ASPECTOS BSICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR (I) INTRODUCCIN La Biologa Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensin de todos

aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la informacin gentica se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos. Este conocimiento ha permitido cruzar barreras naturales entre especies y colocar genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de tcnicas de ingeniera gentica. Una de las consecuencias importantes derivadas, fue la produccin de fragmentos de cidos nucleicos a gran escala, abriendo las puertas a la secuenciacin de los cidos nucleicos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnstico molecular, la terapia gnica o la obtencin de organismos superiores recombinantes. Cronolgicamente podemos citar una serie de hitos que contribuyeron decisivamente en su desarrollo: la historia de su conocimiento comienza en el ao 1866 cuando Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregacin y clasificacin independiente de los genes. En 1869 el cientfico suizo Frederick Miescher descubri en el ncleo de las clulas una sustancia de carcter cido a la que llam nucleina. En los aos 20, el qumico alemn Robert Feulgen, utilizando una tincin especfica, descubri que el DNA estaba situado en los cromosomas. A partir de este descubrimiento todo sucedi muy rpidamente. En 1944 Avery, McCleod y McCarty comprueban que el DNA es el portador de la informacin gentica. En 1953 Watson y Crick revelan la estructura del DNA como una doble hlice complementaria que recuerda la estructura de una escalera de caracol. A partir de entonces y de manera exponencial, se suceden los descubrimientos (enzimas de restriccin, polimerasas, etc...) que conducirn a lo que se conoce como tecnologa del DNA recombinante. Qu es el DNA? Podemos considerar el DNA o cido desoxiribonucleico, como el }cerebro~ celular que regula el nmero y naturaleza de cada tipo de estructura y composicin celular, transmitiendo la informacin hereditaria y determinando la estructura de las protenas, que a travs de enzimas determinar el resto de funciones celulares. A finales del siglo pasado se descubri tambin la existencia de una segunda clase de cido nucleico, denominado cido ribonucleico (RNA). El RNA se encuentra tanto en el ncleo (concretamente en el nucleolo) como en el citoplasma de las clulas de manera abundante. Ambos tipos de cido nucleico, DNA y RNA, se encuentran simultneamente en organismos eucariotas (con clulas de ncleo diferenciado) y procariotas (bacterias, etc.), y slo uno de ellos en los virus. COMPOSICIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Los cidos nucleicos polmeros de alto peso molecular constituidos por unidades elementales denominadas }nucletidos~, los cuales estn formados por tres componentes: 1. Molcula de azcar Ribosa, en el caso del RNA Desoxirribosa, en el caso del DNA 2. Base orgnica nitrogenada Adenina, guanina (bases pricas), citosina y timina (bases pirimidnicas) en el caso del DNA. Adenina, guanina (bases pricas), citosina y uracilo (bases pirimidnicas) en el caso del RNA. 3. Grupos fosfato

Los nucletidos se unen formando cadenas cuyo esqueleto est formado por la unin entre un azcar de un nucletido y el fosfato del siguiente, quedando las bases nitrogenadas en la parte central, unidas cada una al C1 del azcar. Estas bases son las que rinden especificidad al cido nucleico.

ESTRUCTURA DEL DNA Estructura primaria La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucletidos. Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucletido o de un cido nucleico, se representa mediante la terminologa de cada una de las bases. Por ejemplo: 5'-ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3' Esta secuencia representa un oligonucletido con 20 bases, de las cuales 6 son adeninas (A), 3 son timinas (T), 8 son citosinas (C) y 3 guaninas (G). El orden de la secuencia es muy importante, ya que en l reside la informacin contenida en el cido nucleico; la orientacin viene dada en el sentido 5' 3' 3' 5'; el 5' representa el extremo terminal del fosfato y el 3' el extremo final del tomo de carbono de la desoxirribosa.

Estructura secundaria Edwin Chargaff analizando las bases del DNA mediante mtodos cromatogrficos descubre, que stas no se encuentran en la misma proporcin y que el nmero de adeninas es igual al de timinas y el de citosinas, al de guaninas. En 1953 James Watson y Francis Crick construyeron un modelo tridimensional del DNA con la configuracin ms favorable energticamente combinando los datos obtenidos hasta entonces sobre l, los descubrimientos de Chargaff y la interpretacin tridimensional de los espectros de difraccin de Rayos X; esto ltimo fue de gran importancia para la consecucin de tal modelo, el cual consiste en una doble hlice antiparalela cuyo esqueleto fundamental est formado por las cadenas de azcar-fosfato, quedando en la parte central las bases, enfrentadas las de una cadena con las de la otra complementaria y formando entre s puentes de hidrgeno, factor que da estabilidad a la doble hlice. El enfrentamiento de bases es constante; la adenina siempre se enfrenta con la timina y entre s se forman dos puentes de hidrgeno, y la guanina con la citosina, formndose entre ambas tres puentes de hidrgeno. Esta caracterstica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hlice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5' 3' y la otra lo hace en sentido 3' 5'. Por eso hablamos del DNA como una doble hlice antiparalela.

Disposicin de la unin entre bases formando dos puentes de hidrgeno entre adenina timina y tres puentes de hidrgeno entre citosina - guanina.

Estructura de doble hlice a derechas del DNA.

Estructuras terciaria y cuaternaria

Teniendo en cuenta que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior celular. Estas estructuras, terciaria y cuaternaria, permiten el empaquetamiento del DNA formando los cromosomas. En las clulas eucariotas existen varios cromosomas y en los procariotas, existe un DNA empaquetado denominado seudocromosoma.

ESTRUCTURA DEL RNA El RNA generalmente est formado por una sola cadena de nucletidos, aunque existen algunos virus que poseen RNA de doble cadena. Los cidos ribonucleicos no slo pueden tener informacin propia, sino que constituyen la herramienta para la conversin de la informacin contenida en el DNA en protenas especficas.

PROPIEDADES DEL DNA Las hebras del DNA que forman la hlice tienen orientaciones opuestas: una va en la direccin 5-3y su complementaria en la 3-5. La ruptura de los puentes de hidrgeno por calor, lcali o diversos compuestos qumicos, produce la separacin fsica de las dos hebras del DNA en un proceso denominado desnaturalizacin. La desnaturalizacin por calor es total a los 90C y por lcali a pHs superiores a 11,3. En ambas casos el proceso es reversible, y al desaparecer el agente desnaturalizante se produce la renaturalizacin de la molcula, esto es, la re-adquisicin de la estructura helicoidal perdida. El proceso de desnaturalizacin va seguido por un aumento de la absorcin de luz ultravioleta (260 nm) denominado efecto hipercrmico. Otro concepto interesante de definir es el de temperatura de fusin (Tm), que es la temperatura a la que la mitad de las molculas de una solucin de cido nucleico, han pasado a estado desnaturalizado. Esta temperatura depende del nmero de pares G-C que existan en la molcula de cido nucleico. Cuando mayor sea este mayor ser la Tm.

FUNCIONES DE LOS CIDOS NUCLEICOS

DNA

Su funcin principal consiste en la conservacin de la informacin de la clula u organismo que lo contiene y la transmisin de esta informacin al replicarse.

RNA

En algunos virus su funcin es contener y transmitir informacin. Pero, como hemos citado anteriormente, su funcin ms importante consiste en la conversin de la informacin contenida en el DNA en protenas especficas. Para ello existen varios tipos de RNA: RNA mensajero (RNAm), RNA transferente (RNAt) y RNA ribosmico (RNAr).

DOTACIN GENTICA DE LOS VIRUS Los virus pueden tener DNA duplex, DNA monocatenario, RNA monocatenario o RNA duplex. En algunas ocasiones, el genoma vrico dispone de la informacin biolgica necesaria para que la maquinaria de la clula a la que parasita trabaje para l, y en otras posee la informacin para realizar por s mismo las diferentes funciones para su replicacin.

DOTACIN GENTICA DE LAS BACTERIAS

Las bacterias, al igual que los organismos eucariotas poseen los dos tipos de cidos nucleicos antes citados: DNA, componente de su nico cromosoma, y los diferentes cidos ribonucleicos (RNAr, RNAt, RNAm). Adems, las bacterias tambin tienen cierta cantidad extra de DNA que suele encontrarse circularizado y repetido varias veces, denominado DNA extracromosmico o DNA plasmdico y, aunque puede no contener una informacin especfica (plsmido crptico), normalmente codifica factores de resistencia a los antimicrobianos, como b-lactamasas, etc.

Bacteria

DNA plasmdico

DNA cromosmico

DNA plasmdico

Dotacin genmica de una bacteria.

CROMATINA Y CROMOSOMAS El DNA nunca est desnudo. En eucariotas interacciona con una gran variedad de protenas, se espiraliza y condensa para formar la cromatina y los cromosomas.

Los cromosomas constituyen el orden superior de empaquetamiento del DNA y se pueden visualizar al microscopio ptico. La unidad estructural por debajo del cromosoma es la fibra de cromatina que se puede visualizar al microscopio electrnico. Esta fibra est compuesta por 6-7 nucleosomas por vuelta. Cada nucleosoma es un disco formado por un octmero de protenas bsicas denominadas histonas, donde exteriormente se enrolla el DNA.

REPLICACION DEL DNA

Como dijimos anteriormente, el DNA est formado por dos hlices complementarias unidas por enlaces dbiles de puentes de hidrgeno que pueden romperse y volverse a formar simplemente calentando y enfriando. A estos procesos se les llama respectivamente desnaturalizacin y renaturalizacin del DNA.

Partiendo de este concepto y de manera muy esquemtica, la replicacin del DNA en la naturaleza consiste en:

1. Separacin de las dos cadenas que forman la doble hlice, de lo cual se encargan enzimas y protenas que se encuentran en la clula eucaritica. 2. Unin de los cebadores ('primers' o iniciadores) de RNA en una de las hebras separadas. (3'5')

3. Unin de la polimerasa a los lugares donde se encuentra el 'primer' para comenzar a copiar de manera progresiva la hebra de DNA, ya que la polimerasa necesita un cebador que le indique dnde empezar, por ser incapaz de copiar DNA monocatenario. El sentido de la sntesis es siempre 5' 3'. 4. Constitucin de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra hija, por lo que al proceso se le denomina replicacin semiconservativa del DNA. De esta forma, de un DNA parental, tras su replicacin, se obtienen dos molculas hijas exactamente iguales.

Horquilla replicativa del DNA con todas las enzimas implicadas en la sntesis. Es necesaria la existencia de un 'primer' para que la DNA polimerasa de E. coli inicie cadenas de novo. Este 'primer' es proporcionado por una RNA polimerasa llamada primasa, la cual en asociacin con un complejo de protenas llamado primosoma sintetiza una cadena corta de RNA. La DNA polimerasa III puede utilizar este 'primer' para continuar la sntesis de DNA. Una protena llamada helicasa (originalmente llamada rep) es necesaria para desenlazar y abrir la hlice de DNA para permitir la replicacin. Las protenas de enlace a ssDNA se encargan de estabilizar las regiones de simple cadena que se forman transitoriamente durante el proceso de replicacin. La DNA polimerasa puede sintetizar DNA en la direccin 5 3, por lo que una de las hebras debe ser sintetizada discontinuamente, esto lleva a la formacin de cortas cadenas de DNA con huecos entre ellas que deben ser completados por la accin de la DNA polimerasa I y unidos por la accin de una DNA ligasa.

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR Cmo hace una molcula de DNA para codificar una protena?

transcripcin DNA

traduccin RNA PROTEINA

Transcripcin: La informacin del DNA es transferida al RNAm, que es sintetizado utilizando como molde el DNA original y dirigido por la holoenzima RNA polimerasa. Este RNAm ser transportado desde el ncleo a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma. Traduccin: La factora celular responsable de la sntesis de protenas es el ribosoma. La molcula especifica que va a trasladar los aminocidos (componentes elementales de las protenas) siguiendo las pautas dictadas por el RNAm es el RNAt. Cada RNAt tiene un anticodon especifico (formado por tres bases).

