Cuestiones para el examen

1. Definir la transcripcin. 2. Cul es el azcar y la basa especficos del ARN? 3. Con cul base se aparea el uralcilo? 4. Que abastece la hidrlisis del PPi? 5. A qu sirve un promotor? 6. Definir la palabra opron. 7. Cual diferencia hay entre operon y policistron? 8. Que es que X-gal? 9. Que es que lacZ? 10. Que es que IPTG? 11. Dfinir: operon y repressor. 12. describir el opron lactose. 13. Cul es la protena codificada por el gen i en casa de E coli? 14. Cmo la ARN pol de E. coli hace para fijarse sobre su promotor? 15. Que es que la caja de Pribnow? 16. Que es que un terminador? 17. Cmo se acaba la transcripcin? 18. Que es que la secuencia de Shine-Delgarno? 19. Queremos exprimir un gen de mamfero en E. coli, cules son los problemas puestos? 20. Que es que una protena de fusin? 21. Podemos producir protenas nativas en casa de E. coli? 22. Lo que es lo que una etiqueta histidina? 23. Describa la sntesis de la insulina por E. coli.

A. la transcripcin en las bacterias a. introduccin: La transcripcin en general

La transcripcin es el proceso por el que se transmite la informacin contenida en el ADN al ARN. La ARN polimerasa utiliza como molde una de las dos cadenas del ADN, la cadena codificante. Al principio de la transcripcin se reconoce un sitio especfico de la molcula de ADN en el que se van a unir las protenas del complejo de ARN polimerasa. Este sitio especfico se denomina promotor del gen.

1. Los actores de la transcripcin

El ARN: Como el ADN, el ARN es una molcula de cido nucleico. El ARN casi siempre est formado por una nica cadena. El azcar del ARN es la ribosa. El ARN tiene los nucletidos G, A y C, pero la timina (T) se sutituye por el uracilo (U). El ARN puede sirve como una suerte de mensajero gentico, transmitiendo la informacin guardada en el ADN de la clula, desde el ncleo (En las clulas que tienen un ncleo) hacia otras partes de la clula donde se usa para ayudar a producir protenas. El ARN se transcribe a partir de una de las dos cadenas del ADN. Vemos aqu slo lo que es neceser para nuestro curso. Para de ms amplios informacin el estudiante debe ir a el sitio: http://www.um.es/~molecula/anucl03.htm ------------------------------------chain: cadenas

template: molde sugar: azcar

La ribosa Es un azcar de 5 carbonos. Es un componente estructural de la estructura del ARN, como el ATP, GTP, CTP y TTP. Forma parte de la estructura de los nucletidos que forman el ARN. El uracilo Es una de las 4 bases del ARN. Se representa con la letra U. En el ARN, El uracilo reemplaza a la timina. El uracilo se aparea con la adenina. El porqu el ARN contiene uracilo en vez de timina No es conocido.

promotor ARN polimerasa y rNTPs La polimerasa se une a una secuencia llamada promotor que Enzima encargada de la sntesis de ARN a partir de molde de ADN. normalmente est delante de la secuencia que especifica el RNA. La reaccin que cataliza consiste en: El primer nucletido que est en el RNA (incluyendo en el promotor) es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto de referencia, (ARN)n-residuos + NTP <===> (ARN)n-residuos + 1 + PPi. delante - y detrs +. El resto del promotor no se transcribe. NTP: nuclesido trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP); posteriormente, el PPi se hidroliza, lo que abastece la energa de la reaccin. Todas las clulas contienen una o varias ARN polimerasas. En procariotes esta una enzima. Esta enzima sintetiza todo los ARNs excepto el necesario para el cebador en la replicacin del ADN (esta reaccin es catalizada por la primasa). ribonucletidos Los nucletidos, ribonucletidos y desoxiribonucletidos estn compuestos de una base nitrogenada, un azcar (ribosa o desoxiribosa), y un grupo fosfato. Si el azcar es ribosa se trata de ribonucletidos, constituyente del ARN.

