Introduccin El dominio Bacteria alberga a numerosos microorganismos que son capaces de subsistir en gran variedad de hbitats y bajo diversas

condiciones ambientales, haciendo posible su existencia en casi cualquier lugar imaginable. Las bacterias presentan una amplia gama de morfologas y caractersticas metablicas que permiten su diferenciacin y clasificacin mediante anlisis de laboratorio. Para ello, es necesario cultivar las cepas en medios propicios para su crecimiento y proliferacin, sean estos lquidos (Ej.: caldo nutriente), semislidos (Ej.: agar TSI) o slidos (Ej: agar corriente). La identificacin bacteriana se basa principalmente en la observacin macroscpica y microscpica de los cultivos y los resultados de distintas pruebas realizadas a ellos. El anlisis macroscpico consiste en observar a simple vista cambios cualitativos en las muestras, como variacin en el color u opacidad del medio de cultivo, textura de la superficie, agrupacin macroscpica, bordes de la colonia, elevacin de esta, y tipo de hemlisis, en el caso de los cultivos en agar sangre, y movilidad, en el caso del agar MIO. La observacin microscpica busca esclarecer caractersticas que no es posible visualizar sin el instrumental adecuado. Para ello, se utiliza el microscopio y ciertas tinciones (Ej.: tincin de Gram) para obtener apreciaciones ms certeras de la colonia, como forma de la bacteria, agrupacin (racimos, cadenas, etc), y gram positividad/negatividad. Tambin existen pruebas bioqumicas como la Fisiotaxonoma bacteriana, que de acuerdo a variables selectivas y diferenciales como utilizacin de fuentes de carbono, presencia de enzimas, sensibilidad a compuestos qumicos y formacin de productos metablicos, permite un reconocimiento ms preciso de los organismos en cuestin. Del mismo modo, la prueba API 10s conduce a una identificacin rpida de enterobacterias y bacilos gram-negativos mediante la comparacin de los resultados obtenidos con otros preexistentes. Este test consiste en 11 pruebas bioqumicas estandarizadas que utilizan sustratos deshidratados. Los anlisis anteriormente descritos son tiles para la identificacin de bacterias con las que convivimos en nuestro cotidiano, as como tambin de potenciales patgenos que ponen en riesgo la salud humana.

Este trabajo prctico tiene los siguientes objetivos:

 Identificar material empleado en la prctica bacteriolgica Adquirir destreza para manipular materiales y cultivos, cuidando la esterilidad Conocer los diferentes medios de cultivo Conocer la utilidad de los medios de cultivo ms usados Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias Practicar diferentes tipos de siembra y aislamiento bacteriano Comparar colonias bacterianas desarrolladas en placas de agar Describir colonias de acuerdo a criterios macroscpicos Practicar tinciones diferenciales de frotis bacterianos: tincin de Gram, tincin de cpsula y esporas. Dada una serie de preparaciones microscpicas, identificar diferentes formas y agrupaciones de microorganismos teidos con la tincin de Gram Reconocer gneros y especies bacterianas de acuerdo a sus caractersticas macro y microscpicas. Practicar algunas pruebas bioqumicas rpidas para la identificacin de cocceas Gram+ Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos intermediarios, debido a la accin bacteriana Identificar macroscpica y microscpicamente bacterias de nuestra flora normal en las placas sembradas en la sesin anterior. Identificar bacterias que estn presentes en el ambiente Identificar una cepa bacteriana Gram(-) a travs de su comportamiento en diferentes medios de cultivo y analizar macroscpica y microscpicamente.

Materiales y Mtodos Los materiales utilizados en los pasos prcticos son los siguientes: Mechero Asas de siembra Pipetas Pasteur Suero fisiolgico Placas de agar Corriente Placas de agar McConkey Placas de agar Sangre Tubos de agar Corriente

 Tubos de agar semitendido Cultivos Bacterianos en medio slido Cultivos Bacterianos en medio tendido Batera de tubos con diversos medios de cultivo Batera de tubos de pruebas fisiotaxonmicas Batera API S10 Batera de preparaciones fijadas Microscopio Portaobjetos Reactivos para tincin de Gram

