UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas

METABOLITOS DEL ETANOL CON EFECTOS EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL: SEPARACIN DE LOS REGIOISMEROS SALSOLINOL E ISOSALSOLINOL Y SUS RESPECTIVOS ENANTIMEROS R Y S
Tesis para optar al grado acadmico de Magster en Bioqumica, rea de especializacin Toxicologa y Diagnstico Molecular y Memoria para optar al Ttulo de Bioqumico por:

Mara de los ngeles Juricic Urza

Directores de Tesis: Dr. Yedy Israel J. Dr. Bruce K. Cassels

Santiago, Chile Julio, 2010

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS

INFORME DE APROBACIN TESIS DE MAGSTER

Se informa a la direccin de posgrado de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas que la Tesis de Magster presentada por la candidata:

Mara de los ngeles Juricic Urza

ha sido aprobada por la Comisin Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Magster en Bioqumica, rea de especializacin Toxicologa y Diagnstico Molecular y al Ttulo de Bioqumico, en el examen de defensa de Tesis rendido el da _____ de __________________ de 2010.

Directores de Tesis: Dr. Yedy Israel Jacard Dr. Bruce K. Cassels __________________________ __________________________

Comisin Informante de Tesis: Dr. Marcelo Kogan Bocian (Presidente) Prof. Asoc. Diego Bustamante Cdiz Dr. Hernn Pessoa Mahana __________________________ __________________________ __________________________

A mi familia: Victor, Bernardita, Mara Paz, Joaqun y Sebastin.

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quisiera agradecer al Dr. Yedy Israel por haberme dado la oportunidad de hacer mi tesis bajo su direccin, pero sobre todo por haber confiado en m en todo momento y por haber ido ms all de sus deberes como director de tesis, apoyndome y preocupndose siempre de potenciar mi desarrollo como cientfica y como persona. Quisiera dar tambin las gracias al Dr. Bruce Cassels, por haber dirigido mi tesis y haberme guiado con paciencia durante todo este tiempo, aportando con su vasta experiencia, sus consejos y correcciones que siempre ayudaron a mejorar mi trabajo. A los miembros de la Comisin Informante de Magster, los profesores Marcelo Kogan, Diego Bustamante y Hernn Pessoa. Sus consejos y ayuda fueron muy importantes para el desarrollo de esta tesis. Tambin quisiera agradecer a la Dra. Amalia Sapag por ensearme el valor de hacer las cosas bien hechas, por formarme en el trabajo de un laboratorio del rea biolgica y sobre todo por animarme a salir de las dificultades, aconsejarme y estar presente cada vez que lo necesit. Al profesor Julio de la Fuente, por haberme enseado a trabajar en un laboratorio y por haberme acompaado desde entonces hasta hoy. Junto a l, quisiera agradecer tambin a los profesores Claudio Saitz, Ramiro Araya, Carolina Jullian y Claudio Olea por haberme apoyado siempre y estar siempre presentes. Quisiera agradecer especialmente a los profesores Diego Bustamante, Germn Gunther y Jos Parada por su desinteresada ayuda para sobrellevar las dificultades tcnicas que se me presentaron. A mis compaeros de laboratorio -Benjamn, Carlos, Mario, Mnica, Robel y Thergiory- y a mis compaeros de universidad Alvaro, Andrea, Caro, Chepo, Italo y Nacho-, por ser siempre un apoyo en lo cientfico y, an ms importante, un apoyo en lo personal. A mi familia, muchas gracias a todos por animarme, apoyarme y soportarme durante todo este largo camino que ha sido mi tesis y desde mucho antes tambin, sin ustedes nada de esto habra sido posible. Finalmente, quisiera agradecer a Sebastin, por ayudarme tantas veces, por aguantarme, consolarme y animarme. Gracias mi amor por estar siempre conmigo, por recibirme siempre con un abrazo y por sacarme siempre una sonrisa.

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FINANCIAMIENTO Esta tesis se desarroll en el Laboratorio de Farmacoterapia Gnica del Departamento de Qumica Farmacolgica y Toxicolgica de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas de la Universidad de Chile. Fue financiada por los proyectos FONDECYT 1095021 (Ethanol as a prodrug 2009-2012) e Iniciativa Cientfica Milenio P-05-001F.

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NDICE GENERAL

FINANCIAMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NDICE GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NDICE DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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1. INTRODUCCIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1 Efectos del etanol en el sistema nervioso central . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Salsolinol generado por acetaldehdo: efectos reforzantes y motivacionales . . . . 1.3 Desarrollo de metodologas para determinar los regioismeros y enantimeros generados en la condensacin de acetaldehdo y dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1 Cromatografa de pares inicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2 Columnas con -ciclodextrina: separacin de ismeros pticamente activos 1.3.3 Mtodos de deteccin de los analitos separados por HPLC . . . . . . . . . . . . . 1.3.4 Metodologas reportadas para la separacin y cuantificacin de los enantimeros R y S del salsolinol mediante HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 2 4

8 8 9 11

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2. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1 Objetivo General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Objetivos Especficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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3. MATERIALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 Reactivos Qumicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Columnas para HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4. MTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1 HPLC de pares inicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4.2 HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina . . 4.3 Curvas de calibracin de la dopamina y el salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1 Sistema de HPLC de pares inicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 Sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 Recoleccin de salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 Espectrometra de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6 Estabilidad de la dopamina y el salsolinol en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7 Anlisis estadstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18 18 18

19 19 20 20 22

5. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1 Resultados objetivo especfico 1: Separacin salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . 5.1.1 Optimizacin de las condiciones de separacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 Curvas de calibracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2.1 Curva de calibracin de la dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2.2 Curva de calibracin del salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2 Resultados objetivo especfico 2: Confirmacin de las estructuras del salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3 Resultados Objetivo Especfico 3: Determinacin de la estabilidad de la dopamina y del salsolinol comercial en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.1 Estabilidad de la dopamina en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2 Estabilidad del salsolinol comercial en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2.1 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 14,4 minutos y que posiblemente corresponde a salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2.2 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 26,1 minutos y que posiblemente corresponde a isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4 Resultados objetivo especfico 4: Separacion de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.1 Optimizacin de las condiciones de separacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.2 Curvas de calibracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.2.1 Curva de calibracin de la dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.2.2 Curva de calibracin de los enantimeros R y S del salsolinol . . . . . . . . .

23 23 23 26 26 26

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44 44 47 47 48

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6. DISCUSIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1 Separacin de salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC de pares inicos acoplada a detector electroqumico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2 Confirmacin de la identidad de los picos que corresponden a salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3 Estudio de la estabilidad de la dopamina en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4 Estudio de la estabilidad del salsolinol e isosalsolinol en solucin . . . . . . . . . . . 6.5 Separacin de los enantimeros R y S del salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC de reparto en columna quiral de -ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6 Proyecciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.1 Purificacin de la enzima (R)-salsolinol sintasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.2 Sntesis de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.3 Administracin intrategmental de (R)-salsolinol y (S)-salsolinol, (R)isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.4 Formacin de isosalsolinol in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51 52

58 60 64

67 72 72

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73 74

7. CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8. REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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NDICE DE FIGURAS Figura 1. Naturaleza quiral del salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 2. Reaccin de condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 3. Sistema de HPLC de pares inicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 4. Estructura de la -ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 5. Separacin de la dopamina y el salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 6. Estructura del salsolinol y el isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 7. Curva de calibracin de la dopamina para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 8. Curva de calibracin del salsolinol comercial para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 9. Espectros de masas de los compuestos eluidos en la HPLC del salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 10. Reaccin de oxidacin de la dopamina a aminocromo . . . . . . . . . . . . . . . Figura 11. Oxidacin de la dopamina a temperatura ambiente y a 37C . . . . . . . . . . Figura 12. Porcentaje de dopamina remanente en la solucin tras cinco horas de oxidacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 13. Productos de oxidacin del salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 14. Estabilidad del salsolinol a temperatura ambiente y a 37C . . . . . . . . . . . Figura 15. Porcentaje de salsolinol remanente en la solucin tras cinco horas de oxidacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 16. Estabilidad del isosalsolinol a temperatura ambiente y a 37C . . . . . . . . Figura 17. Porcentaje de isosalsolinol remanente en la solucin tras cinco horas de oxidacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 18. Separacin de dopamina, (S)-salsolinol, (R)-salsolinol e isosalsolinol . . Figura 19. Separacin de los enantimeros R y S del sasolinol e isosalsolinol mediante HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina a partir de las fracciones colectadas de salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 20. Curva de calibracin de la dopamina para sistema de HPLC de reparto en columna quiral de -ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 21. Curva de calibracin de los enantimeros R y S del salsolinol para sistema de HPLC de reparto en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina . . . . Figura 22. Estructura de las catecolaminas: dopamina, salsolinol e isosalsolinol . . . 5 6 9 10 24 26 27 28 30 33 34 35 36 38 40 42 43 45

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RESUMEN Las propiedades reforzantes del etanol en el sistema nervioso central (SNC), que se postula son responsables de la auto-administracin repetida de alcohol, se deben al aumento de la liberacin de dopamina, inducido por el etanol, en el ncleo accumbens, rea del sistema mesolmbico inervada por neuronas del rea tegmental ventral. Esta accin parece estar mediada por su metabolito primario, el acetaldehdo, producido en el cerebro por la oxidacin del etanol a travs de dos sistemas enzimticos alternativos: la catalasa cerebral y el citocromo p450 2E1 (CYP2E1). Las ratas se autoadministran tanto etanol como acetaldehdo directamente en el rea tegmental ventral. La concentracin necesaria para producir efectos reforzantes es menor para el acetaldehdo que para el etanol, indicando que este metabolito del alcohol es un agente reforzante ms potente que el etanol.

El acetaldehdo se puede condensar con la dopamina formando una mezcla de salsolinol e isosalsolinol. Las ratas se autoadministran salsolinol comercial (que contiene entre un 8 % y un 15 % de isosalsolinol) directamente en el rea tegmental ventral. Las concentraciones autoadministradas son an menores que las de acetaldehdo, indicando una mayor potencia del salsolinol (y/o del isosalsolinol) como agente reforzante.

Tanto el salsolinol como el isosalsolinol tienen un centro quiral y existen como los enantimeros R y S. En el cerebro, el salsolinol sera producido por al menos tres vas: 1) condensacin no enzimtica del acetaldehdo con dopamina, que produce la mezcla racmica de (R,S)-salsolinol y, posiblemente en menor proporcin, una mezcla racmica de (R,S)isosalsolinol; 2) condensacin enzimtica del acetaldehdo con la dopamina, que producira preferencialmente (R)-salsolinol y 3) condensacin enzimtica del cido pirvico con dopamina seguido de descarboxilacin del producto, lo cual producira preferencialmente (R)-salsolinol. No existe claridad acerca de cul de los ismeros, salsolinol o isosalsolinol (o la mezcla de ambos), es responsable de las propiedades reforzantes observadas ni, especficamente, cul de los enantimeros - R o S - de estos compuestos es el que tiene una mayor actividad biolgica.

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Para poder determinar cul de los ismeros presentes en el salsolinol comercial -(R)salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol o (S)-isosalsolinol- es el que tiene una mayor actividad biolgica y para poder profundizar en los efectos que tiene el consumo de etanol sobre la produccin de ellos in vivo, es necesario poder contar con metodologas que permitan la produccin de estos ismeros en forma separada y a su vez que permitan cuantificarlos en muestras de origen biolgico. En este sentido, los principales resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis fueron los siguientes:

(i)

Se desarroll una metodologa de HPLC de apareamiento inico en columna de gel de slice-C18 acoplada a detector electroqumico capaz de separar y cuantificar dopamina, salsolinol e isosalsolinol en aproximadamente 30 min. En este sistema, la dopamina eluye primero (13,0 min. aprox.) seguida del salsolinol y el isosalsolinol (14,4 min. aprox y 26,1 min. aprox), permitiendo una buena separacin y cuantificacin de estos analitos en concentraciones desde 10-8 M.

(ii)

Se estableci que las sustancias separadas mediante HPLC de apareamiento inico a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, corresponden efectivamente a salsolinol (tiempo de retencin 14,4 min. aprox.) e isosalsolinol (tiempo de retencin 26,1 min. aprox) sobre la base de que: a) El tiempo de retencin de SC1 (14,4 min. aprox.) es menor que el tiempo de retencin de SC2 (26,1 min. aprox.) y, tericamente, cabe esperar que el salsolinol eluya antes que el isosalsolinol por tener sus grupos hidroxilo ms disponibles para interactuar con la fase mvil. b) La razn entre las reas de los picos del salsolinol comercial SC1 (tiempo de retencin 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retencin 26,1 min. aprox.) se corresponde con los porcentajes de salsolinol (92%) e isosalsolinol (8%) en el salsolinol comercial determinados por 1H-RMN. c) El peso molecular de las sustancias separadas a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, se corresponde con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol (179 g/mol).

(iii)

Se determin que la dopamina se degrada (posiblemente por autoxidacin) en solucin a pH 7,4 de acuerdo a una cintica de orden cero, mientras que el salsolinol y el isosalsolinol lo hacen de acuerdo a una cintica de orden uno, siendo la velocidad de oxidacin del isosalsolinol 10 veces mayor que la del salsolinol.

(iv)

Se desarroll una metodologa de HPLC de fase inversa en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina capaz de separar y cuantificar dopamina, (R)salsolinol y (S)-salsolinol en aproximadamente 40 minutos. En este sistema, la dopamina eluye primero (22,9 min. aprox) seguida de (S)-salsolinol (26,9 min. aprox.), (R)-salsolinol (29,9 min. aprox.) y el (R) y (S)-isosalsolinol (31,3 y 32,9 min. aprox), permitiendo una buena separacin y cuantificacin de dopamina, (S)salsolinol y (R)-salsolinol en concentraciones desde 10-8 M. Si bien el isosalsolinol pudo ser separado de dopamina y de los enantimeros R y S del salsolinol, no se logr separar completamente los enantimeros R y S del isosalsolinol entre s.

A futuro, estas metodologas permitirn la deteccin y cuantificacin de los enantimeros en muestras de origen biolgico y la administracin selectiva de un enantimero especfico directamente en el cerebro de las ratas, ampliando as los conocimientos que se tienen sobre las propiedades reforzantes del etanol como una prodroga y cmo stas pueden ser mediadas por el salsolinol.

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SUMMARY

ETHANOL METABOLITES WITH EFFECTS ON THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM: SEPARATION OF THE REGIOISOMERS SALSOLINOL AND

ISOSALSOLINOL AND THEIR CORRESPONDING R AND S ENANTIOMERS The reinforcing properties of ethanol in the central nervous system (CNS), believed to be responsible for the repeated self-administration of ethanol, are due to the increase of dopamine release -induced by ethanol- in the nucleus accumbens, a part of the mesolimbic system innerved by neurons from the ventral tegmental area. This action of ethanol seems to be mediated by its primary metabolite, acetaldehyde, which is produced in the brain from ethanol oxidation by two alternative enzymatic systems: brain catalase and cytochrome p450 2E1 (CYP2E1). Rats selfadminister both ethanol and acetaldehyde directly into the ventral tegmental area. The concentration needed to produce the reinforcing effects is lower for acetaldehyde than for ethanol, suggesting that this metabolite is a more powerful reinforcing agent than ethanol.

Acetaldehyde can condense with dopamine to form salsolinol and isosalsolinol. Rats selfadminister commercially available salsolinol (which contains between 8% to 15% of isosalsolinol) directly in the ventral tegmental area. The concentrations of salsolinol selfadministered are even lower than acetaldehyde concentrations, suggesting that salsolinol (and/or isosalsolinol) is an even more powerful reinforcing agent.

Both salsolinol and isosalsolinol have a chiral center and exist as the R and S enantiomers. In brain, salsolinol could be produced by at least three pathways. 1) non-enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine, which produces a racemic mixture of R and S salsolinol and possibly, to a lesser extent, a racemic mixture of R and S isosalsolinol; 2) enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine which would produce, preferentially, (R)-salsolinol and 3) enzymatic condensation of pyruvic acid with dopamine followed by decarboxylation of the condensation product wich would produce, preferentially, (R)-salsolinol. There is no clarity about which of the isomers, salsolinol or isosalsolinol (or both), is primarily responsible for the

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observed reinforcing properties, nor, specifically, about which of the enantiomers R or S- of these compounds has a greater biological activity.

In order to determine which of the isomers present in comercially available salsolinol (R)salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol and (S)-isosalsolinol- has stronger biological activity and in order to better understand the effects of ethanol consumption on the in vivo synthesis of these isomers, methodologies that allow us to produce these substances independently and methodologies that allow us to quantify them in biological samples are needed. In relation to this, the main results obtained in this thesis were the following:

(i)

An ion pairing HPLC methodology using a silicagel-C18 column coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, salsolinol and isosalsolinol in approximately 30 min., was developed. By this methodology, dopamine elutes first (13.0 min. approx.) followed by salsolinol and isosalsolinol (14.4 min. approx. and 26.1 min. approx.), allowing a good separation and quantification of these analytes in concentrations above 10-8 M.

(ii)

The substances separated by ion pairing HPLC from commercially available salsolinol correspond to salsolinol (retention time of 14.4 min. approx.) and isosalsolinol (retention time of 26.1 min. approx.). This was established on the basis that: a) The retention time of SC1 (14.4 min. approx.) is lower than the retention time of SC2 (26.1 min. approx.) and, theoretically, it is expected that salsolinol elutes before than isosalsolinol because salsolinol has its hydroxyl groups more available to interact with the mobil phase than isosalsolinol. b) The ratio between the areas of the peaks observed for commercially available salsolinol SC1 (retention time of 14.4 min. approx.) and SC2 (retention time of 26.1 min. approx.) is in agreement with the expected percentages of salsolinol (92%) and isosalsolinol (8%) in the commercially available salsolinol as determined by 1H-NMR.

xiii

c) The molecular weight of the substances separated from commercially available salsolinol, SC1 and SC2, is the same as the molecular weight of salsolinol and isosalsolinol (179 g/mol).

(iii)

It was determined that dopamine degradation (possibly by autoxidation) at pH 7.4 follows zero order kinetics, while salsolinol and isosalsolinol oxidations follow first order kinetics. The rate of oxidation of isosalsolinol is about 10 times higher than the rate of oxidation of salsolinol.

(iv)

A reversed phase HPLC methodology using a silicagel--cyclodextrin coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, (R)-salsolinol and (S)-salsolinol in about 40 minutes, was developed. In this methodology, dopamine elutes first (22.9 min. approx.), followed by (S)-salsolinol (26.9 min. approx.), (R)salsolinol (29.9 min. approx.) and (R) and (S)-isosalsolinol (31.3 and 32.9 min. approx.), allowing a good separation and quantification of dopamine, (S)-salsolinol and (R)-salsolinol in concentrations above 10-8 M. Although this methodology succeeded in separating isosalsolinol from dopamine and from the R and S enantiomers of salsolinol, it was unable to completely resolve (R)-isosalsolinol from (S)-isosalsolinol.

In the future, these methodologies will allow the detection and quantification of these regioisomers and enantiomers in biological samples and will allow the selective administration of a specific enantiomer directly into rat brain, extending our knowlegde on the reinforcing properties of ethanol as a prodrug and on how these properties may be mediated by salsolinol.

xiv

1. INTRODUCCIN El alcoholismo, o sndrome de dependencia alcohlica, es una enfermedad crnica cuyo desarrollo y manifestaciones estn influenciadas por factores genticos, psicosociales y ambientales (ASAM, 1990). Se caracteriza por un conjunto de sntomas fisiolgicos y de comportamiento que se desarrollan tras el consumo sostenido de alcohol y que indican que un individuo contina su consumo sin importar los problemas reconocidos por l mismo y relacionados a esta sustancia (Cottler et al., 2000; WHO (OMS), 2009). Tpicamente, incluye tolerancia y sntomas de dependencia fsica (sndrome de privacin) y/o de dependencia psicolgica (falta de control sobre el consumo, mayor prioridad puesta en el consumo que en otras actividades y ocupaciones, consumo persistente a pesar de las consecuencias dainas y gran uso de tiempo en las actividades relacionadas al consumo) (ASAM 1990; Cottler et al., 2000; WHO (OMS), 2009).

El consumo crnico de alcohol est asociado a una serie de patologas. Puede producir dao heptico (hgado graso, hepatitis alcohlica y cirrosis heptica), inmunodeficiencia, enfermedades cardiovasculares (cardiomiopata, enfermedad de la arteria coronaria,

hipertensin, arritmias e infartos), cncer (cabeza y cuello, tracto digestivo y mamas), etc. (Alcohol and Health, 2000).

