmezii la temperaturi de 25-30oC, celula mam i celula fiic rmn ataat una de alta pentru un timp mai lung, se formeaz lanuri ramificate, drojdiile nmulite rmn asociate i sunt ridicate de dioxidul de carbon i depozitate n spum, nu formeaz flocoane; tulpini de drojdie de fermentare inferioar, fermenteaz plmada la temperaturi de 1525oC. Dup nmulire, drojdia fiic se desparte de drojdia mam, formnd agregate dintr-un numr mic de drojdii superioare, care se depun compact sau mai puin compact, la sfritul fermentaiei. Fermenteaz rafinoza n totalitate, au un coeficient de respiraie i o capacitate de nmulire redus. Se depun la sfritul fermentrii la baza vasului. Cele mai importante diferene fiziologice ntre drojdiile de fermentaie joas i drojdiile de fermentaie nalt se refer la: respiraie; metabolism; capacitatea de a forma spori; capacitatea de a fermenta rafinoza (cele de fermentaie inferioar). n cazul drojdiilor de fermentaie joas predomin metabolismul fermentativ, n timp ce la drojdiile de fermentaie nalt mai pronunat este metabolismul respiratoriu. Recolta de drojdie la sfritul fermentrii este mult mai mare n cazul drojdiilor de fermentare nalte dect a celor de fermentaie joas. Drojdiile de fermentaie joas au un coninut enzimatic mai mic dect drojdiile de fermentare nalt. Drojdiilor de fermentaie joas au abilitatea de a forma ascospori limitat, sporuleaz mai puin, iar formarea sporilor dureaz mai mult. Dup modul de comportare la floculare, drojdiilor de fermentaie joas se mpart n: drojdii pulverulente, se caracterizeaz prin aceea c celulele rmn separate una de alta, sunt repartizate fin prin mediul lichid i se depun la sfritul fermentrii; drojdii floculante, se caracterizeaz prin aceea c se adun dup un timp scurt i formeaz flocoane care se depun rapid, iar capacitatea floculant este determinat genetic mpreun cu tolerana la temperatur. Abilitatea drojdiilor de a flocula are foarte mare importan practic, aceste drojdii floculante au un grad de fermentare mic, iar depozitul de drojdie este compact. De tulpina de drojdie folosit depinde randamentul i calitatea vinului obinut. De aceea, drojdiile sunt selecionate, conservate i multiplicate n condiii optime. Principalele caracteristici ale drojdiilor folosite sunt: viteza de fermentare;

 capacitatea de fermentare; tolerana la alcool; osmotolerana; rezistea la antiseptice; rezistena la produsele sintetizate de microflora de contaminare etc. Tulpinile de drojdii folosite n vinificaie trebuie s aib urmtoarele nsuiiri: s fermenteze complet zahrul din substrat; s reziste la o concentraie alcoolic sczut; s reziste la un pH sczut caracteristic plmezii din melas; s aib o capacitate redus de spumare; s aib o capacitate de floculare ridicat.