Resultados Parte I: El anlisis macroscpico de los cultivos de las bacterias Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus cereus arroj las siguientes caractersticas para cada colonia, respectivamente:

Staphylococcus aureus
Tipo de Agar Medio de cultivo Crecimiento Colonia Borde Superfi cie Elevaci n C. Fsicas Hemoli sis Corriente LS Bajo Puntiforme Ondulado Rugosa Plana Crea Brillante Color amarillo Sangre LS Moderado Puntiforme Ondulado Rugosa Elevada Crea Brillante Color amarillo McConckey L S No crece -

Tabla 1: Caractersticas Staphylococcus aureus

Caractersticas morfolgicas

morfolgicas

para

la

colonia

de

Escherichia coli
Tipo de Agar Medio de cultivo Crecimiento Colonia Borde Superfi cie Elevaci n C. Fsicas Caractersticas morfolgicas Hemoli sis Corriente S S Moderado Puntiforme Liso Lisa Elevada Transparente Brillante Sin color Sangre S S Alto Irregular Liso Lisa Elevada Crea Brillante Color blanco McConckey L S Alto Puntiforme Liso Lisa Convexa Crea Brillante Color fucsia -

Tabla 2: Caractersticas morfolgicas para la colonia de Escherichia coli.

Bacillus cereus
Tipo de Agar Medio de cultivo Corrien te L S Corriente S S Sangre S S McConckey L S

Caractersticas morfolgicas

Crecimiento Colonia Borde Superfi cie Elevaci n C. Fsicas

Bajo Puntifor me Liso Lisa Elevada Transpa rente Brillante Sin color -

Moderado Rizoide Lobulado Rugosa Elevada Crea Opaca Color Amarillo

Alto Irregular Ondulad o Rugosa Elevada Crea Opaca Color gris

Alto Puntiforme Liso Lisa Elevada Crea Brillante Color rosado

Hemoli sis Tabla 3: Caractersticas morfolgicas para la colonia de Bacillus cereus El anlisis microscpico realizado posterior al uso de la tincin de Gram, mostr los resultados siguientes:

Anlisis Microscpico
Bacteria Staphyloco ccus aureus Agar Sangre Escherichia coli Bacillus cereus Bacillus cereus

Muestra Agar Agar Agar Colonia MacConckey Sangre MacConkey Afinidad Gram + Gram Gram + Gram tintrea Forma Cocacea Bacilo Bacilo Bacilo Agrupaci Racimo Racimo Cadena Racimo n Tabla 4: Morfologa microscpica de las cepas bacterianas sembradas y sometidas a la tincin de Gram. La observacin microscpica de la batera de muestras fijadas indic los resultados expuestos en la Tabla 5.

Tinci n
Gram

N
101 102 103

Muestra
Gram + Gram Mezcla

Afinidad T.
Gram + Gram Gram +

Forma
Bacilo Bacilo Cocacea

Agrup acin
Cadena Cadena y racimo Diplo

105 106 107

Verde 109 de Malaqu ita Tinta 110 Capsula China Tabla 5: Morfologa de colonias fijadas.

Gram + y Gram Estafilococ os Levadura Estreptococ os Esporas

Gram Gram + Gram + Gram +

Bacilo Cocacea Cocacea Cocacea Bacilo

Diplo Racimo Racimo Racimo Cadena

Cocacea

Diplo

Parte II

Las muestras nasofarngeas recolectadas en el laboratorio (Fig. ) fueron analizadas macroscpica, microscpica y bioqumicamente, entregando los resultados expuestos en las tablas.

Muestra N1

Muestra N 2

Muestra N3

Fig. * : Muestras nasofarngeas en agar sangre, pertenecientes a tres estudiantes distintos

Muestras nasofarngea
N muestra Tipo de Agar Crecimiento Caractersticas morfolgicas Colonia Borde Superfic ie Elevaci n C. Fsicas Hemolisi s 01 02 Sangre Sangre Alto Moderado Moderado Bajo (1) (2) Puntiforme Rizoide Puntiform Irregular e Liso Lobulado Liso Liso Liso Rugosa Lisa Lisa Convexa Transparent e Brillante Sin color Elevada Crea Brillante Color Amarillo Convexa Transpar ente Brillante Sin color Elevada Crea Brillante Color Amarillo 03 Sangre Moderado Bajo Puntiforme Liso Lisa Convexa Transparent e Brillante Sin color Puntiform e Liso Lisa Convexa Crea Opaca Color Amarillo