Una protena cargada denominada aminoacil tRNA sintetasa es la encargada de unir el aminocido correcto correspondiente al anticodon a una posicin de anclaje. De esta manera a partir de una seal de iniciacin en el RNAm (codon ATG) comienza la sntesis, y el primer aminocido transportado por el RNAt y correspondiente a este codon es la metionina. Este primer paso se denomina iniciacin de la traduccin y tiene lugar en una posicin concreta del ribosoma denominada aminoacil (A). Posteriormente este RNAt junto con su aminocido correspondiente salta a una posicin contigua denominada peptidil (P)y llega un nuevo RNAt con el correspondiente aminocido para anclarse en su codon y se sita en la posicin A que ha quedado libre. Entre ambos aminocidos se establece una unin peptdica y el RNAt de la posicin P es liberado, comenzando el proceso de nuevo. Este proceso de elongacin continua hasta llegar a un codon de parada.

Una vez sintetizada la protena pueden haber modificaciones postranscripcionales (cortes por enzimas proteolticas, fosforilaciones, glicosilaciones etc...

LA BELLEZA DE LAS MUTACIONES Sabemos que cada gen es una secuencia de cido nucleico que transporta informacin representando un polipeptido particular. Un gen es una entidad estable, pero puede sufrir un cambio en su secuencia. A ese cambio se le llama mutacin. Sin embargo las mutaciones son importantes ya que nuestro medio sufre cambios constantes y nosotros debemos cambiar con ellos o quedaremos obsoletos y moriremos.

Uno de los mecanismos de cambio es a nivel del DNA. Las mutaciones pueden dar lugar a nuevos genes y funciones que adapten nuestro organismo a los cambios del medio ambiente en el que vive.

Hay distintos tipos de mutaciones: Mutaciones cromosmicas: Translocaciones: Implican un intercambio de grandes fragmentos de DNA entre dos cromosomas diferentes. Inversiones: Aparecen cuando una regin del DNA cambia su orientacin respecto al resto del cromosoma. Delecciones: Perdida de algn fragmento del cromosoma No disyuncin de los cromosomas

Mutaciones puntuales: Consiste en un simple cambio de una base. Mutacin sin sentido: Crea un codon de parada donde antes no exista. Mutacin de sentido perdido: Cambia el cdigo del RNAm, implicando un cambio en el aminocido codificado y por tanto en la protena correspondiente. Mutacin silente: No tiene efecto en la protena codificada.

ASPECTOS BSICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR (II) Pocas reas de la Biologa Molecular han permanecido inalteradas con la aparicin de una serie de tcnicas englobadas dentro del trmino genrico de Ingeniera Gentica y referidas indistintamente como clonaje, DNA recombinante o manipulacin gentica. Antes del desarrollo de la Ingeniera Gentica no era posible aislar un gen concreto eucaritico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto. LAS ENZIMAS Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos procesos de la Biologia Molecular. Entre ellas podemos destacar: Endonucleasas de restriccin: Son enzimas que hidrolizan los cidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotdicos del interior de la cadena. Las endonucleasas de restriccin son enzimas producidas principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces

fosfodiester del esqueleto de DNA de doble hebra en secuencias especficas. Las endonucleasas de restriccin de tipo II son las ms tiles en los mtodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reaccin de unin como para la de ruptura.

Las enzimas de restriccin se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del gnero y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia. El nmero seala el orden cronolgico de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe.

Casi todas las secuencias nucleotdicas reconocidas por las endonucleasas de restriccin poseen un eje de simetra impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palndromos. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simtrica respecto al eje binario.

Las endonucleasas de restriccin cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5 monocatenario, de unos cuatro nucletidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.

Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA in vitro. La mayora de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molcula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa (enzima empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa). La mayora de las polimerasas necesitan un pequeo cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerizacin a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que aade nucletidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+.

Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), Fosfatasas (eliminan el fosfato de la regin 5 de los cidos nucleicos, quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas) etc...

LA CLONACION

Consiste en la obtencin de un gran nmero de fragmentos idnticos a partir de uno original. Para ello se asla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plsmidos, fagos , csmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una clula va a permitir su replicacin por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran nmero de copias del fragmento de inters.

LA ELECTROFORESIS Es un mtodo que permite la separacin de molculas en base a su tamao. Esta separacin se realiza en un gel, que es una malla compleja de molculas polimricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de cidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases. La poliacrilamida es preferible para la separacin de fragmentos ms pequeos de cidos nucleicos. El fundamento de esta separacin est basado en que las molculas de cidos nucleicos estn cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampn en el que se encuentran) y al someterlas a un campo elctrico migran hacia el polo positivo de este a travs del gel, a velocidades que dependen de sus tamaos: una molcula pequea puede seguir su camino a travs del gel ms fcilmente que una molcula grande. Las velocidades de migracin de las molculas de cidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares (Aaij y Borst). La deteccin tras la migracin se realiza fcilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los cidos nucleicos) que contiene el propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para

valorar la migracin de los cidos nucleicos en un gel adems de su tamao es la configuracin espacial que adopte la molcula.

El peso molecular de los cidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:

DNA: en pares de bases o bp. RNA : en nucletidos o nt. Protenas: en Daltons o Da.

LA HIBRIDACION Es un proceso de unin de dos hebras complementarias de cidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas ser el cido nucleico diana y la otra ser la sonda empleada para localizar ese cido nucleico diana.

Qu es una sonda?

Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molcula reporter, y que se emplea para el reconocimiento especfico de una molcula determinada de cido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridacin.

Existen tres tipos de sonda de cidos nucleicos:

Fragmentos de DNA Fragmentos de RNA Oligonucletidos sintticos u oligosondas.

Qu son las molculas reporter? Son molculas qumicas unidas a la sonda y que van a permitir la deteccin de esta tras un proceso de hibridacin. Existen molculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimticas (Fosfatasa, Peroxidasa ...) y quimioluminiscentes (steres de acridina).

Qu factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reaccin de hibridacin? Concentracin del cido nucleico diana Complementariedad sonda-cido nucleico diana Concentracin de la sonda. Longitud de la sonda Actividad especfica de la molcula reporter. Condiciones de hibridacin (pH, fuerza inica, temperatura de hibridacin, ...) Tm Acceso al cido nucleico diana. Formato de hibridacin

Cuales son los formatos de hibridacin?

Hibridacin en solucin: La sonda y el cido nucleico diana se encuentran en una solucin lquida. Las condiciones de hibridacin deben ser rigurosas. La velocidad de

formacin del duplex en estas condiciones es alta. El problema de este tipo de hibridacin es la eliminacin de la sonda que no ha reaccionado, emplendose entre otros mtodos la nucleasa S1-precipitacin con tricloroactico o la hibridacin protection assay.

Hibridacin en fase slida: El cido nucleico diana o bien la sonda se encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijacin por calor) o de nylon (fijacin por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijacin se aade la sonda marcada que buscar su secuencia complementaria en el cido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona, hbridos inestables o uniones inespecficas son eliminados mediante lavados. Su sensibilidad es menor que la hibridacin en solucin. Actualmente tambin se ha conseguido fijar los cidos nucleicos al plstico de las placas de microtitulacin.

Existe un tipo de hibridaciones en fase slida que son muy empleadas en Biologa Molecular: los Southern blot (DNA cortado con enzimas de restriccin e hibridado con una sonda de DNA) y Northern Blot (RNA separado e hibridado con sondas de DNA o RNA). Estas tcnicas consisten en una separacin inicial de las molculas en base a su peso molecular mediante electroforesis , trasferencia capilar de estas molculas a un filtro de papel o de nylon, fijacin, hibridacin con la sonda de inters y deteccin.

Hibridacin in situ

Permite la deteccin de genes o expresin de genes dentro del contexto morfolgico de la clula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el cido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener acceso la sonda, pero preservando la morfologa para la consiguiente interpretacin y anlisis. Para ello se emplean fijadores especialmente de entrecruzamiento, como la formalina, paraformaldehido, glutaraldehido. El empleo de proteasas, que facilitan el acceso de la sonda al cido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no provocar el desmantelamiento de la morfologa celular. Se recomienda el empleo de oligosondas.

Sondas de PNA (Peptide Nucleic Acid)

Fueron inventadas en 1990 por un grupo de cientficos daneses (Buchardt, Berg, Nielsen, Egholm). Son una nueva clase de sondas hbridas entre cido nucleico y protenas, diseadas para la deteccin de secuencias especficas de cidos nucleicos. Su estructura esta formada por una cadena de aminocidos que forman el esqueleto principal, y a los cuales se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los parmetros conformacionales descritos por Watson y Crick. Las bases (A,T,C,G) estn colocadas a la misma distancia que en el DNA

Esta estructura hibrida le confiere una serie de caractersticas especiales:

Son molculas de simple cadena No estn cargadas siendo el esqueleto principal flexible. Sus hibridaciones son rpidas, especficas y sensibles.

Presentan una especificidad y sensibilidad mas elevada que los oligomeros DNA/RNA

Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede. Enlaces ms fuertes Molculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas.

SECUENCIACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

La introduccin de mtodos rpidos de secuenciacin a finales de los aos 70 represent un cambio importante en los estudios sobre el DNA Existen dos mtodos de secuenciacin de los cidos nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos qumicos a fin de cortar el DNA a nivel de bases especficas. El otro se denomina enzimtico, de terminacin en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un fragmento de cido nucleico.

En el mtodo qumico un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por accin de la enzima polinucletido quinasa. Ambos extremos se separan por la accin de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos fragmentos, no ms de una o dos veces por molcula, con reacciones qumicas especficas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alcuotas y trataremos cada una de ellas con un compuesto qumico que modifique una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molcula de DNA. El tratamiento posterior con piperidina producir la rotura de la cadena all donde la base haba sido alterada.

Especificidad Base Reactivo

G G+A T C

Dimetil sulfoxido Acido frmico Permanganato Potsico Hidroxilamina

Posteriormente se analizan los fragmentos en geles desnaturalizantes.

El mtodo enzimtico es el ms utilizado en la actualidad. Se prepara un DNA circular lineal (clonando en el fago M13). Se introduce un cebador que va a servir para el inicio de la sntesis del DNA que vamos a marcar y a secuenciar. El cebador es especfico a

una secuencia complementaria del fago M13. Una polimerasa (enzima de Klenow o secuenasa) se encarga de polimerizar. Se establecen cuatro alcuotas. La sntesis se lleva a cabo en dos pasos: en la primera parte del proceso el cebador se alarga unos cientos de nucletidos utilizando para ello los cuatro nucletidos, pero uno de ellos est marcado. En el segundo paso se produce la terminacin de las cadenas por la adicin de una pequea cantidad de un dideoxinucletido distinto en cada alcuota. El dideoxido es un nucletido trifosfato que por carecer de grupos OH tanto en el carbono 2como el 3 de la ribosa lo que imposibilita el crecimiento de la cadena paraliza la sntesis. El resultado en cada tubo de ensayo es una coleccin de fragmentos, de tantos tamaos como unidades de la base existan en la secuencia. Los distintos fragmentos se analizan por electroforesis en geles de acrilamida.

Actualmente para el marcaje se utilizan cuatro fluorocromos distintos: fluoresceina, NBD(4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazol), tetrametilrodamina y rojo texas, uno para cada base. . Una vez conjugados a cuatro alcuotas del cebador, se procede a la extensin del iniciador e interrupcin con dideoxis.

