Importancia de la microbiologa en la industria cervecera

Mblgo. Franklin Zumarn Pretell

45 L

Cuntos estilos de cerveza existen?

(Brewers Association: 2012 Beer Style Guidelines)

140 estilos

>10000 marcas

Levadura cervecera
a) Genticamente estable durante varios ciclos continuos b) Fermenta mosto en un tiempo aceptable para llegar a niveles de etanol de 4% a 12% (v/v) c) No metabolitos indeseables, responsables de sabores y aromas no caractersticos (off-flavours). d) Fcilmente removible del medio de fermentacin e) Suficientemente viables despus de la cosecha para poder ser reinoculados en nuevos ciclos de fermentacin.

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces pastorianus

Otros microorganismos relevantes en cervecera

Hongos Bacterias
Unicelulares Levaduras Unicelulares Hongos miceliares (mohos) Filamentosos

Forma Tamao Movilidad

Esferas, bastones o espirales

0.5-1.0 x 2-5 u Algunas

Ovoide, redondeada o alargada 3-4 x 10 12 u

No Gemacin

Alargadas formando filamentos 5-20 u

No Esporas

Reproduccin Fisin binaria

Bacterias

Morfologa bacteriana

cocos
0.3 1.0 m

Bacilos
1.0 10 m x 0.1 1.0 m

Reproduccin bacteriana
Tiempo 00:00 00:20 00:40 01:00 02:00 03:00 04:00 05:00 N de bacterias 1 2 4 8 64 512 4096 2,097,152

Reproduccin bacteriana
Al cabo de 24 horas podemos tener 4.72 x 1021 clulas

Necesidades de oxgeno de las bacterias

a) Aerobios estrictos b) Anaerobios estrictos c) Anaerobios facultativos d) Microaerfilos e) Anaerobios aerotolerantes

Levaduras extraas

Reproduccin por gemacin

Levadura en gemacin activa que produce clulas hijas maduras en unos 30 minutos. Estas fotografas fueron tomadas a intervalos de 10 minutos. (Cortesa de Carl C. Lindegren.)

Hongos miceliares (mohos)

Factores (de la cerveza) inductores del crecimiento microbiano

a) Fuentes de carbono: dextrinas, alcoholes y cidos orgnicos. b) Fuentes de nitrgeno: aminocidos, pptidos y protenas. c) Nutrientes esenciales: vitaminas (B), purinas, piridinas. d) Micronutrientes y elementos traza: K, Ca, Mg, Na, Zn, Mn, etc.

Factores (de la cerveza) de proteccin contra el crecimiento microbiano

a) Medio anaerobio b) Contenido de CO2 c) pH < 4.5 d) cidos orgnicos, polifenoles e) Presencia de sustancias del lpulo f) Presencia de etanol g) Poca cantidad de nutrientes esenciales, debido a la fermentacin por la levadura h) Proceso a bajas temperaturas

Microorganismos patgenos no sobreviven en cerveza

Salmonella typhi

Slo microorganismos cido-tolerantes, lpulo-tolerantes, microaerfilos, anaerobios, anaerobios facultativos son capaces de crecer en cerveza.

Clasificacin de los microorganismos dainos a la cerveza

Cat. Clasificacin Ejemplos
Lactobacillus brevis Lactobacillus lindneri Pediococus damnosus Pectinatus cerevisiiphilus Saccharomyces c.diastaticus Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis Leuconostoc Micrococcus cristinae Zymomonas mobilis
Obesumbacterium proteus Candida kefyr Hansenula anomala Sacch.cerevisiae-Fremdhefen

Efecto en la cerveza y significado de los M.O.