Algunos bacteriofagos sintetizan una ARN polimerasa que solo sintetiza ARN especfico del fago. En eucariontes hay 4 5 ARN polimerasas diferentes que sintetizan diferentes tipo de ARNs. --------------------------primer: cebador.

b. Control de la tanscripcin: el opron lactosa:

Se denomina opern lactosa a una sucesin de gens adyacentes, transcritos en un slo ARNm. El opern contiene tambin la regin de regulacin. Los operones se encuentran en los eucariotas ( Trypanosmas spp.) y en ciertos procariotas. En la figura de la derecha, se ha esquematizado el opern lactosa, comenzando por el gene [i], entonces el operador [Op]. El contiene regiones que codifican la galactosidasa [Z], la permeasa [Y] y una transacetilasa [A]. el gen [i]: El gen i codifica el rpresseur. En la ausencia de lactosa, el represor es codificado por un gen [i]. el represor se fija en el operador [Op] y la transcripcin del opern se inhibe. -galactosidasa y X-Gal: E. coli utilisa los productos de la hidrlisis de la lactosa: la glucosa y la galactosa. La -galactosidasa hydrolisa la lactosa. Si no encuentra lactosa en el medio de cultivo, E. coli exprime solamente muy poco de -galactosidasa. Al contrario, en presencia de lactosa, la -galactosidasa es abundantemente expresada. La -

galactosidasa hidrolisa tambin el substrato sinttico X-gal: ella produce entonces un compuesto coloreado en azl. LacZ alfa peptido (lacZ): El LacZ-alfa pptido es una parte de la -galactosidasa que no posee actividad por s misma, pero que es necesaria para la accin de la enzima. LacZ forma parte del gen de -gal. Es posible cortar la secuencia LacZ y meterla en un plasmido donde ella exprimir el pptido alfa. Existen cultivos comerciales de E.coli a los cuales se les ha quitado el alfa pptido y de plsmidos que continen se pptido. Para poseer actividad -gal, sas bactrias deben haber sido transfectadas con un plsmido codante de LacZ. inductor (la lactosa y el IPT): La lactosa cuando est presente es un inductor de la expresin de -gal. Existen otros compuestos capces de reaccionar inducir. En el laboratorio, se utiliza como inductor el isopropil -b-Dgalactosido (IPTG). En efecto, al contrario de la lactosa, el IPTG no es metabolizado y subsiste en el medio.

El operador: Es una secuencia en el opern en la que se fija el represor. La disposicin espacial unducida por la fijacin de se represor en el operador impide que la ARN polimerasa se fije en el ADN para comenzar la sntesis de l'ARNm codificante de la -galactosidasa.

a. comienzo de la transcripcin
ARN polimerasa (ARN pol): En las bacterias slo existe una ARN polimerasa (ARN pol). Las ARN pols de las bacterias se unen directamente al ADN sin utilizar un complejo de iniciacin. La ARN pol de la bacteria E. coli est constituido por una enzima de base tetramrica que contiene subunidades de tipo alpha y con una esteroquiometra alpha2'. El asemblaje alpha2' es suficiente para alargar la transcripcin. la sub-unidad sigma: La iniciacin por otro lado necesita la sub-unidad sigma, que completa a sta holoenzima (alpha2'sigma). El factor sigma reconoce al promotor. La enzima de base se puede unir al promotor en ausencia de sigma, pero solamente de manera inficaz y sin especificidad. La funcin principal del factor sigma es la de aumentar la eficiencia de la unin de la ARN polimerasa al promotor y de reducir los enlaces inespecficos. Un solo factor s (s70 chez E. coli) comienza la transcripcin de la mayora de gens. Ciertos bacterifagos (virus de bacteria) como el T4, sintetizan su propio factor s que tiene la habilidad de cambiar la enzima de base de su vctima E. coli para que ella slo y nicamente transcriba los gens del fago. promotor: La ARN polimerasa explora la doble hlice del ADN de la bacteria y se la de manera dbil a ella hasta que encuentra a un promotor. La enzima se une entonces fuertemente a la secuencia del promotor, La distancia entre los 2 sitios representa un solo giro de la hlice, lo desnatura un segmento pequeo de ADN cercano del promotor y que permite a los 2 motivos de reaccionar al mismo tiempo con el comienza la transcripcin de ste ADN en ARN. El factor sigma se factor sigma. disocia de la holoenzima cuando alrededor de una docena de ribonucletidos han sido asemblados. El primer nucletidodo de la cadena de ADN contiene genralmente una purina (adenina

guanina). Los promotores bacterianos poseen cuatro caractersticas comunes: (1) lel punto de comienzo de la transcripcin, denominado +1, (2) la secuencia de la posicin 10 llamada caja de Pribnow (TATAAT), (3) la secuencia 35 (TGTTGACA) y (4) la distancia entre las secuencias 10 y 35. E punto donde se inicia la transcripcin es genralmente una purina (A ou G).

