Pruebas bioqumicas primarias.

Las pruebas bioqumicas primarias son usadas para determinar el gnero de la mayoria de las bacterias. 1. 2. 3. 4. 5. Tincin de GRAM. Prueba de catalasa. Prueba de oxidasa. Prueba de oxidacin/fermentacin conocida como OF. Motilidad.

Nota: Para identificar el gnero de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Tincin de GRAM. Fue creada en 1884 por el mdico danes Hans Christian Gram, Esta tincin nos permite separar a la mayora de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tien de color violeta y las gram negativas que se tie de color rosa. La diferencia en la tincin radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias. Pared celular de las bacterias Gram positivas.

Pared celular de bacterias Gram negativas.

Reactivos usados en la tincin de Gram. Agua estril para realizar el frotis. Cristal violeta tambin conocido como violeta de genciana. Safranina. Una mezcla de alcohol-acetona 1:1. Agua corriente para enjuagar. Tcnica de la tincin de Gram. De preferencia la tincin debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente. Frotis bacteriano. Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica hasta el rojo vivo y esperar a que enfre un poco. Tomar con el asa una gota de agua estril y agregarla en un portaobjetos. Flamear nuevamente el asa y esperar a que enfre. Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada. Despus agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares. Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. Tincin. 1Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
2

dejar actuar durante 60 segundos. 2Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos. 3Enjuagar con agua corriente. 4Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente. 5Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos. 6Enjuagar con agua corriente. 7Dejar secar a temperatura ambiente. 8Observar en un microscopio ptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersin.

Fundamento de la tincin de Gram. **Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecnicamente el exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona. **El colorante cristal violeta es de naturaleza bsica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier
3

bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teidas de color violeta. **Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijacin de algn colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijacin a la pared clular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague.Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en cidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas cidez de los cidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante bsico cristal violeta. **La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgnico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloracin no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos ms aceptadas. -Una teora dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol. En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco pptido glicano y una gran cantidad de lpidos estos ltimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol. -Otra teora dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de cidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la slida del complejo cristal violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloracin. **La safranina es un colorante catinico que tie las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tien de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tien debido a que su pared clular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina. Factores que considerar en la tincin de Gram. No se debe sobrepasar los tiempos de tincin y decoloracin. Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tian parcial o totalmente de color rosa. Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:

Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. Prueba de la oxidasa. Esta prueba esta basada en la identificacin de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa. Todas las bacterias aerobias obtienen su energa en forma de ATP a partir del proceso de respiracin tambin llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicacin de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP. En la respiracin hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasale quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxgeno siendo este el ltimo aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxgeno tiene un exceso de electrones puede atraer tomos de Hidrgeno formando dos posibles productos: Agua o perxido de hidrgeno. Reactivos usados en la prueba de oxidasa. Se utilizan colorantes cromgenos que actan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los ms usados son:

Tetrametil-p-fenilendiamina. Dimetil-p-fenilendiamina. Indofenol. El reactivo basado en una disolucin acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el ms comn y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo. Fundamento bsico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromtica y la oxidacin de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliogrfia en especial el libro de Mac Fadin. Como realizar la prueba de la oxidasa. Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h. La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
5

Se debe observar una coloracin morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo. Control positivo: Pseudomonas aeruginosa. Control negativo: Escherichia coli.

Factores a considrerar en la pueba de oxidasa.

No considerar un resultado positivo despus de 30seg ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo. No usar asa bacteriolgica metlica ya que la mayora de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos. No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentacin del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba. Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.

Prueba de la catalasa. Fundamento de la pruebe de catalasa. El perxido de hidrgeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta va metablica recibe el nombre de metabolismo aerobiooxidativo. La acumulacin del perxido es muy toxico por lo que la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzima llamada catalasa que degrada el perxido de hidrgeno obteniendo agua y oxigeno gas. Tcnica e interpretacin de la prueba.
6

El reactivo utilizado en la prueba es el perxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes tcnicas para realizar la prueba la mas comn es poner una gota de perxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay produccin de oxgeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reaccin positiva debil aunque son las menos.

Prueba de oxidacin y fermentacin tambin conocida como OF. Las bacterias ocupan diferentes vas metablicas para obtener sus nutrientes y la energa, casi todas las bacterias consumen algn tipo de carbohidrato
7

generalmente el mas utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la va oxdativa, fermentativa o ambas. La va oxidativa utiliza oxgeno, un sinnimo es va aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno, sinnimo metabolismo anaerobio.

Fundamento de la prueba bioqumica de OF. El metabolismo oxdativo de la glucosa produce cidos dbiles, por lo tanto en la prueba bioqumica se utiliza de indicador el azul de bromotimol que tiene un vire de ph menor respecto al rojo de fenol, ya que son cidos dbiles se agrega una mayor cantidad de glucosa hasta el 1%, para que se produzca una mayor cantidad de cidos y se alcance mas fcilmente el vire del indicador. El metabolismo de las peptonas produce sustancias alcalinas que podran disminuir el Ph del medio evitando as evidenciar la presencia de los cidos dbiles producidos por la via oxidativa, para solucionar esto el medio tiene poca cantidad de peptonas hasta el 2% respecto a la D-glucosa. Ph de vire del azul de bromotimol: 6-7 cido: Amarillo Alclino: Verde. En el tubo sin aceite: La produccin de cidos dbiles reducira el ph del medio esto ser evidenciado gracias al indicador producindose una coloracin amarilla en todo el tubo, aunque puede variar su intensidad.
8

En el tubo con aceite: La fermentacin de la glucosa produce cidos fuertes respecto a los que produce la va oxidativa, ejemplo de estos cidos son el cido lctico, cido frmico, cido actico, entre otros. El medio se acidifica y el vire del indicador da como resultado una coloracin amarilla intensa en la totalidad del tubo. Tcnica de la prueba. Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estril, despus se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada posteriormente se inoculan ambos tubos por el mtodo de picadura y finalmente se preparan las condiciones de los tubos, un tubo se cerrara su tapa de tal forma que quede floja con la intencin de que entre algo de oxigeno, al segundo tubo se le agregara 1.5-2ml de aceite mineral estril y la tapa se cerrara completamente, se incubarn durante 24h.

10

Control positivo oxidativo: Pseudomonas aeruginosa Control positvo fermentador: Escherichia coli Control sin cambios, no consume glucosa: Moraxella sp

Prueba de motilidad. La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la inoculacin de los medios OF o en un medio SIM, este mtodo es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular lo que nos darian falso positivo. Para evitar este factor se realiza la tcnica de gota suspendida bacteriana. Tcnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solucin fisiolgica salina estril, ponerle un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un cubreobjetos al que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeas de plastilina con el objetivo de evitar que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X. Se alcanzan haber bacterias muy pequeas y casi translcidas moverse a velocidad variable, observar al menos de 5-10 bacterias recorrer todo el campo de visin para declarase una motilidad positiva. La mayora de las bacterias motiles son de morfologa bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.

11