Geles de secuenciacin

TECNICAS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

Se renen con esta denominacin una serie de tcnicas que nos van a permitir un aumento considerable en la deteccin de secuencias especficas de los cidos nucleicos

Amplificacin de la diana PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa) 3SR (Self sustaining sequence replication) NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) SDA (Strand displacement amplification)

Amplificacin de la diana Qb replicasa LCR (Ligase chain reaction)

Amplificacin de la seal Branched probe Gen point (hibridacin in situ)

EL DIAGNOSTICO DEL FUTURO Muestra Extraccin de A.N. Amplificacin de zona inters Secuenciacin

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FUNDAMENTOS DE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Dr. D. Antonio Martnez La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica de laboratorio que permite la copia in vitro de secuencias especficas de DNA y que ha revolucionado el campo de la Biologa Molecular. Conceptualmente, la PCR es una tcnica sencilla, consiste en la separacin por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere amplificar, y su copia simultnea a partir de un punto, determinado por un fragmento de DNA artificial llamado cebador, mediante la accin de una enzima denominada DNA polimerasa. El resultado es la duplicacin del nmero de molculas de una secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un nmero determinado de veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificacin exponencial del nmero de

copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si partimos de una molcula nica de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se duplica el nmero de molculas, tericamente, al final de los 30 ciclos, se obtendrn 230 molculas idnticas, es decir 1073741824 molculas.

La gran ventaja de la PCR es que amplifica nicamente el fragmento de DNA que queremos aunque est en cantidades mnimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La reaccin es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia de otros componentes.

La PCR se aplic inicialmente como una tcnica de laboratorio de investigacin, pero su gran especificidad y sensibilidad ha permitido el desarrollo de tcnicas especficas basadas en la PCR en muchos campos de la investigacin y el anlisis. As, la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigacin (clonado de genes, deteccin de clones recombinantes, estudio de DNA de fsiles), medicina forense y criminalstica (determinacin de la paternidad, identificacin de individuos, identificacin sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violacin, etc.), sanidad animal y mejora gentica (deteccin de enfermedades genticas e infecciosas, pureza de razas, etc.) y medicina (diagnstico de enfermedades).

La PCR fue desarrollada por Kary Mullis (Saiki et al, 1985; Mullis, 1990) en 1985, utilizando como DNA polimerasa el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llev a cabo cambiando los tubos de reaccin en cada ciclo, entre dos baos que estaban a 94 C (desnaturalizacin) y 37 C (hibridacin y extensin del cebador). Debido a que esta enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 C, era necesario aadirla en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalizacin, lo que converta a la PCR en una tcnica tediosa y costosa. La PCR mejor vertiginosamente como herramienta de laboratorio a partir de 1988, gracias a dos hechos que hicieron que la tcnica se pudiera automatizar: el primero de ellos fue la comercializacin de la enzima denominada Taq polimerasa (Saiki et al, 1988) que es un enzima termoestable, por lo que permanece activa despus de incubaciones prolongadas a 94 C, y no hay que aadirla en cada ciclo de amplificacin. El segundo hecho fue la aparicin en el mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura automticamente, sin necesidad de distintos baos. La gran revolucin que ha producido en la Biologa Molecular la aparicin de la PCR ha supuesto para su descubridor la concesin del Premio Nobel en el ao 1993.

A lo largo de la clase se repasarn los aspectos crticos que afectan a la reaccin, sus componentes, as como la optimizacin de un protocolo de PCR.

RAZONES PARA LA UTILIZACIN DE TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR EN EL LABORATORIO DE ANATOMA PATOLGICA. Error! No se encuentra el origen de la referencia. Dr. D. Julio Velasco.

1.

INTRODUCCIN

Los laboratorios de anatoma patolgica se han enriquecido de una manera notoria con los avances en la inmunologa y en la biologa molecular, los cuales, han puesto un autntico arsenal de tcnicas novedosas para realizar diagnsticos que, hasta hace bien poco, eran exclusivamente morfolgicos.

El uso de las tcnicas de biologa molecular es un hecho en muchos de nuestros laboratorios y tiene el mismo significado que tuvo la aplicacin de la microscopa electrnica o la inmunohistoquimia en un pasado an cercano. Al igual que ocurri con con estas tcnicas los inicios son confusos y la proporcin de escpticos y de profesionales contrarios a su implantacin como tcnicas de rutina va disminuyendo con el paso del tiempo y con los crecientes logros de las mismas.

Es necesario que una disciplina de la importancia de la anatoma patolgica no languidezca, que se impregne de los nuevos conocimientos y que los aplique adecuadamente, que con la mayor premura comencemos a escudriar los formidables secretos que nos depara el ADN.

Las aplicaciones actuales de la biologa molecular para el diagnstico clnico son muy variadas: Gentica

Diagnstico prenatal Tipaje de HLA Reordenamientos genticos Deteccin de esperma aneuploide Creacin de mapas genticos

Diagnstico Microbiolgico Diagnstico rpido de infecciones vricas Deteccin de microorganismos en clulas infectadas/transformadas

Determinacin de la relacin gnetica entre varios tipos de microorganismos similares Correlacionar la presencia/expresin de agentes virales/infecciosos en tejidos neoplsicos. Determinar la resistencia a los antibiticos de las bacterias. Epidemiologa de las infecciones

Detectar y cuantificar microorganismos difciles de cultivar o para los que no existen reactivos serolgicos. Detectar regiones transformantes especficas en virus

Diagnstico y clasificacin de neoplasias y establecimiento de un pronstico Detectar reordenamientos de genes Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalas consistentes cariotpicas Detectar reordenamientos moleculares/anomalas de expresin gentica en ausencia de alteraciones del cariotipo Estudio de la estructura/expresin de oncogenes Deteccin de amplificacin gentica/resistencia a drogas Diagnstico de cell lineage en base a la expresin gentica

Laboratorio clnico/endocrinologa Detectar la produccin de hormonas ectpicas

2. MATERIAL Y MTODOS EN BIOLOGA MOLECULAR APLICADA A LA ANATOMA PATOLGICA sondas de nucletidos ADN o ARN diana aparatos nucletidos, tampones y otros reactivos

2.1. TCNICAS DE HIBRIDACIN UTILIZADAS EN ANATOMA PATOLGICA. Hibridacin in situ con filtro Hibridacin Southern blot blot invertido dot/spot blot Hibridacin sandwich Hibridacin in situ Hibridacin Northern

Hibridacin en fase lquida Sistema de captacin de hibridos FISH HGC

MTODOS DE AMPLIFICACIN GENTICA PCR PCR in situ

1.2. OTRAS TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR APLICADAS A LA ANATOMA PATOLGICA. Tcnicas de secuenciacin Tcnicas de clonacin

1.3. LA EXPERIENCIA DEL SERVICIO DE ANATOMA PATOLGICA DEL HOSPITAL SAN AGUSTN EN LA APLICACIN DE TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR.

En nuestro servicio comenzamos a utilizar tcnicas de biologa molecular desde finales de los 80. Inicialmente trabajamos con hibridacin in situ en biopsias con sondas de ADN con marcaje enzimtico, actualmente solamente realizamos hibridacin in situ para detectar virus Epstein-Barr por medio de sondas PNA. En 1989 incorporamos a nuestro laboratorio, con material adquirido con una beca DGCYT, las tcnicas de hibridacin con sondas radioactivas con las que empezamos a realizar de forma sistemtica el tipaje de los diferentes virus del papiloma humano. En 1991, con ayudas del Fondo de Investigacin Sanitaria, pusimos los primeros ladrillos de lo que ya se puede considerar como un laboratorio de PCR. En este laboratorio se realizan anualmente mas de 200 pruebas de PCR, fundamentalmente deteccin y tipaje de virus del papiloma humano y, en menor medida, deteccin de la t(14;18) en procesos linfoproliferativos. Para la deteccin y tipaje de virus del papiloma humano tras algunas

pruebas con diferentes reactivos nos inclinamos por utilizar primers que amplifican un fragmento de unos 450 pb localizado dentro del ORF del virus. Esta regin presenta un patrn de restriccin caracterstico para los diferentes genotipos, con lo cual podemos hacer un excente tipaje sin recurrir a tcnicas de hibridacin post-amplificacin con el consiguiente ahorro de tiempo y, como no, de dinero. La realizacin de PCR para detectar virus del papiloma humano es, hoy da, una tcnica que se utiliza de forma rutinaria para el manejo de las mujeres con diagnsticos citolgicos de lesiones premalignas y malignas y como instrumento de control de calidad.

La tcnica de PCR t(14;18) la utilizamos basicamente para diferenciar procesos benignos en los ganglios linfticos de linfomas foliculares. En nuestro laboratorio realizamos una amplificacin de los dos posibles puntos de traslocacin la major breakpoint region y la minor cluster region, adems de un fragmento del gen de la betaactina. La deteccin del producto amplificado se realiza con la tcnica ELISA.

Brevemente utilizamos algunas otras tcnicas de biologa molecular en nuestro Servicio. Realizamos una pequea serie de dot blot con sondas biotiniladas complementarias de ADN EBV y tambien realizamos algunos experimentos con el sistema de captacin de hbridos.

2.4. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. FENOGLIO C, WILLMAN CL. Molecular biology and the pathologist. Arch Pathol Lab Med 111:601-619;1987 2. NUOVO GJ,RICHART RM. A comparison of slot blot, Southern blot and in situ hybridization analyses for HPV DNA in genital tract lesions.Obst Gynecol,74:673678;1989 3. SCHNEIDER A,GRUBERT T. Diagnosis of HPV infections by recombinant DNA technology.Clin Obst Gynecol,32:127-139;1989 4. SCHOLTE GHA, VAN DOORN LJ, QUINT WGV, LINDEMAN J. Polymerase chain reaction for the detection of Helicobacter pylori in formaldehyde-sublimate fixed, paraffin-embedded gastric biopsies. Diagn Mol Pathol 6:238-243;1997 5. SYRJANEN S.:Basic concepts and practical applications of recombinant DNA techniques in detection of HPV infections.APMIS,98:95-110;1990 6. VELASCO J,PALACIO V,VAZQUEZ S,MOSQUERA C,SAMPEDRO A.:Diagnostic accuracy of the cytologic diagnosis of anal HPV infection compared with DNA hybridization studies.STD;20:1-5;1993

INSTRUMENTOS DE USO HABITUAL Y ORGANIZACIN DE UN LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR. Dra. Da. Pilar Arca

Toda la charla girar en torno a qu condiciones debe cumplir un laboratorio de Biologa Molecular de tipo clnico. Si bien la Biologa Molecular abarca diferentes campos, durante la exposicin se har especial hincapi en aquel relacionado con los cidos nucleicos: ADN y ARN.

Despus de la exhibicin de unas diapositivas mostrando la organizacin espacial del laboratorio de Biologa Molecular de Ampligen Diagnsticos se pasar a exponer cuales fueron las razones para dicha distribucin, y cuales son los instrumentos totalmente necesarios para que cada una de las reas funcione de forma autnoma e independiente. Entre dichos instrumentos estarn aquellos dedicados a:

1. la correcta preparacin de tampones, sales, soluciones de lisis o soluciones de purificacin del ADN /ARN, 2. la obtencin y cuantificacin del ADN/ARN a partir de distintas muestra biolgicas, 3. 4. 5. y, 6. la amplificacin en solucin e in situ de ADN/ARN, hibridacin de ADN/ARN, separacin de las molculas de ADN/ARN en geles de agarosa o de poliacrilamida visualizacin de las molculas de ADN/ARN una vez separadas en gel.

OBTENCIN DE ADN Y SEPARACIN DE FRAGMENTOS DE ADN. Dra. Da. Pilar Arca A un laboratorio de Biologa Molecular de tipo clnico llegan distintos tipos de muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN. A priori se plantean dos situaciones diferentes. Si lo que se pretende es conocer la ubicacin fsica del ADN/ARN de inters en un corte histolgico se deber proceder a estudios in situ, mientras que si no es necesario conocer dicha ubicacin ser suficiente con obtener el ADN celular en solucin. El ADN en solucin es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.

Centrndose en la obtencin de ADN en solucin existen diferentes mtodos de lisis: lisis diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solucin de ADN obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificacin, restriccin, marcaje o secuenciacin, por lo que es conveniente por un lado separar el ADN del resto de macromolculas que lo acompaan, preferentemente protenas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes orgnicos (fenol y cloroformo) y, por otro separar el ADN de aquellas molculas de pequeo tamao con actividad inhibidora presentes en la solucin de ADN. El ADN una vez limpio de protenas y/o pequeas molculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayora de las situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltracin o precipitacin con alcohol.