Turbidez/Acidulacin Turbidez/Acidulacin Sedimento/diacetilo Turbidez/cido propinico, acetoina Sedimento/Turbidez Turbidez ligera/ Diacetilo Turbidez ligera/Diacetilo Turbidez/Acidulacin Variacin del aroma/sedimento ligero Turbidez/H2S, DMS, Acetaldedo
Fenol,DMS, Acetona, Proteinasas Fenol, DMS, Proteinasas Off-flavors (fenoles voltiles) Off-flavors Fallas de fermentacin

OBLIGATORIOS

II III
IV V

POTENCIALES

INDIRECTOS

INDICADORES

Acetobacter pasteurianus Acinetobacter calcoaceticus Klebsiella pneumoniae Debaryomyces hansenii Saccharomyces c. chevalieri Bacillus sp. Clostridium sp. Enterobacteriaceae Micrococcus

Muchas veces se le asocia a los microorganismos dainos

No son nocivos ni indicadores

LATENTES

Suciedad orgnica Suciedad inorgnica

Microorganismos Indicadores de Higiene e Indirectos

Bacterias potencialmente dainas

Malas Prcticas de higiene, materiales en mal estado

Bacterias Dainas

Contaminacin microbiana
Contaminacin Primaria
Proceso de produccin: de materias primas hasta salida de BBT Posible eliminacin: Filtracin; tratamiento trmico Usualmente contaminacin de lotes completos

Contaminacin Secundaria
Proceso de produccin: durante el envasado Posible eliminacin: Pasteurizacin Usualmente contaminacin de envases aislados

Rutas de ingreso de los microorganismos

MATERIAS PRIMAS / INSUMOS
(Cebada, Malta, Lpulo, Ayudas filtrantes y otros)

Lev. extraas, Mohos , Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Corynebacterium, Acetobacter, Pseudomonas, Xanthomonas, Zymomonas , Enterobacterias

LEV. CERVECERA
Lev. extraa, bacterias dainas obligatorias y potenciales (Pediococcus damnosus , Lactobacillus lindneri, Enterobacter aglomerans ,)

HOMBRE
Enterobacteriaceae Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus

AGUA
Pseudomonas, Xanthomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter, Flavobacterium, Alcaligenes , Enterobacterias

CERVECERA

AIRE
Lev. extraas, Mohos, Acetobacter, Gluconobacter Lactobacillus Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Micrococcus,

CERV. DEVUELTA
Mayormente dainos obligados: Lactobacillus brevis Pediococcus damnosus Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphera cerevisiae. Lev. extraas

ARRASTRE

BOT. VACIAS-RETORNO Contaminacin secundaria en medio ambiente, mquinas, drenajes, goteos por condensacin
Lev. extraas, Mohos, Acetobacter, Gluconobacter, Lactobacillus, Lactococcus lactis, Micrococcus,

EMBOTELLAMIENTO

Efectos microbianos en la cerveza

Sensoriales
Visual: Turbidez Sedimento Pelculas Color Espuma Off-Flavour: Aroma Sabor Otros:
pH

Qumicos
Degradacin de ingredientes Produccin de metabolitos: cidos orgnicos Alcoholes steres Compuestos azufrados Gas Etc.

Biolgicos
Crecimiento microbiano Toxinas: Nitrosamina Aminas biognicas Micotoxinas

Viscosidad

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Lactobacillus sp.
Morfologa: Bacilos cortos o alargados; individuales, en pares o cadenas; no mviles.

Fisiologa: Gram-positivos; catalasa negativos, oxidasa negativos, microaeroflicos, resistentes al lpulo. Produccin de cido lctico, CO2, cido actico y/o etanol (especies heterofermentativas). Produccin de cido lctico y diacetilo (especies homofermentativas).

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Lactobacillus sp.
Efectos dainos: Sedimento, turbidez, acidificacin. Especies homofermentativas: fuerte off-flavour debido al diacetilo. Especies heterofermentativas: off-flavour cido. Especies dainas obligadas: Heterofermentativas: L. brevis, L. lindneri, L. brevisimilis, L. frigidus. Homofermentativas: L. casei, L. coryneformis Especies potencialmente dainas: Homofermentativas: L. plantarum

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Pediococcus sp.
Morfologa: Cocos individuales, en pares o tetradas, no mviles

Fisiologa: Gram-positivos; catalasa negativos, oxidasa negativos, microaeroflicos, resistentes al lpulo. Produccin de cido lctico y diacetilo.

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Pediococcus sp.
Efectos dainos: Fuerte sedimento, poca turbidez, poca acidificacin. Fuerte off-flavour debido al diacetilo.