El alcoholismo constituye un problema de salud pblica a nivel mundial. En Chile, un 12% de los usuarios de alcohol de entre 12 y 64 aos presenta dependencia alcohlica (600 mil de un total de 5 millones de usuarios) y un 23,8% de la poblacin general cae en el criterio de bebedor problema (CONACE, 2003).

El etanol es absorbido en el estmago y, principalmente, en el intestino, distribuyndose a travs del organismo hasta alcanzar concentraciones idnticas en el agua de todos los tejidos, incluyendo el cerebro (Wallgren y Barry, 1970a). El metabolismo perifrico del etanol es llevado a cabo principalmente en el hgado donde es oxidado a acetaldehdo por la enzima deshidrogenasa alcohlica (alcohol dehydrogenase, ADH) (Wallgren y Barry, 1970b), particularmente por la isoforma ADH1 (Galter et al., 2003). En el cerebro, donde no se expresa

la isoenzima ADH1 (Galter et al., 2003), la oxidacin del etanol a acetaldehdo es llevada a cabo principalmente por la enzima catalasa (Aragon et al., 1992; Gill et al., 1992; Zimatkin et al., 2006; Zimatkin y Buben, 2007) y en menor medida por la isoforma CYP2E1 del citocromo P450 (Zimatkin et al., 2006), la cual es inducida por el consumo crnico de etanol (Sanchez-Cataln et al., 2008). La contribucin de la catalasa y el citocromo P450 a la oxidacin perifrica del etanol es slo marginal (Lieber, 2005). Tanto a nivel perifrico como central, el acetaldehdo generado es oxidado a acetato por la enzima deshidrogenasa aldehdica (aldehyde dehydrogenase, ALDH) (Wallgren y Barry, 1970b). Es importante sealar que el acetaldehdo en condiciones metablicas normales no cruza la barrera hematoenceflica debido a que es transformado completamente a cido actico gracias al alto contenido de ALDH en la microvasculatura del cerebro (Tabakoff et al., 1975).

Los efectos aversivos del alcohol son mediados por los niveles de acetaldehdo en plasma. Entre ellos se incluyen vasodilatacin perifrica, taquicardia, dolor de cabeza y nuseas (Heilig y Egli, 2006; Johnson, 2008). Estos efectos son la base de los tratamientos farmacolgicos tradicionales contra el alcoholismo, como el disulfiram, el cual -al inhibir la enzima ALDHconduce a altos niveles plasmticos de acetaldehdo tras la ingesta de alcohol, niveles que son capaces de producir efectos aversivos hacia el consumo de esta droga (Heilig y Egli, 2006; Johnson, 2008). Tambin se han reportado variantes genticas tanto en humanos (Chen et al., 1999; Thomasson et al., 1991) como en ratas que, ya sea por una produccin aumentada de acetaldehdo (Quintanilla et al., 2007; Rivera-Meza et al, 2010) o por una degradacin disminuida de ste (Sapag et al., 2003), constituyen un factor protector contra el alcoholismo en humanos o podran ser la base de la abstinencia del consumo de alcohol de las lneas de ratas no bebedoras.

1.1 Efectos del etanol en el sistema nervioso central El etanol en el sistema nervioso central (SNC) tiene dos tipos de propiedades generales: (i) sedantes/anestsicas y (ii) reforzantes (Alcohol and Health, 2000). Los efectos sedantes del alcohol parecen estar mediados por un aumento de las acciones inhibitorias del cido gammaaminobutrico (GABA), en particular mediante la activacin de los receptores GABAA

(Huidobro-Toro et al., 1987; Lobo y Harris, 2008). Por otra parte, los efectos anestsicos del alcohol parecen estar mediados por una reduccin de los efectos excitatorios del glutamato, en particular a travs de la inhibicin de los receptores NMDA de este neurotransmisor (Lovinger et al., 1989; Wirkner et al., 1999).

El etanol, al igual que otras drogas de abuso, produce efectos reforzantes en los individuos que las consumen. Estos se refieren a aquellos efectos eufricos, placenteros o motivacionales que se asocian al alcohol y llevan a repetir su consumo. Se cree que las propiedades reforzantes de muchas drogas, como la cocana y la morfina, son causadas por su accin estimuladora de la transmisin dopaminrgica en el sistema mesolmbico (Bozarth, 1986), sistema tradicionalmente relacionado con el aprendizaje de la expresin de comportamientos motivados (Wise, 2004).

El sistema mesolmbico est constituido por las clulas dopaminrgicas del rea tegmental ventral (ventral tegmental area, VTA) que se proyectan fundamentalmente hacia el ncleo accumbens (NAc) (Wise, 2004). Tanto el VTA como el NAc han sido involucrados en la adiccin a drogas como las anfetaminas, la cocana, la morfina, la nicotina y el alcohol. Todas estas drogas aumentan la transmisin dopaminrgica en el NAc actuando ya sea en este mismo sitio o en las neuronas del VTA (Bozarth, 1986). La administracin sistmica de etanol en dosis bajas e intermedias aumenta la liberacin de dopamina (DA) en el NAc (Imperato y Di Chiara, 1986; Bustamante et al., 2008). Los efectos del etanol en la liberacin de DA parecen relacionarse con un aumento en la actividad de las neuronas dopaminrgicas del VTA inducido por el etanol (Imperato y Di Chiara, 1986; Diana et al., 1992; Melis et al., 2007).

Se ha sugerido que las propiedades reforzantes del etanol se deben a la accin de su metabolito el acetaldehdo. Esta teora es apoyada por abundantes estudios (Amit et al., 1977; Brown et al., 1979; Amit y Smith, 1985; Aragon y Amit, 1992; Foddai et al., 2004; Rodd et al., 2005; Melis et al., 2007; Peana et al., 2008; Diana et al., 2008). En primer lugar, la administracin sistmica de acetaldehdo o etanol aumenta la actividad de las neuronas dopaminrgicas del VTA (Foddai et al., 2004). En segundo lugar, las ratas se auto-administran acetaldehdo directamente en el cerebro (Amit et al., 1977; Brown et al., 1979; Amit y Smith, 1985; Rodd et al., 2005). De hecho, las ratas se auto-administran tanto etanol como acetaldehdo directamente en el VTA. Sin embargo, las concentraciones de acetaldehdo (6 x 10-6 M)

necesarias para la manifestacin de efectos reforzantes son 1000 veces menores que las necesarias de etanol (17 x 10-3 M) para ver los mismos efectos (Rodd et al., 2005). Finalmente, la administracin directa de acetaldehdo en el VTA, en dosis conocidas por ser autoadministradas, aumenta la concentracin extracelular de DA en el NAc (Melis et al., 2007).

Por otra parte, la inhibicin de la oxidacin del etanol a acetaldehdo, usando el inhibidor de la catalasa 3-aminotriazol, inhibe el efecto del etanol sobre la actividad de las neuronas dopaminrgicas del VTA (Melis et al., 2007) y resulta en una disminucin del consumo voluntario de etanol en ratas (Aragon y Amit, 1992). El acetaldehdo (sistmico a altas dosis o intraventricular) es capaz de inducir una preferencia de lugar condicionada en ratas (Amit y Smith, 1985; Melis et al., 2007; Peana et al., 2008). Adems, al ser inyectado directamente en el VTA, aumenta la actividad locomotriz de estos animales (Snchez-Cataln et al, 2009). Se ha visto tambin que el acetaldehdo es capaz de inducir una preferencia de lugar condicionada y aumentar el consumo voluntario de alcohol en las ratas bebedoras UChB (Quintanilla y Tampier, 2003).

1.2 Salsolinol generado por acetaldehdo: efectos reforzantes y motivacionales. En estudios ms recientes se ha sugerido que parte de los efectos del acetaldehdo en el sistema nervioso central pueden estar mediados por el producto de la condensacin de ste con dopamina: el salsolinol (Nakahara et al., 1994; Jamal et al., 2003; Rodd et al., 2008).

El salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina) es un alcaloide que se produce naturalmente en mamferos. El salsolinol tiene un centro quiral en el carbono 1 y existe como los enantimeros R y S (Figura 1) (Naoi et al., 2004).

En ratas, el salsolinol se encuentra fundamentalmente en el cuerpo estriado (Matsubara et al., 1987; Jamal et al., 2003) e hipotlamo (Matsubara et al., 1987) y, en bajos niveles, en el hipocampo y el mesencfalo (Matsubara et al., 1987). Se ha informado que la administracin crnica de etanol en el cerebro aumenta los niveles de salsolinol en el estriado (Sjoquist et al., 1982; Matsubara et al., Collins et al., 1990; 1987; Jamal et al., 2003; Rojkovicova et al., 2008) y

el hipotlamo (Matsubara et al., 1987). Sin embargo la administracin crnica de etanol parece no afectar los niveles de salsolinol en el ncleo accumbens (Baum et al., 1999; Lee et al., 2010).

Figura 1: Naturaleza quiral del salsolinol.

La figura muestra la estructura qumica de los enantimeros R y S del salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4tetrahidroisoquinolina).

En humanos, el (R,S)-salsolinol se encuentra principalmente en el ncleo accumbens, el ncleo caudado, el putamen, la sustancia nigra y el hipotlamo. En todos estos tejidos la razn (R)-salsolinol/(S)-salsolinol es cercana a 2 (Musshoff et al., 2000).

El salsolinol sera producido en el cerebro por al menos tres vas independientes: 1) Condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo, la cual produce una mezcla racmica de (R)-salsolinol y (S)-salsolinol (Bates et al, 1986; Dostert et al., 1988; Naoi et al., 2004); 2) Condensacin enzimtica de dopamina con acetaldehdo ((R)-salsolinol sintasa), la cual producira el enantimero (R)-salsolinol y se relacionara con el consumo de etanol (Naoi et al., 1996) y 3) Condensacin enzimtica de dopamina con cido pirvico ((R)-salsolinol sintasa) seguida de la descarboxilacin enzimtica. Esta reaccin producira el enantimero (R)salsolinol y putativamente dara cuenta de la mayor sntesis endgena de este compuesto (Naoi et al., 1996). Sin embargo no se ha descrito un mecanismo de descarboxilacin.

En estudios in vitro, se ha visto que la condensacin no enzimtica de acetaldehdo con dopamina genera, como producto secundario, el isosalsolinol (1-metil-7,8-dihidroxi-1,2,3,4tetrahidroisoquinolina) (King et al., 1974), el cual tambin es un compuesto quiral (Figura 2). La cantidad relativa que se produce de cada ismero in vitro depende en gran medida del pH al cual

se lleva a cabo la reaccin (Bates et al., 1986). A pH 7, la condensacin de dopamina con acetaldehdo genera un 50% aproximadamente de cada ismero (Bates et al., 1986).

Figura 2: Reaccin de condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo.

El acetaldehdo se condensa con la dopamina para formar una mezcla de salsolinol e isosalsolinol, ambos compuestos con un centro quiral en el carbono 1 (King et al., 1974).

Mediante 1H-RMN se ha determinado que el salsolinol distribuido comercialmente (Sigma) contiene entre un 85% y un 92% de (R,S)-salsolinol y entre un 8% y un 15% de (R,S)isosalsolinol (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels). No se puede descartar que este ltimo compuesto sea tambin formado in vivo y tenga una accin reforzante (o incluso que sea la sustancia que genere los efectos reforzantes del salsolinol disponible comercialmente; vide infra).

Se ha observado que el salsolinol (comercial) tambin es capaz de ejercer efectos reforzantes en el sistema mesolmbico. De hecho las ratas se autoadministran salsolinol (3 10-8 M a 3 107

M) directamente en el VTA posterior (Rodd et al., 2008). Adems, el salsolinol es capaz de

inducir una preferencia de lugar condicionada (Matsuzawa et al., 2000) y aumentar la actividad locomotriz en ratas (Hiplito et al., 2010), ambos efectos que parecen ser mediados por la activacin de los receptores -opioides. En este sentido, el uso de antagonistas de los receptores opioides (naltrexona o naloxona) o el uso de un antagonista especfico de los receptores opioides (-funaltrexamina) permite suprimir la preferencia de lugar condicionada (Matsuzawa et al., 2000) y el aumento de la actividad locomotriz (Hiplito et al., 2010) inducidos por el salsolinol.

Es importante considerar que el salsolinol utilizado para estos experimentos es el disponible comercialmente y contiene tanto salsolinol como isosalsolinol (y sus respectivos enantimeros R y S). Por lo anterior, es imposible asegurar cual(es) de estos cuatro ismeros ((R)-salsolinol, (S)salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-salsolinol) genera(n) los efectos reforzantes observados.

Segn algunos autores, los efectos reforzantes del salsolinol estaran mediados por su enantimero R (Nakahara et al., 1994; Naoi et al., 2004). De hecho, la perfusin con altas concentraciones de (R)-salsolinol (10-3 M) en el estriado de ratas aumenta los niveles de DA y serotonina (5-HT) y disminuye los niveles de sus metabolitos DOPAC, HVA y 5-HIAA (Nakahara et al., 1994; Naoi et al., 2004) debido a que inhibe en forma competitiva la monoamino oxidasa A (MAO-A) y la catecol-O-metiltransferasa (COMT), enzimas involucradas en la generacin de los citados metabolitos (Naoi et al., 2004). Estos efectos son inducidos en forma ms potente por el enantimero (R)-salsolinol que por el enantimero S (Naoi et al., 2004). El salsolinol en altas concentraciones tambin inhibe la tirosina hidroxilasa (enzima involucrada en la sntesis de L-DOPA) y los derivados del salsolinol, como el N-metil salsolinol, inhiben en forma no competitiva la triptofano hidroxilasa (enzima involucrada en la sntesis de serotonina) (Naoi et al., 2004).

Hasta ahora, no se conoce con exactitud el mecanismo de accin por el cual el salsolinol comercial ejerce sus acciones reforzantes en el cerebro. Sin embargo, como ya se mencion, diversas investigaciones sugieren que el salsolinol podra actuar como agonista de los receptores -opioides (Matsuzawa et al., 2000; Snchez-Cataln et al., 2009; Hiplito et al., 2010).

A pesar de la mayor importancia que pareciera tener el (R)-salsolinol por sobre su enantimero S, en ratas expuestas en forma crnica a etanol se observa un aumento tanto del (R)salsolinol como del (S)-salsolinol en el mesencfalo, ncleo caudado y putamen junto con una disminucin de la razn (R)-salsolinol/(S)-salsolinol. Esto parece indicar que la mayor sntesis de salsolinol debida al consumo de alcohol ocurre a travs de la condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo (Rojkovicova et al., 2008). Queda, sin embargo por entender si esta condensacin no enzimtica es la que genera los efectos motivacionales y determinar si la enzima salsolinol sintasa, que produce preferencialmente el enantimero R, tiene una localizacin que haga que este producto sea preferencialmente motivacional. Es por consiguiente

importante determinar con certeza cual de los compuestos, salsolinol o isosalsolinol, y cual de sus enantimeros, R o S, es el que posee una mayor actividad biolgica.

1.3 Desarrollo de metodologas para determinar los regioismeros y enantimeros generados en la condensacin de acetaldehdo y dopamina. No existe claridad en que los mtodos reportados por Naoi et al. (1996) separen eficientemente las formas (R/S)-salsolinol. Adems, ni estos autores ni los otros que han estudiado el tema han abordado el anlisis del (R/S)-isosalsolinol. Por todo lo anteriormente expuesto, es necesario poder cuantificar los ismeros estructurales salsolinol e isosalsolinol y sus respectivos enantimeros, esto con el fin de poder detectar y cuantificar cada uno de estos ismeros en cerebro (por microdilisis) y tambin con el fin de poder a futuro purificar cada uno de estos ismeros para administrarlos en forma pura.

1.3.1 Cromatografa de pares inicos La cromatografa de lquidos de alta eficacia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) es uno de los mtodos analticos de separacin de compuestos ms ampliamente utilizados para compuestos no voltiles. En ella, la muestra se inyecta en una fase mvil lquida y, mediante la presin aplicada por una bomba, alcanza una columna que contiene la fase estacionaria. De esta manera, en la HPLC, los componentes de una muestra se separan en virtud de las diferencias en su distribucin entre la fase mvil lquida y la fase estacionaria. La HPLC de reparto en fase inversa (fase estacionaria no polar y fase mvil relativamente polar) en su modalidad de cromatografa de pares inicos, permite la separacin de especies inicas mediante el uso de un contrain lipoflico de carga opuesta a la del analito en la fase mvil. La combinacin del analito con el contrain forma una especie neutra que es retenida por la fase inversa estacionaria (Skoog et al., 2001a). Este sistema permite aumentar el tiempo de retencin, en columnas de fase inversa, de analitos cargados que de otra manera seran pobremente retenidos. La HPLC de pares inicos es comnmente utilizada para la separacin de catecolaminas y sus metabolitos (Bustamante et al., 2002; Acworth y Cunningham, 1999),

puesto que estos compuestos a pH cido (3,0-3,5) se encuentran protonados. El salsolinol y el isosalsolinol tambin se encuentran protonados a pH cido lo que les confiere una carga positiva que puede ser neutralizada usando el contrain cargado negativamente octilsulfato, permitiendo que sean retenidos por una columna de fase inversa (Figura 3).

Figura 3: Sistema de HPLC de pares inicos

La figura muestra el mecanismo de retencin de los analitos mediante HPLC de pares inicos. En ella se observa como los analitos salsolinol e isosalsolinol protonados en su grupo amino, tal como se encontraran a pH cido, forman una especie neutra al asociarse con el contrain octilsulfato y como es esta especie neutra la que es retenida por la columna de gel de slice-C18 mediante la interaccin de la cadena lipoflica del octilsulfato y la cadena de 18 carbonos de la columna. Tambin pueden apreciarse las diferencias en la posicin de los grupos hidroxilo del salsolinol y el isosalsolinol que hacen que el grupo hidrxilo en la posicin 8 del isosalsolinol est estricamente impedido para interactuar con la fase mvil por el grupo metilo en la posicin 1.

1.3.2 Columnas con -ciclodextrina: separacin de ismeros pticamente activos Los mtodos ms exitosos para separar ismeros pticos (enantimeros) se basan en explotar las interacciones diferenciales que pueden tener lugar como resultado de su orientacin espacial nica. Esto se puede lograr introduciendo al sistema, ya sea en la fase mvil o la estacionaria, un material quiral para inducir una selectividad particular (Scott, 2003a). En la cromatografa de

reparto con fases estacionarias quirales, la interaccin diferencial de cada enantimero del analito con el enantimero unido qumicamente a la fase estacionaria produce una diferencia en los tiempos de retencin de cada uno de ellos (Scott, 2003a; Skoog et al., 2001a).

Las ciclodextrinas son oligosacridos producidos por la degradacin parcial del almidn seguida del acoplamiento enzimtico de unidades de D(+)-glucosa, unidos entre s por enlaces -(1,4)-glicosdicos. Las ciclodextrinas son estructuras toroidales y el tamao de su cavidad depende del nmero de unidades de D(+)-glucosa que posean. La -ciclodextrina (Figura 4) tiene 7 unidades de D(+)-glucosa y una cavidad de 6,0 a 6,5 de dimetro (Menges y Armstrong, 1991; Scott, 2003a).

Figura 4: Estructura de la -ciclodextrina.

La figura muestra las 7 unidades de D(+)-glucosa de la -ciclodextrina formando una estructura toroidal.

Las ciclodextrinas son capaces de formar complejos de inclusin, es decir pueden incluir sustancias dentro de su cavidad hidrofbica central interactuando con ellas mediante fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas, etc (Menges y Armstrong, 1991; Huang et al., 2009).

Las unidades de D(+)-glucosa le confieren a esta macromolcula su naturaleza quiral, permitiendo su utilizacin para la separacin de enantimeros. Los soportes de gel de slice

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unidos qumicamente a molculas de ciclodextrina se encuentran entre las fases estacionarias quirales ms usadas para la separacin de ismeros pticos (Scott, 2003a).

1.3.3 Mtodos de deteccin de los analitos separados por HPLC Existen muchos mtodos que permiten la deteccin y el anlisis cualitativo (por los tiempos de retencin) o cuantitativo (por las reas bajo la curva del pico correspondiente) de los analitos separados por HPLC (Skoog et al., 2001b).

