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DETERMINACIN DE PARMETROS CINTICOS DURANTE LA NITRIFICACIN MEDIANTE ENSAYOS DE RESPIROMETRA Y TITULACIN

Gustavo Ciudad Universidad de la Frontera Arne Werner Universidad Tcnica de Berlin *Cristian Bornhardt Universidad de la Frontera, Temuco / Chile; Ingeniero Civil Qumico de la Universidad de Concepcin / Chile; Magister en Ciencias de la Ingeniera, mencin Ingeniera Qumica de la Universidad de Concepcin; Doctorado en Ingeniera de la Universidad Tcnica de Berlin / Alemania. Profesor Titular para ctedras de Ingeniera Ambiental y Director de la Carrera de Ingeniera Ambiental. Investigacin y asesora tcnica en gestin de RILes y Produccin Limpia. Carlos Muoz Universidad de la Frontera Christian Antileo Universidad de la Frontera Direccin postal del autor principal (*): Universidad de La Frontera, Dpto. Ingeniera Qumica, Av. Francisco Salazar 01145, Casilla 54-D, Temuco, Chile Telfono: 56-45-325474 56-45-325472 Fax: 56-45-325053 e-mail: cbor@ufro.cl RESUMEN En el diseo de tratamientos biolgicos es de vital importancia el conocimiento de la cintica de los microorganismos involucrados. Uno de los mayores inconvenientes del clculo de constantes cinticas en el proceso de nitrificacin, es la diferenciacin cintica de las dos poblaciones microbianas que participan: amonio oxidantes (AO) y nitrito oxidantes (NO), que se diferencian en su afinidad por el oxgeno, y en que los AO liberan protones. Para ello se determin parmetros cinticos mediante ensayos cortos de respirometra y titulometra en un reactor batch. Para los microorganismos AO se encontr que la constante de saturacin de oxgeno (KAO), fue de 0,99 mg . O2/L y la constante de saturacin por sustrato (KsAO) fue de 0,28 mg N-NH4/L Para los microorganismos NO la constante de saturacin de oxgeno (KNO) fue de 1,4 mg O2/L y la -4 constante de saturacin de sustrato (KsNO) tuvo un valor de 2,15x10 mg HNO2/L. Por lo tanto, mediante respirometra, y utilizando las diferencias de afinidad por oxgeno de los microorganismos AO y NO, fue posible determinar K, rmx y KsNO para ambos microorganismos por separado, mientras que el clculo de KsAO se realiz por titulometra. Se concluye que la aplicacin conjunta de respirometra y titulacin es una potente herramienta para el clculo de constantes cinticas en la nitrificacin. Palabras Claves: respirometra, cintica microbiana, nitrificacin, titulacin.

INTRODUCCIN Para disear tratamientos biolgicos es de vital importancia conocer el comportamiento de los microorganismos, es decir, su cintica. En contraste con las tcnicas clsicas, uno de los mtodos ms rpidos y sencillos para el clculo de parmetros cinticos, son los ensayos respiromtricos. Este mtodo mide e interpreta la tasa de respiracin de los microorganismos, la cual refleja dos de los ms importantes procesos bioqumicos que ocurren en las plantas de tratamiento: el crecimiento de la biomasa y el consumo de sustrato (Langergraber et al., 2003). Las bacterias que participan en la nitrificacin se separan en 2 grupos: las Amonio Oxidantes (AO) y las Nitrito Oxidantes (NO) (Ficara et al., 2000). Dentro de stas, las ms estudiadas son las Nitrosomonas como AO y Nitrobacter como NO.

Como en la oxidacin de amonio a nitrito por parte de los microorganismos AO se liberan protones, otra tcnica utilizada para conocer la cintica es la titulacin, que se basa en la medicin de la modificacin de la acidez o la alcalinidad del medio debido a las reacciones biolgicas, por titulacin con una solucin neutralizante para mantener el pH constante (Ficara et al., 2000). Diversos estudios han demostrado que las poblaciones NO son ms sensibles a las bajas concentraciones de oxgeno, en comparacin a las poblaciones AO, debido a que presentan coeficientes de saturacin de oxgeno K ms altos (Laanbroek and Gerards, 1993; Mux, 1994; Bernet et al., 2001), lo que podra permitir la diferenciacin cintica de ambos grupos bacterianos. Por lo tanto, como hiptesis se plante determinar por separado la cintica de las bacterias AO y NO mediante ensayos rpidos de respirometra y titulacin, calculando YO2/sustrato, K, rmx y Ks, utilizando las diferencias en afinidad por oxgeno y la produccin de protones.