Especies dainas obligadas: Pediococcus damnosus

Especies potencialmente dainas: Pediococcus inopinatus

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Pectinatus sp.
Morfologa: Bacilos largos y delgados (0.7-0.8 x 2.0 32 m), ligeramente curvados y de extremos redondeados. Clulas individuales, en pares, raramente forman cadenas cortas. Mviles mediante flagelo.

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Pectinatus sp.
Fisiologa: Gram-negativos; catalasa negativos, anaerobios estrictos, mesfilos (15-37 C). Crecimiento a pH>4.4 y O2 < 0.3 ppm. Fuentes de carbono: azcares, glicerol, piruvato, cido lctico. Produccin de cido actico, cido propinico, cido succnico, acetona, CO2 y H2S. Efectos dainos: Contaminante secundario en las salas de embotellado, en mezclas de cerveza, agua y lubricante de cadenas

Algunos microorganismos dainos a la cerveza

Pectinatus sp.
Efectos dainos: Infiltracin a travs del aire, botellas vacas (sucias), sistemas de drenaje. Nichos en las esquinas de la llenadora y coronadora. Sedimento, formacin de turbidez, fuerte offflavour a huevos podridos o desage colapsado. Especies dainas obligadas: Pectinatus cerevisiphilus Pectinatus frisingensis

Algunos microorganismos dainos a la cerveza

Megasphera sp.
Morfologa: Cocos esfricos u ovalados (1.2 1.6 m) Clulas individuales, en pares, raramente forman cadenas cortas (4 clulas). No mviles. Fisiologa: Gram-negativos; catalasa negativos, anaerobios estrictos, mesfilos (15-37 C). Crecimiento a pH>4.5, O2 < 0.3 ppm y bajas concentraciones de etanol. Fuentes de carbono: fructosa, piruvato, cido lctico.

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Megasphera sp.
Fisiologa: Produccin de cido actico, cido propinico, cido butrico, cido valrico, cido caprinico, acetona, CO2 y H2S.
Efectos dainos: Contaminante secundario en las salas de embotellado. Infiltracin a travs del aire, botellas vacas (sucias), sistemas de drenaje. Nichos en las esquinas de la llenadora y coronadora. Poco sedimento, poca formacin de turbidez, fuerte off-flavour a huevos podridos. Especies dainas obligadas: Megasphaera cerevisiae

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Bacterias potencialmente dainas:
Lactococcus lactis Crece en cervezas con menos de 13 unidades de amargor. Sedimento, turbidez, off-flavour diacetilo.
Leuconostoc mesenteroides Crece en cervezas ligeramente lupuladas, con pH>4.6. Sedimento, turbidez, formacin de dextrinas (aumenta la viscosidad), off-flavour diacetilo. Kocuria kristinae Crece en cervezas ligeramente lupuladas, con pH>4.7 y contenido de oxgeno aumentado. Poca turbidez, off-flavour afrutado.

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Bacterias potencialmente dainas:
Zymomonas mobilis Crece slo en cervezas carbonatadas con azcar (primed beer). Sedimento, etanol adicional, CO2, aldehdos, acetato, H2S y DMS (off-flavours).

Algunas bacterias dainas a la cerveza

Bacterias indirectamente dainas:
Bacterias del mosto Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae, as como los gneros Bacillus y Clostridium. Contaminacin durante el enfriamiento del mosto o por germinacin de esporas. Contaminacin debido a grandes fallas tcnicas/tecnolgicas en el proceso productivo. Puede producir desaceleracin de la fermentacin, coloracin y/o generacin de off-flavours por compuestos fenlicos.