Entre ellos se encuentran la deteccin por espectrofotometra de UV, la deteccin electroqumica, la deteccin por espectrometra de masas, etc. (Skoog et al., 2001b). El detector electroqumico es ampliamente utilizado por su gran aplicabilidad y sensibilidad y registra el paso de sustancias oxidables o reducibles (Scott, 2003b). Un tipo de detector electroqumico es el detector amperomtrico. En l la diferencia entre el potencial del electrodo de trabajo y el electrodo de referencia es constante. Al pasar una sustancia oxidable por el electrodo se origina una corriente medida en amperes debida a la oxidacin del analito y que es proporcional a la concentracin de ste en la solucin (Tth et al., 2004). Esta corriente es detectada por el equipo y transformada en un potencial de salida correspondiente a la corriente producida en el electrodo de trabajo y dependiente de la sensibilidad a la que se ha puesto el detector. Posteriormente, este potencial es graficado (eje y) versus el tiempo de elucin de la sustancia (eje x), dando origen a los picos cromatogrficos (Bioanalytical Systems Inc., 2000).

Este sistema de deteccin ha sido utilizado tradicionalmente para la deteccin y cuantificacin de catecolaminas (Bustamante et al., 2002; Tsunoda, 2006) y tambin de salsolinol (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al, 1989b; Pianezzola et al., 1989; Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997).

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1.3.4 Metodologas reportadas para la separacin y cuantificacin de los enantimeros R y S del salsolinol mediante HPLC Existen varios mtodos descritos en la literatura para la separacin de los enantimeros R y S del salsolinol mediante HPLC (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al, 1989b; Pianezzola et al., 1989; Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008 y Cai et al., 2008). De estas metodologas, todas a excepcin de las desarrolladas por Strolin Benedetti et al. (1989a y b) y Pianezzola et al. (1989), quienes derivatizan el salsolinol para formar diasteroismeros- usan un compuesto quiral en la fase mvil o en la fase estacionaria para permitir la separacin. La mayora usa una fase estacionaria unida qumicamente a un compuesto quiral, por ejemplo la ciclodextrina (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Rojkovicova et al., 2008 y Cai et al., 2008). Sin embargo, Deng et al. (1997) describieron un mtodo que usa una columna de fase inversa (columna de gel de slice-C18) y -ciclodextrina en la fase mvil para separar ambos enantimeros.

En los mtodos que usan -ciclodextrina, el salsolinol forma complejos de inclusin con este compuesto quiral. La estabilidad de los complejos de inclusin formados entre el R o S salsolinol y la ciclodextrina es diferente para cada enantimero, siendo mayor la estabilidad del complejo formado entre el (R)-salsolinol y la -ciclodextrina (Huang et al., 2009). De esta manera, cuando se usa -ciclodextrina en la fase mvil el tiempo de retencin es menor para el (R)-salsolinol que para el (S)-salsolinol (Deng et al., 1997), mientras que cuando se usa -ciclodextrina unida qumicamente a la fase estacionaria, el tiempo de retencin es menor para el (S)-salsolinol que para el (R)-salsolinol (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al, 1996; Liu et al., 2000; Cai et al, 2008; Rojkovicova et al, 2008; Huang et al, 2009).

Se han descrito fundamentalmente dos mtodos para la deteccin y cuantificacin de cada enantimero, R o S salsolinol, separados por HPLC: mediante detector electroqumico (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al., 1989b; Pianezzola et al., 1989; Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997) y mediante espectrometra de masas (Haber et al., 1995; Liu et al., 2000; Musshoff et al., 2000; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008; Cai et al., 2008).

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Hasta la fecha slo se ha descrito someramente una metodologa para separar (R,S)-salsolinol del (R,S)-isosalsolinol, utilizando una columna de gel de slice-C18 y como fase mvil KH2PO4 0.01 M (pH 4,5), al parecer sin agregado de un contrain lipoflico (Bates et al., 1986). En ninguno de los artculos citados anteriormente en relacin con la separacin de los enantimeros del salsolinol se hace referencia a la formacin de isosalsolinol producto de la condensacin de dopamina con acetaldehdo. Esto podra ser consecuencia de la incapacidad de estos sistemas quirales de separar los regioismeros o de la baja concentracin de isosalsolinol en las muestras utilizadas. Sin embargo, cabe esperar que el uso de -ciclodextrina unida qumicamente a la fase estacionaria permita tambin la separacin de los enantimeros R y S del isosalsolinol.

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2. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS

2.1 Objetivo General Implementar mtodos analticos que permitan la separacin de los ismeros estructurales salsolinol e isosalsolinol y sus respectvos enantimeros R y S formados en la condensacin de dopamina con acetaldehdo in vitro.

2.2 Objetivos Especficos: 1) Desarrollar metodologas para separar mediante HPLC de pares inicos el salsolinol de su ismero estructural isosalsolinol.

2) Confirmar que las estructuras de las sustancias separadas a partir de salsolinol comercial mediante HPLC de pares inicos corresponden a los ismeros estructurales, salsolinol e isosalsolinol.

3) Determinar la estabilidad de la dopamina y del salsolinol comercial en solucin.

4) Desarrollar metodologas para separar mediante HPLC de pares inicos en columnas de ciclodextrina, o eventualmente otra fase estacionaria, los ismeros (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol

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3. MATERIALES

3.1 Reactivos qumicos

Merck (Darmstadt, Alemania): metanol grado HPLC, acetonitrilo grado HPLC, cido fosfrico 85% (H3PO4) (p.a.), cido actico glacial (p.a.), fosfato de sodio dibsico heptahidratado (Na2HPO47H2O) (p.a.), acetato de amonio (p.a.). J.T. Baker (Ecatepec, Estado de Mxico, Mxico): isopropanol grado HPLC.

Sigma (St. Louis, MO, EE.UU): clorhidrato de ()-salsolinol, clorhidrato de dopamina, cido etilendiaminotetraactico (EDTA) (sal disdica), octil sulfato de sodio, hidrxido de sodio (NaOH).

Winkler (Santiago, Chile): cido perclrico 70% (HClO4) (p.a.), fosfato de sodio monobsico monohidratado (NaH2PO4H2O) (p.a.).

3.2 Soluciones Soluciones de dopamina y salsolinol: Las soluciones madre de los clorhidratos de dopamina y salsolinol comercial (que contiene tanto salsolinol como isosalsolinol) se prepararon en cido perclrico 0,1 M, para prevenir la oxidacin de estos compuestos. En el caso de la dopamina se prepar una solucin 1,37 10-2 M y, en el caso del salsolinol comercial, se disolvieron 27 mg de esta sustancia en 10 ml de cido perclrico 0,1 M. Considerando que el salsolinol comercial contendra, de acuerdo a estudios realizados por 1H+-RMN, un 92% de salsolinol y un 8% de isosalsolinol (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels), la solucin de salsolinol comercial preparada sera 1,15 10-2 M en salsolinol y 1,00 10-3 M en isosalsolinol. Las diluciones que se usaron para los distintos experimentos fueron preparadas en cido perclrico 0,1 M o fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4 segn se necesitara prevenir la oxidacin o emular condiciones fisiolgicas, respectivamente.

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Tampn de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4: El tampn de fosfato de sodio se prepar en agua destilada y desionizada. Contiene fosfato de sodio dibsico 0,08 M y fosfato de sodio monobsico 0,02 M. El pH de la solucin fue ajustado a pH 7,4 usando hidrxido de sodio 1M.

Otra soluciones: Todas las soluciones acuosas usadas se prepararon en agua destilada y desionizada mediante el purificador de agua NANOpure Infinity UF de Barnstead-Thermolyne (Dubuque, IA, EE.UU.).

3.3 Columnas para HPLC Supelco (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.): columna de gel de slice-C18 SUPELCOSIL LC-18 de 250 mm de largo, 4,6 mm de dimetro interno y partculas de 5 m.

Macherey-Nagel (Dren, Alemania): columna de gel de slice modificada con -ciclodextrina NUCLEODEX -OH de 200 mm de largo, 4 mm de dimetro interno y partculas de 5 m.

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4. MTODOS

4.1 HPLC de pares inicos.

La separacin de dopamina, salsolinol e isosalsolinol se llev a cabo mediante HPLC de pares inicos acoplada a detector electroqumico. Para ello se us una bomba isocrtica Shimadzu LC-10AD (Kyoto, Japn) acoplada a un detector amperomtrico BASi LC-4C (West Lafayette, IN, EE.UU). Las muestras, de un volumen de 50 l, se inyectaron a la columna a travs de un inyector Rheodyne (Rohnert Park, CA, EE.UU.). Como fase estacionaria se us una columna de gel de slice-C18 Supelcosil LC-18 (Supelco, Sigma-Aldrich) de 250 mm de largo, 4,6 mm de dimetro interno y un tamao de partcula de 5 m. La temperatura de la columna fue de 30C, para lo cual se us un horno Shimadzu CTO-10A (Kyoto, Japn). Como fase mvil se utiliz tampn de fosfato de sodio 0,1 M pH 3,4 con un 20% de metanol como modificador orgnico; adems la fase mvil contiene EDTA 0,03% y octilsulfato como contrain (141 mg/L). Se us una velocidad de flujo de la fase mvil de 0,4 mL/min. El potencial de oxidacin del electrodo fue fijado en 700 mV y la sensibilidad del detector electroqumico en 20 nA. Los resultados fueron analizados mediante el programa computacional CLASS CR10 Versin 1.2 (Shimadzu Corporation, 1993).

La capacidad del sistema para separar dopamina, salsolinol e isosalsolinol fue evaluada mediante el clculo del coeficiente de resolucin (R) entre cada par de analitos, el cual est determinado por los tiempos de retencin (tr) de cada sustancia y el ancho de la base del pico (W) correspondiente de acuerdo a la frmula: R = 2(trA trB)/(WA + WB). Mientras mayor es el coeficiente de resolucin, mayor es la separacin de los analitos. Para un pico cromatogrfico ideal (simtrico), un coeficiente de resolucin mayor o igual a 1 indica una separacin esencialmente completa de los analitos (Skoog y Leary, 1994).

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4.2 HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina La separacin de los enantimeros R y S salsolinol se llev a cabo mediante HPLC de reparto en columna quiral acoplada a detector electroqumico. Para ello se us una bomba isocrtica Shimadzu LC-10AD (Kyoto, Japn) acoplada a un detector amperomtrico BASi LC-4C (West Lafayette, Indiana, EE.UU). Las muestras, de un volumen de 50 l, se inyectaron a la columna a travs de un inyector Rheodyne (Rohnert Park, CA, EE.UU.). Como fase estacionaria se us una columna de gel de slice--ciclodextrina NUCLEODEX -OH de Macherey-Nagel (Dren, Alemania) de 200 mm de largo, 4,0 mm de dimetro interno y un tamao de partcula de 5 m. La temperatura de la columna fue de aproximadamente 2C, para lo cual se puso en contacto directo con la columna una compresa de fro-calor Nexcare (St.Paul, MN, EE.UU.), enfriada durante 80 minutos en el congelador hasta alcanzar 2C. Para cada muestra se us una compresa de fro-calor recin enfriada. Como fase mvil se utiliz acetato de amonio 25 mM de pH 3,8 con un 10% de acetonitrilo como modificador orgnico. Se us una velocidad de flujo de la fase mvil de 0,2 mL/min. El potencial de oxidacin del electrodo fue fijado en 700 mV y la sensibilidad del detector electroqumico en 20 nA. Nuevamente, la capacidad del sistema para separar los analitos fue medida mediante el clculo del coeficiente de resolucin (R).

4.3 Curvas de calibracin de la dopamina y el salsolinol comercial

4.3.1 Sistema de HPLC de pares inicos

Se hicieron curvas de calibracin para la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol con el fin de determinar la relacin entre la concentracin de cada sustancia y el rea del pico correspondiente a ella en el cromatograma. Para la dopamina, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de dopamina 1,37 10-3 M preparada a partir de la solucin madre de esta sustancia, usndose para la realizacin de la curva de calibracin seis concentraciones de dopamina comprendidas en el rango de 1,37 10-7 M a 2,74 10-6 M. Para el salsolinol y el isosalsolinol, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de salsolinol comercial 1,15 10-3 M de salsolinol y 1,00 10-4 M de isosalsolinol preparada a partir de la solucin madre de salsolinol comercial. Para la realizacin de la curva de calibracin del salsolinol se usaron seis

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concentraciones de salsolinol comprendidas en el intervalo de 2,88 10-7 M a 5,30 10-6 M. Para la realizacin de la curva de calibracin del isosalsolinol se usaron seis concentraciones comprendidas en el rango de 2,50 10-8 M a 5,00 10-7 M. El clculo de las concentraciones de salsolinol e isosalsolinol se hizo suponiendo que el clorhidrato de salsolinol comercial contiene un 92% de salsolinol y un 8% de isosalsolinol. Todas las curvas de calibracin se hicieron por triplicado.

4.3.2 Sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina Se hicieron curvas de calibracin para la dopamina, el (R)-salsolinol y el (S)-salsolinol con el fin de determinar la relacin entre la concentracin de cada sustancia y el rea del pico correspondiente a ella en el cromatograma. Para la dopamina, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de dopamina 1,37 10-3 M preparada a partir de la solucin madre de esta sustancia, usndose para la realizacin de la curva de calibracin seis concentraciones comprendidas en el intervalo de 1,37 10-7 M a 2,74 10-6 M. Para el (R) y (S) salsolinol, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de salsolinol comercial 1,15 10-3 M de salsolinol y 1,00 10-4 M de isosalsolinol preparada a partir de la solucin madre de salsolinol comercial. Para cada curva, se usaron seis concentraciones de (R) y (S) salsolinol comprendidas en el intervalo de 1,44 10-7 M a 2,88 10-6 M. Los clculos de la concentracin de (R) y (S) salsolinol se hicieron considerando que del total de salsolinol contenido en el clorhidrato de salsolinol comercial, un 50% corresponde a (R)-salsolinol y un 50% a (S)-salsolinol. No se realiz curva de calibracin para el isosalsolinol en el sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice--ciclodextrina por no haberse logrado resolver completamente los respectivos enantimeros R y S. Todas las curvas de calibracin se hicieron por triplicado.

4.4 Recoleccin de salsolinol e isosalsolinol Para los experimentos en los que fue necesario recolectar las fracciones separadas a partir del salsolinol comercial por el mtodo de HPLC de pares inicos antes descrito y que se presume corresponden a salsolinol e isosalsolinol, se desconect el sistema del detector amperomtrico y

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se recolectaron en forma manual fracciones de aproximadamente 0,6 ml cada una. Luego se analiz el contenido de cada una de estas fracciones evaluando su tiempo de retencin en el sistema de HPLC de pares inicos acoplado a detector electroqumico. Posteriormente, slo se utilizaron aqullas fracciones en las que se encontr una sola sustancia.

4.5 Espectrometra de masas Los anlisis de espectrometra de masas fueron llevados a cabo por el Centro de Estudios para el Desarrollo de la Qumica (CEPEDEQ) de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas de la Universidad de Chile. Para los anlisis de espectrometra de masas se us un espectrmetro de tipo electrospray-trampa inica ESI-IT Esquire 4000 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Alemania). La nebulizacin mediante electrospray se realiz usando nitrgeno a una temperatura de 300C, una presin de 10 psi y un flujo de 5 L/min. La adquisicin de los espectros se realiz en polaridad positiva. El control del espectrmetro se realiz a travs del programa esquireControl Versin 5.2 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Alemania).

4.6 Estabilidad de la dopamina y el salsolinol en solucin La estabilidad de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol en solucin a pH 7,4 se evalu dejando una solucin de la sustancia respectiva expuesta al aire durante al menos 8 horas a temperatura ambiente y a 37C. Para estudiar la estabilidad de la dopamina se us una solucin con una concentracin inicial de 3,43 10-6 M. Para estudiar la estabilidad del salsolinol comercial se usaron dos soluciones: a) una solucin 2,88 10-6 M de salsolinol y 2,50 10-7 M de isosalsolinol para estudiar la estabilidad de la sustancia que eluye a los 14,4 min y se supone que corresponde a salsolinol y b) una solucin 1,15 10-4 M de salsolinol y 1,00 10-5 M de isosalsolinol para estudiar la estabilidad de la sustancia que eluye a los 26,1 min y se supone que corresponde a isosalsolinol. En todos los casos, las soluciones fueron preparadas a partir de la respectiva solucin madre y diluidas en tampn fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4.

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La concentracin de cada sustancia en la solucin se determin mediante HPLC de pares inicos de acuerdo al mtodo ya referido y usando las curvas de calibracin de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol, que relacionan el rea del pico correspondiente con la concentracin del analito en la solucin. Para determinar cual es la cintica de desaparicin de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol, se grafic la disminucin de la concentracin de cada sustancia en el tiempo y se determin el orden de la reaccin como de orden cero1 u orden uno2 dependiendo de si la grfica corresponda a una funcin lineal o a una funcin exponencial, respectivamente. La determinacin de las ecuaciones integradas de velocidad que representan la cintica de desaparicin de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol se hizo usando los datos obtenidos para las distintas mediciones independientes realizadas para cada sustancia. Para ello se determin mediante una regresin lineal, usando el programa Microsoft Office Excel 2003, la ecuacin de la recta que mejor se ajusta a la disminucin de la concentracin de la sustancia en tiempo o a la disminucin del logaritmo natural de la concentracin de la sustancia en el tiempo segn se tratara de una reaccin de orden cero u orden uno, respectivamente.

Para determinar los porcentajes de dopamina, salsolinol e isosalsolinol remanentes tras 5 horas de oxidacin, se calcul primero la concentracin de cada sustancia remanente en la solucin a las 5 horas interpolando el valor en la curva que relaciona la concentracin de la sustancia correspondiente con el tiempo de reaccin. Luego se calcul el porcentaje remanente de cada sustancia en la solucin considerando la concentracin inicial de la sustancia como un 100%. Este clculo se hizo para cada uno de los experimentos realizados para cada sustancia. Los resultados se presentan como el promedio desviacin estndar.

Orden de reaccin cero: Corresponde a una reaccin en la que la velocidad es constante y no depende de la concentracin de los reaccionantes. En ella la concentracin de los reaccionantes es una funcin lineal del tiempo de reaccin de acuerdo a la siguiente ecuacin integrada de velocidad: [A] = -kt + [A]o Donde [A] corresponde a la concentracin del reaccionante A, k a la constante de velocidad y t al tiempo de reaccin (Logan, 2000). 2 Orden de reaccin uno: Corresponde a una reaccin en la que la velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de uno de los reaccionantes. En ella el logaritmo natural de la concentracin de uno de los reaccionantes es una funcin lineal del tiempo de reaccin de acuerdo a la siguiente ecuacin integrada de velocidad: Ln [A] = -kt + ln [A]o Donde [A] corresponde a la concentracin del reaccionante A, k a la constante de velocidad y t al tiempo de reaccin (Logan, 2000).

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4.7 Anlisis estadstico Todos los experimentos se realizaron como mnimo dos veces y los resultados se expresaron como el promedio de los resultados la desviacin estndar de la media (SD). Las diferencias se consideraron significativas a p < 0,05. El clculo de la significancia de los resultados para cada experimento se realiz mediante el anlisis t de Student usando el programa SISA (www.quantitativeskills.com/sisa/statistics/t-test).

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5. RESULTADOS

5.1 Resultados objetivo especfico 1: Separacin del salsolinol y el isosalsolinol.

5.1.1 Optimizacin de las condiciones de separacin Para la separacin y cuantificacin de las especies dopamina, salsolinol e isosalsolinol se us HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica.

Se observ que alguna sustancia contenida en la solucin de cido perclrico 0,1 M (PCA) usada para preservar las soluciones de dopamina y salsolinol comercial es retenida por la columna, eluyendo a los 5,770 0,007 min (n = 22) (Figura 5A). Una situacin similar se observ para la solucin de tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 usada para emular condiciones fisiolgicas, donde alguna sustancia contenida en la solucin es retenida por la columna eluyendo a los 6,029 0,006 min (n = 21) (Figura 5B). Por otra parte, la dopamina (DA), sustancia precursora del salsolinol e isosalsolinol, es retenida por la columna eluyendo a los 13,015 0,174 min (n = 18) (Figura 5C).

Para el salsolinol comercial (SC), que contiene entre un 8% y un 15% de isosalsolinol, se observan dos picos en el cromatograma: SC1, con un tiempo de retencin (tr) de 14,397 0,015 min (n = 18) y SC2, con un tiempo de retencin (tr) de 26,137 0,025 min (n = 18) (Figura 5D), reflejando la presencia de al menos dos sustancias oxidables en la solucin.