Culturi de drojdii destinate vinificaiei

O verig important din lanul fluxului tehnologic o constituie i folosirea drojdiilor. n mustul provenit din strugurii sntoi, fermentaia demareaz rapid fr a fi necesar introducerea de culturi starter. n mustul provenit din strugurii infectai pentru demararea fermentaiei este necesar folosirea de culturi starter. Avantajele folosirii culturilor starter sunt mai multe i ele se folosesc n urmtoarele cazuri: fermentaia decurge lent, din cauza numrului sczut de drojdie provenit de la strugurii splai de ploi sau a mustului provenit din strugurii mnai i tratai cu doze mari de dioxid de sulf; fementaia are loc la temperaturi sczute; la obinerea vinurilor spumante; fermentaia la rece a vinurilor roii. Prin realizarea unor mutaii genetice a tulpinilor de drojdii s-au obinut celule cu caliti deosebite. Proprietile specifice drojdiilor din vin sunt urmtoarele: putere alcooligen drojdiile sunt capabile s fermenteze zaharurile din must producnd alcool etilic pn la 18-20% vol. alcool; alcoolorezisten drojdiile pot declana fermentaia i n prezen de alcool etilic, n proporie de 8 -12% vol. alcool; osmotoleran drojdiile produc fermentaia alcoolic pn la o concentraie de 10-13% vol. alcool, n mediu cu o concentraie iniial n glucide de 30%; sulforezisten drojdiile produc fermentaia alcoolic i n prezen de dioxid de sulf, n cantiti de pn la 300mg dioxid de sulf/l; rezisten la tanin n cazul vinificrii n rou sau la tratamente cu enzime pectolitice; formarea unei pelicule la suprafaa lichidului n prezena aerului n vinurile cu 16% vol. alcool, de tip Xeres; proprieti fiziologice specifice formare de acizi organici, din alcooli superiori, formare n cantitate mic de acizi volatili, eliberarea de substane cu efect stimulator sau inhibitor asupra bacteriilor care sunt ageni ai fermentaiei malolactice, caracterul killer, formarea spumei etc.; capacitatea de a crete i produce fermentaii la presiuni ridicate de dioxid de carbon cu formare de sedimente pulverulente, aceste drojdii sunt folosite pentru obinerea de vinuri spumante. n funcie de proprietile tehnologice, drojdiile se clasific n mai multe grupe:

 drojdii criofile produc fermentaia mustului la temperaturi sczute, de 7-12C, se obin vinurile albe seci sau vinuri spumante. Vinurile se caracterizeaz printr-o arom specific strugurilor din care provin. La vinurile spumante unde s-au folosit aceste tulpini de drojdii, fermentaia decurge mai lent, este complet, se mbuntete aroma, crete gradul alcoolic i se pstreaz activitatea sistemului enzimatic; drojdii termofile produc fermentarea la temperaturi ridicate, de 30-35C, sunt folosite n centrele viticole tropicale; drojdii spumante au proprieti hidrofobe determinate de proteinele existente n pereii celulari care migreaz n spum i plutesc la suprafaa lichidului n timpul fermentaiei alcoolice. Odat terminat fermentaia, aceste drojdii se depun uor permind limpezirea rapid a vinului; drojdii nespumante au proprieti hidrofile, permit fermentaia rapid a mustului, nu permit o spumarea abundent, au un grad de flotabilitate sczut i se disperseaz uniform n must. Dintre dezavantaje amintim: sedimentarea lent la finele fermentaiei. Exist unele gene de Leuconostoc oenos care se introduc i alturi de drojdia din vin degradeaz fermentativ acidul malic. n comparaie cu alte tehnologii fermentative, n vinificaie mustul de struguri nu este supus procesului de pasteurizare i el conine cantiti ridicate de drojdii, mucegaiuri i bacterii. Pentru obinerea de vinuri de calitate se impune folosirea de culturi selec ionate. Aceste culturi se obin n minim patru ani de lucru trecndu-se prin mai multe etape de lucru. Selectarea culturi de drojdie ine seama de urmtoarele criterii: comportamentul drojdiei n timpul fermentrii (viteza de fermentare, rezistena le factorul Killer, gradul de spumare, cantitatea de drojdie format n depozit); randamentul n alcool i puterea alcooligen; cantitate de zahr nefermentat; capacitatea de formarea glicogenului i alcoolilor superiori; formarea compuilor volatili (acizi volatili); rezistena la temperaturi ridicate i sczute. Drojdiile selecionate folosite se prezint sub form de drojdii crem, presate i sub form de drojdii liofilizate. n industria vinicol sunt utilizate mai rar drojdiile sub form de crem i cele presate, deoarece se pstreaz greu datorit umiditii ridicate, care depete 70%. De asemenea, puritatea microbiologic se poate asigura mai greu, ele se pot degenera uor i sub aceast form sunt supuse infeciilor cu bacterii, mucegaiuri i alte drojdii. Drojdiile sub form de crem se obin n urma separrii prin centrifugare a drojdiilor din mediu lichid. Cele presate se prepar dup aceeai tehnologie, la care se aplic n plus o filtrare steril, printr-un material filtrant textil, urmat de separarea lor de pe pnza filtrant, presarea i ambalarea steril. Livrarea drojdiilor selecionate se face n flacoane, pungi din plastic, etc.de diferite capaciti care sunt cuprinse ntre 100-500ml. Din aceste se prepar maielele de drojdii selecionate.