b. terminar la transcripcin
La efficiencia de la terminacin en sitios r-independient es vara entre menos de 25 % a ms de 75 %. terminadores (t): En las bacterias y las levaduras, la transcripcin se termina en secuencias discretas llamadas terminadores (t) gracias a dos mecanismos que responden ms a una seal de transcripcin del mismo que a una seal del gen. terminacin r -independiente: El mecanismo ms comn es el fin intrnsico terminacin r independiente. Los transcriptos adoptan estructuras secundarias que obligan a la ARN polimerasa a frenar. Un motivo o secuencia de terminacin frequente es una secuencia repetida, inversada y rica en G, C seguida por una secuencia poly-U. terminaison r-dpendante: El otro mecanismo de finalizacin (terminaison r-dpendante), llamado dependiente, es poco utilizado por los gens del cromosoma bacteriano, pero frequentemente utilizado por fagos, como el fago lambda. Este utiliza una protena que se llama r (rho) que tiene la capacidad de poder unirse a un sitio especfico del transcripto. Este sitio a menudo contiene una secuencia rica en citidina, pobre en guanosina y tiene una longitud de 50 a 100 nucletidos. La protena r separa el ARN transcripto a partir de un ADN matrz producto de una reaccin directa con la ARN polimerasa.

El palndrome rico en G, C forma una especie de bincha horquilla, que obliga a la ARN polimerasa a hacer una pausa. En se momento las 2 hebras de ADN se encuentran y pueden aparejarse. La ARN polimerasa se dissocia entonces de la matrz y una de las hebras del ARN formado se libera.

B. la traduccin en las bacterias

secuencia Shine-Dalgarno (SD):
El sitio de fijacin del ribosoma utiliza el codn de iniciacin de la traduccin (AUG) y una secuencia de 3 a 9 nucletidos situadas entre el 3 y 11 nucletido encima del codn de iniciacin. Esta secuencia se denomina Shine-Dalgarno (SD) y es complementaria a la extremidad 3' del ARN 16S de la E. coli. La secuencia consensus es UAAGGAGG. El enlace del ribosoma al ARN es facilitado par el cruze entre la secuencia SD del ARNm y la secuencia de la extremidad 3' del ARN 16S

C. Expresin de genes de mamferos en la bacteria E. coli

Las clulas bacterianas son extremadamente tiles para la

Otro problema es que las proteinas producidas por stos mtodos pueden presentar modificaciones post-tranduccionales como la formacin incorrecta de enlaces disulfuros, glucosilacin, fosforilacin, oligomerizacin protelisis. Modificaciones que no han sido efectuadas por las clulas bacterianas. Este problema es particularmente agudo cuando se busca la expresin de receptores de superficie, hormonas extracelulares y ciertas enzimas.

traduccin activa de protenas de mamferos, immunolgicamente activas. protenas de fusin proteinas compuestas, formadas de una porcin amino-terminal como la de la beta-galactosidasa (LacZ) fusionada en protenas eucariotas son utilizadas para preparar anticuerpos policlonales monoclonales. Estos anticuerpos se pueden usar para purificar protenas por cromatografa de afinidad, para diagnosticar y cuantificar niveles de protenes, para localizar protenas en organismos, en tejidos y en clulas individuales y en combinacin con otras tcnicas como la immunofluorescencia.