Bajo las condiciones de operacin anteriormente detalladas se consigui separar dopamina de los dos picos de salsolinol (Figura 5E) con coeficientes de resolucin de 1,783 para la separacin de dopamina de SC1, 14,018 para la separacin de dopamina de SC2 y 10,743 para la separacin de los dos picos del salsolinol comercial entre s. Estos resultados indican que el sistema de HPLC de apareamiento inico implementado es capaz de separar eficientemente dopamina y ambos picos del salsolinol comercial en aproximadamente 30 minutos.

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Figura 5: Separacin de la dopamina y el salsolinol comercial.

La figura muestra los cromatogramas que se obtienen usando HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica bajo las condiciones descritas anteriormente. Sobre cada pico se indica a que sustancia corresponde: DA, dopamina; SC1, primer pico salsolinol comercial y SC2, segundo pico salsolinol comercial. A) cido perclrico 0,1 M. B) Tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4. C) Solucin de dopamina 1,37 10-6 M en cido perclrico 0,1 M. D) Solucin de salsolinol comercial (2,88 10-6 M de salsolinol y 2,50 10-7 M de isosalsolinol) en cido perclrico 0,1 M. E) Cromatograma de una solucin que contiene dopamina 1,37 10-6 M y salsolinol comercial (2,88 10-6 M de salsolinol y 2,50 10-7 M de isosalsolinol) en cido perclrico 0,1 M, se observa una buena resolucin de los picos correspondientes al cido perclrico (5,759 min), la dopamina (13,498 min) y el salsolinol comercial (14,996 min y 27,635 min).

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Existen dos factores que llevan a especular que SC1 corresponde a salsolinol mientras que SC2 corresponde a isosalsolinol: (i) Los tiempos de retencin de SC1 y SC2 y (ii) la abundancia relativa de SC1 y SC2.

Con respecto a los tiempos de retencin de SC1 y SC2, se cree que SC1 corresponde a salsolinol y SC2 a isosalsolinol porque se espera que el salsolinol sea retenido menos tiempo en la columna que el isosalsolinol, puesto que los grupos hidroxilo del salsolinol estn ms disponibles para interactuar con el solvente que los del isosalsolinol, donde uno de los grupos hidroxilo est impedido estricamente por el grupo metilo en la posicin 1 (Figura 6).

Con respecto a la abundancia relativa de SC1 y SC2, el clorhidrato de salsolinol comercial contiene entre un 85-92% de salsolinol y un 8-15% de isosalsolinol (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels), por lo que cabe esperar que el rea del pico en el cromatograma correspondiente a salsolinol sea mucho mayor que la del correspondiente a isosalsolinol. Si se supone que una misma cantidad de dos sustancias estructuralmente muy similares producen corrientes tambin muy similares al ser oxidadas en el detector electroqumico, entonces se puede inferir que la razn entre las reas de los picos correspondientes es equivalente a la razn entre las concentraciones de dichas sustancias. Si se aplica lo anterior a los picos observados para el salsolinol comercial y se observa que las reas de stos estn en la razn de 11,5 1,6 (n = 18), se puede inferir que SC1 corresponde a un 91,91 1,01% del total de sustancias oxidables (con un potencial de oxidacin de 700 mV) del salsolinol comercial, mientras que SC2 corresponde al 8,09 1,01%. Estos porcentajes se corresponden en forma bastante aproximada con el contenido estimado por 1H-RMN de salsolinol e isosalsolinol en el clorhidrato de salsolinol comercial (8592% y 8-15%, respectivamente) (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels).

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Figura 6: Estructura del salsolinol y el isosalsolinol.

La figura muestra las estructuras y las numeraciones de los tomos de carbono del salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina) y del isosalsolinol (1-metil-7,8-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina). Se observa como el grupo hidroxilo en la posicin 8 del isosalsolinol est estricamente impedido por el grupo metilo en la posicin 1, mientras que en el salsolinol ambos grupos hidroxilo estn libres para interactuar con el solvente.

5.1.2 Curvas de calibracin Se realizaron curvas de calibracin para la dopamina y el salsolinol comercial, con el fin de determinar como se relaciona la concentracin de cada una de estas sustancias con la seal entregada por el detector electroqumico en trminos de rea del pico correspondiente en el cromatograma.

5.1.2.1 Curva de calibracin de la dopamina

En la Figura 7 se observa que el rea del pico correspondiente a dopamina se relaciona en forma lineal con la concentracin de dopamina en la solucin de acuerdo a la ecuacin: rea pico = 1235,4 [DA] (10-7 M). Esta relacin se mantiene en el intervalo de 1,37 10-7 M a 2,74 10-6 M, sobre esta concentracin la seal se satura.

5.1.2.2 Curva de calibracin del salsolinol comercial Como ya se mencion, se observ que en el sistema de HPLC de apareamiento inico implementado el salsolinol comercial se separa en dos sustancias con tiempos de retencin promedio de 14,397 min y 26,137 min. Si bien la identidad de los picos no ha sido confirmada,

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como se indicara anteriormente, se sospecha que el que eluye primero (SC1) es el salsolinol y el segundo (SC2) el isosalsolinol y as se considerar para los efectos de la curva de calibracin.

40000 rea pico (unidades arbitrarias) 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 5 10 15 20 25 30 concentracin dopamina (10-7 M) rea pico = 1235,4 [DA] (10-7 M) R2 = 0,9917

Figura 7 Curva de calibracin de la dopamina para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18.
La curva de calibracin para dopamina en sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 fue realizada por triplicado inyectando un volumen de 50 l de muestra. En ella se observa que el rea del pico de dopamina se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9917) con la concentracin de dopamina ([DA]), expresada en 10-7 M, de acuerdo a la ecuacin: rea del pico = 1235,4 * [DA] (10-7 M). El rea de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de rea entregados por el programa computacional de anlisis (CLASS CR10)

La Figura 8 muestra que las reas de los picos que corresponden a SC1 y SC2 se relacionan en forma lineal con la concentracin de salsolinol (rea pico = 1074,1 [Sal] (10-7 M)) e isosalsolinol (rea pico = 1036,4 [Isal] (10-7 M)) en la solucin, respectivamente. Para el primer pico (Figura 8A), correspondiente a SC1 y que se supone que es salsolinol, esta relacin se mantiene en el intervalo de 2,88 10-7 M a 5,75 10-6 M de salsolinol. Para el segundo pico (Figura 8B), correspondiente a SC2 y que se supone es isosalsolinol, esta relacin se mantiene al menos en el intervalo de 2,50 10-8 M a 5,00 10-7 M de isosalsolinol.

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A
60000 area pico (unidades arbitrarias) 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 10 20 30 40 50 60 70 concentracin salsolinol (10-7 M) rea pico = 1074,1 [Sal] (10-7 M) R2 = 0,9956

B
6000 rea pico (unidades arbitrarias) 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 1 2 3 4 5 6 concentracin isosalsolinol (10-7 M) rea pico = 1036,4 [Isal] (10-7 M) R2 = 0,9913

Figura 8: Curva de calibracin del salsolinol comercial para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18.
La curva de calibracin para el salsolinol comercial en el sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 fue realizada en triplicado inyectando un volumen de 50 l de muestra. Para los efectos de la curva de calibracin se considera que SC1 corresponde a salsolinol y SC2 a isosalsolinol A) El rea del pico de SC1 se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9956) con la concentracin de salsolinol ([Sal]), expresada en 10-7 M, mediante la ecuacin rea del pico = 1074,1 * [Sal] (10-7 M). B) El rea del pico SC2 se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9913) con la concentracin de isosalsolinol ([Isal]), expresada en 10-7 M, mediante la ecuacin rea del pico = 1036,4 * [Isal] (10-7 M). El rea de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de rea entregados por el programa computacional de anlisis (CLASS CR-10)

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5.2 Resultados objetivo especfico 2: Confirmacin de las estructuras del salsolinol e isosalsolinol. Como ya se mencion, se supone que las dos sustancias separadas a partir del clorhidrato de salsolinol comercial por el sistema de HPLC de pares inicos implementado, SC1 y SC2, corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente.

El salsolinol y el isosalsolinol tienen ambos un peso molecular de 179 g/mol. Por esta razn y como primera aproximacin a la identificacin de los picos que se observan mediante HPLC de apareamiento inico para el salsolinol comercial, se colectaron las fracciones correspondientes a cada uno de los picos y a cada una se le registr un espectro de masas en un espectrmetro de tipo electrospray-trampa inica ESI-IT Esquire 4000 (Bruker Daltonik GMBH, Alemania).

En polaridad positiva, la ionizacin del analito produce un ion precursor que corresponde al analito protonado y que se designa por (M+H+), indicando que su masa corresponde a la del analito ms la de un protn. En los espectros de ambas fracciones (Figura 9) se observa que el ion precursor (M+H+) tiene una relacin masa/carga de 180, indicando que corresponden a sustancias cuyo peso molecular es de 179 g/mol. Esto refuerza la hiptesis de que las sustancias aisladas y designadas como SC1 y SC2 corresponden a salsolinol e isosalsolinol y no a otra sustancia oxidable que pudiera estar presente en el salsolinol comercial.

Luego, el ion precursor es fragmentado en la trampa inica produciendo un espectro de fragmentacin que es nico para cada sustancia en trminos de la relacin masa/carga de los fragmentos producidos y/o en la abundancia relativa de cada uno de estos fragmentos. As, para dos sustancias muy similares, como es el caso de los regioismeros salsolinol e isosalsolinol, cabe esperar que el espectro de fragmentacin sea similar en cuanto a la relacin masa/carga de los fragmentos producidos, dado que la fragmentacin del ion precursor puede producirse en sitios anlogos generando algunos fragmentos que sern iguales para ambos compuestos y otros que sern distintos. Sin embargo, cabe esperar tambin que la abundancia relativa de los fragmentos observados para ambos compuestos sea diferente, puesto que la probabilidad de generar cada fragmento ser distinta para cada compuesto (Silverstein et al, 2005).

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Figura 9: Espectros de masas de los compuestos eluidos en la HPLC del salsolinol comercial.
Los espectros de masas se obtuvieron en un espectrmetro de masas tipo electrospray-trampa inica. El ion precursor de m/z 180 se design con la letra a y los fragmentos principales de m/z 163, m/z 145, m/z 137 y m/z 117 se designaron con las letras b, c, d y e, respectivamente. Los espectros corresponden a las dos sustancias aisladas a partir del salsolinol comercial mediante HPLC de pares inicos: el primer pico obtenido (SC1, tr promedio = 14,397 min) y al segundo pico (SC2, tr promedio = 26,137). A) Espectro de masas de SC1 donde se observa el ion precursor de m/z 180 (a) aislado ([M+H+]) y el espectro de fragmentacin (MS/MS), en el cual se observan los fragmentos principales de m/z 163 (b), m/z 145 (c), m/z 137 (d) y m/z 117 (e). B) Espectro de masas del SC2 donde se observa el ion precursor de m/z 180 (a) aislado ([M+H+]) y el espectro de fragmentacin (MS/MS), en el cual se observan los fragmentos principales de m/z 163 (b), m/z 145 (c), m/z 137 (d) y m/z 117 (e).

En los espectros de fragmentacin del ion precursor (MS/MS) de las fracciones correspondientes a SC1 (Figura 9A) y a SC2 (Figura 9B) del salsolinol comercial se observa que los fragmentos de relacin masa/carga 163, 145, 137 y 117 estn presentes en ambos espectros de fragmentacin aunque su abundancia relativa es distinta (Figura 9).

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La Tabla 1 muestra la abundancia relativa de cada uno de los fragmentos anteriores en el espectro de fragmentacin. Al fragmento ms abundante, que en ambos espectros result ser el de m/z 163, se le asign un valor de abundancia de 100. La abundancia de los dems fragmentos de cada espectro fue expresada con un valor relativo al fragmento ms abundante. Para SC1, la abundancia relativa de los fragmentos de relacin m/z 145, 137 y 117 es de un 55%, 44% y 7%, respectivamente. En el caso de SC2, la abundancia relativa de estos mismos fragmentos es de un 20%, 4% y 9%, respectivamente.

Tabla 1: Abundancia relativa de cada uno de los fragmentos observados en los espectros de masas MS/MS del primer y segundo pico observados para el salsolinol comercial.
La abundancia de cada fragmento se expresa en trminos relativos al fragmento ms abundante de cada espectro (m/z = 163) al cual se le asigna arbitrariamente el valor 100. Los fragmentos provienen de las sustancias aisladas a partir de salsolinol comercial mediante HPLC de pares inicos, SC1 y SC2, que se cree corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente. La abundancia de cada fragmento fue registrada por el programa esquireControl Versin 5.2 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Alemania).

Abundancia Relativa Relacin SC1 SC2 m/z (Sal) (Isal) 100 100 163 55 20 145 44 4 137 7 9 117

En definitiva, los iones moleculares que se observan para el salsolinol comercial tienen ambos la misma masa y esta masa es igual al peso molecular del salsolinol y el isosalsolinol. Adems, algunos de los fragmentos que se producen a partir de cada una de estas sustancias tienen la misma relacin masa/carga, lo que se condice con la similitud de las estructuras del salsolinol y el isosalsolinol.

De esta manera, se puede concluir que las sustancias SC1 (tiempo de retencin 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retencin 26,1 min. aprox.) corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente, en base a las siguientes evidencias: (i) las reas de los picos SC1 y SC2 se encuentran en una razn de 11,5:1, lo cual se corresponde con los porcentajes de salsolinol

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(92%) e isosalsolinol (8%) que se espera se encuentren en el salsolinol comercial de acuerdo con su espectro de 1H-RMN (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels) y (ii) los espectros de masas de SC1 y SC2 indican que ambas sustancias tienen un peso molecular de 179 g/mol, coincidente con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol, y que ambas sustancias se fragmentan en forma similar tal cual se esperara para sustancias estructuralemente muy relacionadas, como lo son los regioismeros. Estas evidencias concuerdan adems con el menor tiempo de retencin que se espera para el salsolinol con respecto al isosalsolinol, puesto que en el salsolinol los grupos hidroxilo estn ms disponibles para interactuar con las molculas de la fase mvil de lo que lo estn en el isosalsolinol (ver Figura 3).

5.3 Resultados Objetivo Especfico 3: Determinacin de la estabilidad de la dopamina y del salsolinol comercial en solucin.

5.3.1 Estabilidad de la dopamina en solucin Usualmente, la sntesis in vitro de salsolinol se lleva a cabo en solucin acuosa mezclando clorhidrato de dopamina con acetaldehdo (King et al., 1974; Bates et al., 1986), lo que da una solucin de un pH aproximado de 4-5. En estas condiciones, se produce tambin entre un 1020% de isosalsolinol (King et al., 1974; Bates et al., 1986). Por otra parte, si esta reaccin se lleva a cabo en presencia de oxgeno, la dopamina puede tambin oxidarse para formar aminocromo (Figura 10) (Ochs et al., 2005). De esta manera, parte de la desaparicin de dopamina en el tiempo se deber a la formacin de salsolinol y parte se deber a la formacin de aminocromo. Por esta razn, es importante determinar la estabilidad de la dopamina en solucin en las condiciones que se usarn para producir salsolinol e isosalsolinol.

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Figura 10: Reaccin de oxidacin de la dopamina a aminocromo.

La dopamina se oxida a aminocromo en una reaccin que tiene cuatro pasos y tiene como intermediarios la dopamina semquinona, la dopamina quinona y el leucoaminocromo (Ochs et al., 2005).

La desaparicin de dopamina en el tiempo, atribuible a su oxidacin, puede ser seguida mediante HPLC de apareamiento inico usando el mtodo desarrollado en el objetivo especfico nmero uno. Con este fin, se us una concentracin inicial de dopamina de 3,43 10-6 M y se evalu la cintica de la oxidacin de dopamina a pH fisiolgico (pH 7,4) tanto a temperatura ambiente como a 37C. Luego se calcul el porcentaje de dopamina remanente tras 5 horas de oxidacin para usarlo como un indicador de la dopamina perdida por oxidacin en el contexto de una reaccin de sntesis de salsolinol y/o isosalsolinol.

Se observ que la concentracin de dopamina disminuye conforme transcurre el tiempo, comportamiento que se ajusta a una recta (Figura 11). La disminucin a velocidad constante de la dopamina podra indicar que se trata de una reaccin de orden cero. Independientemente del orden de la reaccin, en el intervalo de tiempo estudiado (0-500 min) la concentracin de dopamina en el tiempo se puede determinar mediante las siguientes ecuaciones: [DA] (10-7 M) = - 0,018 t (min) + 35,819 a temperatura ambiente (aproximadamente 20 C) [DA] (10-7 M) = - 0,083 t (min) + 36,306 a 37C Donde [DA] = concentracin de dopamina expresada en 10-7 M t = tiempo de reaccin expresado en minutos

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40 concentracin de dopamina (10-7 M) 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 0 -10 100 200

[DA] (10-7 M) = -0,0182 t (min) + 35,819 R2 = 0,8561

[DA] (10-7 M) = -0,0828 t (min) + 36,306 R2 = 0,961

20C 37C

300

400

500

600

tiempo (min)

Figura 11: Oxidacin de la dopamina a temperatura ambiente (20C) y a 37C.

En la figura se observa la disminucin de la concentracin de dopamina con el tiempo (min) en una solucin de dopamina (concentracin inicial 3,43 10-6 M) en tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 a 20 C () y a 37 C ().La medicin de la concentracin de dopamina se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica. Para cada temperatura, el experimento fue realizado por triplicado y los resultados de cada una de estas mediciones independientes se representan en blanco, gris y negro. Las rectas corresponden al mejor ajuste considerando los datos obtenidos para los tres experimentos realizados para cada temperatura. En los recuadros se observan las ecuaciones integradas de velocidad que describen la desaparicin de dopamina en el tiempo a 20 C (lnea continua) y a 37 C (lnea punteada).

Se observa que la reaccin es ms rpida a 37C que a temperatura ambiente, lo cual se refleja en las respectivas constantes de velocidad: 0,018 (10-7 M/min) a temperatura ambiente y 0,083 (10-7 M/min) a 37C. Esta diferencia en la velocidad se traduce en que, a esta concentracin inicial de dopamina, el tiempo de vida media de la dopamina es de 16,4 horas a 20C y 3,7 horas a 37C. Por esta razn, se encuentra una diferencia significativa (p < 0,005) en el porcentaje de dopamina remanente en la solucin tras 5 horas, la cual es 2,7 veces mayor cuando la oxidacin se lleva a cabo a temperatura ambiente (84,1 4,1 %, n = 3) que cuando se lleva a cabo a 37C (31,4 2,5 %, n = 3) (Figura 12).

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100 90 % dopamina remanente 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20 C 84,1 %

p = 0,0046

31,4 %

37C

Figura 12: Porcentaje de dopamina remanente en la solucin tras 5 horas de oxidacin.

En la figura se observa el porcentaje de dopamina remanente en la solucin (concentracin inicial de dopamina 3,43 10-6 M) tras 5 horas de oxidacin a temperatura ambiente (20C) y 37C. El porcentaje de dopamina remanente a las 5 horas de oxidacin se determin interpolando el valor de concentracin correspondiente a las 5 horas de oxidacin en las rectas que describen la disminucin de sta conforme transcurre el tiempo.Luego este valor se compar con la concentracin inicial de dopamina utilizada. Las mediciones fueron realizadas por triplicado. La medicin de la concentracin de dopamina se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica.

Dados los resultados anteriores, las condiciones ms favorables para la formacin de salsolinol e isosalsolinol son aqullas en las que la oxidacin de dopamina se ve menos favorecida y que permiten la formacin de salsolinol e isosalsolinol. Estas condiciones son una temperatura de reaccin de 20C y pH fisiolgico (pH 7,4). Si bien manteniendo la dopamina a pH cido se puede prevenir su oxidacin, a este pH la formacin de salsolinol es muy lenta y no se forma isosalsolinol (Bates et al, 1986). En caso de usarse otras condiciones para la sntesis de salsolinol e isosalsolinol a partir de dopamina y acetaldehdo, como por ejemplo en ensayos de sntesis enzimtica donde las condiciones de pH y temperatura se asemejan a las fisiolgicas (37C y pH 7,4), habr que tener en consideracin que la dopamina se oxidar a una mayor velocidad.

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5.3.2 Estabilidad del salsolinol comercial en solucin Se sabe que el salsolinol se puede oxidar en presencia de oxgeno para formar la orto-quinona respectiva y, a partir de ella, se pueden producir otros productos por tautomerizacin u oxidacin (Figura 13) (Fa and Dryhurst, 1991). Si bien no hay publicaciones en las que se informe sobre la oxidacin del isosalsolinol, cabe esperar que, dada la estrecha similitud estructural entre ambos, el isosalsolinol se oxide al menos para formar tambin una orto-quinona. Esto podra provocar que parte del salsolinol e isosalsolinol desaparezcan del medio de reaccin a medida que transcurre el tiempo. Por esta razn se evalu, mediante HPLC de apareamiento inico, la variacin del rea de los picos que se observan para el salsolinol comercial en el tiempo. Para todas las mediciones, la concentracin de salsolinol e isosalsolinol en la solucin se estim considerando que el salsolinol comercial contiene un 92% de salsolinol y un 8% de isosalsolinol.