Modificarea biotehnologic a Saccharomyces cerevisiae: strategie de mbunt ire a calit ii vinului

Completa secveniere a genomului drojdiei a condus la: dezvoltarea unor instrumente care monitorizeaz schimbrile globale n configuraia expresiei genetice i a profilelor proteinelor; rspunsul la manipularea genetic sau de mediu;

aplicarea unor instrumente genomice sau proteomice pentru o ntelegere a caracteristicilor fiziologice i rspunsurilor biologice ale acestui organism; determinarea posibilelor consecine biologice ale schimbrii genetice directe. Alte cercetri: Dezvoltarea de instrumente moleculare sofisticate pentru analiza transferului lateral de gene; Tratamente de modificare genetic a diferitelor tulpini de Saccharomyces cerevisiae i a altor drojdii i bacterii cu care organismul mparte mediul. Tehnici de screening rapid care elimin utilizarea rezistenei la medicamente sau ali ADN ca markeri i previne transferul genelor ctre alte organisme din mediu. mpreun cu Saccharomyces bayanus - conversia mustului n vin; ndelungata asociere cu rasa umana si faptul ca vinul este produs de peste 7000 ani, Saccharomyces cerevisiae a evoluat la speciile moderne de azi in mediul fermentatiei anaerobe. In prezenta aerului, pe suprafata fructelor, in prezenta radiatiei ultraviolete si la temperaturi extreme - prezinta lipsa de dominanta si nivel relativ mare de sensibilitate. Inocularea greoaie a viilor cu tulpini specifice demonstreaza slaba rezistenta a acestui organism la conditii salbatice - reduce riscul contaminarii mediului cu tulpinile de Saccharomyces recombinante; asocierea dintre drojdie si oameni - oamenii pot deveni vectori ai transferului drojdiei de la o productie la alta (In industria vinului, sursa drojdiilor contaminante a reprezentat-o angajatii).

Proprietati ale drojdiei, responsabile de imbunatatirea calitatii vinului sau procesului tehnologic
1.Metabolismul drojdiei - responsabil de aparitia catorva componente organoleptice ale vinului. Drojdia genereaza numeroase componente detectabile in vin ca: alcooli si esteri ai acestora, acizi grasi volatili, aldehide, compusi volatili cu sulf, esteri derivati din metabolismul aminoacizilor si fenoli volatili rezultati din modificarile enzimatice ale compusilor fenolici ai plantelor. 2.Obtinerea de tulpini de Saccharomyces recombinante pentru usurarea producerii vinului sau pentru stabilizarea lui.

Metode de imbunatatire a proceselor tehnologice si a calitatii vinului

1.tulpini de drojdii optimizate pentru productia de proteaze acide pentru a previne denaturarea vinului dupa fermentare de catre proteine (reducerea continutul de proteine al vinului). 2.tulpini de Saccharomyces cu activitate pectinazica sau celulazica - o alternativa de preparate enzimatice comerciale (aditia unei enzime poate fi mai usor de controlat si monitorizat decat o tulpina recombinanta) pentru imbunatatirea filtrabilitatii vinului, prin degradarea polizaharidelor din struguri.

3. tulpini de drojdie cu activitati enzimatice care imbunatatesc eliberarea aromei strugurilor.

Obiectivele ingineriei genetice la Saccharomyces cerevisiae pentru productia de vin

Imbunatatirea performantei fermentatiei prin:
toleranta mare la etanol, acetaldehida sau acetat; toleranta mica sau mare la temperatura; utilizarea eficienta a resurselor de azot; rezistenta la stres

Imbunatatirea calitatilor organoleptice prin:

eliminarea pierderilor de productie; cresterea productiei de glicerol; cresterea eliberarii de esteri din drojdie; imbunatatirea eliberarii compusilor de aroma din precursori glicozizi-glucoza; cresterea cantitatii de enzime cu rol in biosinteaza compusilor de aroma.