MATERIALES Y MTODOS Reactor respiromtrico: En este estudio se utiliz un reactor batch perfectamente agitado de 2,35 L, el cual fue llenado y sellado completamente. La temperatura se mantuvo a 20 C mediante una camisa conectada a un termostato. Todo el proceso fue controlado por un PLC Siemens modelo Simatic S7-200, operado a travs del programa Mathlab 6.5. La concentracin de oxgeno disuelto (OD), temperatura (T), pH y gasto de una solucin de carbonato para mantener el pH constante, fueron registradas por el programa de adquisicin de datos KepServer. El pH se mantuvo en un valor constante de 8,0. La concentracin de biomasa, expresada como slidos suspendidos voltiles (SSV), fue de 0,67 mg SSV/L. La Figura1, ilustra la instrumentacin y control del proceso. Hach EC 310 Electrodo pH Seal WTW Oxi 171 Electrodo OD Bomba pH Carbonato

Inyeccin de Sustrato Camisa a 20C

PLC Registro y control Vlvula electromagntica

O2 Figura 1. Instrumentacin y control del proceso

Cintica de la nitrificacin: A concentraciones elevadas de sustrato, la cintica de la nitrificacin se puede interpretar por medio de la ecuacin de Haldane. Sin embargo, como una manera de simplificar los clculos, el reactor se oper a valores de concentracin de sustrato menores o + iguales a los ptimos para NH4 y NO2 respectivamente, lo que permiti estudiar la cintica de la nitrificacin usando la ecuacin de Monod (ecuacin 1) (Antileo et al., 2003).

r = rmx

c NH 3

K SH + c NH 3 K '+ c 'O2
+ -

c 'O2

ecuacin (1)

Al utilizar concentraciones de sustrato (NH4 o NO2 ) no limitantes, y concentraciones limitantes de oxgeno (< 2 mg O2/L), la ecuacin (1) toma la forma de la ecuacin (2), debido a que la nica limitante de la cintica es la concentracin de oxgeno. Sin embargo, si se utiliza concentraciones limitantes de sustrato y concentraciones elevadas de oxgeno, la ecuacin (1) se transforma en la ecuacin (3).
r ' = r 'mx c' dc ' = K '+ c ' dt

ecuacin (2)

rN + 3 = rN + 3 , mx

c HNO 2 Ks + c HNO 2

ecuacin (3)

La ecuacin (2) puede ser linearizada como se muestra en la ecuacin (4), para obtener K y rmx, del intercepto y la pendiente, respectivamente. Utilizando el mismo procedimiento, la ecuacin (3) puede ser linearizada de modo de obtener Ks y rmx mediante la ecuacin (5) (Wiesmann, 1994; Schreiner et al., 1999).

c ' 0 c ' t = r ' mx K' c' 0 c' 0 Ln Ln c' c'

ecuacin (4)

cHNO2 ,0 cHNO2 t = r 'mx Ks cHNO2 ,0 cHNO2 ,0 Ln Ln cHNO2 cHNO2

ecuacin (5)

Para la determinacin de KS,AO su emple ensayos de titulacin, basados en la cuantificacin de la produccin de protones durante la oxidacin de amonio a nitrito. La produccin de protones es proporcional a la cantidad de amonio consumido, lo que se puede correlacionar con el consumo de carbonato para mantener el pH constante. La oxidacin biolgica de nitrito a nitrato no produce protones, por lo tanto no interfiere en la medicin.

Protocolo experimental: La oxigenacin se realiz en forma intermitente, y fue operada como se muestra en la Figura 2. Previo a cada experimento respiromtrico y titulomtrico, la biomasa fue lavada con agua destilada, de modo de eliminar cualquier sustrato remanente que afectara el resultado final. Luego la biomasa se aire hasta una concentracin superior a 8,0 mg O2/L, dejndose en reposo, para garantizar la respiracin endgena. + Para el clculo de las fracciones de nitrgeno (N-NH4 , N-NO2 , N-NO3 ) se utiliz metodologa experimental estandarizada APHA (1992).

Determinacin de KNO: En la determinacin de KNO se utiliz la ecuacin (4). Los set-points para el control de la concentracin de oxgeno se fijaron en 0,1 y 7,8 mg O2/L, respectivamente. La concentracin inicial de sustrato fue de 130 mg N-NO2 /L, valor ptimo segn cintica de Haldane a pH 8,0 (Antileo et al., 2003).