La expresin de gen de mamferos en la E. coli necesita tambin resolver los problemas siguientes: 1. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas bacterianas. 2. los gens eucariotas contienen intrones. 3. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas bacterianos ; 4. las protinas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de inclusin insolubles 5. las protenas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraos (foreign bodies) por las proteasas de la bacteria y ser degradadas.

protenas intactas nativas Otras protenas intactas nativas han sido ya producidas en grandes cantidades en la E. coli para realizar estudios funcionales. En otros casos, una gran cantidad de protenas eucariotas han sido sintetizadas a partir de bacterias pero con replicacin de manera incorrecta poco eficz y con poca actividad biolgica.

a. protenas de fusin
1. vector pUR278:
Para clonar un gen se utilizan plsmidos disponibles en el mercado para ser usados en biologa molecular. As como hay muchos de plsmidos comerciales, escogeramos uno: el plsmido pUR278. Insertamos el gen de la protena en la sitio de clonaje. La protena de fusin ser precedida de la la -galactosidasa (lacZ). El plsmido as transformado se introduce en una bacteria a la que se le ha suprimido el gen lacZ. Clonar un gen de inters en 3' (= arriba) en un gen de E.coli con lacZ, ofrece tres ventajas: 1. la protena de fusin se puede producir en grandes cantidades puesto que los sitios de iniciacin de la transcripcin y de la traduccin son secuencias normales de la E. coli. 2. las protenas de fusin son ms estables que las protenas extraas nativas. 3. las protenas de fusin son ms grADNes que la mayora de las protenas de la E. coli y fciles de identificar en un gel de poliacrilamida. La porcin del gel que contiene la protena puede recuperarse y ser utilizada para immunizar animales por ejemplo.

No hay que modificar la rejilla de lectura. El ltimo codon del primer gen debe ser seguido por el primer codon del segundo. Hacen falta varios vectores para realizar esta continuidad. En efecto, cada vector posee sitios de restricion colocados para resolver este problema. Los vectores disponibles como el plsmido pUR278, posen una serie de sitios de restriccin que permiten la introduccin de un fragmento de ADN entre las tres entradas posibles en la parte 3' del gen lacZ. En ciertos casos, la construccin del gen de fusin necesitar ya sea rellenar eliminar un extremo adhesivo.

2. vector pMAL:
maltose binding protin (MBP) La maltose binding protin (MBP) es una protena periplsmica . El gen de interes puede tambin ser clonado en el vector pMAL a lo largo del gen malE de la E. coli que codifica la protena de ligado a la maltosa (maltose binding protein, MBP). La MBP es una protena periplsmica que participa al transporte de maltosa en la bacteria. Gracias al promotor tac y a otras seales de iniciacin de la traduccin de la MBP, puede exprimir grandes cantidades de protena de fusin. el promotor tac and IPTG: El promotor tac es un promotor hbrido trp-lac que puede ser reprimido por el represor lac, inducido por el inductor IPTG. El gen lacI que codifica el represor est presente en el plsmido. complementacin alpha: La horquilla polylinker utilizada para la insercin de ste ADN extranjero est situada en la parte amino-terminal del fragmento de

beta-galactosidasa (No representado en el esquema de derecha) permitiendo la complementacin alpha, lo que le dona una coloracion blanco/azl a las colonias bacterianas obtenidas. purificacin de la proteina: La protena de fusin producida por plsmido recombinante se purifica en diferentes etapas, desde cromatografa de afinidad usando la finidad de la MBP por la amilosa. Luego se la libera de la columna mediante la utilizacin de una solucin de maltosa. En la mayora de casos, la protena de fusin es soluble. Los rendimientos de obtencin son del rden de 100 mg/L. As mismo, el vector pMAL es ideado para que la protena de fusin obtenida presente una secuencia de reconocimiento por una proteasa especfica, (Facteur Xa, entrokinase ou thrombine) lo que permite de separar la protena de inters de la MBP.