Usurarea procesarii vinului prin:

eliminarea opalescentei vinului; degradarea pectinelor din struguri sau a poliglucidelor; reglarea abilitatii de floculare; toleranta la sulf; productia de bacteriocine.

Modificari benefice pentru sanatate prin:

eliminarea carbamatului de etil; imbunatatirea continutului de vitamine; eliminarea reziduurilor de pesticide/micotoxine/metale grele; eliminarea inhibitorilor compusilor fenolici/ a celor cancerigeni naturali care exista in plante; imbunatatirea nivelelor de substante bioactive/ antioxidanti

Utilizarea ingineriei genetice

a.tulpinile care modifica aroma sunt acceptate de catre consumatori ca un mod de a ascunde anumite greseli de fabricatie. b. schimbari genetice care fac vinul mai sigur pentru consumul uman si il imbunatateste din punct de vedere nutritional. c. obtinerea de tulpini care reduc aparitia carbamatului de etil in mediul de fermentatie. Carbamatul de etil = substanta naturala, cancerigena care se formeaza spontan din reactia gruparilor carbamil care contin uree si etanol - in toate bauturile fermentate. - carbamatul de etil a facut parte timp de secole din dieta omului - studii pentru reducerea aceastei substante. - obtinerea de tulpini care sa influenteze valoarea nutritiva a vinului prin cresterea continutului de vitamine si a cofactorilor acestora; - obtinerea de tulpini recombinante de drojdii pentru a creste continutul in substante fitochimice cum ar fi resveratrolul; - obtinerea de compusi fenolici bioactivi care se pare ca joaca un rol pozitiv in prevenirea anumitor boli.

Saccharomyces cerevisiae si mediul inconjurator

se gaseste in natura pe suprafata strugurilor. Desi reprezinta o minoritate a microflorei existente pe struguri, domina fermentatia. Initial, continutul de Saccharomyces cerevisiae in sucul de struguri este de la 1 la 100 celule/ml, in timp ce alte drojdii si bacterii se gasesc in numar de la 10(6) la 10(8) cfu/ml. La sfarsitul fermentatiei exista aproape cultura pura de Saccharomyces cerevisiae deoarece aceasta drojdie este foarte bine adaptata la mediul fermentativ.

Proprietati biologice fac sa permita dominanta lui Saccharomyces cerevisiae

rezistenta drojdiei la etanol. Concentratiile de 6% si 7% (v/v) etanol sunt inhibitoare pentru majoritatea organismelor in timp ce Saccharomyces tolereaza >12% chiar pana la 17%. Sensibilitatea la etanol este crescuta daca pH-ul este mai mic de 4, iar pH-ul mustului este intre 3 si 4. Sensibilitatea este de asemenea crescuta la temperaturi mai inalte, iar fermentatia rapida creste temperatura mediului contribuind astfel la cresterea toxicitatii etanolului. Saccharomyces poate capta cu usurinta micronutrientii din mediu. Aceasta drojdie elibereaza sulfiti la nivele care inhiba bacteriile. Saccharomyces se pare ca rezista la factori inhibitori cum ar fi acid acetic sau alti produsi de metabolism ai altor organisme. Mustul de struguri are o osmolaritate mare (20-28%) si mari concentratii de glucide existand o concentratie echimoleculara de glucoza si fructoza. Saccharomyces tolereaza schimbarile mari in ceea ce priveste transformarea glucidelor in alcool;

Mediul de fermentatie este limitat in azot - analizele genomice au aratat ca tulpinile comerciale sunt eficiente in reciclarea azotului. Tulpinile de Saccharomyces cerevisiae pentru vin consuma repede aminoacizii. In timpul fermentatiei, celulele nu cresc, iar glucidele se transforma in etanol. O rata de fermentatie potrivita necesita nutrienti specifici numiti factori de supravietuire, necesari pentru a mentine rata fermentativa la o densitate mare a populatiei si in prezenta a mari concentratii de etanol.