Levaduras dainas a la cerveza

Levaduras Extraas
Dainas obligadas
S. Cerevisiae ssp.
S. diastaticus; S. logos; S. bayanus; S. cratericus; S. ellipsoideus; S. willianus

Dainas potenciales

Levaduras aerobias
Debaromyces sp.
D. hanseni

Saccharomyces sp.
S. exiguus

Saccharomycoides sp.
S. Ludwigii Candida sp.
S. intermedia; S. tropicalis

Rhodotorula sp.
Cryptococcus sp.
S. intermedia; S. tropicalis

Bretanomyces sp.
B. Bruxellensis
Sobre atenuacin Turbidez Sedimentos Off flavours: steres, fenoles Prdida de cuerpo Astringencia y amargor

Hansenula anomala.
Turbidez Sedimentos Off flavours: steres,

Biofilms Candida, Pichia, Hansenula

Indicadores de contaminacin Insuficientes limpieza y sanitizacin

Contaminacin por mohos

Los mohos no constituyen contaminantes directos de la cerveza, pero s de la cebada, cereales aditivos y la malta. Flora normal de la cebada: Fusarium, Helminthosporium y Alternaria Si la humedad >13,2%, germinan las esporas y se desarrollan Aspergillus y Penicillium: prdida de color, generacin de micotoxinas y off-flavours. Contaminacin en el proceso puede dar lugar a off-flavour: musty.

Control microbiolgico

Control microbiolgico

Sistema de monitoreo
1. Planes de muestreo
Matriz de muestreo Puntos de muestreo Tiempo Intervalo Cantidad Responsables Estadstica
9 3 4 5

1.- COC IMIEN

1 2

His opad o cocimie de superficie interna nto de CIP-Sod a Cast ica CIP-ci do

TO

MUEST RA
Frecue
pailas de
Cada 2 meses Se man Se man Se man al

ncia m nima d e

muest reo

Lugar -

muest ra

Solucin sanitiza nte en tina pa His opad ra acce o de Ju sorios mpers (codos o cone xiones ) 6 CIP - Agua de enju ague fi nal de pailas 7 Agu a helada Agua ca lie Mos to ca nte

al

al

liente

( )

Qui ncen al 50% de los CIP de la se mana 20% de los CIP de la se mana 10% de los CIP de la se mana Se man al Se man al

10

Mos to frio an te Mos to frio an te

s de la

aireaci n - Es ta

bilidad

11 Air e para

s de la

el mos

aireaci n - Es ta

to

nte NB BC

12 Obs ervacin 13

de la extern s a de eq uipamie condiciones nto y ed de lim ificaci pieza n A

gua en juague lnea

Uno de los co ci mie nt tanque os que s fe rm in entado San Ju re s conv gresa a cada an (27) TCC. Pa ensi on consid ra los al es de erar el M 50% de l nmer otupe (18) y o de m ue stra s. Se man al Qui ncen Se man

() Rea lizar s microbi lo cuan do mos ana y/ o se de to frio sarrolle pres en te carg trab a en la ln ajos de man tenimie ea nto Tube ra de in gres

Paila de adjunt os, de Lauter mezcl a, , tq. de cuba mosto , paila lpulo de y Whi rp ool CIP-co ci mie nt o CIP-co ci mie nt o Coci m ie nto Supe rf icie s in te rnas empaqu y etadur as Coci m ie nto Coci m ie nto Coci m ie nto Tanque de agua he lada Tanque de agua calie nt e o al en friador mosto de

Tube ra

de salid

a de l en friador mosto de

Coci m ie nto a 2.- PRO Fe rmen taci n PAGAC IN DE 14 Prop agaci L E VADUR n - prim er es cala A 15 Propagac mient

al

Aireado Coci m

labora

3.- Ma nejo d 24 e
Levadu ra cose

- tercer es cala miento en labo 17 His opado de ratorio. la supe Carls be rficie in rg terna de 18 Air botella e es tri l 19 His opado de Jum pers (c 20 CIP odos o - Agua conexi ones ) de enju ague de l propag 21 Mos to en el pr ador opagad or - Es Mos to tabilid en el pr ad opagad Levadu or - Es ra en tante N BBC 22 proces o - En el propagador ri a qu la Levadu ecimie s 24 de nto ra en iniciado el prop proces el ag o - Exte ador a ns in las 24 de inic iado el 23 Obs ervacin de la extern s a de eq uipamie condiciones nto y ed de lim ificaci pieza n chada

