Presentacin

Sangre y Hemoderivados del Ministerio de Salud, en nombre del compromiso con la mejora de la atencin a la poblacin, unen sus esfuerzos con la finalidad de promover el perfeccionamiento de los profesionales de los laboratorios de salud pblica y de las unidades dehemoterapia. En esa perspectiva, los cursos del Sistema de Educacin a Distancia TELELAB, organizados en un abordaje favorable a una reconsideracin de la prctica profesional, ofrecen a los profesionales de salud una oportunidad de adquirir conocimientos basados en criterios tcnico cientficos de calidad para asegurar el estndar de excelencia deseable en la atencin a los usuarios de los servicios de salud. Queremos dejar registrado nuestro agradecimiento a todos los que contribuyeron en la produccin de las cintas de video y de los manuales que componen los cursos. Esos especialistas de reas tan diversas aprovecharon las diferencias para realizar un trabajo armnico e integrado, lo que refuerza nuestra idea de que es en equipo y en asociacin que se construye un sistema nico de salud con calidad. A los alumnos del TELELAB, nuestra bienvenida y nuestros deseos de xito!

El Programa Nacional de ETS y SIDA y el Programa de

Pedro Jos de Novaes Chequer

Coordinador Nacional de ETS y SIDA

Hlio Moraes de Souza

Coordinador Nacional de Sangre y Hemoderivados

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Bienvenido(a)!
Usted ahora forma parte del TELELAB, un Sistema de Educacin a Distancia del Ministerio de Salud. Estn a su disposicin los siguientes cursos:
Cursos TELELAB 01 - TcnicaparaColectadeSecreciones 02 - TcnicaparaColectadeSangre 03 - Tcnica de Coloracin de Gram 04 - Cultivo, Aislamiento e Identificacin de Neisseria gonorrhoeae 05 - Diagnstico Laboratorial de Chlamydia 06 - Diagnstico Serolgico de la Sfilis 07 - Diagnstico Serolgico de VIH: Pruebas de Tamizaje 08 - Diagnstico Serolgico de VIH: Pruebas de Confirmacin 09 - Colecta de Sangre de Donadores 10 - PreparacindeHemocomponentes 11 - Enfermedad de Chagas Tamizaje y Diagnstico Serolgico en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica 12 - HTLV I/II Tamizaje y Diagnstico Serolgico en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica 13 - Hepatitis Virales Tamizaje y Diagnstico Serolgico en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica 14 - Control de Calidad de Pruebas Serolgicas en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica 15 - Equipos Utilizacin y Monitoreo en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica 16 - Bioseguridad en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica Pre-requisitos Curso 01 Curso 01 y Curso 03 Curso 01 Curso 02 Curso 02 Curso 02 y Curso 07 Curso 09 Curso 02 Curso 02 Curso 02 Curso 06 07 u 11 o 12 o 13 Uno de los cursos anteriores Uno de los cursos anteriores

Observaciones:

1. Usted se inscribe en un curso de cada vez, elegido de acuerdo con su inters y/o necesidad de trabajo,
respetando los requisitos previos identificados.

2. El curso Control de Calidad de Pruebas Serolgicas es complemento esencial para todos los cursos de
diagnstico serolgico. El mismo debe ser realizado inmediatamente despus de concluir el primero de esos cursos (06 07 u 11 12 13). 3. Los cursos de Equipos (15) y de Bioseguridad (16) - son complementos esenciales para todos los otros cursos y deben ser realizados despus que usted concluya el primer curso.

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Cmo funciona
Los cursos del TELELAB estn programados de modo que no interfieran en su rutina de trabajo y usted tiene 1 mes para concluir cada curso que haga. En cada uno de ellos, usted: Examen inicial Cinta de Video Manual hace un examen inicial y, despus, asiste una cinta devideocuantasveceslodesee,enlugaracordado con la coordinacin local del TELELAB; estudia el manual correspondiente, en el tiempo, hora y lugar de su preferencia; hace un examen final para la evaluacin de su aprendizaje; luego de responder correctamente a, como mnimo, el 80% del examen posterior, recibe un certificado.

Examen final Certificado

Al final del curso Enfermedad de Chagas Seleccin y diagnstico serolgico en unidades hemoterpicas y laboratorios de salud pblica, usted estarcapacitadopara:
!

! ! !
!

Identificar los procedimientos y las tcnicas recomendadas por el MinisteriodeSaludparalaseleccinserolgicadedonadoresdesangre y para el diagnstico serolgico de la Enfermedad de Chagas; Ejecutar las pruebas para la deteccin de la infeccin por el T.cruzi, obedeciendo a criterios tcnicos y de control de calidad.