El sistema de valoracin de la concentracin de ADN ser funcin de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido. Pueden emplearse

desde mtodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometra y fluorometra, hasta mtodos aproximativos, tales como la comparacin del grado de fluorescencia respecto a un control de concentracin conocida.

Una vez conocida la concentracin del ADN, ste ser utilizado bsicamente con el propsito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.

En ciertos casos la simple deteccin del fragmento amplificado tiene valor diagnstico por s mismo. La metodologa empleada para la deteccin puede ser: 1. separacin y visualizacin de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. deteccin de infeccin por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncognicos...). En otros casos el valor diagnstico se obtiene por comparacin de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de caractersticas conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado del gen supresor p53 en relacin al mismo exon normal...), o bien, 2. deteccin del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimtrico o quimioluminiscente.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes tcnicas:

1. Corte con enzimas de restriccin. Los fragmentos generados en la restriccin se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificacin HPV, genotipado ApoE...). 2. Hibridacin. Los fragmentos generados en el PCR se separan en gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificacin de los genes HLA Clase II...). 3. Secuenciacin. Los fragmentos generados durante la reaccin de secuenciacin se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciacin de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades...).

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR EN FASE LQUIDA Y CON MEMBRANA. APLICACIN A LA ANATOMA PATOLGICA. Dr. D. Julio Velasco 1. INTRODUCCIN

Las tcnicas de biologa molecular que utilizan membranas o las que se utilizan, sondas y ADN diana en medio lquido estn poco extendidas en los laboratorios de Anatoma Patolgica. La razn fundamental es que, a pesar de sus muchas ventajas, no permiten visualizar la morfologa del espcimen.

2. MTODOS DE MEMBRANA

Describiremos los ms utilizados en Anatoma Patolgica.

Hibridacin in situ con filtro (HISF). Este mtodo tampoco precisa de extraccin de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las clulas se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalizacin del ADN. El mtodo HISF es de muy fcil ejecucin, rpido y barato es ,sin embargo, poco especfico y, a menudo, resulta difcil separar las seales positivas del fondo (1). Su uso se limita a trabajos con gran cantidad de especmenes.

Hibridacin Southern blot (SB). Necesita de la extraccin del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminacin de ARN y proteinas de la misma por digestin enzimtica. Con la aplicacin de endonucleasas de restriccin-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaos ofreciendo un patrn caracterstico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizndose una separacin electrofortica de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizndose una hibridacin. El SB es el mtodo de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta tcnica es superior a cualquier otra debido a la

purificacin extra del ADN por electroforesis. Adems es el nico mtodo que permite conocer si el genoma viral est en situacin episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad tcnica, duracin de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.

El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reaccin individual para cada especmen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/clula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espcimen.

El dot/spot blot (DB) consiste en la extraccin del ADN celular total y en su desnaturalizacin, despus se fija a una membrana por medio de presin negativa en un aparato manifold. Tambin se puede realizar la desnaturalizacin en la misma membrana. Una vez realizada la hibridacin se produce la autorradigrafa, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimtico, si se utilizaron fras. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especmenes mientras que el SB no admite mas de 15. Uno de los problemas mas importantes del DB es el "fondo" provocado por las hibridaciones inespecficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los hbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecficas pueden eliminarse con la aplicacin de ARNasa (2).

La hibridacin sandwich (HS) no necesita extraccin del ADN. Esta tcnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una regin complementaria con el cido nuclico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia especfica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos est marcado y se fija al hbrido anclado en la membrana permitiendo su deteccin.La HS es un mtodo con una especificidad estimada en 1-5 X 105 molculas de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, adems, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X 105 (3).

La hibridacin Northern se utiliza para la detccin de RNA de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.

En todos los sistemas de hibridacin descritos anteriormente el cido nuclico diana est localizado en un soporte slido, bien una membrana o una biopsia o extendido

citolgico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el cido nucleico se encuentra disuelto en un lquido.

3. MTODOS DE HIBRIDACIN EN FASE LQUIDA

En la hibridacin en fase lquida, la sonda y el HPV diana estn en solucin. La hibridacin en fase lquida ha sido utilizada para estimar la relacin gentica entre los diferentes HPVs, hoy da es de escaso uso.

El sistema de captacin de hibridos tambin se realiza en medio lquido.Primero se desnaturaliza el especimen, posteriormente se hibrida el HPV ADN con la correspondiente sonda. Los hbridos son capturados por la superficie del recipiente, cubierta con anticuerpos anti-hbridos que reaccionan con fosfatasa alcalina, hacindose visibles tras la aplicacin de un sustrato quimioluminiscente. Los sistemas captacin de hbridos estn todava en fase experimental, las pruebas iniciales permiten suponer una elevada sensibilidad y fcil manejo de la tcnica.

4. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. SCHNEIDER A,GRUBERT T. Diagnosis of HPV infections by recombinant DNA technology.Clin Obst Gynecol 32:127-139;1989 2. VELASCO J, FERNANDEZ C, LOPEZ I, CUETO A, SAMPEDRO A. Disappearence of DNA HPV in sequential specimens of occult cervical infections in a "normal" population. Eur J Gynaec Oncol 23:372-377;1996. 3. PARKKINEN S. Nucleic acid sandwich hybridization in detection of HPV 16 DNA:Technique and its clinical application.J Virol Meth 19:69-77;1988

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR in situ: HIBRIDACIN in situ Y PCR in situ. Error! No se encuentra el origen de la referencia. Dr. D. Julio Velasco 1. INTRODUCCIN Las tcnicas "in situ" tienen la gran ventaja de que son las nicas tcnicas de biologa molecular que permiten en un solo acto correlacionar positividad o negatividad con la morfologa de la lesin. Este hecho es de incalculable valor para una especialidad esencialmente morfolgica, como es la Anatoma Patolgica.

2. 1. LA HIBRIDACIN IN SITU (HIS). Se utiliza en cortes histolgicos y en extendidos citolgicos. La sonda se aplica directamente sobre el espcimen (no requiere extraccin del ADN), previamente tratado con una proteasa para permitir su acceso al ADN nuclear.La desnaturalizacin del ADN diana y de sonda marcada se realiza simultaneamente utilizando elevadas temperaturas (alrededor de 100 ). La HIS es una tcnica mucho menos sensible que los mtodos de membrana,necesitando 100 veces mas copias virales que el dot blot o que el southern blot (1), aunque puede ser tan efectiva como aquellas cuando el tipo infectante es 6/11 o 16 y cuando la lesin muestra los cambios histolgicos tpicos de lesin HPV (2). Cuando el condiloma se acompaa de displasia, la HIS disminuye la rentabilidad segn el grado de la misma, lo cual refleja la disminucin del nmero de copias virales con la progresin de la lesin. Otro problema es que precisa de tejido, puesto que aunque se puede practicar en frotis citolgicos sus resultados no son tan buenos como con material procedente de una biopsia. La HIS tiene la gran ventaja de que permite la visualizacin al microscopio del lugar donde tuvo lugar la hibridacin, motivo por el cual es la tcnica de hibridacin con cidos nuclecos preferida por los anatomopatlogos.

2. 2. PCR IN SITU. La tcnica PCR, como es sabido, utiliza una enzima, la polimerasa, para copiar a una determinada molcula de un cido nucleico, habitualmente un ADN. La repeticin de este proceso origina la produccin de un gran nmero de molculas hijas puesto que las nuevas molculas son utilizadas por la polimerasa como moldes. El proceso se inicia con la separacin de las dos cadenas que configuran la molcula de ADN o por el calentamiento de solucin en la que encuentra el ADN a unos 90. Tras un descenso trmico de la solucin se produce el "anillamiento" o hibridacin de dos secuencias diferentes de nucletidos, denominados "primers" o "cebadores" que delimitan el fragmento de ADN a amplificar. Con el concurso de la polimerasa se van aadiendo los nucletidos presentes en la solucin, fase denominada de "extensin" de

los cebadores. Cada uno de estos ciclos se repite un nmero determinado de veces en un aparato denominado termociclador que permite ascensos y descensos trmicos programables. El hecho de que las moleculas hijas sirven a su vez de molde para sintetizar nuevos ADNs produce un efecto multiplicador, producindose aproximadamente 106 copias de ADN en unos 30 ciclos. El ADN amplificado se puede detectar por medio de una reaccin de hibridacin o bien por medio de una electroforesis en gel con bromuro de etidio y una fuente de luz ultravioleta para su identificacin. El avance que hizo posible la tcnica de la PCR fu el descubrimiento de polimerasas capaces de actuar a temperaturas elevadas. La primera de ellas fu la que que contienen las bacterias denominadas Thermus aquaticus o polimerasa Taq y que se hallan en manatiales donde las aguas termales estn a menudo a temperaturas superiores a 90. Antes del descubrimiento de esta polimerasa se realizaban tcnicas de amplificacin de ADN con el fragmento de Klenow como polimerasa ADN,pero esta enzima es inestable a temperaturas superiores a los 37,con lo que era necesario aadir una dosis de enzima en cada ciclo de amplificacin lo cual resultaba extraordinariamente tedioso a la par que se acumulaban grandes cantidades de enzima degradada. El descubrimiento de la Taq polimerasa evit la necesidad de aadir enzima en cada ciclo de amplificacin, facilitando as la automatizacin del proceso.

La extraordinaria sensibilidad de la tcnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un milln de clulas es un arma de gran valor en la deteccin de infecciones HPV, especialmente en aquellas con un bajo nmero de copias vricas, como es el caso de la infeccin oculta. El problema mas importante de las tcnicas de amplificacin genmica es la contaminacin de la reaccin con ADNs extraos, en cualquiera de sus fases, produciendo resultados falsamente positivos. La adopcin de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de separacin de especmenes y reactivos o de "primers" anticontaminacin permiten la obtencin de resultados fiables. Otra desventaja de la reaccin de PCR es la no amplificacin de genomas cuando no existen "primers" especficos, con la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs. La tcnica PCR in situ adapta la tecnologa habitual de la PCR a un corte histolgico. Se puede utilizar un termociclador convencional con alguno "trucos" (3), o bien recurrir a un termociclador especfico para PRC in situ

3. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. SMOTKIN D. Virology of Human Papillonavirus. Clin Obstet Gynecol 32:117126,1989. 2. NUOVO GJ,RICHART RM. A comparison of slot blot, Southern blot and in situ hybridization analyses for HPV DNA in genital tract lesions.Obst Gynecol 74:673678;1989 3. NUOVO GJ, GALLERY F, MacCONNELL P, BRAUN A. In situ detection of PCR-amplified HIV-1 nucleic acids and tumor necrosis factor RNA in the central nervous system. Am J Pathol 144:1-8;1994