Pulso de sustrato OD [mg/L] Set point 1 Oxgeno

Set point 2 Oxgeno Respiracin endgena Respiracin exo y endgena Tiempo [min]

Figura 2. Control de la oxigenacin

Determinacin de KAO: Como las bacterias NO tienen una menor afinidad por el oxgeno, en comparacin a las AO, el set-point 1 de la concentracin de OD se fij en 2,5 mg O2/L. En este rango se asume que las bacterias NO tienen limitacin por oxgeno, por lo tanto se encuentran + inactivas. El sustrato tuvo una concentracin inicial de 114,85 mg N-NH4 /L. Para el tratamiento de los datos, se aplic el mismo procedimiento de la determinacin de KNO (ecuacin (4)). Determinacin de KsNO: Para ello se utiliz la ecuacin (5), donde se determin adems rO2, mediante el clculo de pendientes cada 31 puntos en la curva dada por la ecuacin (5). A travs de los coeficientes de rendimiento se obtuvo una ecuacin para rN+3. Integrando esta ecuacin se conoci el consumo de sustrato en el tiempo, a partir del cual se obtuvo KsNO, utilizando la misma metodologa de obtencin de K.

Determinacin de KsAO: La concentracin de oxgeno se mantuvo entre 4 y 8 mg O2/L. La concentracin inicial de amonio fue de 17,5 mg N-NH4/L. En el experimento se registr el consumo de carbonato en el tiempo, con lo que se pudo obtener indirectamente el consumo de sustrato (amonio). Para sto se utiliz una relacin CO3/N-NH4 calculada en experimentos previos, y posteriormente se utiliz la misma metodologa como para el clculo de KSNO. Con los coeficientes cinticos se puede calcular rO2 de las bacterias AO. Usando estos datos, la curva de consumo de oxgeno total y la respiracin endgena, se puede obtener la curva de rO2,NO, que puede ser procesada como se describi antes para obtener KSNO y rmax. RESULTADOS Y DISCUSIN Una serie de ensayos respiromtricos fueron desarrollados con el fin de obtener parmetros cinticos de microorganismos nitrificantes, utilizando como sustrato amonio y nitrito, independientemente. En la primera seccin de la curva (figura 3) se observa claramente la respiracin endgena; posterior a sto se agreg el sustrato, e inmediatamente se observ el consumo de oxgeno. Como se trat de experimentos de corta duracin, la respiracin endgena se asumi como constante (Schreiner et al., 1999), y se calcul de la pendiente de la primera seccin de la curva mostrada en la figura 3, dando un valor de 0,62 mg O2/L*h. Todos los parmetros cinticos calculados fueron corregidos en funcin de la respiracin endgena, de manera que los resultados fueron influenciados solamente por la concentracin de sustrato agregado. En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos para los coeficientes de rendimiento de oxgeno consumido por sustrato oxidado, observndose que presentan una gran similitud con

valores propuestos por otros autores. Estos valores estn relacionados con la estequiometra de las reacciones qumicas, e indican el alto consumo de oxgeno del proceso global de la nitrificacin, que es uno de los principales gastos en plantas de tratamiento que realizan este tratamiento biolgico.
10

Pulso sustrato
8
Oxigeno [mg/L]

6 4

2 0 0 50 100 Tiempo [min] 150 200

Figura 3. Respiracin endgena y exgena de microorganismos AO y NO

Tabla 1. Coeficiente de rendimiento para microorganismos AO y NO Nitrificacin total YO2/ N-NH4+ NO2 + [g O2/g N-NH4 + NO2 ] Promedio 4,161 Desviacin estndar 0,369 * Pirsing, 1996 * Larsen, 1992 * Wiesmann, 1994 * Parmetros cinticos encontrados en la literatura AO + YO2/N-NH4 + [g O2/g N-NH4 ] 3,035 3,160 3,430 3,180 NO YO2/N-NO2 [g O2/g N-NO2 ] 1,126 0,040 1,090 1,140 1,100

La Figura 4 muestra la curva tpica para la estimacin de K y rmx. La pendiente se calcula en la primera seccin de la curva. La zona horizontal indica valores constantes de concentracin de oxgeno.