GUARDE ESTE MANUAL. ES SUYO. SELO!

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Sumario
INTRODUCCIN LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Y MTODOS PARA DETECCIN DE LA INFECCIN POR EL T.CRUZI7 Introduccin ElagentecausadordelaEnfermedaddeChagas Formas de contaminacin por el T. cruzi Pruebas utilizadas para el diagnstico laboratorial de la infeccin por el T.cruzi Pruebasparasitolgicas Pruebasserolgicas Pruebas serolgicas para deteccin de la infeccin por el T.cruzi PRUEBA DE HEMAGLUTINACIN INDIRECTA HAI LareaccindeHAI Lectura de la reaccin y criterios para definicin de muestra reactiva, no reactiva y indeterminada Prueba cualitativa y cuantitativa diluciones Determinacin de ttulo de una muestra en la prueba de HAI Materiales para realizacin de HAI cualitativa y cuantitativa Procedimientos para realizacin de la prueba de HAI cualitativa y cuantitativa Garanta de calidad en los resultados de HAI PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA IFI La reaccin de IFI Lectura de la reaccin y criterios para definicin de muestra reactiva, no reactiva e indeterminada Diluciones de la muestra para realizacin de IFI cualitativa y cuantitativa Determinacin del ttulo de muestra en la prueba de IFI Necesidaddetitulacindelconjugado Materiales para la realizacin de IFI cualitativa y cuantitativa Almacenamiento de los reactivos de IFI Realizacin de titulacin del conjugado Interpretacin de los resultados para determinacin del ttulo ideal del conjugado Realizacin de la prueba de IFI Garanta de calidad de los resultados de IFI 9 11 12 12 12 12 13 15 17 18 19 20 21 22 24 25 27 28 28 30 31 32 32 33 36 38 40

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PRUEBA DE ELISA En qu se basa el ELISA? Variaciones en los componentes del ELISA Tipo de ELISA utilizado en el diagnstico de la infeccin por el T. cruzi Secuencia del ELISA indirecto Definicin de muestra reactiva, no reactiva e indeterminada en el ELISA Equipamientos y materiales para realizacin del ELISA Medidas para garantizar la calidad de los resultados ELISA SELECCIN SEROLGICA DE DONADORES DE SANGRE EN UNIDADES DE HEMOTERAPIA Y DIAGNSTICO SEROLGICO EN LABORATORIOS DE SALUD PBLICA Registro de muestras en unidades hemoterpicas Cantidad, acondicionamiento y conservacin de las alcuotas en unidades hemoterpicas SeleccinserolgicadedonadoresdesangreparalaenfermedaddeChagas SecuenciadelaseleccinserolgicadedonadoresdesangreparalaenfermedaddeChagas Procedimientos con los donadores con resultados reactivos o indeterminados Registro y distribucin en cuotas de las muestras para el anlisis en los laboratorios de salud pblica SecuenciaparadiagnsticoserolgicodelaenfermedaddeChagas FRMULAS Preparacin de tampn fosfato (PBS) pH 7.2 Solucin de azul de Evans: solucin stock (0,1%) Preparacin de la solucin PBS-AE al 0,01% Preparacindelaglicerinatamponada ANEXOS Anexo 1 Protocolo de la prueba HAI Anexo 2 Protocolo de la prueba IFI Anexo 3 Protocolo de ELISA BIBLIOGRAFA

41 43 43 44 44 45 47 48

49 51 52 53 54 56 57 58 61 63 64 65 65 67 69 70 71 73

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INTRODUCCION - ENFERMEDAD DE CHAGAS Y MTODOS PARA LA DETECCIN DE LA INFECCIN POR EL T.CRUZI