BASES TERICAS DE LA TCNICA LCR Dr. D. Juan Jos Palacios INTRODUCCIN El principio bsico de cualquier tecnologa diagnstica molecular es la deteccin de una secuencia especfica de cidos nucleicos mediante hibridacin con una secuencia complementaria, la sonda, seguida de la deteccin del hbrido. Sin embargo, la sensibilidad de los tests que utilizan sondas de cidos nucleicos sin recurrir a la amplificacin es inferior a la de los tests clsicos. Su aplicacin principal es la identificacin de microorganismos ms que su deteccin. La replicacin del ADN fue posible en 1958 cuando Kornberg descubri la ADN polimerasa; durante muchos aos la principal aplicacin fue la secuenciacin de ADN (Sanger et al.). En 1986 Mullis et al. describieron un proceso reiterativo que permita incrementar exponencialmente el nmero de cidos nucleicos (amplificacin). Las tcnicas de amplificacin pueden clasificarse de diferentes formas: conceptualmente, aquellas en las que se amplifica la diana (polymerase chain reaction -PCR-; stranddisplacement amplification-SDA-; nucleic acid sequence-based amplification-NASBA-; transcription-mediated amplification-TMA-); las que se amplifica la sonda (Q replicase amplification-QRA-); y mixtas (gapped-LCR). Ligasas y mecanismos de ligacin La enzima ADN ligasa es esencial para la replicacin del ADN, para la recombinacin y para la reparacin de material gentico in vivo. A partir de virus y de organismos tanto procariotas como eucariotas, se han aislado y caracterizado diferentes ADN ligasas; ms recientemente, han sido clonadas y purificadas ADN ligasas a partir de microorganismos termoflicos. Las ligasas caracterizadas hasta la fecha constan de una simple cadena polipeptdica y exhiben diferentes actividades. La actividad de ligacin incluye: 1) la unin de cidos nucleicos de doble cadena con terminales cohesivos, 2) la unin de complejos blunt-end, y 3) la unin de fragmentos de cidos nucleicos por medio de mecanismo de sellado de brechas (nick-sealing) . La tecnologa diagnstica de la ligasa explota casi exclusivamente la actividad selladora de brechas. Las ADN ligasas mejor estudiadas son las aisladas de Escherichia coli y las codificadas por el genoma del bacteriofago T4. E. coli ADN ligasa es especfica para la unin de segmentos de ADN que estan hibridados a una secuencia de un ADN molde; por contra, T4 ADN ligasa cataliza la unin de segmentos de ARN o ADN con cualquier molde sea ARN o ADN. El sustrato tpico para la actividad de sellado de brechas comprende al menos dos segmentos de ADN que estan hibridados y en posiciones inmediatamente adyacentes en la misma hebra del cido nucleico molde (Figura-1). La secuencia 5 debe terminar con un grupo hidroxilo (OH) en 3; mientras que la secuencia 3 debe poseer un grupo fosfato (P) en 5. La unin enzimtica de los dos segmentos de cidos nucleicos se lleva a cabo por medio de una reaccin que consta de tres pasos. El complejo ligasa-AMP esta formado por una conexin fosfoamida entre una lisina residual en la molcula de la enzima y el AMP derivado del cofactor apropiado (cualquiera NAD o ATP).

Posteriormente, una conexin fosfodiester se forma entre el AMP del complejo y el fosfato 5 de la sonda B. El ataque nucleoflico del fosfato 5 por el grupo hidroxilo 3 de la sonda A resulta en un sellado de la melladura, con liberacin de AMP.

Mtodos de deteccin La especificidad de las tcnicas moleculares es dependiente de la astringencia (rigidez) de las condiciones de hibridacin, la cual est determinada por una combinacin de diferentes factores incluyendo la temperatura y la concentracin de sales. La presencia de una secuencia diana dentro de una muestra clnica se demuestra por la formacin de un hbrido de cidos nucleicos entre la diana y la sonda. La sonda puede marcarse directa o indirectamente, con una molcula detectable. El marcaje directo puede realizarse con radioisotopos (ej. P32 o S35) o con molculas fluorescentes (ej. fluorescena o rodamina). Las sondas pueden marcarse en posicin 5 o 3 por medio de reacciones enzimticas; tambin es posible el marcaje en posiciones internas mediante la incorporacin, va polimerizacin, de nucletidos modificados. El marcaje indirecto depende del uso de una pareja de ligandos por afinidad como son la biotina y la estreptavidina, as, las sondas pueden ser marcadas con biotina en alguna de las diferentes posiciones posibles, y tras la hibridacin con la secuencia diana el complejo puede reaccionar con un conjugado estreptavidina-enzima, para, posteriormente, llevar a cabo la deteccin del complejo resultante mediante la incubacin con un sustrato adecuado para la enzima.

Un defecto de estos mtodos es la posibilidad de hibridacin cruzada de las sondas con secuencias diferentes a la diana elegida. Este problema es especialmente relevante en tcnicas de hibridacin en solucin. Aunque la hibridacin en solucin ofrece la ventaja de una rpida cintica, se hace necesario separar, antes de la fase de deteccin, los hibridos sonda-diana de la sonda no unida, lo que dificulta la automatizacin de estas tcnicas. Para reducir este problema se recurre a mtodos como el Southern (DNA) y Northern (RNA) blotting, en los que se produce una separacin de las molculas de cidos nucleicos por electroforesis, para, subsecuentemente, ser transferidas a un soporte slido. Los cidos nucleicos inmovilizados se incuban bajo condiciones cuidadosamente controladas en una solucin que contiene la sonda para asegurar el ms alto nivel de especificidad.

Se han descrito diferentes sistemas de hibridacin con dos sondas, el formato ms tpico es aquel en el que las dos sondas hibridan con secuencias diferentes de la misma diana, una sonda se marca con un grupo de captura y la otra con un grupo detectable. Al reaccionar las dos sondas con la muestra que contiene la secuencia diana se produce la formacin de un complejo sonda de captura-diana-sonda de deteccin; posteriomente,

antes de la fase de deteccin, este complejo se separa de las sondas no unidas gracias al grupo de captura. La especificidad de este sistema deriva del hecho de que tienen que producirse dos eventos de hibridacin diferentes para que se genere el complejo sonda de captura-diana-sonda de deteccin. Sin embargo, es necesario un cuidadoso control de las condiciones de hibridacin para mantener un nivel de especificidad elevado.

A finales de los aos 80 se describi un mtodo de ligacin de oligonucletidos para sellar brechas de ADN denominado OLA (oligonucleotide ligation assay), precisa de un mnimo de dos sondas especficas para la misma diana que hibridan en posiciones inmediatamente adyacentes. La sonda A contiene un grupo hidroxilo 3 libre, la sonda B contiene un grupo 5 fosfato libre; las sondas hibridadas presentan un sustrato adecuado para que la actividad de la ADN ligasa permita la unin mediante sellado de la brecha. La estabilidad del producto de ligacin-diana es mayor que la del producto sonda individual-diana. Las sondas pueden ser modificadas de tal modo que una contenga una mitad con un marcaje de captura y la otra con un marcaje de deteccin. Con esta configuracin nicamente son capturados y detectados los productos ligados. La presencia de errores en la zona de ligacin o bien en zonas prximas a ella repercuten negativamente en la actividad de la ligasa; sin embargo, aunque la capacidad de la ligasa para discriminar errores es elevada no es absoluta. La discriminacin de errores se ve afectada por la concentracin de sales, por la concentracin de enzima, y por la temperatura; tambin por errores especficos de bases. La inclusin de 200 mM NaCl o 2-5 mM espermidina reduce tanto la adenilacin como los errores de ligacin.

La tcnica de ligacin de oligonucletidos es un mtodo particularmente til para la deteccin de anormalidades genticas especficas como son: las mutaciones puntuales, las delecciones y los cambios estructurales. La eficiencia de este sistema ha sido demostrada en diferentes enfermedades (anemia de clulas falciformes, fibrosis qustica). La sensibilidad de la prueba puede ser mejorada asociando la ligacin de oligonucletidos con la amplificacin de cidos nucleicos mediante PCR.

Una variante consiste en la eleccin de sondas de tal modo que cuando la diana est presente las sondas hibridarn pero en posiciones no inmediatamente adyacentes sino separadas por un hueco o gap (Figura-2). El tamao del hueco puede variar, pero habitualmente afecta a uno o a varios pares de bases. La sonda A se extiende a travs de la regin del gap por medio de la ADN polimerasa en presencia de los desoxirribonucletidos trifosfato (dNTP) para conseguir que las sondas queden adyacentes. A la sonda B se le proporciona un grupo 5 fosfato. Las sondas, nuevamente adyacentes, son entonces unidas por la ADN ligasa. Las secuencias de las sondas son diseadas de tal modo que la mutacin sea identificada en la secuencia diana siempre que est situada dentro del gap (entre las sondas hibridadas), o bien en el extremo 3 de

la sonda A o en el 5 de la sonda B. Solamente se suministran los dNTPs necesarios para rellenar el gap, ya que la sobreextensin o la infraextensin afectaran la eficacia del paso de ligacin. Esta metodologa, aunque es extremadamente especfica, precisa ir asociada a una PCR para alcanzar un grado de sensibilidad adecuado que permita su aplicacin de cara al diagnstico de las enfermedades infecciosas.

Ligase chain reaction (LCR)

La LCR consta de una serie de ciclos repetidos, de hibridacin de oligonucletidos y de ligacin, para generar mltiples copias de la secuencia de cidos nucleicos elegida como diana. Requiere un mnimo de dos parejas de sondas oligonucletidas complementarias (sondas A, A y sondas B, B) (figura-3). Dos sondas (A-B y A-B) hibridarn en posiciones adyacentes en cada hebra del ADN diana. El complejo diana-sondas ser el sustrato para la unin por medio de la ADN ligasa gracias a su actividad selladora de brechas. Una vez producida la ligacin, el producto resultante puede ser separado mediante desnaturalizacin por calor; as, tanto la hebra de ADN monocatenario como el producto ligado servirn de moldes adicionales. En teora en cada ciclo se duplicar el numero de copias.

Las versiones iniciales de esta reaccin empleaban ligasas mesoflicas (E. coli ADN ligasa, T4 ADN ligasa) con lo que era necesario agregar nuevo enzima con cada ciclo debido a la inactivacin que experimentaba la misma por efecto del calor en la fase de desnaturalizacin. La disponibilidad ADN ligasa clonada termoestable (Thermus thermophilus) ha simplificado el procedimiento.

La LCR difiere de los mtodos de amplificacin basados en la polimerasa (PCR, NASBA, SDA, TMA) en que no se produce sntesis de ADN o ARN nuevo. Con los mtodos basados en la polimerasa se produce sntesis in vitro de nuevas molculas que

servirn de moldes para reacciones adicionales; por contra, con la LCR simplemente hay una reorganizacin de las sondas para generar dianas que soporten el proceso de amplificacin. La diana no es duplicada, simplemente sirve de molde para la reorganizacin de sondas preexistentes; las sondas una vez organizadas y ligadas servirn de sustrato para nuevas reacciones.

La eficiencia de la hibridacin y ligacin de las sondas en la LCR se consigue con una elevada la concentracin de sondas y de ligasa en relacin a la concentracin de la diana; como resultado, cuando la concentracin de la diana es baja la inmensa mayora de sondas est presente en forma de duplicados de sonda, especialmente en los primeros ciclos. Debido al hecho de que ciertas ligasas son capaces de catalizar una reaccin de ligacin blunt-end, podra ocurrir que segmentos de ADN de doble cadena se unieran en ausencia de diana, (ligacin diana-independiente), y sirvieran de molde para ciclos adicionales generando as un producto indistinguible del generado por una ligacin diana-dependiente. Afortunadamente, la eficiencia de este tipo de unin blunt-end es varias veces inferior a de la reaccin de sellado de brecha. Para reducir la unin inespecfica blunt-end, se ha recurrido a incluir en la reaccin 200 mM de NaCl 2-5 mM espermidina; aadir grandes cantidades de ADN no especfico; y a evitar la utilizacin de reactivos como el polietilenglicol o Ficoll que incrementan la eficiencia de la ligacin blunt-end. La sensibilidad de la amplificacin LCR aunque es adecuada para muchas aplicaciones, particularmente en las enfermedades genticas en las cuales es crtica la especificidad y no tanto la sensibilidad, resulta insuficiente para su aplicacin al campo diagnstico de las enfermedades infecciosas donde la sensibilidad es esencial. La sensibilidad tambin puede mejorarse realizando una preamplificacin en la cual la secuencia diana es amplificada varios ciclos con dos de las cuatro sondas, para, posteriormente, aadir la segunda pareja de sondas.