Impactul strategiilor de inginerie genetica in tulpinile de Saccharomyces pentru vin

Aroma si savoarea trebuie mentinuta si protejata pe tot parcursul procesului.

Procesul de obtinere a vinului = proces natural si depinde de activitatea unor bacterii si a unor drojdii alaturi de drojdia Saccharomyces.

Cand obtinerea vinului nu se face in conditii sterile, orice tulpina introdusa poate deveni un rezident al locului si pot aparea schimburi genetice cu alti membri de la alte specii - orice strategie de constructie genetica a tulpinilor de vin poate fi considerata un risc de transfer lateral de gene si poate conduce la contaminare incrucisata a lotului. Schimbarile pot sa nu altereze abilitatea tulpinii de a domina mediul nativ, de a avea toleranta la etanol sau de a continua procesul de fermentatie. In aditie la transferul lateral de gene, in dezvoltarea tulpinilor modificate genetic trebuie luate in considerare: - persistenta tulpinilor; - dominanta tulpinilor; - activitati nedorite ale microorganismelor; - mutatii secundare; - stabilitatea schimbarii genetice; - impactul altor microorganisme din mediu.

Persistenta organismelor modificate in mediul centrului de vinificatie este cruciala

Tulpina ideala = cea care domina fermentatia cand este utilizata ca inocul dar care sa nu domine flora centrului de vinificatie. Acest lucru este foarte greu sa se obtina in practica. Persistenta in acest caz inseamna nu numai prezenta pe parcursul fermentatiei dar si abilitatea de a forma biofilme si a inlocui alte specii rezidente din centru.

Tulpinile de Saccharomyces modificate genetic trebuie sa:

fie capabile sa concureze cu microorganismele native ale aceleiasi specii dar sa nu fie in competitie cu ele pentru dominanta in biofilme; mentina caracteristicile biologice care permit dominanta in mediul nativ asupra altor drojdii si bacterii;

sa nu genereze caractere nedorite ale vinului sau sa lipseasca vinul de componentele organoleptice importante.

Caractere noi prin inginerie genetica

A fost dezvoltata o strategie noua prin utilizarea Saccharomyces pombe care degradeaza malatul la etanol intr-un proces mai complex. Malatul este convertit la piruvat care este apoi succesiv este degradat la etanol si bioxid de carbon. Desi Saccharomyces cerevisiae poseda aceeasi cale metabolica, afinitatea substratului enzimei malice din Sacharomyces pentru malat este asa de mica astfel incat elimina conversia malatului la piruvat in conditii enologice. Saccharomyces nu poseda malat permeaza, astfel ca malatul este transportat in celula prin difuzie pasiva. Nivelul citoplasmatic al malatului este mai mic de Km al enzimei. Genele care codifica malat permeaza in Saccharomyces pombe (mae1) si enzima malica (mae2) sunt utilizate pentru a transforma tulpina de Saccharomyces cerevisiae, a o face mai eficienta in catabolismul malatului. Expresia tulpinilor genei bacteriene mleS a fost de asemenea transformata cu transportorul de gene mae1. Cea mai veche modificare genetica: obtinerea unei tulpini producatoare de enzime bacteriene care catalizeaza conversia acidului malic la lactat. Acidul malic si acidul tartric sunt doi importanti acizi care se afla in struguri. In regiunile mai reci, continutul de acid malic poate fi foarte mare in timpul recoltarii conducand la vinuri cu gust excesiv astringent.

Bibliografie:
1. Genetica microorganismelor si inginerie genetica microbiana-Note de curs si tehnici de laborator 2. Tehnologia alcoolului si a drojdiei-Note de curs 3. ANGHEL, I., 1984, Drojdiile, Editura Academiei R.S.R., Bucureti 4. DUMITRU, I. A.VAMANU, O.POPA, 2002, Drojdiile. Biotehnologii clasice i moderne, Editura Ars Docendi, Bucureti 5. www.wikipedia.ro