b. protenas no fusionadas
vector pET-3a (Stratagen).
Las protenas no fusionadas pueden tambin ser producidas en las bacterias. Se procede insertando el ADNc de inters en el vector a lo largo de un promotor fuerte e inducible y tambin de una seal clara que permita una traduccin efficiente de la protena en question por los ribososmas de E. coli. Los niveles de expresin varan entre 1 y 30 % de protenas totales de la bacteria. En la mayora de los casos, sto significa un enriquecimiento de al menos 1.000 veces en relacin a la produccin natural de la protena. El vctor pET-3a es uno de los vectores. Para producir una de sas protenas, es necesario entonces conocer su ADNc, el vecteur pET-3a, la bacteria husped modificada y eventualmente el plsmido hte pLys. El vector pET-3a (promoter T7). El vector de expresin pET-3a contiene un promotor fuerte, el promotor del bacterifago T7 (P T7). Este promotor es especfico de la T7 ARN pol, no deja acceso del ARN pol de la E. coli al gen clonado. La T7 ARN pol usa el gen de T7 que ha sido insertado en el cromosoma de la bacteria husped. Si la expresin del ADNc clonado es txico para la bacteria, los niveles de expresin de la T7 ARN polimerasa son mantenidos muy bajos cuando las bacteria se multiplican. Justo antes de cosechar las bacterias se induce la expresin masiva de la T7 ARN pol. La bacteria husped (T7 ARN pol gene, IPTG controlado). Se utiliza una bacteria lisgena BL21 (DE3), en cuyo cromosoma se Si el ADNc se clona en el sitio NdeI, la protena expresada no ser una protena de fusin. Se puede observar en el esquema que NdeI prove el codn ATG del gen a clonar. Si al contrario, si la protena se clona al nivel de BamHI, ella ser una protena de fusin. Si estudias cuidadosamente el esquema presentado, podrs ver que ella comienza por los primeros 11 aminocidos de la regin lder del gen 10 (ste gen codifica la regin lder de la protena principal de la cpside del bacterifago T7). El plsmido pET-3 contiene tambin el terminador del bacterifago T7 (T T7).

ha insertado el gen que codifica la T7 ARN pol precedido del promotor lacUV5. La expresin del gen de T7 ARN pol se controla mediante el promotor LacUV5. Este es un promotor del opern lactosa inducible por la IPTG. Slo muy dbiles niveles de expresion de T7 RNA pol se producen cuADNo ste no es inducido. El plsmido pLys. Para controlar ms estrictamente el nivel de la T7 ARN pol en la bacteria, se utiliza bacterias que contienen el plsmido pLys. Estos plsmidos codifican la lisoenzima de T7 que es un inhibidor de la T7 RNA polimerasa. Ellas reducen la capacidad de sta polimerasa de transcribir ADNc cuando el promotor lacUV5 no est inducido. El clonaje.. Los gens de inters se clonan en el plsmido sea en el sitio Ndel en el sitio BamHI.

vector pKK240-11
ATG y sitio de restriccin Nco I Adems de un promotor bacteriano, el segundo factor ms importante para exprimir un gen eucariota en una bacteria, como la E. coli es el de tener un sitio eficiente de fijacin al ribosoma. Cuando se busca la expresin de un gen procariota, el sitio de fijacin del ribosoma de se gen es a menudo suficiente. Se procede entonces a clonar el gen de inters a lo largo del promotor (fuerte inducible), utilizando un sitio de restriccin en 5' de la secuencia Shine-Dalgarno, para obtener niveles de expresin elevados. El sitio de fijacin al ribosoma se puede mejorar y hacer eficiente si

El ATG est includo en el sitio de restriccin NcoI. El plsmido se digiere entonces por NcoI y la extremidad adhesiva se rellena con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. A la extremidad derecha de ste arreglo se le puede aadir un fragmento de ADN que comienze por el segundo codn del gen a exprimir. Este fragmento es fcilmente preparado por PCR utilizando la Pfu ADN polimerasa. El vector pKK240-11 pose un promotor tac y un sitio de fijacin de ribosoma del gen LacZ y tambin los terminadores de transcripcin T1 y T2 del gen 5S de E. coli.

se desea la expresin de gens eucariotas y procariotas con sitios de fijacin poco eficientes. Esto se realiza insertADNo el gen de inters en un plsmido, como el pKK240-11, y asegurndose que el segundo codn de se gen siga al codn ATG del vector.

vector pQE de Quiagen (Etiqueta Histidina)