7.5
(c0-c)/ln(c0/c)

2.5

0 0 0.2 0.4 0.6 t/ln(c0/c) 0.8 1 1.2

Figura 4. Linearizacin de curva de consumo de oxgeno para el clculo de K y rmx

En la Tabla 2 se muestran los resultados para K y rmx, calculados a partir de la ecuacin (4), con un coeficiente de regresin igual o superior a 0,98. Estos valores, en comparacin a los encontrados en literatura, son superiores, lo que puede indicar que los microorganismos estudiados son ms sensibles a bajas concentraciones de oxgeno. Dado que el valor de KNO es ms alto que KAO, se justifica la aplicacin de la metodologa propuesta. Tabla 2. Estimacin de K y rmx mediante respirometra para microorganismos AO y NO AO rmx K -1 -1 -1 [mg O2*L *h ] [mg O2*L ] Promedio 0,997 46,595 Desviacin estndar 0,048 3,942 * Larsen, 1992 0,540 * Wiesmann, 1994 0,300 * Pirsing, 1996 0,300 *Parmetros cinticos encontrados en la literatura
+

NO K -1 [mg O2*L ] 1,406 0,234 1,100 1,3 rmx -1 -1 [mg O2*L *h ] 43,194 2,678 -

En la determinacin de KAO se consumieron 9,76 mg N-NH4 /L, de los cuales 2,668 mg N-NH4 /L fueron transformados en nitrato, lo que equivale a un 27,33% del total. Este resultado confirma la limitacin de los microorganismos NO. Sin embargo, KAO podra estar influenciado, en parte, por el nitrito oxidado. Esto puede ser una explicacin del alto valor encontrado para KAO. Lo anterior se puede reflejar en la alta desviacin estndar encontrada para rmx. El valor de KNO es similar a lo que indica la literatura, lo que demuestra que en esta determinacin no hay influencia de las poblaciones AO. En la Figura 5 se muestra la curva de consumo de oxgeno para la determinacin de KsNO, que fue trabajada con oxigenacin intermitente entre 4,0 y 8,5 mg O2/L, concentraciones no limitantes para estos microorganismos. Se aprecia que a medida que se avanza en el tiempo, las pendientes disminuyen, hasta casi quedar en forma horizontal, esto se explica por que se utiliz una concentracin de sustrato limitante, el cual se consumi completamente a los 130 minutos aproximadamente. A partir de ese momento comenz la respiracin endgena.
10 8 6 4 2 0 0 30 60 90 Tiempo [min] 120 150 180

Concentracin [mg/L]

Figura 5 Curva de consumo de oxgeno para la determinacin de KsNO La Figura 6 representa el consumo de N-NO2 en el tiempo, obtenido a partir de la metodologa -4 descrita. De la linearizacin de la curva de la Figura 6 se obtuvo KsNO, dando un valor de 2,15x10 mg HNO2/L, con un coeficiente de regresin igual a 0,94. Este valor se encuentra dentro del rango -4 -4 descrito por la literatura clsica, que va desde 0,05 x10 hasta 2,5 x10 mg HNO2/L (Williamson y McCarty, 1976; Bergeron, 1978).
-

30

cNO2 [mg/L]

20

10

2000

4000

6000 Tiempo [s]

8000

10000

12000

Figura 6 Consumo de N-NO2 en el tiempo Usando la informacin del consumo de carbonato y el coeficiente CO3/N-NH4 se puede obtener el consumo de N-NH4 en el tiempo, lo que permite el clculo de los coeficientes cinticos. En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos para los coeficientes de saturacin de sustrato KS y para rmax. Como se observa, todos los valores calculados son similares a los descritos en la literatura. Los valores de los coeficientes de regresin fueron en todos los casos mayores a 0,93. Tabla 3. Estimacin de KS y rmx mediante respirometra para microorganismos AO y NO AO Ks -1 [mg N-NH4*L ] 0,28 0,028 0,6 rmax -1 -1 [mg NH3*L *h ] -2 3,36*10 Ks -1 [mg N-NO2*L ] -4 2,15*10 -4 0,32*10 -4 2,5*10 NO rmax -1 -1 [mg HNO2*L *h ] -2 2,88*10 -

Promedio *Wiesmann, 1994 *Horn, 1992 *Bergeron, 1978

CONCLUSIONES La utilizacin de las diferencias de afinidad por oxgeno de los microorganismos AO y NO, para la determinacin de YO2/sustrato, K, rmx y Ks, de ambas poblaciones, demostr ser viable. Sin embargo, los valores encontrados para KAO, hacen suponer una influencia de la presencia de los microorganismos NO. Los valores encontrados indican que, en general, los microorganismos estudiados son ms sensibles a bajas concentraciones de oxgeno, que los encontrados en la literatura. Los ensayos respiromtricos son un rpido y sencillo mtodo para el clculo de concentraciones de amonio, nitrito y cintica de la nitrificacin, sin necesidad de medir la concentracin de sustrato; sto ofrece mltiples aplicaciones en los tratamientos de aguas residuales, ya sea en la formulacin de modelos, como en el seguimiento de reactores. La titulacin permite efectivamente calcular los KsAO, sin la influencia de los microorganismos NO, por lo tanto la aplicacin conjunta de la titulacin y la respirometra permiten seguir la cintica de la nitrificacin mediante ensayos cortos y sencillos.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por el proyecto FONDECYT 1030317.