La LCR se ha utilizado para la deteccin de varios agentes infecciosos (papillomavirus, HIV-1, Mycobacterium tuberculosis) y enfermedades genticas, mantiendo el elevado grado de especificidad comentado anteriormente para otras reacciones mediadas por la ligasa. Sin embargo, todava existen numerosas aplicaciones que requeriran mejorar la sensibilidad de esta metodologa. Variantes de la LCR Con ellas se trata de evitar la unin inespecfica (blunt-end) de las sondas mediante bloqueo o eliminacin de los grupos hidroxilo 3 o fosfato 5. Una variante denominada

gapped-LCR est diseada de tal modo que las sondas hibridan con el ADN diana pero no inmediatamente adyacentes (Figura-4), sino separadas por un hueco o gap; as, las sondas no hidridadas no podrn ser ligadas. Para conseguir que las sondas se vuelvan adyacentes (y con ello que puedan ser ligadas) se emplea una ADN polimerasa y dNTPs apropiados para extender la sonda a travs del gap (es crtico evitar la sobre o infraextensin que impediran la ligacin). La extensin de la polimerizacin se controla con los dNTPs adecuados, la eliminacin de uno o ms dNTPS asegura que la extensin terminar en el sitio apropiado.

Figura 4. gapped-LCR Conclusin La especificidad de la unin de segmentos de ADN catalizada por la enzima ADN ligasa puede ser explotada en sistemas diseados para identificar la presencia de una secuencia diana de cidos nucleicos dentro de una muestra biolgica. Los mtodos de amplificacin basados en la ligasa permiten incrementar la sensibilidad sin producir una merma en la especificidad. Se han descrito modificaciones de estas tcnicas que permiten reducir la ligacin inespecfica. La automatizacin de los ensayos permitir en el futuro el uso rutinario de este tipo de tecnologa en el laboratorio clnico. APLICACIN DE TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR EN EL DIAGNSTICO DE VIRUS ONCOGNICOS (I): VIRUS EPSTEIN-BARR. Error! No se encuentra el origen de la referencia. Dr. D. Julio Velasco

El virus Epstein-Barr (EBV) fu descrito en el ao 1964 por Epstein y cultivado en clulas de un linfoma de un nio de Uganda por Achong y Barr (1). En 1968 Henle et al (2) identificaron al EBV como el agente etiolgico de la mononucleosis infecciosa y posteriormente este virus fu detectado constantemente en clulas neoplsicas de linfoma de Burkitt endmico y de carcinoma indiferenciado nasofarngeo (3).

El EBV infecta a gran parte de la poblacin mundial de forma asintomtica. En muy pocas personas la infeccin primaria por EBV se manifiesta con el sndrome de la mononucleosis aguda. Durante la primera fase de este sndrome mas del 10% de los linfocitos de sangre perifrica estn infectados por el virus, al final de enfermedad su nmero se reduce a unos pocos por milln que persiste indefinidamente. El resultado es una inmunidad a largo plazo.

El EBV es un activador celular B-linfotrfico que transforma in vitro los linfocitos B en lineas celulares linfocitoides que se propagan indefinidamente. El virus penetra en los linfocitos a travs del receptor del complemento C3d (tambin denominado CD2 o CD21).

Durante muchos aos las neoplasias malignas relacionadas con el EBV han sido el linfoma de Burkitt y el carcinoma indiferenciado nasofarngeo, recientemente, y con la utilizacin de sistemas de deteccin de elevada sensibilidad se ha comunicado la presencia de ADN viral en procesos linfoproliferativos en inmunodeficiencias de varios tipos, as como en una amplia gama de neoplasias.

Genoma y expresin gentica del EBV.

El EBV es un virus herpes de la subfamilia gamma. Es un virus icosadrico encapsulado que contiene una doble cadena lineal de ADN de 172.000 pares de bases. Una vez infectada la clula, el ADN vrico es transportado al ncleo en donde se dispone fundamentalmente como una molcula circular extracromosmica o episoma. El episoma EBV consta de las secuencias nicas corta y larga (US y UL) separadas por una "large internal repeat sequence" (IR1) y flanqueado por "terminal repeats" (TR) en cada fin del genoma. La secuencia UL se subdivide en elementos repetitivos (IR2, IR3 e IR4).

El genoma EBV contiene mas de 100 ORFs (marcos de lectura abiertos) codificadores potenciales de otros tantos polipptidos, aunque solo han sido caracterizados una pequesima parte de los mismos. Clulas de lineas linfoblastoides inmortalizadas por EBV expresan seis antgenos nucleares: EBNA-1, 2, 3A, 3B, 3C y LP y tres protenas de membrana: LMP-1, LMP-2A y LMP-2B.

El antgeno nuclear EBNA-1 es una protena de unos 76 kDa. Su tamao vara entre los diferentes EBV aislados y es, por lo tanto, un buen marcador para identificar las diferentes cepas. Muestra una actividad de unin a ADN y se fija con gran afinidad al lugar de replicacin viral episomal (OriP). Esta unin conduce a la replicacin inicial del genoma EBV y tiene importancia en el mantenimiento del estado episomal.

El antgeno nuclear EBNA-2 es un transactivador especfico de genes virales y celulares. En linfoma de Burkitt EBV (-) la transfeccin con EBNA-2. En clulas B inmortalizadas EBNA-2 modula la expresin de antgenos celulares de activacin (p.e. CD23, CD21) y de antgenos de funcin linfocitaria (CD11a, CD18, CD58). Basndose basicamente en las diferencias del ORF EBNA-2 se distinguen dos tipos de EBV: EBV1 (EBNA-2 de 491 aminocidos) y EBV-2 (EBNA-2 de 443 aminocidos) que muestran diferentes capacidades transformantes, as el EBV-1 es mas eficaz inmortalizando linfocitos (4).

Las funciones de los ORFs EBNA-3 son poco conocidas, son marcadamente hidrfilos y sus ARNs se transcriben a bajo nmero de copias. Datos recientes indican que EBNA3C es esencial para la transformacin de linfocitos B. Este ORF es activado por EBNA2 y modula la transcripcin atravs de la interaccin con la proteina J kappa (5).

La nica proteina EBV con actividad transformante suficiente probada es la LMP-1. In vitro es esencial para la transformacin de linfocitos B en lineas celulares linfocitoides con el concurso de EBV. Induce muchos de los signos de de activacin de las clulas B infectadas como es la expresin de CD23, CD11a, CD18, CD58 y la molcula de adhesin intracelular 1 (ICAM-1). LMP-1 tambin muestra efectos transformantes en lineas celulares de fibroblastos de mamferos producindo incremento del crecimiento sin sustrato e inhibiendo los efectos del contacto clula-clula. En ratn transgnico la expresin de LMP-1 en piel produce hipertrofia de la epidermis y en clulas epiteliales humanas incrementa la expresin de receptores de crecimiento epidrmico (6) y que la cola citoplasmtica de esta proteina interacciona con el factor asociado a la necrosis tumoral (TRAF-3) comunicando una seal de crecimiento (7). La proteina LMP-1 se localiza en la membrana celular asociada a la vimentina.

La funcin de LMP-2 es, hasta la fecha, desconocida.

Dos pequeos ARN se detectan en elevado nmero de copias (mas de 106) en los nucleos de las clulas con infeccin latente. Son el EBER1 (165 bases) y el EBER2 (169 bases) (acrstico de: EBV-encoded non-polyadenylated RNAs). Como otros transcriptos de polimerasa III los EBERs no codifican proteinas y son habitualmente encontrados en complejos con la proteina celular La. Se desconoce con exactitud la funcin de estas molculas.

Basndose en la expresin variable de los productos gnicos latentes se ha propuesto una clasificacin de estados de latencia. En latencia I la expresin antignica est

restringida a EBNA-1. En esta situacin los promotores Wp, Cp y LMP estn silentes. En latencia II la expresin antignica ocurre en EBNA-1 y EBNA-2 y est dirigida, al igual que en latencia I, desde un promotor en el fragmento BamHI-F del genoma, si

bien en este estado tambien se detecta transcripcin desde los promotores LMP. En latencia III se expresan todos los EBNA y LMPs. Los transcriptos se dirigen desde el promotor Cp, si bien en una fase muy temprana de la infeccin o cuando existe deleccin o mutacin de Cp el promotor Wp se puede activar.

La entrada del EBV en estado ltico con produccin de viriones infecciosos se asocia a la expresin de una gran cantidad de proteinas vricas que incluyen enzimas involucradas en el metabolismo de cidos nucleicos y en la formacin de proteinas de la cpside. La proteina llave, la primera que se expresa, es ZEBRA, es el producto del fragmento BamHI-Z leftward reading frame (BZLF)1. ZEBRA es una proteina unida al ADN que transactiva otros genes lticos. Su ausencia se puede considerar como evidencia de infeccin latente, aunque su presencia no implica necesariamente la existencia de infeccin ltica. Otras proteinas lticas dignas de mencin son la BCFR1, practicamente idntica a la interleuquina 10 y la BHFR1 similar a bcl-2, un inhibidor de la apoptosis. Se postula si esta proteina puede tener una accin similar en clulas infectadas por EBV en fase ltica.

Deteccin de EBV en tejidos. Southern blot (SB). Las sondas habitualmente utilizadas son las homlogas a IR1, ya que esta secuencia se repite 10 veces, lo que se traduce en el aumento de la sensibilidad de la deteccin. SB ofrece algunas ventajas en la deteccin tisular de EBV: Es el nico sistema que permite certificar la monoclonalidad de una infeccin EBV. La presencia de una nica banda terminal fusionada sugiere que la las clulas infectadas representan una expansin clonal de una nica clula con infeccin viral latente. En contraste con la presencia de mltiples bandas que reflejan de episomos con nmeros variables de TRs, caracterstico de la existencia de infecciones mltiples y, por tanto, de infecciones poli u oligoclonales (8). El anlisis con SB de los IRs permite reconocer la infeccin ltica. La digestin de ADN EBV linear con BamHI libera un fragmento terminal (derecho) de 4 kb fusionado con un nmero variable de IRs y fragmento terminal (izdo) de 3,5 kb fusionado con un nmero variable de IRs (9). En algunos casos se puede determinar con SB si el ADN EBV est o no en el genoma celular. Hibridacin in situ (HIS). Se utiliza con sondas homlogas IR1 en tejidos congelados, fijados, en lineas celulares y en extensiones de cromosomas en metafase (10). La mayor

desventaja de HIS con sondas ADN es su baja sensibilidad y, por tanto, su incapacidad para detectar infecciones latentes. La situacin es muy distinta cuando se emplean sondas ARN complementarios de EBER1 y de EBER2, los cuales estn presentes en elevadsimo nmero de copias en la infeccin latente. Las sondas PNA mejoran la sensibilidad (11). Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Su gran sensibilidad ha ocasionado un cambio profundo en la deteccin de ADN EBV. Tcnicas inmunohistoqumicas. Con anticuerpos frente a: LMP-1, EBNA-2 y ZEBRA.

EBV en linfomas. EBV se detecta en un elevado porcentaje de linfomas de Burkitt endmicos y entre el 15% y el 30% de los no endmicos (12), por tanto su presencia no es constante, no as la presencia de translocaciones cromosmicas que afectan al oncogen c-myc.

Los linfomas Burkitt EBV (+), endmicos o no, muestran un patrn de latencia I, con expresin restringida a EBER1 y EBER2, aunque de forma espordica se ha documentado expresin de LMP-1 (13).