Otra tcnica de purificacin de protenas recombinantes se basa en la observacin de que un segmento de una protena constitudo de una serie de 6 histidina se une a metales de transicin mediante el uso de queladores. La secuencia codificante de la protena se clona an un plsmido arriba abajo de una secuencia que codifica la 6 Histidina. Las protenas eucariotas producidas pueden representar hasta 50 % de las protenas celulares totales. Las bacterias son lisadas y ste extracto bacteriano se deposita en una columna de resinas Ni++NTA (Nitrilo-Tri-Acetic Acid). Los iones Ni++ complexados en los cuatro puntos de coordinacin por la resina tienen una alta afinidad por las 6 histidinas consecutivas fijadas a la protena. La resina puede fijar hasta 5 mg protena/ml de resina. La afinidad de la resina Ni++-NTA por las 6 Histidina es ms grADNe que la producida entre antgeno-anticuerpo. Por lo tanto no es influenciada por agentes denaturantes como la rea 8M el hidrocloruro de guanidina 6M. Debido a que hay slo un nmero limitado de protenas (HNF6 presentan 8 histidinas consecutivas) que de manera natural se unan a metales de transicin, las protenas fusionadas de secuencia 6 histidina pueden ser purificadas en una sla etapa. La protena pura se la obtiene aadiendo imidazol como agente competidor. El nivel de recuperacin es alto, an si slo

constituye el 1% del total de protenas provenientes de la lsis original. La secuencia de las 6 Histidina no tienen carga a pH fisiolgico y slo afectan muy raramente la conformacin de la protena a la cual se ligan: preservADNo la funcin de la otra protena. Adems no interfiere en su secrecin y es poco immunognica en la mayora de las especies, salvo en el mono.

c. cuerpos de inclusin
Una concentracin elevada de protenas en la E. coli provoca a menudo la aparicin de grnulos citoplasmticos cuerpos de inclusin insolubles. Despus de la lsis de bacterias, los cuerpos de inclusin se recuperan mediante centrifugacin y se lavan con detergentes (Triton X-100) y de EDTA. Para cada protena es necesario adapatar un protocolo apropiado. A menudo se utiliza el hidrocloruro de guanidina (5 8 M), la rea (6 a 8 M), el SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), un pH alcalino una mezcla de acetonitrilo y de propanol.

CuADNo la protena es por fin solubilizada, se debe encontrar la manera adecuada de eliminar el agente denaturante y la protena recupere su conformacin original. Ejemplos de protenas de mamferos expresadas en E. coli Algunas protenas de eucariotas, como la insulina y la hormona del crecimiento humana son exprimidas de manera eficiente y con poco costo en microorganismos.

d. Ejemplos
a. La insulina
El problema de la insulina: El primer medicamento producido por ingenra gentica y con la primera licencia de sta clase, es la insulina humana, destinada al tratamiento de la diabtes. Este producto reemplaz a la insulina extrada del pncreas del cerdo y la vaca. A pesar de que sta molcula es biolgicamente activa en el hombre, su secuencia en aminocidos no es idntica a aquella de la molcula humana. Es por sto que ciertos pacientes producen anticuerpos contra sta insulina. pre-pro-insulina: La insulina regula el metabolismo de los azcares y es normalmente secretada en la sangre por las clulas del pncreas. Es una protena de 108 aminocidos, con una secuencia hidrofoba secuencia seal (24 aminocidos) que le permite atravezar las membranas intracelulares y que se conoce como pre-proinsulina. pro-insulina y peptido C A lo largo de su transporte, la secuencia seal de 24 aminocidos se separa de la cadena del polipptido, formando la pro-insulina, que se almacena en vesculas que se lian a las membranas de las clulas pancreticas. La pro-insulina es entonces replegada comprimida como una letra G, los 2 extremos del chorro sostenidos juntos por 3 puentes disulfuros y entonces transformada en insulina dentro de las vesculas pancreticas mediante la excisin enzimtica de un segmento polipptidico de 33 aminocidos conocidos como pptido C.