Figura 13: Productos de oxidacin del salsolinol

La figura muestra los principales productos de la oxidacin de una solucin de salsolinol a pH 7 al ser sometido a un potencial de oxidacin de 290 mV. En ella se observa que el salsolinol se oxida para formar la ortoquinona respectiva y que sta por tautomerizacin y/o oxidacin genera al menos tres productos estables (Adaptado de Fa y Dryhurst, 1991)

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5.3.2.1 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 14,4 minutos y que posiblemente corresponde a salsolinol Para el estudio de la estabilidad de la sustancia que eluye a 14,4 minutos aproximadamente y que se presume corresponde al salsolinol, se us una solucin de salsolinol comercial con una concentracin estimada de salsolinol de 2,88 10-6 M y de isosalsolinol 2,50 10-7 M, puesto que a esta concentracin el pico observado en el cromatograma es bastante grande sin alcanzar a saturar la seal. La estabilidad de esta sustancia a pH 7,4 fue estudiada a temperatura ambiente y a 37C. Se observ que el rea de este pico y con ella la concentracin de la sustancia respectivadisminuye conforme transcurre el tiempo, comportamiento que se ajusta tanto a una ecuacin lineal (r2 = 0,8841 y 0,9692 a 20C y a 37C, respectivamente) (Figura 14A) como a una ecuacin exponencial (r2 = 0,8962 y 0,9701 a 20C y a 37C, respectivamente) (Figura 14B). Dada esta similitud, la oxidacin de la sustancia que eluye a los 14,4 min. podra tratarse de una reaccin de orden cero, donde la concentracin se relaciona en forma lineal con el tiempo de reaccin, o de una reaccin de orden uno, donde el logaritmo natural de la concentracin se relaciona en forma lineal con el tiempo de reaccin. Si se supone, dados los argumentos anteriormente expuestos, que la sustancia que eluye a los 14,4 min corresponde a salsolinol, la disminucin de su concentracin en el tiempo se puede expresar mediante las siguientes ecuaciones, dependiendo de si se la considera una reaccin de orden cero o de orden uno: a) Orden cero: [Sal] (10-7 M) = -0,0178 t (min)+ 30,154 a temperatura ambiente (aprox. 20C) [Sal] (10-7 M) = -0,0341 t (min) + 23,518 a 37C b) Orden uno: Ln [Sal] (10-7 M) = - 0,0007 t (min) + 3,415 a temperatura ambiente (aprox. 20 C) Ln [Sal] (10-7 M) = - 0,0027 t (min) + 3,280 a 37C Donde [Sal] = concentracin de salsolinol expresada en 10-7 M t = tiempo de reaccin expresado en minutos

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A
concentracin salsolinol (10-7 M) 35 30 25 20 15 10 5 0 0 100 200 300 tiempo (min) 400 500 600 [Sal] (10-7 M) = -0,0341 t (min) + 23,518 R2 = 0,9692 20 C 37C [Sal] (10-7 M) = -0,0178 t (min) + 30,154 R2 = 0,8841

B
4 3,5 ln [Sal] (10-7 M) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 100 200 300 tiempo (min) 400 500 600 Ln [Sal] (10-7 M) = -0,0027 t (min) + 3,2799 R2 = 0,9701 20C 37C Ln [Sal] (10-7 M) = -0,0007 t (min) + 3,4145 R2 = 0,8962

Figura 14: Estabilidad del salsolinol a temperatura ambiente (20C) y a 37C.

En la figura se observa A) la disminucin de la concentracin de salsolinol en el tiempo (min) en una solucin de salsolinol comercial (concentracin inicial salsolinol 2,88 10-6 M e isosalsolinol 2,5 10-7 M) en tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 a 20 C () y a 37 C ().Las ecuaciones corresponden al mejor ajuste lineal considerando los datos obtenidos para los dos experimentos realizados para cada temperatura. En los recuadros se observan las ecuaciones que describen la disminucin de la concentracin de salsolinol en el tiempo a 20 C (lnea continua) y a 37 C (lnea punteada) y B) la disminucin del logaritmo natural de la concentracin de salsolinol en el tiempo (min) en una solucin de salsolinol comercial (concentracin inicial salsolinol 2,88 10-6 M e isosalsolinol 2,5 10-7 M) en tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 a 20 C () y a 37 C (). Las ecuaciones corresponden al mejor ajuste lineal considerando los datos obtenidos para los dos experimentos realizados para cada temperatura. En los recuadros se observan las ecuaciones integradas de velocidad que describen la desaparicin de salsolinol en el tiempo a 20 C (lnea continua) y a 37 C (lnea punteada). La medicin de la concentracin de salsolinol se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica, suponiendo que la sustancia que eluye a los 14,4 min. aproximadamente corresponde a salsolinol y que el clorhidrato de salsolinol comercial contiene un 92% de salsolinol. Para cada temperatura, el experimento fue realizado por duplicado y los resultados de cada una de estas mediciones independientes se representan en blanco y negro.

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La formacin de una semiquinona a partir del salsolinol es una reaccin bimolecular entre el salsolinol y el oxgeno. Desde esta perspectiva, cabe esperar que la reaccin siga una cintica de orden dos. Sin embargo, dado el gran exceso de oxgeno en la solucin, es posible esperar una cintica de pseudo orden uno. A pesar de que los estudios aqu realizados con respecto a la cintica de oxidacin del salsolinol no son concluyentes, para los efectos de comparacin con la oxidacin del isosalsolinol se considerar que la reaccin de oxidacin del salsolinol sigue una cintica de orden uno bajo las condiciones utilizadas en este trabajo y que el hecho de que la disminucin de la concentracin de salsolinol en el tiempo se ajuste tambin a una recta se debe a que no se evalu la reaccin el tiempo suficiente para que la curva exponencial se diferencie claramente de una recta.

Se observa que la reaccin es ms rpida a 37C que a temperatura ambiente, lo cual se refleja en las respectivas constantes de velocidad: 0,0007 (min-1) a temperatura ambiente y 0,0027 (min-1) a 37C. Esta diferencia en la velocidad se traduce en una diferencia significativa (p < 0,01) en el porcentaje de salsolinol remanente en la solucin tras 5 horas, encontrndose que la cantidad remanente es 2,1 veces mayor cuando la oxidacin se lleva a cabo a temperatura ambiente (85,2 3,8 %, n = 2) que cuando se lleva a cabo a 37C (41,5 3,9 %, n = 2) (Figura 15). Adems, en base a las ecuaciones de velocidad, se calcul que el tiempo de vida media del salsolinol es de 16,5 horas a 20C y 4,3 horas a 37C.

5.3.2.2 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 26,1 minutos y que posiblemente corresponde a isosalsolinol Para el estudio de la estabilidad de la sustancia que eluye a 26,1 minutos aproximadamente y que se supone corresponde al isosalsolinol, se us una solucin de clorhidrato de salsolinol comercial con una concentracin de salsolinol estimada de 1,15 10-4 M y de isosalsolinol 1,00 10-5 M, puesto que a esta concentracin el pico es bastante grande sin alcanzar a saturar la seal. La estabilidad de esta sustancia fue estudiada a temperatura ambiente y a 37C.

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100 90 % salsolinol remanente 80 70 60 50 40 30 20 10 0

85,2 %

p = 0,0079

41,5 %

20 C

37C

Figura 15: Porcentaje de salsolinol remanente en la solucin tras 5 horas de oxidacin.

En la figura se observa el porcentaje de salsolinol remanente en la solucin tras 5 horas de oxidacin a temperatura ambiente (20C) y 37C. Se us una solucin de clorhidrato de salsolinol comercial (2,88 10-6 M de salsolinol y 2,5 10-7 M de isosalsolinol) y se cuantific el porcentaje de salsolinol remanente a distintos tiempos de oxidacin. El porcentaje de salsolinol remanente a las 5 horas de oxidacin se determin interpolando el valor correspondiente en la ecuacin exponencial que describe la disminucin del porcentaje de salsolinol conforme transcurre el tiempo. Las mediciones fueron realizadas por triplicado. La medicin del porcentaje de salsolinol se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica.

El estudio de la estabilidad de esta sustancia se llev a cabo a temperatura ambiente (aproximadamente 20C) y a 37C, observndose que el rea de este pico y con ella la concentracin de la sustancia respectiva- disminuye conforme transcurre el tiempo, comportamiento que se ajusta mejor a una ecuacin exponencial (r2 = 0,944 y 0,9608 a 20C y a 37C, respectivamente) (Figura 16B) que a una ecuacin lineal (r2 = 0,9426 y 0,8616 a 20C y a 37C, respectivamente) (Figura 16A). Este comportamiento podra indicar que se trata de una reaccin de orden uno y por lo tanto el logaritmo natural de la concentracin se relaciona en forma lineal con el tiempo de reaccin. Si se supone, dados los argumentos anteriormente expuestos, que la sustancia que eluye a los 26,1 min corresponde a isosalsolinol, la disminucin de su concentracin en el tiempo se puede expresar mediante las siguientes ecuaciones: Ln [Isal] (10-7 M) = - 0,0072 t (min) + 4,868 a temperatura ambiente (aproximadamente 20C) Ln [Isal] (10-7 M) = - 0,0273 t (min) + 4,752 a 37C Donde [Isal] = concentracin de isosalsolinol expresada en 10-7 M t = tiempo de reaccin expresado en minutos

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Se observa que la reaccin es ms rpida a 37C que a temperatura ambiente, lo cual se refleja en las respectivas constantes de velocidad: 0,0073 (min-1) a temperatura ambiente y 0,0273 (min-1) a 37C. Esta diferencia se traduce en una diferencia significativa (p < 0,005) en el porcentaje de esta sustancia remanente en la solucin tras 5 horas, encontrndose que la cantidad remanente a temperatura ambiente es de un 15,2 1,4 % (n = 3) mientras que a 37C es de un 0,04 0,03 % (n = 3) (Figura 17). Adems, en base a las ecuaciones de velocidad, se calcul que el tiempo de vida media del isosalsolinol es de 96,3 minutos (1,6 horas) a 20C y 25,4 minutos (0,4 horas) a 37C.

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A
100 concentracin isosalsolinol (10-7 M) 80 60 40 20 0 -20 -40 tiempo (min) 0 100 200 300 400 500 600 [Isal] (10-7 M) = -0,4809 t (min) + 67,559 R2 = 0,8616 20C 37C [Isal] (10-7 M) = -0,1737 t (min) + 78,688 R2 = 0,9426

B
6 5 Ln [Isal] (10-7 M) 4 3 2 1 0 -1 0 100 200 300 tiempo (min) 400 500 600 Ln [Isal] (10-7 M) = -0,0273 t (min) + 4,7521 R2 = 0,9608 20C 37C Ln [Isal] (10-7 M) = -0,0072 t (min) + 4,8676 R2 = 0,944

Figura 16: Estabilidad del isosalsolinol a temperatura ambiente y a 37C.

En la figura se observa A) la disminucin de la concentracin de isosalsolinol en el tiempo (min) en una solucin de clorhidrato de salsolinol comercial (concentracin inicial de salsolinol 1,15 10-4 M e isosalsolinol 1,00 10-5 M) en tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 a 20 C () y a 37 C (). Las ecuaciones corresponden al mejor ajuste lineal considerando los datos obtenidos para los tres experimentos realizados para cada temperatura. En los recuadros se observan las ecuaciones que describen la disminucin de la concentracin de isosalsolinol en el tiempo a 20 C (lnea continua) y a 37 C (lnea punteada) y B) la disminucin del logaritmo natural de la concentracin de isosalsolinol en el tiempo (min) en una solucin de clorhidrato de salsolinol comercial (concentracin inicial de salsolinol 1,15 10-4 M e isosalsolinol 1,00 10-5 M) en fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4 a 20 C () y a 37 C (). Las ecuaciones corresponden al mejor ajuste lineal considerando los datos obtenidos para los tres experimentos realizados para cada temperatura. En los recuadros se observan las ecuaciones integradas de velocidad que describen la desaparicin de isosalsolinol en el tiempo a 20C (lnea continua) y a 37C (lnea punteada). La medicin de la concentracin de isosalsolinol se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica y suponiendo que el salsolinol comercial contiene un 8% de isosalsolinol. Para cada temperatura, el experimento fue realizado por triplicado y los resultados de cada una de estas mediciones independientes se representan en blanco, gris y negro.

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100 % isosalsolinol remanente 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20 C 37C 0,04 % 15,2 %

p = 0,0027

Figura 17: Porcentaje de isosalsolinol remanente en la solucin tras 5 horas de oxidacin.

En la figura se observa el porcentaje de isosalsolinol remanente en la solucin tras 5 horas de oxidacin a temperatura ambiente (20C) y 37C. Se us una solucin de clorhidrato de salsolinol comercial (1,15 10-4 M de salsolinol y 1,00 10-5 M de isosalsolinol) y se cuantific el porcentaje de isosalsolinol remanente a distintos tiempos de oxidacin. El porcentaje de isosalsolinol remanente a las 5 horas de oxidacin se determin interpolando el valor correspondiente en la ecuacin exponencial que describe la disminucin del porcentaje de isosalsolinol conforme transcurre el tiempo. Las mediciones fueron realizadas por triplicado. La medicin del porcentaje de isosalsolinol se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica.

Tanto en el caso del salsolinol como en el del isosalsolinol, la disminucin de la concentracin del compuesto en el tiempo se puede describir mediante una ecuacin exponencial, indicando que podra tratarse de reacciones de orden uno. Si se observan las constantes de velocidad de desaparicin del isosalsolinol (0,0072 min-1 a 20 C y 0,0273 min-1 a 37C), se puede ver que estas son aproximadamente 10 veces mayores que las del salsolinol (0,0007 min-1 a 20 C y 0,0027 min-1 a 37 C). De la misma manera, los tiempos de vida media del isosalsolinol (1,6 horas a 20C y 0,4 horas a 37C) son aproximadamente 10 veces menores que los tiempos de vida media del salsolinol (16,5 horas a 20C y 4,3 horas a 37C).

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5.4 Resultados objetivo especfico 4: Separacion de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)isosalsolinol y (S)-isosalsolinol.

5.4.1 Optimizacin de las condiciones de separacin

Para la separacin y cuantificacin de las especies dopamina, (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol se us HPLC de reparto en una columna de gel de slice modificada con -ciclodextrina acoplada a un detector electroqumico.

Se observ que al menos tres sustancias contenidas en la solucin de cido perclrico 0,1 M (usada para preservar las soluciones de dopamina y salsolinol comercial) son retenidas por la columna, eluyendo a los 9,361 0,126 min (n = 18), 10,632 0,142 min (n = 18) y 18,802 0,665 min (n = 18), respectivamente (Figura 18A). Una situacin similar se observ para la solucin de tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 (usada para emular condiciones fisiolgicas) donde al menos dos sustancias contenidas en la solucin son retenidas por la columna eluyendo a los 8,748 0,027 min (n = 3) y a los 11,118 0,100 min (n = 3) (Figura 18B). Por otra parte, la dopamina, sustancia precursora del salsolinol e isosalsolinol, es retenida por la columna eluyendo a los 22,954 0,632 min (n = 18) (Figura 18C).

Para el salsolinol comercial, que contiene entre un 8% y un 15% de isosalsolinol, se observan cuatro picos en el cromatograma: el primero con un tr de 26,906 0,591 min (n = 18), el segundo con un tr de 29,925 0,713 min (n = 18), el tercero con un tr de 31,304 0,192 min (n = 3) y el cuarto con un tr de 32,979 0,510 min (n = 10) (Figura 18D), reflejando la presencia de al menos cuatro sustancias oxidables en la solucin. Al inyectar una muestra de una fraccin que contiene salsolinol (sustancia que eluye a los 14,4 min), separado del isosalsolinol (sustancia que eluye a los 26,1 min) mediante HPLC de pares inicos, se observa que los picos con tiempos de retencin 26,9 min y 29,9 min en la columna quiral corresponden ambos a salsolinol (Figura 19). Por otra parte, al inyectar una muestra de una fraccin que contiene isosalsolinol, separado del salsolinol mediante HPLC de apareamiento inico, se observa que los picos con tiempos de retencin 31,3 min y 33,0 min en la columna quiral corresponden ambos a isosalsolinol (Figura 19).

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Figura 18. Separacin de dopamina, (S)-salsolinol, (R)-salsolinol e isosalsolinol

La figura muestra los cromatogramas que se obtienen usando HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina acoplada a un detector electroqumico bajo las condiciones descritas anteriormente. Sobre cada pico se indica a que sustancia corresponde: DA, dopamina; SAL1, primer pico de salsolinol; SAL2, segundo pico de salsolinol; ISAL1, primer pico de isosalsolinol y ISAL2, segundo pico de isosalsolinol. A) cido perclrico 0,1 M. B) Tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4. C) Solucin de dopamina 1,37 10-6 M en cido perclrico 0,1 M. D) Solucin de salsolinol comercial (3,83 10-6 M de salsolinol y 3,33 10-7 M de isosalsolinol) en cido perclrico 0,1 M. E) Cromatograma de una solucin que contiene dopamina 1,37 10-6 M y salsolinol comercial (3,83 10-6 M de salsolinol y 3,33 10-7 M de isosalsolinol) en cido perclrico 0,1 M, se observa una buena resolucin de los picos correspondientes al cido perclrico (9,814 min, 11,073 min y 18,111 min), la dopamina (24,596 min) y el salsolinol (26,286 min y 29,100 min). Se observa tambin que los picos putativamente correspondientes al isosalsolinol (30,897 min. y 31,990 min.) no logran resolverse en estas condiciones (ver Figura 19).

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Figura 19. Separacin de los enantimeros R y S del salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina a partir de las fracciones colectadas de salsolinol e isosalsolinol.
A partir del salsolinol comercial, se separ salsolinol e isosalsolinol usando la metodologa de HPLC de apareamiento inico antes descrita (columna de gel de slice-C18, fase mvil: tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 3,4 con un 20% de metanol y 141 mg/L de octilsulfato) y se colectaron fracciones correspondientes a SC1 (que se supone corresponde a salsolinol) y SC2 (que se supone corresponde a isosalsolinol). Luego las fracciones colectadas que contienen cada una de estas sustancias fueron analizadas mediante HPLC en columna quiral de gel de slice-ciclodextrina. Debe notarse que al corresponder a fracciones colectadas tras la separacin mediante HPLC de apareamiento inico, las muestras estn disueltas en la fase mvil utilizada para la separacin. En la figura se observa que (A) la fraccin correspondiente a salsolinol se separa en dos sustancias correspondientes a los picos SAL1 y SAL2 y (B) la fraccin correspondiente a isosalsolinol se separa en dos sustancias correspondientes a los picos ISAL1 e ISAL2.

Bajo las condiciones de operacin anteriormente detalladas se consigui separar dopamina, (R)-salsolinol, (S)-salsolinol e isosalsolinol (Figura 18E), con coeficientes de resolucin de 3,14 para la separacin de dopamina de (S)-salsolinol, 5,30 para la separacin de dopamina de (R)salsolinol y 1,98 para la separacin de (S)-salsolinol de (R)-salsolinol. Se observa que el sistema de HPLC de reparto quiral en columna de gel de slice--ciclodextrina implementado es capaz de separar eficientemente dopamina y ambos enantimeros del salsolinol comercial en

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aproximadamente 35 minutos, pero es incapaz de separar completamente los enantimeros del isosalsolinol entre s.

Con respecto a los picos que corresponden a los enantimeros del salsolinol, se sabe que el complejo de inclusin formado entre el (R)-salsolinol y la -ciclodextrina es ms estable que el que se forma con (S)-salsolinol (Huang et al., 2009). Como, en el sistema implementado, la ciclodextrina se encuentra unida a la fase estacionaria, cabe esperar que el (S)-salsolinol, que forma el complejo de inclusin ms inestable, eluya primero que el (R)-salsolinol, tal como ha sido reportado por otros investigadores (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Cai et al., 2008; Rojkovicova et al., 2008). Por lo anterior, podemos suponer que la sustancia que eluye a los 26,9 min corresponde a (S)-salsolinol, mientras que la sustancia que eluye a los 29,9 min corresponde a (R)-salsolinol. Para confirmar esto es necesario analizar las sustancias que corresponden a cada pico mediante el uso de un polarmetro, lo cual requerira cantidades grandes de los productos.