En 1987 Weiss et al (10) identificaron ADN EBV en cuatro linfomas de Hodgkin con SB, uno de los genomas estaba presente en forma episomal monoclonal y en los otros tres casos el ADN era policlonal. En las series publicadas con posterioridad la frecuencia de ADN EBV oscila entre, aproximadamente, un 40% con tcnicas de membrana, a cerca de un 80% cuando se utiliza PCR (14). En un estudio reciente de 102 casos con hibridacin EBER (15) se observ seal fundamentalmente en clulas de Hodgkin o de Reed-Sternberg en el 45% de los casos, en linfocitos acompaantes en el 22% y ausencia de seal en el 33% de casos. Con tcnicas inmunohistoqumicas se detect expresin de LMP-1 en clulas de Hodgkin o de Reed-Sternberg EBER (+) y negatividad en linfocitos EBER positivos. La positividad para EBER sugiere que en la infeccin es un evento precoz en la gnesis tumoral y los resultados inmunohistoqumicos son los de una fase de latencia II. De los estudios realizados hasta la fecha se puede extraer que los casos de Hodgkin de nios y de edades avanzadas son neoplasias asociadas a EBV, a diferencia de los linfomas de Hodgkin de adultos jvenes (15). En Europa aproximadamente el 40% de linfomas no Hodgkin T son EBER (+), siendo el linfoma T perifrico linfoadenopata anginmunoblstica-like el tipo en el que mas frecuencia se detecta esta positividad (cerca del 50%). La asociacin de los procesos linfoproliferativos en postransplantados con EBV es inquivoca y est bien demostrada serologicamente y con tcnicas de hibridacin molecular. Los procesos linfoproliferativos de los postransplantados es un grupo heterogneo que abarca el espectro de hiperplasia B polimorfa a neoplasia B polimorfa, aunque tambin se

observan linfomas monomorfos, de morfologa convencional, todos ellos estn relacionados con EBV. EBV en linfoepiteliomas-like. El carcinoma indiferenciado nasofarngeo (linfoepitelioma-like) fu, junto con el linfoma de Burkitt, la primera neoplasia que se asoci al EBV. El carcinoma indiferenciado nasofarngeo se asocia a anticuerpos IgA anti-antgenos muy variados de EBV, que en ocasiones preceden al establecimiento del tumor y que sirven para su monitorizacin. Practicamente todos los carcinomas indiferenciados nasofarngeos son EBER (+) y solo unos pocos expresan LMP-1, ninguno EBNA-2. La infeccin ltica se limita a espordicos casos ZEBRA (+), es decir, la mayor parte de estas neoplasias exhiben un patrn tpico de latencia II con expresin de EBER, LMP-1 y EBNA-1. Los datos obtenidos hasta la fecha permiten considerar a la infeccin por EBV como el paso definitivo hacia la carcinognesis en la mucosa nasofarngea (16). Otros carcinomas tipo linfoepiteliomas, extra nasofarngeos, contienen EBV. En linfoepiteliomas-like gstricos se detecta habitualmente el virus y, en los casos que se realiz SB, se objetiv que el ADN vrico es una expansin clonal de una nica clula infectada. En muy pocos casos se realiz deteccin de proteinas codificadas, no existiendo expresin de LMP-1 o EBNA-2, (17) lo cual sugiere un patrn de latencia I.

Casi la totalidad de los linfoepiteliomas-like de glndula salival de pacientes chinos o esquimales contienen ADN vrico, sin que hasta la fecha se haya analizado la clonalidad. Aproximadamente la mitad de los linfoepiteliomas-like de pulmn y de timo contienen EBV, en los casos estudiados, se objetiv ADN EBV episomal y clonal. En un caso de linfoepitelioma-like de esfago se demostr la presencia de ADN EBV (18). En la revisin efectuada hasta la fecha no se ha demostrado ADN EBV en los linfoepiteliomas-like de: crvix uterino, piel, mama (carcinoma medular) y cavidad oral. EBV en adenocarcinomas gstricos. En 1992 se comunica por primera vez la presencia de ADN EBV en el 16% de adenocarcinomas gstricos sin llamativo componente linfoide (19). En las series publicadas con posterioridad se obtiene una frecuencia de tumores asociados a EBV comprendida entre el 2% y el 32,8% (Tabla 1). Ref. Mtodo Prev.LL. Prev.AC. Error! No se encuentra el origen de la referencia. 20 HIS 18/20 (90%) 104/1.828 Prev.total Pas/Etnia

(5,7%) 122/1.848 (6,6%) Japn 21 HIS 17/19 (89,5%) 112/1.806 (6,2%) 129/1.825 (7%) Japn 22 HIS+PCR 14/18 (77,8%) 1/10 (10%) 15/28 (53,6%) Japn 23 HIS+PCR 8/9 (88,9%) 62/991 (6,2%) 70/1.000 (7%) Japn 24 HIS+PCR 6/6(100%) 2/66(3%) 8/72(11%) Japn 25 HIS 5/7(71,4%) 2/67(3%) 7/74 (9,5%) China (H-Kong) 26 HIS 1/1(100%) 3/41(7,3%) 4/42 (9,5%) China (H-Kong) 27 HIS+PCR 1/1(100%) 5/54(9,2%)

6/55(11%) Taiwan 28 HIS 10/10 (100%) 2/79(2,5%) 12/89 (13,5%) Corea 29 HIS 1/1(100%) 0/18(0%) 1/19 (5,2%) GB 30 HIS 4/4(100%) 3/35(9%) 7/39(18%) Alemania 31 HIS+PCR 4/65 (6,1%)(*) Italia 32 HIS 4/6(66,6%) 1/53(1,8%) 7/39(18%) Francia 33 PCR 3/3(100%) USA 19 PCR 22/138 (16%)

USA

(*): Con estroma linfoide prominente

Predominan los pacientes varones con tumores localizados en cardias o cuerpo, poco o moderadamente diferenciados y con un importante estroma linfoide asociado. En los casos en que se realiz SB se demostr infeccin monoclonal, tambin se apreci que la infeccin afectaba a la totalidad de las clulas tumorales. Ambos hechos sugieren que la infeccin viral ocurri antes de transformacin neoplsica (25, 34).

En los casos en los que se detectaron proteinas codificadas se demostr expresin de LMP-1 en pacientes inmunodeprimidos (34, 35) y en un pequeo porcentaje de pacientes sin alteraciones en la inmunidad en Taiwan (27). BIBLIOGRAFIA 1. Epstein MA, Achong BG, Barr YM. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet 1964;1:702-703. 2. Henle G, Henle W, Diehl V. Relation of Burkitt's tumor associated herpes-type virus to infectious mononucleosis. Proc Natl Acad Sci USA 1968;59:94-101. 3. Nonoyama M, Huang CH, Pagano JS, Klein G, Singh S. DNA of Epstein-Barr virus detected in tissue of Burkitt lymphoma and nasopharyngeal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1983;70:3265-3268. 4. Jilg W, Siegre E, Alligere P, Wolf H. Identification of type A and type B isolates of Epstein-Barr virus by polymerase chain reraction. J Virol Methods 1990;30:319-322. 5. Robertson ES, Grossman S, Johannsen E, Miller C, Lin J, Tomkinson B, Kieff E. Epstein-Barr virus nuclear protein 3C modulates transcription through interaction with the sequence-specific DNA-binding protein J kappa. J Virol 1995;69:3108.3116. 6. Miller WE, Earp HS, Raab Traub N. The Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces expression of the epidermal growth factor receptor. J Virol 1995;69:4390-4398. 7. Mosialos G, Birkenbach M, Yalamanchili R, VanArsale T, Ware C, Kieff E. The Epstein-Barr virus transforming protein LMP1 engages signaalin proteins for the tumor necrosis factor receptor family. Cell 1995;80:389-399.

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APLICACIN DE TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR EN EL DIAGNSTICO DE VIRUS ONCOGNICOS (II): VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Error! No se encuentra el origen de la referencia. Dr. D. Julio Velasco Los virus del papiloma humano (HPVs) son virus epidermotrpicos, cuyo genoma es una doble cadena superenrrollada de ADN de unas 8 kilobases de longitud Y de 5 x 106 daltons de peso. El ADN est recubierto por histonas celulares a modo del virus SV 40 y por una cpside icosadrica de 72 capsmeros. Parte del ADN vrico constituye la "unidad reguladora no codificadora" u URR con funciones en la replicacin y la transcripcin viral. El resto del genoma se agrupa en "zonas de lectura abierta" u ORFs, que se subdividen en ORFs L o "late" y en ORFs E o "early". Los L codifican las proteinas necesarias para construir la cpside. Algunos ORFs E codifican proteinas reguladoras, otros proteinas de funcin desconocida mientras que algunas de estas secuencias tienen una actividad potencialmente transformadora de la clula, especialmente los denominados E6 y E7 de algunos de los HPVs. La clasificacin de los HPVs se basa en las diferencias de homologa que existen en la secuencia de cidos nucleicos. Aquellos HPVs que tengan menos del 50% de homologa en la secuencia de cidos nucleicos con los tipos nuevos caracterizados son considerados como tipos nuevos. Hoy en da estn bien caracterizados mas de 70 genotipos, con diferente genoma, los cuales ocasionan varias enfermedades cutneas y ano-genitales, la mayora de comportamiento benigno, si bien varios genotipos estn asociados con la transformacin neoplsica. Los HPVs infectan las clulas escamosas o sus progenitoras (clulas de reserva). El intervalo entre la exposicin al virus y el desarrollo de la lesin oscila entre unas semanas y varios meses, y quizs ms. Se calcula una media de 6-24 meses entre el contacto con el HPV y la deteccin de ADN HPV. Las clulas basales actuan como reservorio de ADN vrico. La iniciacin de la replicacin viral ocurre en las clulas descendientes de las basales infectadas. En los estratos superiores el virus se replica y se encapsula. Una parte de los queratinocitos exhiben halos perinucleares y nucleos grandes e hipercromticos, algunos con morfologa tpica de coilocitos, en estas clulas se concentran todos los viriones maduros. La maduracin viral est unida a la maduracin celular y, a la postre, a la produccin de queratinas y de involucrina. Las

clulas con estos cambios morfolgicos son positivas para PCNA, Ki-67/Mb-1 y otros ndices de cintica celular (1), lo cual implica que, de alguna manera, la replicacin viral influye en el crecimiento celular. El mecanismo de oncognesis mas aceptado es la unin del ORF 7 con el producto del gen del retinoblastoma y del ORF 6 con el producto del gen P53, con la consiguiente inhabilitacin funcional de ambos genes reguladores (2a,2b). 2. METODOS DE DETECCIN Y TIPAJE DE HPV En la actualidad existe un arsenal de mtodos para detectar HPVs, unos mas extendidos, otros con mayor sensibilidad... Destacan los basados en las tcnicas de biologa molecular, ya que son los nicos que permiten establecer el genotipo infectante, cuestin clave en este tipo de infeccin en la que solamente algunos tipos son realmente transformantes. 2.1. METODOS MORFOLOGICOS UTILIZADOS EN EL DIAGNOSTICO DE INFECCION HPV La citologa.La primera aproximacin al diagnstico de infeccin HPV fu realizada por Ayre (3) en frotis citolgicos crvico-vaginales, quien describe brevemente, en ao 1949, los ya bien conocidos coilocitos, como uno de los cambios citolgicos asociados a lesines precancerosas. Siete aos despus Koss y Durfee (4) acuan el trmino de "atipia coiloctica" que designa unas clulas muy caractersticas con un espacio claro perinuclear aunque no lo relacionaron con la infeccin viral. Fu el propio Ayre (5), quien en 1959 sugiri la hiptesis de que dichos cambios podran estar producidos por un un agente viral. Otro tipo de clula asociada a infeccin HPV visible en el frotis citolgico es disqueratocito, menos especfico que el coilocito, ya que se pueden detectar en lesiones no relacionadas con HPV. El frotis citolgico sigue siendo en la actualidad el mtodo por medio del cual se realizan la gran mayora de diagnsticos de infeccin HPV ano-genital, fundamentalmente con el frotis crvico-vaginal, tcnica que es acreedora de una gran especificidad, prxima al 100%, y cuya sensibilidad est comprendida entre un 15% y un 58% para lesiones condilomatosas. Un porcentaje variable de estas lesiones son clasificadas como lesin escamosa intraepitelial de bajo grado, que engloba al condiloma plano y a la displasia leve asociada a condiloma. El resto de frotis con cambios HPV corresponden a una lesin escamosa intraepitelial de alto grado, trmino con el que la reciente Clasificacin de Bethesda (6) agrupa a la displasia moderada, displasia grave y carcinoma in situ. El frotis citolgico del canal anal se est empleando con xito en grupos de riesgo y su seguridad diagnstica es similar al frotis crvicovaginal (7). Tambin se emplean, con peores resultados, la citologa uretral y vulvar para detectar infecciones HPV. Los falsos negativos de la citologa son consecuencia de una toma mal realizada o de un error de interpretacin del frotis. Una causa habitual de falso positivo es la utilizacin de criterios citolgicos muy amplios, poco especficos. La biopsia. La muestra tisular es otro mtodo para el diagnstico de esta infeccin profusamente utilizado. Existen, al igual que con la citologa problemas de interpretacin y grandes diferencias interobservador y la posibilidad de un falso negativo tras una toma-biopsia realizada a ciegas o por un colposcopista poco experimentado. Con la biopsia se obtiene un diagnstico refinado y de gran precisin,