16 Prop agaci n

in - se o en la gundo borato torio rio es cala miento en

Cada 2 m

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Cada pr op Cada pr op Cada pr op Cada pr op Cada pr op

Lnea m os to de spus

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Primer escala mie nto o esca lamie nt o Bote lla Carl sb erg an entreg te s de ar a El ab oraci n Bote lla Carl sb erg Sala pr opagac in Supe rf icie in empaqu te rna y etadur a Sala pr opagac in Sala pr op Sala pr op Sala pr op Sala pr op agaci n Se gund

agaci n

agaci n

agaci n

Cada 2 meses Cada pr op Cada pr op Cada pr op Cada pr op agaci n

agaci n

agaci n

agaci n al

LEVAD URA

agaci n

Qui ncen

agaci n

25 Leva dura 26 Air e

para si

embra

Cada co se cha C

agaci n

Control microbiolgico

Sistema de monitoreo
2. Muestreo
Llaves Vlvulas Cucharones Hisopados de superficies Muestreadores de aire Muestreadores automticos contnuos Materiales y equipos para muestreo

Esquema de muestreo

Control microbiolgico

Sistema de monitoreo
3. Cultivo
Filtracin de membrana Enriquecimiento lquido Siembra por supericie Temperaturas de incubacin Generacin de anaerobiosis Medios de cultivo especficos Microorganismos a detectar Conteos de clulas de levadura

Control microbiolgico

Sistema de monitoreo
4. Identificacin
Morfologa macroscpica/microscpica Test fisiolgicos/bioqumicos Serologa

5. Documentacin/interpretacin/informacin
Precisin y sensibilidad de los mtodos. Estandarizacin Registros Rpido acceso Precisin en la interpretacin

Control microbiolgico

Sistema de monitoreo
6. Instalaciones y personal
Localizacin Diseo Limpieza Cambios en la tecnologa Staff, capacitacin

Control microbiolgico
Mtodos Para la Deteccin Rpida como Apoyo del Aseguramiento del Control de Calidad Microbiolgico ATP-Bioluminiscencia

Ventajas /Desventajas : Muy rpido No especfico No se puede comprobar si el ATP proviene de bacterias nocivas a la cerveza Solamente para evaluar el estado de higiene

Control microbiolgico
Mtodos Para la Deteccin Rpida como Apoyo del Aseguramiento del Control de Calidad Microbiolgico Sondas genticas: Hibridacin fluorescente in situ (FisH)
Introduccin de una sonda gentica con fluorescencia especfica Unin sobre ARN ribosomal La fluorescencia es visible bajo el microscopio

Ventajas/Desventajas Rpido, deteccin especfica Uso de pocos equipos Evaluacin microscpica (experiencia)

Control microbiolgico
Mtodos Para la Deteccin Rpida como Apoyo del Aseguramiento del Control de Calidad Microbiolgico Mtodos de deteccin basados en PCR
PCR estndar PCR en Tiempo-Real Preparacin PCR : Primers, Sondas, Buffer, Polimerasa, ADN Objetivo Componentes del ADN

Muestreo

Filtracin

Aislamiento de ADN

Evaluacin de la reaccin del PCR

Prevencin de la contaminacin
1. Personal
Calificacin Motivacin Entrenamiento en el puesto de trabajo Comunicacin Higiene Buenas Prcticas de Manufactura

Prevencin de la contaminacin
2. Limpieza y Sanitizacin
Insumos qumicos Temperatura Concentraciones pH Tiempo Efecto mecnico Frecuencias

Limpieza

Sanitizacin

Prevencin de la contaminacin
3. Tecnologa
Receta cervecera especfica Calidad de la materia prima Manejo de la levadura (cosecha, almacenamiento y siembra) Fermentacin

Prevencin de la contaminacin
4. Ingeniera
Diseo higinico Llenado estril Filtracin estril Tratamiento trmico Mantenimiento preventivo y correctivo

Prevencin de la contaminacin
5. Monitoreo del estado de higiene
Control microbiolgico de: Materias primas Intermediarios Aguas de enjuague Proceso de produccin Planta de produccin (Checklist de higiene) Producto final Higiene de trabajadores