5.4.2 Curvas de calibracin Se realizaron curvas de calibracin para la dopamina y los enantimeros del salsolinol, con el fin de determinar como se relaciona la concentracin de cada una de estas sustancias con la seal entregada por el detector electroqumico en trminos de rea del pico correspondiente en el cromatograma.

5.4.2.1 Curva de calibracin de la dopamina En la Figura 20 se observa que el rea del pico correspondiente a dopamina se relaciona en forma lineal con la concentracin de dopamina en la solucin de acuerdo a la ecuacin: rea pico = 2537 [DA] (10-7 M). Esta relacin se mantiene al menos en el rango de 1,37 10-7 M a 1,37 10-6 M, saturndose la seal a una concentracin de 2,74 10-6 M.

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rea pico (unidades arbitrarias)

80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 5 10 15 20 25 30 rea pico = 2537 [DA] (10-7 M) R2 = 0,9953

concentracin dopamina (10-7 M)

Figura 20: Curva de calibracin de la dopamina para sistema de HPLC de reparto en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina.
La curva de calibracin para la dopamina en el sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice-ciclodextrina fue realizada por triplicado inyectando un volumen de 50 l de muestra. En ella se observa que el rea del pico de dopamina se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9953) con la concentracin de dopamina (expresada en 10-7 M) de acuerdo a la ecuacin: rea del pico = 2537 * [DA] (10-7 M). El rea de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de rea entregados por el programa computacional de anlisis (CLASS CR10)

5.4.2.2 Curva de calibracin de los enantimeros R y S del salsolinol Como ya se mencion, se observ que en el sistema de HPLC de pares inicos implementado el salsolinol comercial se separa en dos sustancias con tiempos de retencin promedio de 14,397 min y 26,137 min. Si bien la identidad de los picos no ha sido confirmada, se sospecha que el que eluye primero es el salsolinol y el segundo el isosalsolinol.

La sustancia que eluye a los 14,397 min y que se cree que corresponde a salsolinol, es retenida por una columna quiral de gel de slice--ciclodextrina. Para esta sustancia se observa la aparicin de dos picos en el cromatograma, cada uno correspondiente a uno de los enantimeros del salsolinol3. Dada la mayor estabilidad del complejo de inclusin formado entre el (R)salsolinol y la -ciclodextrina, comparado con el que forma el (S)-salsolinol, se supone que el

Debe notarse que la identificacin precisa de cada enantimero slo puede hacerse mediante polarimetra, observando como cada enantimero desva la luz polarizada. En el caso del salsolinol, el enantimero R es dextrgiro (tiene una rotacin especfica positiva) mientra que el enantimero S es levgiro (tiene una rotacin especfica negativa) a la longitud de onda de 589 nm.

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primer pico (tr = 26,9 min) corresponde a (S)-salsolinol y el segundo (tr = 29,9 min) a (R)salsolinol y as ser considerado para efectos de las curvas de calibracin.

En la Figura 21 se observa que el rea del primer pico del salsolinol, que se supone corresponde a (S)-salsolinol, se relaciona en forma lineal con la concentracin de (S)-salsolinol en la solucin de acuerdo a la ecuacin: rea pico = 2390 [(S)-Sal] (10-7 M). Esta relacin se mantiene al menos en el rango de 1,44 10-7 M a 2,88 10-6 M. Por otra parte, el rea del segundo pico del salsolinol, que se supone corresponde a (R)-salsolinol, se relaciona en forma lineal con la concentracin de (R)-salsolinol en la solucin de acuerdo a la ecuacin: rea pico = 2529,4 [(R)-Sal] (10-7 M). Esta relacin se mantiene al menos en el rango de 1,44 10-7 M a 2,88 10-6 M.

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A
rea pico (unidades arbitrarias) 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 rea pico = 2390 [(S)-Sal] (10-7 M) R2 = 0,999

concentracin (S)-salsolinol (10-7 M)

B
rea pico (unidades arbitarias) 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 rea pico = 2529,4 [(R)-Sal] (10-7 M) R2 = 0,9995

concentracin (R)-salsolinol (10-7 M)

Figura 21: Curva de calibracin de los enantimeros R y S del salsolinol para sistema de HPLC de reparto en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina.
La figura muestra las curvas de calibracin hechas para los enantimeros R y S del salsolinol, suponiendo que el salsolinol comercial contiene un 92% de salsolinol y que de ste el 50% corresponde a (R)-Salsolinol y el 50% a (S)salsolinol. A) Curva de calibracin para el (S)-salsolinol: se observa que el rea del pico de (S)-salsolinol se relaciona en forma lineal (r2 = 0,999) con la concentracin de (S)-salsolinol (expresada en 10-7 M) de acuerdo a la ecuacin: rea pico = 2390 * [(S)-Sal] (10-7 M). B) Curva de calibracin para el (R)-salsolinol: se observa que el rea del pico de (R)-salsolinol se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9995) con la concentracin de (R)-salsolinol (expresada en 10-7 M) de acuerdo a la ecuacin: rea pico = 2529,4 * [(R)-Sal] (10-7 M). La curva de calibracin para la dopamina en el sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice--ciclodextrina fue realizada por triplicado inyectando un volumen de 50 l de muestra. Basado en la literatura, se consider que el primer pico de salsolinol (tr = 26,9 min) corresponde a (S)-salsolinol y que el segundo pico (tr = 29,9 min) corresponde a (R)-salsolinol. El rea de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de rea entregados por el programa computacional de anlisis (CLASS CR10)

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6. DISCUSIN Como se indicara anteriormente, tanto el salsolinol como el isosalsolinol tienen un centro quiral y existen como los enantimeros R y S. Todos los experimentos, tanto de administracin como de autoadministracin de salsolinol en el cerebro, se han hecho usando el salsolinol disponible comercialmente (Matzusawa et al, 2000; Rodd et al, 2008; Hiplito et al, 2009; Hiplito et al, 2010). Por esta razn, no existe claridad acerca de cul de los ismeros, salsolinol o isosalsolinol (o la mezcla de ambos), es responsable de las propiedades reforzantes observadas ni, especficamente, cul de los enantimeros - R o S - de estos compuestos es el biolgicamente activo.

Por lo anterior, este trabajo se centr en la implementacin de mtodos analticos que permitieran la separacin y cuantificacin de los enantimeros R y S de los ismeros estructurales salsolinol e isosalsolinol.

En relacin al objetivo de este trabajo, se logr implementar un mtodo de HPLC de apareamiento inico acoplado a detector electroqumico capaz de separar salsolinol de isosalsolinol y ambos de su precursor dopamina en aproximadamente 30 minutos. Se confirm que las sustancias que se consider corresponden a salsolinol e isosalsolinol tienen ambas, al ser ionizadas en un espectrmetro de masa, una relacin masa/carga de 180, lo que se corresponde con el peso molecular de ambos regioismeros (179 g/mol). Adems, se implement un mtodo de HPLC de reparto en columna quiral de -ciclodextrina acoplado a detector electroqumico capaz de separar dopamina, (R)-salsolinol, (S)-salsolinol y (R/S)-isosalsolinol en

aproximadamente 40 minutos. No se consigui mediante este sistema separar (R)-isosalsolinol de (S)-isosalsolinol. Para ambas metodologas se hicieron las curvas de calibracin que permiten relacionar la concentracin de las distintas sustancias con el rea del pico correspondiente en el cromatograma. Adicionalmente, se estudi la estabilidad de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol en solucin, establecindose que, en todos los casos, la concentracin del analito disminuye conforme transcurre el tiempo y que la velocidad de desparicin se ve aumentada al aumentar la temperatura de 20 a 37 C. Aparentemente, la oxidacin de dopamina sigue una cintica de orden cero, mientras que la desparicin de salsolinol e isosalsolinol se ajustan a una

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cintica de orden uno, siendo la velocidad de desaparicin del isosalsolinol diez veces mayor que la del isosalsolinol..

6.1 Separacin de salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC de pares inicos acoplada a detector electroqumico. El salsolinol y el isosalsolinol son ambos productos de la condensacin de dopamina con acetaldehdo (King et al, 1974) y, al igual que su neurotransmisor precursor, son catecolaminas. Es decir poseen un grupo catecol y un grupo amino, que en el caso del salsolinol y el isosalsolinol corresponde a una amina secundaria (Figura 22).

Figura 22: Estructura de las catecolaminas: dopamina, salsolinol e isosalsolinol.

La figura muestra la presencia del grupo catecol y la funcin amina en la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol. A) Estructura de la 1,2-benzohidroquinona (catecol). B) En negro se destaca la presencia del ncleo catecol y la funcin amina en la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol.

La eleccin del HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica como metodologa para separar y cuantificar el salsolinol y el isosalsolinol, se bas en el hecho de que la HPLC de reparto en fase inversa con deteccin electroqumica, con o sin la ayuda de un

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contrain, es la metodologa tradicionalmente usada para la deteccin de catecolaminas y sus metabolitos (Perry et al., 2009; Bergquist et al., 2002). Como el salsolinol y el isosalsolinol son tambin catecolaminas, se esperaba que esta metodologa fuera tambin capaz de separarlos y detectarlos.

En la HPLC de reparto en fase inversa, el carcter apolar de la fase estacionaria y el carcter polar de la fase mvil hace que los analitos ms polares sean retenidos por menos tiempo. Las catecolaminas, incluidos el salsolinol y el isosalsolinol, son compuestos relativamente polares y que a pH cido se encuentran protonados en su grupo amino. Este carcter polar hace que las catecolaminas sean retenidas poco tiempo en las columnas de fase inversa, pero si se incorpora un contrain muy lipoflico, de carga opuesta al analito, como el octilsulfato, ste interacta con las catecolaminas formando una especie neutra que es retenida mucho ms tiempo en la columna, aumentando la resolucin entre las distintas catecolaminas y sus metabolitos (Mefford et al, 1981). La HPLC de pares inicos es una metodologa que permite una buena resolucin temporal de las distintas catecolaminas y sus metabolitos y, adems, presenta la ventaja de ser relativamente de bajo costo si se la compara con otras alternativas como la cromatografa de gases o la electroforesis capilar.

Por otra parte, las catecolaminas y sus metabolitos tienen como caracterstica comn la de ser fcilmente oxidables (Mefford, 1981), lo que se presenta como una gran ventaja para detectar y cuantificar estos analitos. Por esta razn, tradicionalmente se ha usado la deteccin electroqumica para cuantificar estas especies, puesto que permite la deteccin de todas las especies oxidables a un determinado potencial de oxidacin y la respuesta del electrodo es adems proporcional a los moles de sustancia oxidados (Mefford, 1981). Si bien la espectrometra de masas en tndem es un mtodo de deteccin y cuantificacin que presenta la ventaja de confirmar la identidad de una sustancia mediante la masa de sta y un espectro de fragmentacin que le es caracterstico, la deteccin electroqumica tiene un costo mucho menor y es suficientemente sensible para detectar las concentraciones de catecolaminas normalmente presentes en el cerebro, que generalmente se encuentran en el rango nanomolar (Bergquist et al., 2002; Bustamante et al., 2008; DeCuypere et al., 2008).

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En resumen, se escogi la HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica como metodologa para separar y cuantificar salsolinol e isosalsolinol, puesto que es una metodologa de alta sensibilidad y bajo costo, comparada con otras existentes, capaz de separar eficientemente las catecolaminas y sus metabolitos y capaz de detectar los niveles de catecolaminas, en particular dopamina, presentes en cerebro.

Se observ que la metodologa de HPLC de pares inicos implementada es capaz de separar dos sustancias a partir del salsolinol comercial: SC1 y SC2 (tr promedio = 14,397 0,015 min. (n = 18) y 26,137 0,025 min (n = 18), respectivamente) (ver Figura 4D) con un coeficiente de resolucin de 10,74. Estas sustancias podran corresponder a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente, pues se espera que el salsolinol tenga un tiempo de elucin menor que el isosalsolinol al tener sus grupos hidroxilo ms disponibles para interactuar con la fase mvil. Por otra parte, se observ que las reas de los picos correspondientes a estas sustancias estn en la razn 11,5:1 (SC1/SC2 = 11,5 1,6 (n = 18)). Esto refuerza la hiptesis de que SC1 y SC2 corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente, puesto que estudios preliminares de la composicin del clorhidrato de salsolinol comercial mediante 1H-RMN indican que ste contiene aproximadamente un 92% de salsolinol y un 8% de isosalsolinol (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels), lo que corresponde a una razn entre las concentraciones de salsolinol e isosalsolinol de 11,5. Adems, se observ que la metodologa implementada es capaz de separar dopamina (tr promedio = 13,015 0,174 min. (n = 18)) de los dos picos de salsolinol comercial (ver Figura 4E) con coeficientes de resolucin de 1,78 y 14,02, respectivamente.

Cabe destacar que los picos cromatogrficos observados para la dopamina y las dos sustancias separadas a partir del salsolinol comercial (Figura 4) no son simtricos, sino que son alargados hacia mayores tiempos de retencin, fenmeno denominado tailing. Este fenmeno puede suceder por la interaccin del analito (si es de naturaleza bsica) con los grupos silanol de la columna de gel de slice-C18 o porque las conexiones usadas son muy largas y provocan un ensanchamiento del pico. Para solucionar el primer problema se podra usar una base en la fase mvil, como trietilamina, que compitiera con el analito por su interaccin con los grupos silanol. En el caso del segundo problema habra que acortar las conexiones al mximo posible. En cualquier caso y como ya se mencion en la metodologa, un coeficiente de resolucin mayor a 1 implica una separacin esencialmente completa de los analitos correspondientes a dichos picos

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cromatogrficos, siempre y cuando stos sean simtricos. En este caso, donde se observa un fenmeno de tailing de los picos, si bien todos los coeficientes de resolucin son mayores a 1 es evidente (Figura 4) que existe un cierto grado de superposicin de los picos de dopamina y SC1. De esta manera, aunque en las condiciones de este trabajo se logr separar dopamina, SC1 y SC2, los coeficientes de resolucin calculados no son un reflejo de la eficacia de esa separacin.

Es interesante notar que tanto el cido perclrico (PCA) como el tampn fosfato de sodio, utilizados para disolver la dopamina y el salsolinol comercial, contienen sustancias oxidables que eluyen a los 5,770 0,007 min (n = 22) y 6,029 0,006 min. (n = 21), respectivamente. No se espera que ni el cido perclrico (HClO4) ni el tampn fosfato de sodio (que contiene NaH2PO4 y Na2HPO4) se oxiden, puesto que tanto el cloro como el fsforo se encuentran en su mximo estado de oxidacin (+7 y +5, respectivamente). Sin embargo, tanto el cido perclrico utilizado (Winkler, Santiago, Chile) como las sales de fosfato monobsico (Winkler, Santiago, Chile) y dibsico (Merck, Darmstadt, Alemania) contienen hierro (0,00005% a 0,001%), metales pesados como el plomo (0,00005% a 0,001%) en estados de oxidacin que se desconocen, y cloruro (0,0003% a 0,001%), y estas sustancias podran ser responsables de los picos observados en los cromatogramas de las soluciones de cido perclrico 0,1 M y tampn fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4. No existe ninguna informacin acerca de la presencia de posibles impurezas orgnicas oxidables que pudieran generar estas seales.

Hasta ahora, adems del mtodo aqu desarrollado, el nico mtodo que permitira la separacin de salsolinol e isosalsolinol es el desarrollado por Bates et al. (1981) para la separacin de los productos de condensacin de acetaldehdo y formaldehdo con adrenalina. En esta metodologa se us una columna de gel de slice-C18 (300 mm de largo, 39 mm de dimetro interno y partculas de 10 m) como fase estacionaria y fosfato de potasio 0,01 M de pH 4,5 como fase mvil a un flujo de 2 mL/min. Posteriormente esta metodologa fue utilizada para la separacin de salsolinol y su regioismero isosalsolinol (Bates et al., 1986). Sin embargo, no se detallan en ese trabajo ni los tiempos de retencin de cada una de estas especies ni la resolucin lograda en la separacin de los regioismeros entre s y de su precursor dopamina. La falta de informacin sobre los tiempos de retencin del salsolinol e isosalsolinol y sobre la resolucin de estos analitos conseguida en el mtodo desarrollado por Bates hace difcil compararlo con la metodologa desarrollada en este trabajo. Sin embargo, el contrain octilsulfato, el menor flujo

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de la fase mvil (0,4 mL/min), el menor tamao de las partculas de la columna (5 m) y la mayor temperatura de la columna (30C) usados para la separacin de salsolinol e isosalsolinol en la metodologa de HPLC de pares inicos desarrollada en este trabajo, deberan traducirse en una mayor resolucin de los analitos antes mencionados si se compara con la metodologa reportada por Bates et al. (1981).

Segn los datos obtenidos de las curvas de calibracin, la concentracin de los analitos se relaciona en forma lineal con el rea bajo el pico correspondiente en el cromatograma al menos en los siguientes intervalos: 2,88 10-7 M a 5,75 10-6 M para el salsolinol, 2,50 10-8 M a 5,00 10-7 M para el isosalsolinol y 1,37 10-7 M a 2,74 10-6 M para la dopamina. Es posible que tanto para el salsolinol como la dopamina, la relacin se mantenga a concentraciones menores a las del lmite inferior del intervalo antes mencionado, puesto que las pendientes de las tres rectas que relacionan el rea del pico con la concentracin del analito dopamina, salsolinol o isosalsolinol- son muy similares (1235,4, 1074,1 y 1036,4, respectivamente), indicando que la sensibilidad4 para las tres sustancias es muy similar tambin. Por la misma razn, cabe esperar tambin que para el isosalsolinol la relacin entre el rea del pico y la concentracin se mantenga a concentraciones superiores a las observadas para la curva de calibracin y similares a las obtenidas para dopamina y salsolinol. Otro punto a considerar es el lmite de deteccin5 de la metodologa, el cual se refiere a la mnima concentracin de analito que puede ser medido con un cierto nivel de fiabilidad (Tth et al., 2004). En el caso de este trabajo, el lmite de deteccin se determin usando la seal de ruido presente en 40 cromatogramas correspondientes a las curvas de calibracin para dopamina, salsolinol e isosalsolinol. Considerando el promedio y la desviacin estndar de la seal de ruido (ver nota al pie) se determin que la mnima seal distinguible de la seal de ruido corresponde a 4,19 unidades de altura (mV). Usando las curvas de calibracin para cada sustancia, se calcul

Se entiende por sensibilidad de un mtodo para detectar un analito determinado como la capacidad de responder con un cambio en la seal entregada por el detector a un cambio en la concentracin del analito. Mientras mayor es la razn entre el cambio en la seal del detector y el cambio en la concentracin de la sustancia, mayor es la sensibilidad del mtodo para detectar dicho analito (Tth et al., 2004). 5 El lmite de deteccin (LOD) se calcula de acuerdo a la siguiente frmula: LOD = x + 3 x sd Donde x corresponde al promedio de la seal de ruido en el cromatograma y sd corresponde a la desviacin estndar de la seal de ruido (Tth et al, 2004; Skoog y Leary, 1994).

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que los lmites de deteccin en las condiciones usadas (potencial de oxidacin de 700 mV, sensibilidad de 20 nA) son de 1,86 10-8 M para el salsolinol, 2,14 10-8 M de isosalsolinol y 9,15 10-9 M de dopamina.

En resumen, se logr implementar un mtodo de HPLC de pares inicos capaz de separar dopamina, salsolinol e isosalsolinol con coeficientes de resolucin superiores a 1, permitiendo detectar todas estar sustancias en concentraciones del orden de 10-8 M, siendo el primer mtodo reportado en el que se describe detalladamente la separacin de salsolinol y su regioismero isosalsolinol.

Una de las futuras aplicaciones consideradas para la metodologa desarrollada en este trabajo es que permita la deteccin y cuantificacin de salsolinol e isosalsolinol en microdializados de cerebro de rata. En este sentido, se ha observado que los niveles de salsolinol en el NAc y el estriado de ratas se encuentran normalmente en el rango de 5,6 10-10 M a 2,3 10-9 M (Baum et al., 1999; Jamal et al., 2003a; Jamal et al., 2003b; Wang et al., 2007), mientras que el VTA de ratas las concentraciones basales de salsolinol son al menos 7 veces mayores que las reportadas en el NAc (DeCuypere et al., 2008). Por otra parte, los niveles de dopamina tanto en el NAc como en el VTA se encuentran en el rango de 20 a 40 nanomolar (Bergquist et al., 2002; Bustamante et al., 2008; DeCuypere et al., 2008). Aunque se desconoce cules son los niveles de isosalsolinol en cerebro, si su formacin slo se debiera a la reaccin no enzimtica de dopamina con acetaldehdo, cabra esperar que su concentracin en cerebro sea an menor que la observada para el salsolinol.