NOMENCLATURA cO2 cNH3 cNH4 KAO KNO KS,NO rmx rO2 rO2,end rN+3 S YAO/O2 YNO/O2 YO2/N-NH4 YO2/N-NO2 = Concentracin de oxgeno disuelto (mg/L) = Concentracin de amonaco (mg/L) = Concentracin de amonio (mg/L) = Constante de saturacin de oxgeno para amonio oxidantes (mg/L) = Constante de saturacin de oxgeno para nitrito oxidantes (mg/L) = Constante de saturacin de sustrato para nitrito oxidantes (mg/L) = Tasa mxima de consumo de O2 (mg O2/(L*h) = Tasa de consumo de oxgeno (mg O2/(L*h) = Tasa de respiracin endgena (mg O2/(L*h) = Tasa de consumo de N-NO2 (mg N-NO2 /(L*h) = Sustrato (mg/L) = Coeficiente de rendimiento de produccin de biomasa AO por oxgeno consumido (g SSV/g O2) = Coeficiente de rendimiento de produccin de biomasa NO por oxgeno consumido (g SSV/g O2) = Coeficiente de rendimiento de consumo de oxgeno por amonio oxidado (g O2/g + N-NH4 ) = Coeficiente de rendimiento de consumo de oxgeno por nitrito oxidado (g O2/g N-NO2 )

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Antileo C., Roeckel M. and Wiesmann U. (2003) High nitrite build up during nitrification in rotating disk reactors; Wat. Environm. Res., vol. 75, 151-162. APHA, AWWA, WPCP (1992) Mtodos normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales; Ediciones Daz de Santos S. A., Madrid, Espaa. Bergeron P. (1978) Untersuchungen zur Kinetik der Nitrifikation. Karlsruher Berichte zur Ingenieurbiologie, vol. 12. Bernet N., Dangcong P., Delgenes J. and Moletta R. (2001) Nitrification at low oxygen concentration in biofilm reactors; Journal of Environ. Engineering, vol. 127, 3, 266-271. Ficara E., Musumeci A. and Rozzi, A. (2000) Comparison and combination of titrimetric and respirometric techniques to estimate nitrification kinetics parameters; Wat. SA, vol. 26, 2, 217-224. (http://www.wrc.org.za) Laanbroek H. J. and Gerards S. (1993) Competition for limiting amounts of oxygen between Nitrosomonas europea and Nitrobacter winogradsky grown in mixed continuous cultures; Archives of Microbiology, vol. 150, 453-459. Langergraber G., Wuchty M., Fleischmann N. and Lechner M. (2003) Rapid automated detection of nitrification kinetic using respirometry; Wat. Sci. Tech., vol.47, 2, 149-155. Larsen W. (1992) Simulation der Nitrifikation und anderer bakterieller Stoffwandlungen im Biofilm; Diss. TU Berlin, Reihe 15: Umwelttechnik 104, VDI-Verlag Dsseldorf. Muxi L. (1998) Nitrificacin en reactores air-lift; Trabajo de Ttulo, Escuela de Ingeniera Bioqumica, Universidad Catlica de Valparaso, Chile. Pirsing A. (1996) Reaktionstechnische Untersuchungen und mathematische Modellierung der Nitrifikation in hochbelasteten Abwssern; Diss. TU Berlin, Reihe 15: Umwelttechnik 156, VDIVerlag Dsseldorf. Schreiner A., Asmussen C., Wiesmann U. and Stan H. (1999) Investigation of aerobic degradation kinetics of surfactants using respirometric batch experiments, Acta Biotechnol., vol 19, 4, 293-304. Wiesmann U. (1994) Biological nitrogen removal from wastewater; Advances in Biochemical Engineering, vol. 51, 113-154. Williamson K. and McCarty P. (1976) A model of substrate utilization by bacterial films; J. Water Poll. Contr., vol. 48, 9-24.

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