Tabla 6

Tincin de Gram
N Muestra Muestra Colonia Afinidad tintrea Forma Agrupacin 01 Agar Sangre Gram + Cocace as Racimo s Gram Cocacea s Cadena 02 Agar Sangre Gram + Cocaceas Racimos Gram Cocace as Racimo s 03 Agar Sangre Gram + Cocacea s Racimos Gram Cocace as Cadena

Tabla 7: Anlisis microscpico de las muestras, posterior a la tincin de Gram. Posteriormente, se realizaron las pruebas de coagulasa y catalasa a dos cepas bacterianas encontradas en la muestra N 1, lo que se grafica en la Tabla 8.

Prueba bioqumica para cocacea Gram +

N2 (+) Control Control negativ positivo o (-) (+) Tabla 8: Pruebas bioqumicas para las bacterias halladas en la muestra N1. Las muestras extradas del ambiente (Fig. *) fueron sometidas a anlisis macroscpico, obteniendo los resultados observados en la Tabla 9. Bacteria Catalasa Coagulasa N1 (-) No se realizo

a. c.

b.

d. e. Fig. * : Muestras ambientales y corporales correspondientes a: a. cara, b. mueca, c. cuero cabelludo, d. suelo del laboratorio, e. oreja.

Tabla 9: Anlisis macroscpico de las colonias halladas en muestras ambientales y corporales.

Las pruebas de la batera bioqumica para la bacteria asignada indicaron lo expuesto en la Tabla 10. Batera Bioqumica Color al Inicio Color despus de agregar la bacteria Amarillo claro Blanco Rojo Rosado transparente Verde musgo Azul fuerte Naranjo transparente Lila Superficie negra Profundidad roja Morado intenso

Agar o Caldo Corriente Manitol Citrato TSI LIA MIO Corriente

Forma Tendido Tendido Tendido Semitendido Semitendido Lquido

Resultado Pigmentacin (+) Alcalinidad (-) Utilizacin de citrato (-) Medio alcalino Produccin de amoniaco No hay fermentacin (K/K) Presencia de enzimas proteolticas Presencia de H2S No desamina la Descarboxila la lisina lisina No hay motilidad Ausencia de indol (-)

Caractersticas morfolgicas

Caf oscuro Morado Amarillo Amarillo opaco fuerte Urea Lquido Lila claro Lila claro No posee ureasa (-) Sorbitol Lquido Rojo fuerte Rojo anaranjado +- Variable (V) Glucosado Lquido Muestras Amarilloambientales Amarillo y del cuerpo Acidez (A) Muestra Cara Mueca Cuero Suelo Oreja transparente transparente sin cabelludo Laboratorio presenciaMcConckey de gas Tipo de Agar Corriente Corriente McConckey Corriente VogesLquido Amarillo Rosado Rojo Presencia de pHBajo 4,5 o ms Crecimiento Bajo Moderado Proskauer marrn Circular oscuro Acetilmetilcabinol bajo Colonia Puntiforme Circular Borde Liso Liso Liso (+) (+)
Superficie Elevacin C. Fsicas Lisa Pulvinada Crea Opaca Color blanco Lisa Umbonada Transparente Brillante Color Amarillo Lisa Umbonada Crea Opaca Color Amarillo

Tabla 10: Resultados de las pruebas bioqumicas fisiotaxonmicas para la cepa asignada. Posteriormente, el anlisis API 10S para la bacteria (Fig. *) mostr lo indicado en las Tabla 11 y Tabla 12.

a.

b.

c.

Fig. *: a. API 10S con la bacteria sembrada, b. API 10S luego de 3 semanas, c. API 10S luego de 3 semanas ms algunos reactivos.

Bacteria Salmonella choleraesuis ssp arizonae Proteus mirabilis

Pruebas en contra ONP URE ARA TDA G 0% 0% 1% 1% -

LDC 1%

OX 0% -