En el caso del HPLC de apareamiento inico acoplado a detector electroqumico, el lmite de deteccin de la metodologa est determinado por la sensibilidad del detector. A este respecto, en el detector amperomtrico empleado (BASi LC-4C) se pueden utilizar dieciocho sensibilidades distintas en el intervalo de 0,1 nA a 50 A.En este trabajo el detector amperomtrico se us con una sensibilidad de 20 nA y, bajo estas condiciones, se calcul que el lmite de deteccin para dopamina, salsolinol e isosalsolinol es de 1,86 10-8 M, 2,14 10-8 M y 9,15 10-9 M, respectivamente. Se puede observar que el lmite de deteccin de la dopamina es un poco inferior a la concentracin de dopamina en el NAc y en el VTA y, por lo tanto, este analito podra ser cuantificado en estas regiones del cerebro de rata usando una sensibilidad de 20 nA.

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Sin embargo, la concentracin de salsolinol en el NAc es al menos un orden de magnitud menor que el lmite de deteccin calculado a una sensibilidad del detector de 20 nA y la concentracin de salsolinol en el VTA podra ser muy cercana al lmite de deteccin. Por esta razn, para detectar salsolinol e isosalsolinol en microdializados de cerebro de rata es necesario aumentar la sensibilidad del detector electroqumico, lo que en trminos tericos para este equipo- podra aumentar los lmites de deteccin a 4,57 10-11 M, 1,15 10-10 M y 1,07 10-10 M para dopamina, salsolinol e isosalsolinol (ver pgina 72). Estos lmites de deteccin estaran muy por debajo de las concentraciones de dopamina y salsolinol en las regiones del cerebro mencionadas y, por lo tanto, permitiran su cuantificacin.

6.2 Confirmacin de la identidad de los picos que corresponden a salsolinol e isosalsolinol. Dada la ausencia de patrones de salsolinol e isosalsolinol, no se pudo determinar en forma directa la identidad de las dos sustancias separadas a partir de salsolinol comercial, SC1 y SC2, mediante HPLC de pares inicos.

Ante la posibilidad de que la metodologa desarrollada no fuera capaz de separar salsolinol de isosalsolinol y que uno de los picos observados, SC1 o SC2 correspondiera a otra sustancia oxidable presente como contaminante en el salsolinol comercial, se determin la masa molecular y el espectro de fragmentacin de cada una de estas sustancias mediante espectrometra de masas. En estos experimentos se observ, mediante el espectro de masas del ion precursor [M+H+], que SC1 y SC2 tienen ambos la misma masa molecular y sta masa corresponde al peso molecular del salsolinol y el isosalsolinol (179 g/mol).

Como ya se mencion, cabe esperar que para dos sustancias estructuralemente similares, como es el caso de los regioismeros salsolinol e isosalsolinol, el espectro de fragmentacin sea similar en cuanto a la relacin masa/carga de los fragmentos producidos. Lo anterior dado que la fragmentacin del ion precursor puede producirse en sitios anlogos generando algunos fragmentos que sern iguales para ambos compuestos y otros que sern distintos. Sin embargo,

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cabe esperar tambin que la abundancia relativa de los fragmentos observados para ambos compuestos sea diferente, puesto que la probabilidad de generar cada fragmento ser distinta para cada compuesto (Silverstein et al, 2005).

Otros autores han descrito iones de relacin masa/carga idntica a los aqu reportados para SC1 y SC2 como resultado de la fragmentacin del in precursor del salsolinol (m/z =180). En particular, Cai et al. (2008) observaron tambin los fragmentos de relacin masa/carga 163, 145 y 137 usando, igual que este trabajo, espectrometra de masas con ionizacin por electrospray con trampa inica. Por otro lado, Rojkovicova et al. (2008) encontraron todos los fragmentos aqu observados para SC1 y SC2: m/z 163, m/z 145, m/z 137 y m/z 117. Aunque la proporcin de cada fragmento es distinta entre los resultados obtenidos en este trabajo y los otros dos aqu citados, esto se debe principalmente a que las distintas condiciones de fragmentacin pueden dar origen a distintas cantidades de cada fragmento. Sin embargo, la coincidencia en los fragmentos encontrados refuerza la hiptesis de que SC1 y SC2 corresponden a salsolinol e isosalsolinol, puesto que el patrn de fragmentacin de las sustancias separadas es muy similar al patrn de fragmentacin del salsolinol reportado por otros autores.

Basados en los siguientes argumentos es posible afirmar que la primera sustancia separada a partir del salsolinol comercial, SC1, es salsolinol y que la segunda, SC2, es isosalsolinol: (a) se espera que la mayor disponibilidad de los grupos hidroxilo del salsolinol, con respecto a los del isosalsolinol, para interactuar con el solvente redunde en un menor tiempo de retencin para el salsolinol que para el isosalsolinol, tal como se ve para las sustancias SC1 (tr = 14,4 min aprox) y SC2 (tr = 26,1 min aprox.); (b) se observ que las reas de los picos SC1 y SC2 estn en la razn 11,5:1 lo cual se corresponde con el contenido aproximado de salsolinol (92%) e isosalsolinol (8%) encontrado en el salsolinol comercial mediante 1H-RMN (comunicacin personal, Dr. Bruce Cassels) y (c) ambas sustancias, SC1 y SC2, tienen un peso molecular de 179 g/mol coincidente con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol y sus espectros de fragmentacin son muy similares a otros reportados para el salsolinol. Sin embargo, la confirmacin de la identidad de estas sustancias slo puede hacerse mediante un mtodo como
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H-RMN, el cual distinguira las estructuras del salsolinol y el isosalsolinol por los distintos

desplazamientos qumicos y, especialmente, los patrones de acoplamiento de los protones unidos a los anillos aromticos de cada una de estas sustancias. Para esto se requieren varios milgramos

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de cada una de las sustancias SC1 y SC2, lo que hara necesario efectuar una sntesis a gran escala de los regioismeros y separarlos en una columna preparativa.

6.3 Estudio de la estabilidad de la dopamina en solucin Como ya se mencion, una de las potenciales aplicaciones de la metodologa desarrollada es la separacin de salsolinol e isosalsolinol preparados a partir de dopamina y acetaldehdo con el fin de poder administrar estos compuestos en forma pura.

En este contexto, es importante tener en cuenta que, en presencia de oxgeno, parte de la dopamina utilizada para formar salsolinol e isosalsolinol en realidad se consumir por autoxidacin para formar aminocromo. De esta manera, en presencia de oxgeno, no toda la dopamina usada para producir salsolinol e isosalsolinol est realmente disponible, puesto que la reaccin de formacin de salsolinol e isosalsolinol coexiste con la reaccin de autoxidacin de la dopamina.

Si bien no es el nico mecanismo de oxidacin de la dopamina, la autoxidacin de la dopamina ocurre tambin in vivo (Ochs et al, 2005) y coexiste con la oxidacin enzimtica por parte de la monoamino oxidasa (MAO) y su consumo no oxidativo por la catecol-O-metil transferasa (COMT). De esta manera, si se desea cuantificar la produccin enzimtica del salsolinol, se debe tener en cuenta que la desaparicin de dopamina se deber tambin a su catabolismo enzimtico (MAO y COMT) y no enzimtico (autoxidacin a aminocromo).

Por lo anterior, se decidi determinar la magnitud de la oxidacin de la dopamina en condiciones que favorezcan la sntesis de salsolinol e isosalsolinol (tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 y temperatura ambiente) y en condiciones similares a las fisiolgicas (tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 y 37C). El pH se escogi por dos razones: a) la regioselectividad de la reaccin de dopamina con acetaldehdo depende del pH y a pH 7 se forma aproximadamente un 50% de cada regioismero (Bates et al., 1986) y b) el pH 7,4 es considerado el pH fisiolgico y por lo tanto sirve para emular condiciones fisiolgicas. Adems

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el tampn de fosfato 0,1 M tiene una osmolaridad de 280 mOsm, que se asemeja bastante a la osmolalidad fisiolgica (300 mOsm).

Para determinar la magnitud de la oxidacin de la dopamina hay dos posibles aproximaciones experimentales: a) determinar la desaparicin de dopamina en el tiempo o b) determinar la aparicin del producto de oxidacin aminocromo en el tiempo. Se escogi determinar la magnitud de la oxidacin de dopamina en el tiempo mediante la desaparicin de dopamina, puesto que la reaccin de oxidacin de dopamina a aminocromo tiene tres intermediarios (dopamina semiquinona, dopamina quinona y leucoaminocromo) (Ochs et al., 2005) y, por lo tanto, la medicin de la aparicin de aminocromo en el tiempo subestima la cantidad de dopamina oxidada, puesto que parte de sta se encontrar en la forma de alguno de los intermediarios de la reaccin.

Se observ que la concentracin de dopamina, tanto a temperatura ambiente como a 37C, disminuye en forma lineal conforme transcurre el tiempo. La disminucin a velocidad constante de la concentracin de dopamina podra indicar que se trata de una reaccin de orden cero o de una reaccin que, en las condiciones de experimentacin, se comporta como una reaccin de orden cero (pseudo orden cero). Dado que la oxidacin de dopamina es una reaccin bimolecular entre la dopamina y el oxgeno, cabra esperar que la velocidad de desaparicin de la dopamina dependa tanto de la concentracin de dopamina como de la concentracin de oxgeno en la solucin y, por lo tanto, se trate de una reaccin de orden dos (v = [DA][O2]). Sin embargo y como ya se mencion, en las condiciones de experimentacin, la velocidad de oxidacin de la dopamina no depende ni de la concentracin de oxgeno ni de la concentracin de dopamina en la solucin.

La independencia de la velocidad de oxidacin de la concentracin de oxgeno se puede explicar porque, en las condiciones del ensayo, la concentracin de dopamina (3,43 10-6 M) es mucho menor que la concentracin de oxgeno en la solucin (en el orden de 10-4 M, dependiendo de la temperatura y la presin atmosfrica) (U.S. Geological Service, 2006) y, por esta razn, la concentracin de oxgeno casi no vara en el transcurso de la reaccin. Por otra parte, la independencia de la velocidad de oxidacin de la concentracin de dopamina podra explicarse por la catlisis de la reaccin por parte de metales presentes en el tampn fosfato de

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sodio (como el hierro) pues, como ya se coment anteriormente, las sales de sodio usadas en su preparacin contienen estos elementos como contaminantes. En relacin a lo anterior, se ha visto que la oxidacin de dopamina a dopamina quinona, la primera etapa de la oxidacin a aminocromo, es catalizada por metales como el hierro, cobre y manganeso, aparentemente por la formacin de un complejo entre el metal y la dopamina (Florence y Stauber, 1989). De ser as, la velocidad de oxidacin de la dopamina sera constante (orden cero) mientras la formacin del complejo dopamina-metal estuviera limitada por la concentracin del metal en la solucin. En este sentido, la catlisis por metales es anloga a la catlisis enzimtica en la que, al encontrarse la enzima saturada con el sustrato, la velocidad de la reaccin se mantiene constante en un mximo (Vmax). Si bien la presencia de metales en el tampn fosfato podra explicar que la velocidad de oxidacin de la dopamina sea constante, no hay que perder de vista que los metales como el hierro catalizan la reaccin de oxidacin, acelerndola unas 16 veces (Florence y Stauber, 1989), pero no son necesarios para que la reaccin ocurra, por lo que la oxidacin en las condiciones de experimentacin es en realidad un proceso ms complejo en el que parte de la reaccin es catalizada por metales, mientras que otra parte ocurre a una velocidad mucho ms lenta en ausencia del catalizador.

En resumen, en las condiciones de experimentacin, la dopamina se oxida a velocidad constante tanto a temperatura ambiente como a 37C y la independencia de la velocidad de reaccin de la concentracin de oxgeno (datos no presentados) y de dopamina en la solucin se puede explicar por a) la alta concentracin de oxgeno en la solucin con respecto a la concentracin de dopamina utilizada y b) la catlisis de la reaccin por parte de metales presentes como contaminantes en el medio de reaccin.

Si se quiere minimizar la oxidacin de la dopamina, hay al menos cuatro factores que se pueden manejar: a) la temperatura de reaccin, b) el pH de de la reaccin, c) la concentracin de dopamina en la solucin y d) la presencia de oxgeno.

En relacin a la temperatura, cabe notar que la velocidad de oxidacin de la dopamina aumenta 4,6 veces al aumentar la temperatura de 20C (temperatura ambiente) a 37C, como se puede inferir de las respectivas constantes de velocidad (0,018 10-7 M/min y 0,083 10-7 M/min). De hecho, usando una concentracin inicial de dopamina de 3,43 10-6 M, la concentracin de

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dopamina disminuye a la mitad a las 3,7 horas de reaccin a 37C, mientras que a 20C esto slo sucede al cabo de 16,4 horas. Desde esta perspectiva, la disminucin de la temperatura puede ser til para minimizar la oxidacin de dopamina al almacenarla y para la sntesis no enzimtica de salsolinol e isosalsolinol, donde no se ha planteado la necesidad de una temperatura especfica para llevar a cabo la reaccin ni se ha estudiado su cintica en funcin de la temperatura.

Con respecto al pH del medio de reaccin, cabe mencionar que la reaccin de oxidacin de la dopamina es menor a pH cido. Esto se debe a que la dopamina para oxidarse debe perder los dos protones de sus grupos hidroxilo, prdida que est desfavorecida a pH cido, puesto que hay una gran abundancia de protones en el medio. Para la sntesis de salsolinol e isosalsolinol, ya sea enzimtica o no enzimtica, la disminucin del pH no es una buena opcin para controlar la oxidacin de dopamina. En el caso de la sntesis enzimtica esto sera porque el pH cido puede hacer disminuir la actividad a la enzima (por alejamiento de su pH ptimo o por su denaturacin). Por otra parte, en el caso de la sntesis no enzimtica de salsolinol, a pH cido la reaccin de dopamina con acetaldehdo es lenta y forma exclusivamente salsolinol (Bates et al, 1986) y, por lo tanto, no permite la sntesis del regioismero isosalsolinol. Nuevamente, la utilidad del uso de pH cido se reserva para el almacenamiento de dopamina o, eventualmente, si se quiere dirigir la reaccin de dopamina con acetaldehdo exclusivamente hacia la sntesis de salsolinol.

En todos los casos en los que se quiera minimizar el porcentaje de dopamina perdida por oxidacin, conviene utilizar concentraciones de dopamina tan altas como sea posible, pues al oxidarse a velocidad constante (reaccin de orden cero), se perder proporcionalmente menos dopamina mientras mayor sea su concentracin inicial en solucin.

La nica manera de evitar completamente la oxidacin de la dopamina es llevando a cabo la reaccin en un medio sin oxgeno. Esto podra ser til tanto en la sntesis enzimtica como no enzimtica de salsolinol e isosalsolinol y puede conseguirse purgando las soluciones con un gas inerte, como el nitrgeno.

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En conclusin, la dopamina se oxida a velocidad constante independientemente de la concentracin de dopamina en la solucin y esta oxidacin es 4,6 veces ms rpida a 37C que a temperatura ambiente.

6.4 Estudio de la estabilidad del salsolinol e isosalsolinol en solucin En el contexto de la sntesis enzimtica y no enzimtica- de salsolinol e isosalsolinol, es importante tener en consideracin que estas sustancias pueden no ser estables en presencia de oxgeno. Esto se debe a que el salsolinol y el isosalsolinol son tetrahidroisoquinolinas que poseen un ncleo cateclico (1,2-hidroquinonas) y, por lo tanto, podran oxidarse en presencia de oxgeno a las quinonas respectivas. Se sabe que el salsolinol se puede oxidar en presencia de oxgeno para formar la orto-quinona respectiva y, a partir de ella, se pueden producir otros productos por tautomerizacin (trihidrooxoisoquinolina) u oxidacin (isoquinolinadiol y tetrahidroisoquinolinatriol) (Fa and Dryhurst, 1991). Si bien no hay antecedentes bibliogrficos que den cuenta de la oxidacin del isosalsolinol, cabe esperar que, dada la estrecha similitud estructural entre ambos, el isosalsolinol se oxide al menos para formar tambin una ortoquinona.

Por lo anterior, se decidi determinar la estabilidad del salsolinol y el isosalsolinol en condiciones que favorezcan su sntesis (tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 y temperatura ambiente) y en condiciones similares a las fisiolgicas (tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 y 37C). La posible oxidacin del salsolinol y el isosalsolinol se determin cuantificando la desaparicin de estas sustancias en el tiempo, suponiendo que las sustancias separadas mediante HPLC de pares inicos a partir del salsolinol y designadas como SC1 y SC2, corresponden efectivamente a salsolinol e isosalsolinol.

Tanto para el salsolinol como el isosalsolinol, se observ que la disminucin de su concentracin, a temperatura ambiente y a 37C, conforme transcurre el tiempo se puede ajustar a una ecuacin exponencial. Este comportamiento podra indicar que se trata de reacciones de orden uno, donde la velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de una de las sustancias reaccionantes, o que, en las condiciones de experimentacin, la oxidacin

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de salsolinol e isosalsolinol se comportan como reacciones de orden uno (pseudo orden uno). Sin embargo, para el salsolinol, la disminucin de la concentracin en el tiempo puede ajustarse tambin a una recta, por lo que los resultados aqu obtenidos no son concluyentes con respecto a la cintica de la oxidacin de este compuesto.

Dado que la oxidacin del salsolinol y del isosalsolinol son reacciones bimoleculares entre estos compuestos y el oxgeno, cabe esperar que su velocidad de oxidacin dependa tanto de la concentracin de salsolinol (o isosalsolinol) como de la concentracin de oxgeno en la solucin y, por lo tanto, se trate de una reaccin de orden dos (v = [Sal][O2] o v = [Isal][O2]). Sin embargo, en las condiciones de experimentacin, las concentraciones de salsolinol e isosalsolinol disminuyen en forma exponencial conforme transcurre el tiempo y, por lo tanto, la velocidad de oxidacin de estas sustancias parece depender de su concentracin en la solucin y no de la concentracin de oxgeno.

La independencia de la velocidad de oxidacin de la concentracin de oxgeno se puede explicar porque, en las condiciones del ensayo, la concentracin de salsolinol (2,88 10-6 M) o de isosalsolinol (1,00 10-5 M) es mucho menor que la concentracin de oxgeno en la solucin (en el orden de 10-4 M, dependiendo de la temperatura y la presin atmosfrica) (U.S. Geological Service, 2006) y, por esta razn, la concentracin de oxgeno casi no vara en el transcurso de la reaccin.

La oxidacin del salsolinol y del isosalsolinol se puede minimizar manejando los mismos cuatro factores mencionados para la dopamina: a) la temperatura de reaccin, b) el pH de la reaccin, c) la concentracin de la sustancia en la solucin y d) la presencia de oxgeno.

En relacin a la temperatura, cabe notar que la velocidad de oxidacin del salsolinol y el isosalsolinol aumentan al aumentar la temperatura de 20C (temperatura ambiente) a 37C. Para el salsolinol, como se puede inferir de las respectivas constantes de velocidad (0,0007 min-1 a 20C y 0,0027 min-1 a 37C), la velocidad de oxidacin aumenta 3,9 veces al aumentar la temperatura de 20C a 37C. Por otra parte, para el isosalsolinol, el aumento en la velocidad es muy similar (3,8 veces), como se infiere de las respectivas constantes de velocidad (0,0072 min-1 a 20C y 0,0273 min-1 a 37C). Desde esta perspectiva, la disminucin de la temperatura puede

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ser til para minimizar la oxidacin de ambos compuestos: salsolinol e isosalsolinol. Esta estrategia podra usarse no slo para el almacenamiento, sino tambin para la sntesis no enzimtica de salsolinol e isosalsolinol, si la temperatura no fuera crucial para llevar a cabo la reaccin.

Con respecto al pH del medio de reaccin, nuevamente se espera que la formacin de quinonas, a partir del grupo catecol del salsolinol o el isosalsolinol, est desfavorecida a pH cido y, por lo tanto, se prevenga la oxidacin de estos compuestos. Al igual que para la dopamina, la utilidad del uso de pH cido se reserva para el almacenamiento de salsolinol e isosalsolinol.