insulina madura: La insulina madura est formada de 2 cadenas distintas, una de 21 aminocidos (la cadena A) y la otra de 30 aminocidos (cadena B); unidas por puentes disulfuros iguales. La insulina no contiene cadenas sacardicas. La productcin de la insulina usADNo E. coli : El gen cromosmico de la insulina no puede ser utilizado para el clonado de la insulina en la bacteria, puesto que el codifica la preproinsulina que tiene una subdependencia de secuencias promotoras eucariotas y adems contiene un intrn. Es por eso que hubo que primero crear un ADNc de la proinsulina (sin secuencia seal ni intrn) que pudiera ser unido a la extremidad 5' de ste ADNc con un codn metionina (ATG) sintetizado qumicamente (en efecto, la AUG de la insulina se encuentra dentro de la secuencia seal). Este ADNc se inserta en un plsmido que tiene un fragmento del gen lacZ compuesto de un promotor y de una parte de la secuencia codante de la -galactosidasa, creando as una protena de fusin. Es ste plsmido recombinado el que es introducido en la E. coli. En la clula bacteriana, y bajo el control de secuencias de regulacin del gen lacZ, de la ARNm es producido y traducido en protenas constitudas una parte de -galactosidasa fusionada por la metionina suplementaria a la proinsulina. La insulina se obtiene tratando la protena de fusin con bromuro de ciangeno, un reactivo que corta las uniones peptdicas junto a los residuos de metionina. La metionina no aparece en la secuencia de la proinsulina nativa. La insulina recombinada se repliega en una estructura tridimensional gracias a la formacin de puentes disulfuro y el pptido C es cortado por proteasas dando lugar a la insulina humana pura.

b. La hormona del crecimiento humano (hGH)

El problema de la hGH: La produccin de la hormona de crecimiento humano (hGH) en la E. coli es otro ejemplo. La hormona de crecimiento normalmente producida en la hipfisis, es una protena de 191 aminocidos que regulan el crecimiento y desarrollo. Al igual que la insulina, es una protena no glicosilada. Inyecciones frequentes de sta hormona estimulan el crecimiento en nios con su deficiencia permitindoles alcanzar una talla casi normal. A la inversa del caso de la insulina, las hormonas del crecimiento de orgen animal son inefectivas en el hombre. Durante muchos aos se la extrajo de la hipfisis de cadveres humanos. Esta prctica adems de peligrosa ocasion la infestacin de numerosos infantes con protenas de tipo prin. Como la insulina, la hGH es normalmente producida bajo forma de una protena precursora portadora de una secuencia seal aminocido-terminal. La secuencia seal humana sinembargo no era reconocida por la maquinaria bacteriana de secrecin. Es as que un gen hbrido se ide y construy de tal manera que la bacteria pudiera

Adems, la protena deba seguir numerosas etapas para su purificacin y la separacin de las proteinas intracellulares de la bacteria en questin. Otra manera de producir la protena en la bacteria entonces, era la de modificar la manera en que la protena era secretada, ligando la secuencia codificante de la protena hGH a

producir una versin casi normal de la protena humana madura. La production de hGH: Un fragmento de ADN codificante de los aminocidos 1 a 24 fueron sintetizados qumicamente. A lo bajo del primer codn, un tripleto ATG se aadi. Por otro lado, un ADNc codificante de los aminocidos 25 a 191 fueron obtenidos a partir de ARNm de las clulas hipofisarias humanas. Estos 2 fragmentos de ADN fueron clonados abajo del promotor lac en un plsmido. Este plsmido recombinado fu introducido en la E. coli donde la produccin de la hormona de crecimiento humana se produj. El nico inconveniente de sta hormona recombinada era que comenzaba por una metionina que no era separada de la cadena restante del polipptido por las enzima de la bacteria. Las bacterias sintetizaban entonces una protena idntica desde todos los puntos a la original; incluyendo actividad biolgica, a partir de una metionina iniciadora, que no se separaba.

la secuencia seal de una de las protenas bacterianas secretadas. La hormona de crecimiento producida por ste mtodo se secreta en el espacio periplsmico entre la membrana interna y externa de la bacteria con la eliminacin frecuente de la seal peptdica por una proteasa bacteriana. La protena producida es finalmente separada mediante alteraciones hipotnicas fuertes que rompen la membrana externa. La hGH producida de sta manera no contiene metionina iniciadora puesto que una proteasa bacteriana periplsmica corta la seal.