as sabremos con exactitud si existe displasia asociada al condiloma y como es esta asociacin, si vertical u horizontal. La microscopa electrnica. La ultraestructura se utiliza raramente para diagnosticar infecciones HPV, su escasa sensibilidad, inferior al 50%, la necesidad de un costoso aparataje y la lentitud del proceso relegaron este sistema en la deteccin de HPVs. 2.2. METODOS INMUMOLOGICOS PARA DETECTAR HPVs Anticuerpos anti-cpside. La deteccin inmunohistoqumica del antgenos de la cpside vrica comunes a todos los papilomavirus, con anticuerpos producidos en conejos. El porcentaje de lesiones positivas con esta tcnica est en relacin inversa a la severidad de la lesin, de manera que su deteccin en displasias graves y carcinomas in situ no supera el 10%. Anticuerpos anti-proteinas codificadas por secuencias del genoma viral. Los mtodos descritos hasta ahora permiten con mayor o menor sensibilidad establecer el diagnstico de infeccin por HPV, pero ninguno de ellos es capaz de determinar el o los genotipos implicados, hecho fundamental en una infeccin vrica en la cual solo algunos genotipos son verdaderamente transformantes. La posibilidad de producir anticuerpos antiproteinas especficas de un determinado genotipo tiene la importante limitacin de la inexistencia de mtodos de propagacin vrica in vitro, ya que no existen medios de cultivo eficaces para estos virus. Algunos investigadores abordaron este escollo con el desarrollo de mtodos de obtencin de anticuerpos de fusin, clonando secuencias de ADN de HPVs, induciendo de forma artificial, en cultivos bacterianos, la proteina codificada por la secuencia genmica clonada. Los anticuerpos elaborados contra estas proteinas se estn comenzando a utilizar, an a nivel experimental, en el diagnstico de infecciones para determinados genotipos de HPV en sangre perifrica o tejidos. 2.3. LAS TECNICAS DE HIBRIDACION MOLECULAR La aplicacin de tcnicas de biologa molecular estn especialmente indicadas en el diagnstico de las infecciones producidas por HPVs ya que permiten conocer el/los genotipos causantes de la infeccin y permite separar las infecciones de "alto riesgo" (las producidas fundamentalmente por los genotipos 16, 18, 45, 56), de "riesgo intermedio" (31, 33, 35, 39, 51, 52, 53, 55, 58, 59, 63, 66, 68) de transformacin neoplsica de las de "bajo riesgo"(los HPVs 6, 11, 42, 44) son genotipos mas prevalentes en lesiones benignas) (8a). La hibridacin de cidos nucleicos (ADN o ARN) es el mejor proceder disponible actualmente para el diagnstico de infeccin HPV (8b). Existen varias tcnicas de hibridacin molecular, cada una con sus ventajas y sus desventajas, todas se basan en la complementariedad de las bases nitrogenadas-la molcula de ADN es una doble cadena de polinucletidos,ambas unidas por puentes de hidrgeno a nivel de las bases nitrogenadas que sean complementarias-y en el fnomeno de la desnaturalizacin y renaturalizacin del ADN-los puentes de hidrgeno entre cada par de bases se rompen por la accin del calor o de un lcali, separndose ambas cadenas (desnaturalizacin), el enfriamiento o la acidificacin de la reaccin provocan en ensamblaje de ambas cadenas de nucletidos (renaturalizacin). Todas las tcnicas de hibridacin detectan un cido

nucleico presente en las clulas del material a analizar por medio de otro, complementario del anterior y marcado con un istopo radioactivo (sondas calientes) o con sustancias no isotpicas (sondas fras), fundamentalmente la biotina,aunque tambin se utiliza la fotobiotina, la digoxigenina, el mercurio/trinitrofenol, la fluoresceina y la rodamina entre otros. Tradicionalmente se ha considerado que las sondas calientes eran mas sensibles, difciles de manejar y peligrosas que las fras. En la actualidad con la aplicacin de nuevos sistemas de deteccin enzimticos se consiguen niveles de sensibilidad similares para ambas, con la ventaja de que las sondas no isotpicas tienen un margen muy superior de caducidad y no existe exposicin de radioactividad para el personal manipulador. Las reacciones de hibridacin molecular utilizadas en el diagnstico y tificacin de HPVs son las siguientes: Hibridacin in situ con filtro (HISF). Este mtodo tampoco precisa de extraccin de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las clulas se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalizacin del ADN. El mtodo HISF es de muy fcil ejecucin, rpido y barato es ,sin embargo, poco especfico y, a menudo, resulta difcil separar las seales positivas del fondo (9). Su uso se limita a trabajos con gran cantidad de especmenes. Hibridacin Southern blot (SB). Necesita de la extraccin del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminacin de ARN y proteinas de la misma por digestin enzimtica. Con la aplicacin de endonucleasas de restriccin-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaos ofreciendo un patrn caracterstico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizndose una separacin electrofortica de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizndose una hibridacin. El SB es el mtodo de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta tcnica es superior a cualquier otra debido a la purificacin extra del ADN por electroforesis. Adems es el nico mtodo que permite conocer si el genoma viral est en situacin episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad tcnica, duracin de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente. El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reaccin individual para cada especmen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/clula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espcimen. El dot/spot blot (DB) consiste en la extraccin del ADN celular total y en su desnaturalizacin, despus se fija a una membrana por medio de presin negativa en un aparato manifold. Tambin se puede realizar la desnaturalizacin en la misma membrana. Una vez realizada la hibridacin se produce la autorradigrafa, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimtico, si se utilizaron fras. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especmenes mientras que el SB no admite mas de 15. Uno de los problemas mas importantes del DB es el "fondo" provocado por las

hibridaciones inespecficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los hbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecficas pueden eliminarse con la aplicacin de ARNasa (10). La hibridacin sandwich (HS) no necesita extraccin del ADN. Esta tcnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una regin complementaria con el cido nuclico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia especfica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos est marcado y se fija al hbrido anclado en la membrana permitiendo su deteccin.La HS es un mtodo con una especificidad estimada en 1-5 X 105 molculas de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, adems, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X 105 (11). La Hibridacin in situ (HIS). Se utiliza en cortes histolgicos y en extendidos citolgicos. La sonda se aplica directamente sobre el espcimen (no requiere extraccin del ADN), previamente tratado con una proteasa para permitir su acceso al ADN nuclear.La desnaturalizacin del ADN diana y de sonda marcada se realiza simultaneamente utilizando elevadas temperaturas (alrededor de 100 ). La HIS es una tcnica mucho menos sensible que los mtodos de membrana,necesitando 100 veces mas copias virales que el DB o el SB (12), aunque puede ser tan efectiva como aquellas cuando el tipo infectante es 6/11 o 16 y cuando la lesin muestra los cambios histolgicos tpicos de lesin HPV (13). Cuando el condiloma se acompaa de displasia, la HIS disminuye la rentabilidad segn el grado de la misma, lo cual refleja la disminucin del nmero de copias virales con la progresin de la lesin. Otro problema es que precisa de tejido, puesto que aunque se puede practicar en frotis citolgicos sus resultados no son tan buenos como con material procedente de una biopsia. La HIS tiene la gran ventaja de que permite la visualizacin al microscopio del lugar donde tuvo lugar la hibridacin, motivo por el cual es la tcnica de hibridacin con cidos nuclecos preferida por los anatomopatlogos. La hibridacin Northern se utiliza para la detccin de RNA de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN. En todos los sistemas de hibridacin descritos anteriormente el cido nuclico diana est localizado en un soporte slido, bien una membrana o una biopsia o extendido citolgico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el cido nucleico se encuentra disuelto en un lquido. En la hibridacin en fase lquida, la sonda y el HPV diana estn en solucin. La hibridacin en fase lquida ha sido utilizada para estimar la relacin gentica entre los diferentes HPVs, hoy da es de escaso uso. El sistema de captacin de hibridos tambin se realiza en medio lquido.Primero se desnaturaliza el especimen, posteriormente se hibrida el HPV ADN con la correspondiente sonda. Los hbridos son capturados por la superficie del recipiente , cubierta con anticuerpos anti-hbridos que reaccionan con fosfatasa alcalina, hacindose visibles tras la aplicacin de un sustrato quimioluminiscente. Los sistemas captacin de

hbridos estn todava en fase experimental, las pruebas iniciales permiten suponer una elevada sensibilidad y fcil manejo de la tcnica. 2.4. METODOS DE AMPLIFICACION GENOMICA. La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza una enzima, la polimerasa, para copiar a una determinada molcula de un cido nucleico, habitualmente un ADN. La repeticin de este proceso origina la produccin de un gran nmero de molculas hijas puesto que las nuevas molculas son utilizadas por la polimerasa como moldes. El proceso se inicia con la separacin de las dos cadenas que configuran la molcula de ADN o por el calentamiento de solucin en la que encuentra el ADN a unos 90. Tras un descenso trmico de la solucin se produce el "anillamiento" o hibridacin de dos secuencias diferentes de nucletidos, denominados "primers" o "cebadores" que delimitan el fragmento de ADN a amplificar. Con el concurso de la polimerasa se van aadiendo los nucletidos presentes en la solucin, fase denominada de "extensin" de los cebadores. Cada uno de estos ciclos se repite un nmero determinado de veces en un aparato denominado termociclador que permite ascensos y descensos trmicos programables. El hecho de que las moleculas hijas sirven a su vez de molde para sintetizar nuevos ADNs produce un efecto multiplicador, producindose aproximadamente 106 copias de ADN en unos 30 ciclos. El ADN amplificado se puede detectar por medio de una reaccin de hibridacin o bien por medio de una electroforesis en gel con bromuro de etidio y una fuente de luz ultravioleta para su identificacin. El avance que hizo posible la tcnica de la PCR fu el descubrimiento de polimerasas capaces de actuar a temperaturas elevadas. La primera de ellas fu la que que contienen las bacterias denominadas Thermus aquaticus o polimerasa Taq y que se hallan en manatiales donde las aguas termales estn a menudo a temperaturas superiores a 90. Antes del descubrimiento de esta polimerasa se realizaban tcnicas de amplificacin de ADN con el fragmento de Klenow como polimerasa ADN,pero esta enzima es inestable a temperaturas superiores a los 37,con lo que era necesario aadir una dosis de enzima en cada ciclo de amplificacin lo cual resultaba extraordinariamente tedioso a la par que se acumulaban grandes cantidades de enzima degradada. El descubrimiento de la Taq polimerasa evit la necesidad de aadir enzima en cada ciclo de amplificacin, facilitando as la automatizacin del proceso. La extraordinaria sensibilidad de la tcnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un milln de clulas es un arma de gran valor en la deteccin de infecciones HPV, especialmente en aquellas con un bajo nmero de copias vricas, como es el caso de la infeccin oculta. El problema mas importante de las tcnicas de amplificacin genmica es la contaminacin de la reaccin con ADNs extraos, en cualquiera de sus fases, produciendo resultados falsamente positivos. La adopcin de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de separacin de especmenes y reactivos o de "primers" anticontaminacin permiten la obtencin de resultados fiables. Otra desventaja de la reaccin de PCR es la no amplificacin de genomas cuando no existen "primers" especficos, con la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs.

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