En el caso del salsolinol y el isosalsolinol, el porcentaje oxidado ser constante independiente de la concentracin inicial de estas sustancia en la solucin. Esto pues, en una reaccin de orden uno, la cantidad remanente del reactante depende exclusivamente del tiempo de reaccin6. Como ya se mencion, la nica manera de evitar completamente la oxidacin es llevando a cabo la reaccin en un medio sin oxgeno.

Cabe destacar, adems, que la velocidad de oxidacin del isosalsolinol es aproximadamente 10 veces mayor que del salsolinol tanto a 20C (0,0072 min-1 para el isosalsolinol y 0,0007 min-1 para el salsolinol) como a 37C (0,0273 min-1 para el isosalsolinol y 0,0027 min-1 para el salsolinol), indicando una mayor estabilidad de este ltimo compuesto. Esto se traduce en que el isosalsolinol tiene una vida media muy corta si se compara con el salsolinol (1,6 horas versus 16,5 horas a 20C y 0,4 horas versus 4,3 horas a 37C).

Es difcil explicar la gran diferencia en la susceptibilidad a ser oxidado entre el salsolinol y el isosalsolinol considerando que tienen una gran similitud estructural y slo difieren en la posicin de uno de los grupos hidroxilo. Sin embargo, esta diferencia en estabilidad ya ha sido observada para los productos de condensacin de la adrenalina con formaldehdo o acetaldehdo, donde los productos de condensacin anlogos al salsolinol (ciclacin hacia la posicin para con respecto
En una reaccin de orden uno: Ln ([A]/[A]o) = -kt Donde [A] corresponde a la concentracin del reactante A, [A]o a la concentracin inicial del reactante A, k a la constante de velocidad de la reaccin y t al tiempo de reaccin.
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al grupo hidroxilo activante) son ms estables que los productos de condensacin anlogos al isosalsolinol (ciclacin hacia la posicin orto con respecto al grupo hidroxilo activante) (Bates et al., 1981). Independientemente de la causa, es importante tener en consideracin la mayor velocidad de oxidacin del salsolinol con respecto al isosalsolinol. Esta diferencia en las velocidades de oxidacin dificulta la comparacin de las cantidades de salsolinol e isosalsolinol producidas, enzimtica o no enzimticamente, in vivo o in vitro, puesto que adems de la velocidad de sntesis habr que considerar que la velocidad de oxidacin es diferente para ambos compuestos.

6.5 Separacin de los enantimeros R y S del salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC de reparto en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina La separacin de enantimeros se puede llevar a cabo principalmente de dos formas: a) mediante la formacin de diasteroismeros por derivatizacin de los enantimeros mediante la reaccin con otro compuesto quiral o b) mediante el uso de un selector quiral capaz de interactuar en forma diferencial con cada enantimero.

La formacin de diasteroismeros ha sido utilizada para la separacin de R y S salsolinol (Strolin-Benedetti et al., 1989a; Strolin-Benedetti et al, 1989b; Pianezzola et al., 1989; Haber et al., 1995; Musshoff et al., 2000). Presenta la ventaja de que permite la separacin de ismeros pticos mediante mtodos convencionales, como por ejemplo la HPLC de fase inversa en columna de gel de slice-C18. Sin embargo, tiene como desventajas que requiere un paso de derivatizacin con otro compuesto quiral para lograr la separacin, reaccin que puede no ocurrir con un 100% de rendimiento, perdindose parte del enantimero reactante (StrolinBenedetti et al., 1989a; Pianezzola et al., 1989). Adems, el producto separado no corresponde a los esteroismeros originales sino a los diasteroismeros derivados de ellos y, por lo tanto, si se requiere recuperar el producto original, es necesaria una nueva reaccin qumica si la primera no es espontneamente reversible. Tanto por la mayor complejidad, como por el bajo rendimiento de la reaccin de derivatizacin y la prdida del compuesto original por la derivatizacin, en este trabajo se prefiri usar un mtodo de separacin que usara un selector quiral.

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Los selectores quirales son sustancias capaces de interactuar diferencialmente con los enantimeros de un compuesto con un centro quiral. Esta propiedad se debe a que son sustancias que tambin poseen un centro quiral y, si bien no reaccionan con los enantimeros a separar para formar diasteroismeros covalentes, al interactuar con ellos forman complejos que poseen al menos dos centros quirales cuya estabilidad es distinta para cada enantimero.

Los mtodos que usan un selector quiral han sido ampliamente utilizados para la separacin de R y S salsolinol (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Liu et al., 2000; Quan et al., 2005; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008; Cai et al., 2008). A excepcin del mtodo desarrollado por Liu et al. (2000) que usa cromatografa de gases (GC) y el de Quan et al. (2005) que usa electroforesis capilar, todos ellos utilizan la HPLC. La HPLC fue escogida en este trabajo porque tiene la ventaja de que, adems de permitir la separacin de compuestos no voltiles, es una tcnica muy verstil y altamente resolutiva y es comparativamente de bajo costo en relacin a otras metodologas de separacin.

La -ciclodextrina es uno de los selectores quirales ms utilizados para la separacin de enantimeros y ha sido utilizada en HPLC como mtodo de separacin de los enantimeros R y S del salsolinol como parte de la fase estacionaria (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al.,1995; Naoi et al., 1996; Rojkovicova et al., 2008; Cai et al., 2008) o como aditivo en la fase mvil (Deng et al., 1997). La eleccin de la -ciclodextrina en este trabajo se debe a su probada eficacia en la separacin de R y S salsolinol, siendo el selector quiral con el que se ha obtenido una mejor resolucin de estos enantimeros en HPLC (Rojkovicova et al., 2008). Se prefiri usarla como parte de la fase estacionaria puesto que permite recuperar los enantimeros en forma pura en vez de formando parte de un complejo de inclusin.

Se observ que la metodologa de HPLC de fase inversa en columna de gel de slice-ciclodextrina implementada es capaz de separar dos sustancias (coeficiente de resolucin = 1,98) a partir de la sustancia cuya identidad se asume corresponde a salsolinol (SC1): una con un tiempo de retencin promedio de 26,906 0,591 min (n = 18) y otra con un tiempo de retencin promedio de 29,925 0,713 min (n = 18). Estas sustancias podran corresponder a S y R salsolinol, respectivamente, puesto que, al usar estndares de R y S salsolinol sintetizados en forma enantioespecfica, en todas las metodologas de HPLC de fase inversa en columnas de -

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ciclodextrina reportadas el (S)-salsolinol tiene un tiempo de retencin menor que el (R)salsolinol (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008; Cai et al., 2008). Adems Liu et al. (2000) separaron, mediante el mtodo reportado por Baum et al. (1994) que utiliza HPLC de fase inversa en una columa de gel de slice--ciclodextrina, los enantimeros R y S del salsolinol y confirmaron, mediante polarimetra, las propiedades quirpticas de estos compuestos. Por otra parte, Huang et al. (2009), confirmaron mediante modelamiento computacional que el complejo de inclusin formado entre el (S)-salsolinol y la -ciclodextrina es menos estable que el formado por el (R)salsolinol. Si bien la confirmacin de la actividad ptica de las sustancias separadas slo puede hacerse por polarimetra u otro mtodo quirptico, todos estos antecedentes apoyan fuertemente la hiptesis de que el primer compuesto separado a partir de salsolinol (tr promedio = 26,906 min) corresponde a (S)-salsolinol, mientras que el segundo (tr promedio = 29,925 min) corresponde a (R)-salsolinol.

Adems, la metodologa implementada es capaz de separar dopamina (tr promedio = 22,954 0,632 min (n = 18)) tanto del (R) como del (S)-salsolinol, con coeficientes de resolucin de 5,30 y 3,14, respectivamente (ver Figura 17). Esto es importante, puesto que la mayora de las metodologas de HPLC en fase inversa con columna de gel de slice--ciclodextrina desarrolladas hasta ahora o no separan (Deng et al., 1995; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008) o no intentan separar (Naoi et al., 1996; Cai et al., 2008) dopamina de (S)-salsolinol.

Cabe destacar que los picos cromatogrficos observados para la dopamina, el (S)-salsolinol y el (R)-salsolinol (Figura 17) no son picos simtricos, sino que se observa tambin un fenmeno de tailing. Daso que este fenmeno se repite en la metodologa de HPLC de apareamiento inico, lo ms probable es que se deba al uso de conexiones tan largas en el sistema de HPLC. Nuevamente, a pesar de que el coeficiente de resolucin para la dopamina y el (S)-salsolinol es 3,14, es evidente (Figura 17) que existe un cierto grado de superposicin de los picos. De esta manera, aunque en las condiciones de este trabajo se logr separar dopamina, (S)-salsolinol y (R)-salsolinol, los coeficientes de resolucin calculados no son un reflejo de la eficacia de esa separacin.

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Otro punto a considerar, es que la metodologa implementada es capaz de detectar dos sustancias a partir de la sustancia cuya identidad se supone corresponde a isosalsolinol (SC2): una con un tiempo de retencin promedio de 31,304 0,192 min (n = 3) y otra con un tiempo de retencin promedio de 32,979 0,510 min (n = 10). Estas sustancias podran corresponder a R y S isosalsolinol, sin embargo no son eficientemente separadas por las condiciones utilizadas en este trabajo y los resultados obtenidos no permiten la cuantificacin de estas especies ni su aislamiento a partir de una muestra. No obstante, la deteccin de estas especies es importante puesto que no existen antecedentes en la literatura de la separacin de los enantimeros R y S del isosalsolinol y esta podra ser una primera aproximacin para poder separarlos en el futuro. Entre las modificaciones que se podran hacer para mejorar la separacin de los cuatro esteroismeros -(R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol- se encuentran la disminucin de la cantidad de modificador orgnico o el aumento del pH de la fase mvil. Ambos factores que se han probado pueden contribuir a optimizar la separacin entre R y S salsolinol (Deng et al., 1995).

Nuevamente, tanto el cido perclrico (PCA) como el tampn de fosfato de sodio, utilizados para disolver la dopamina y el salsolinol comercial, contienen sustancias oxidables que, esta vez, eluyen formando tres y dos picos distinguibles en el cromatograma, para el cido perclrico y el tampn de fosfato de sodio, respectivamente. Una vez ms, la impureza de los reactivos utilizados podra dar cuenta de la aparicin de estos picos.

Por otra parte, segn los datos obtenidos de las curvas de calibracin, la concentracin de los analitos se relaciona en forma lineal con el rea bajo el pico correspondiente en el cromatograma al menos en los siguientes rangos: 1,44 10-7 M a 2,88 10-6 M para el R y S salsolinol y 1,37 10-7 M a 1,37 10-6 M para la dopamina. Con respecto al lmite de deteccin de la metodologa (ver pgina 56), se determin mediante el anlisis de la seal de ruido de 35 cromatogramas correspondientes a las curva de calibracin de dopamina, (R)-salsolinol y (S)-salsolinol que la mnima seal distinguible del ruido corresponde a 3,87 unidades de altura (mV). Usando las curvas de calibracin para cada sustancia, se calcul que los lmites de deteccin en las condiciones usadas (potencial de oxidacin de 700 mV, sensibilidad de 20 nA) son de 1,06 108

M para el (R)-salsolinol, 9,48 10-9 M para (S)-salsolinol y 5,91 10-9 M para la dopamina.

Como no se logr separar R y S isosalsolinol, no se hicieron curvas de calibracin para estos

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compuestos. Cabe destacar que la sensibilidad del detector electroqumico para los analitos dopamina, (R)-salsolinol y (S)-salsolinol es muy similar, puesto que las pendientes de las tres rectas que relacionan el rea del pico con la concentracin del analito son muy similares (2537, 2529,4 y 2390, respectivamente).

En resumen, se logr implementar un mtodo de HPLC de fase inversa en columna de gel de slice--ciclodextrina capaz de separar dopamina, (R)-salsolinol y (S)-salsolinol con coeficientes de resolucin superiores a 1, permitiendo detectar y cuantificar todas estar sustancias en concentraciones sobre 10-8 M. Adems, es la primera metodologa que reporta adems la deteccin del regioismero isosalsolinol, si bien no permite la separacin de los enantimeros.

Una de las futuras aplicaciones consideradas para la metodologa de HPLC de fase inversa en columna de gel de slice--ciclodextrina es que permita la deteccin y cuantificacin de los enantimeros R y S del salsolinol en microdializados de cerebro de rata. En este sentido y como ya se mencion, los niveles de salsolinol en el NAc y el estriado de ratas se encuentran normalmente en el rango de 5,6 10-10 M a 2,3 10-9 M (Baum et al., 1999; Jamal et al., 2003a; Jamal et al., 2003b; Wang et al., 2007), mientras que el VTA de ratas las concentraciones basales de salsolinol son al menos 7 veces mayores que las reportadas en el NAc (DeCuypere et al., 2008). Por otra parte, los niveles de dopamina tanto en el NAc como en el VTA se encuentran en el rango de 20 a 40 nanomolar (Bergquist et al., 2002; Bustamante et al., 2008; DeCuypere et al., 2008).

Al igual que en la HPLC de pares inicos, el lmite de deteccin de la metodologa de HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina acoplada a deteccin electroqumica est determinado por la sensibilidad del detector. Tambin en este caso el detector amperomtrico se us con una sensibilidad de 20 nA y, bajo estas condiciones, se calcul que el lmite de deteccin para dopamina, (R)-salsolinol y (S)-salsolinol es de 5,91 10-9 M , 1,06 10-8 M y 9,48 10-9 M, respectivamente. Se puede observar que el lmite de deteccin de la dopamina es inferior a la concentracin de dopamina en el NAc y en el VTA y, por lo tanto, este analito podra ser cuantificado en estas regiones del cerebro de rata usando una sensibilidad de 20 nA. Sin embargo, la concentracin de salsolinol en el NAc es al menos un orden de magnitud menor que el lmite de deteccin calculado a una sensibilidad del detector de 20 nA y la concentracin

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de salsolinol en el VTA podra ser muy cercana al lmite de deteccin. Por esta razn, para detectar R y S salsolinol en microdializados de cerebro de rata es necesario aumentar la sensibilidad del detector electroqumico, lo que en trminos tericos para este equipo- podra aumentar los lmites de deteccin a 2,95 10-11 M, 5,29 10-11 M y 4,74 10-11 M para dopamina, (R)-salsolinol y (S)-salsolinol (ver pgina 58). Estos lmites de deteccin estaran muy por debajo de las concentraciones de dopamina, (R)-salsolinol y (S)-salsolinol en las regiones del cerebro mencionadas y, por lo tanto, permitiran su cuantificacin.

6.6 Proyecciones

6.6.1 Purificacin de la enzima (R)-salsolinol sintasa Tanto en humanos como en ratas, se ha visto que el (R)-salsolinol predomina sobre la forma S en la mayora de las reas del cerebro estudiadas y, en particular, en aquellas que se relacionan con los efectos reforzantes del etanol (VTA y NAc) (Musshoff et al, 2000; DeCuypere et al, 2008; Rojkovicova et al, 2008). Se cree que esta diferencia se debe a que la sntesis de (R)salsolinol se produce adems en forma enzimtica y de hecho Naoi et al. (1996) aislaron una enzima llamada R-salsolinol sintasa que cataliza la sntesis especfica de (R)-salsolinol a partir de dopamina y acetaldehdo. Sin embargo, Naoi et al. (1996) slo caracterizaron esta enzima en trminos de su peso molecular (aproximadamente 34 kD). Por lo anterior, sera interesante purificar la enzima a partir de extractos de cerebro, utilizando la metodologa de HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina para detectar el (R)-salsolinol formado, con el fin de secuenciarla e identificar el gen que la codifica. Si se logran estos objetivos y si, efectivamente, el (R)-salsolinol es responsable de parte de los efectos reforzantes del etanol, podran desarrollarse con miras hacia un tratamiento para el alcoholismo- estrategias experimentales que permitieran inhibir la expresin y/o actividad de esta enzima para as disminuir los efectos reforzantes producidos por el etanol en el sistema nervioso central.

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6.6.2 Sntesis de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol Producto de la reaccin de dopamina con acetaldehdo, se forman en distinta proporcin y segn las condiciones de reaccin- (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolnol y (S)isosalsolinol (King et al, 1974; Bates et al, 1986). La sntesis especfica de uno de estos productos es difcil de conseguir e implica utilizar condiciones distintas para cada sntesis y reactivos que fuercen la reaccin para formar un regioismero y un enantimero en forma especfica.

Desde esta perspectiva, es mucho ms sencillo llevar a cabo la reaccin en condiciones en las que se producen los cuatro compuestos y luego separarlos utilizando las metodologas implementadas en este trabajo. La metodologa de HPLC de pares inicos permitira la separacin de salsolinol e isosalsolinol, mientras que la metodologa de HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina permitira la separacin de los enantimeros R y S del salsolinol y, si se optimizan las condiciones de separacin, de los enantimeros R y S del isosalsolinol.

6.6.3 Administracin intrategmental de (R)-salsolinol y (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)isosalsolinol Los efectos reforzantes producidos por la administracin (y la autoadministracin) de salsolinol en el VTA se han estudiado usando el salsolinol comercialmente disponible (Sigma), el cual contiene tanto salsolinol como isosalsolinol (y sus respectivos enantimeros R y S) (comunicacin personal Dr.Bruce Cassels). Por lo anterior, es imposible asegurar cual(es) de estos cuatro ismeros ((R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-salsolinol) genera(n) los efectos reforzantes observados o si ms de alguno de ellos es capaz de generarlos. Por esta razn, sera interesante estudiar los efectos de la administracin en forma independiente cada uno de estos ismeros en el sistema nervioso central y la participacin que cada uno de ellos tiene en los efectos reforzantes del etanol.

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6.6.4 Formacin de isosalsolinol in vivo Como ya se mencion en la introduccin, en la reaccin no enzimtica de condensacin de dopamina con acetaldehdo se forma salsolinol y, en menor proporcin, su regioismero isosalsolinol (King et al., 1974; Bates et al., 1986). Aunque no ha sido reportado, el isosalsolinol podra formarse tambin in vivo. Dado que los estudios de las propiedades reforzantes del salsolinol se han llevado a cabo usando el salsolinol disponible comercialmente (Sigma) y que ste contiene al menos un 8% de isosalsolinol, es posible que el isosalsolinol sea responsable de parte de los efectos reforzantes atribuidos al salsolinol.

Desde esta perspectiva, sera interesante utilizar la metodologa de HPLC de pares inicos desarrollada en este trabajo para estudiar la formacin de isosalsolinol en diferentes reas del cerebro relacionadas con los efectos reforzantes del etanol, como lo son el VTA y el NAc, y las posibles acciones reforzantes que podra tener este producto de la condensacin de dopamina con acetaldehdo. De encontrarse que el isosalsolinol tambin tiene efectos en el sistema nervioso central, sera interesante estudiar si es que alguna de sus formas R o S tiene un mayor efecto, para lo cual sera necesario optimizar la separacin de estos enantimeros mediante HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina.

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7. CONCLUSIONES Se desarroll una metodologa de HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica capaz de separar dos sustancias oxidables a partir del salsolinol comercial (coeficiente de resolucin 10,74) y a stas de la dopamina (coeficientes de resolucin 1,78 y 14,02). (ii) Los resultados obtenidos en esta tesis con respecto a la masa de los compuestos separados a partir de salsolinol comercial por HPLC de pares inicos y con respecto a la proporcin en la que se encuentran en el salsolinol comercial, indican que estas sustancias corresponden a salsolinol e isosalsolinol. (iii) La metodologa de HPLC en columna de gel de slice--ciclodextrina implementada permite la separacin de los enantimeros (R)-salsolinol y (S)-salsolinol (coeficiente de resolucin 1,98) y a stos de su precursor dopamina (coeficientes de resolucin 5,30 y 3,14, respectivamente). (iv) Usando una sensibilidad de 20 nA para el detector electroqumico, los lmites de deteccin de ambas metodologas (en el orden de 10-8 M) podran permitir la deteccin de los niveles normalmente producidos de los enantimeros R y S del salsolinol en el VTA. El uso de la mayor sensibilidad permitida por el detector electroqumico (0,1 nA) podra permitir la deteccin de dopamina, salsolinol e isosalsolinol en concentraciones incluso en el orden de 10-11 M. (v) El uso de estas metodologas, adaptadas a escala preparativa, permite sintetizar (R)salsolinol y (S)-salsolinol a partir de la reaccin de dopamina con acetaldehdo y luego separarlos entre s, de su regioismero isosalsolinol y de su precursor dopamina, con el fin de contar con los enantimeros en forma pura para su posterior administracin. (vi) La aplicacin de estas metodologas podra permitir la cuantificacin de dopamina, isosalsolinol y los enantimeros R y S del salsolinol en muestras de origen biolgico.

(i)

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