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Introduccin
La Enfermedad de Chagas, descripto en 1909, es una parasitosis causada por el protozoo Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Ese parsito es trasmitido al hombre por un insecto conocido popularmente por el nombre de vinchuca o chinche gaucha y de barbeiro, en Brasil. El mdico sanitario brasileo Carlos Justiniano Chagas describi, l solo, el ciclocompletodelaenfermedad,hechoinditoenlahistoriadelamedicina.lidentific el parsito, el transmisor, el reservatorio animal de los parsitos y las manifestaciones clnicas de la enfermedad, que llev su nombre. Chagas denomin al parsito T. cruzi, en honor a Oswaldo Cruz. La enfermedad es frecuente en Amrica Central y en Amrica del Sur. En Brasil, la incidencia de ese mal, que ataca a cerca de tres millones de brasileos, es particularmente elevada en algunos estados, como Minas Gerais, Gois, Ro Grande del Sur, Baha y Piau. Adems de la transmisin por la vinchuca, la infeccin por el T. cruzi es transmitida tambin por va sangunea. La primera prueba utilizada para la deteccin de la infeccin por el T. cruzi fue la reaccin de Fijacin de Complemento, desarrollada por Guerreiro y Machado, en 1913.Hoy,esapruebapresentaapenasvalorhistrico,debidoalaexistenciadeexmenes serolgicos ms simples y precisos. La utilizacin de rutina de los exmenes serolgicos en unidades hemoterpicasha contribuido, de forma decisiva, para la reduccin del nmero de casos postransfucionales de la infeccin por el T. cruzi. En este manual se presentan las pruebas recomendadas, tanto en unidades hemoterpicas, para la seleccin serolgica de donantes de sangre, como en laboratorios de salud pblica, para el diagnstico serolgico de la infeccin por el T. cruzi, atendiendo a criterios tcnicos, de control de calidad y de bioseguridad.

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Enfermedad de Chagas y los mtodos de diagnstico

Cul es el agente causador de la Enfermedad de Chagas?
Comoustedyasabe,elTrypanosomacruzieselparsitocausadordelaEnfermedad deChagas.Eseparsitoestransmitidoalosmamferos(hombresyanimales)porinsectos hematfagoscomoelTriatomainfestans,popularmentellamadovinchuca. Insecto hematfago insecto que se alimenta de sangre. En condiciones naturales, la vinchuca ingiere formas sanguneas del T. cruzi al alimentarse de un hospedero infectado. Esas formas sanguneas se diferencian y se multiplican en el aparato digestivo del insecto, dando origen a los tripomastigotes metacclicos que son eliminados por las deyecciones de la vinchuca. Como el insecto tieneelhbitodedefecarenelmomentodelapicadura,lasdeyeccionesconteniendo los parsitos infectan a los seres humanos a travs de lesiones en la piel, por el orificio de la picadura o por las mucosas. En la Figura 1, usted puede ver la vinchuca y una forma sangunea del T. cruzi.

Figura 1 Triatoma infestans y forma sangunea del T. cruzi.

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Cules son las principales formas de contaminacin por el T. cruzi por va sangunea?
El T. cruzi es transmitido por va sangunea, principalmente:
! ! ! !

En las transfusiones con sangre contaminada; De madre a hijo (transmisin vertical); En la infeccin accidental en laboratorio; En los transplantes de rganos y de tejidos.

Qu pruebas son utilizadas para el diagnstico laboratorial de la infeccin por el T. cruzi?

Para el diagnstico laboratorial de la infeccin por el T. cruzi son utilizadas las siguientes pruebas:
! Parasitolgicas directas (examen a fresco de la sangre, tcnicas de concentracin del parsito, etc.) Esas pruebas son indicadas en la etapa aguda de la enfermedad,cuandolaparasitemiaeselevada;

Serolgicas, sonpruebasinmunolgicasquedetectan,enelsuero,antgenos o anticuerpos en varios tipos de infeccin. Esas pruebas son utilizadas para la deteccin de la infeccin por el T. cruzi en la etapa crnica de la enfermedad.
!

Antgeno Ag es cualquier sustancia que el organismo identifica como extraa y que induce la produccin de protenas especficas (anticuerpos) por el sistema inmune.
Anticuerpo Ac tambin llamado inmunoglobulina (Ig), es una protenaproducidaporelsistemainmuneenrespuestaaundeterminado antgeno. El anticuerpo se une de forma especfica al antgeno. La unin especfica entre el antgeno y el anticuerpo constituye la base de las pruebasserolgicas. EnelcasodelaenfermedaddeChagas,esaspruebassebasanenlaidentificacin de anticuerpos anti-T.cruzi de la clase IgG, predominantes en la etapa crnica de la enfermedad.

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Hay laboratorios que, adems de las pruebas serolgicas, utilizan, en la etapa crnica, reaccin de amplificacin de los cidos nucleicos del parsito. Amplificacin de cido nucleico secuencia de reacciones que promueve el aumento de copias de una molcula de ADN o ARN. Esas reacciones son utilizadas en laboratorios de investigacin, pero an no estn disponibles para la red de laboratorios. Por eso, a partir de aqu, sern enfocadas laspruebasserolgicasquesonrutinariamenteempleadasenladeteccindelainfeccin por el T. cruzi.

Qu pruebas serolgicas son ms utilizadas para la deteccin de la infeccin por el T. cruzi?

Debido a su elevada sensibilidad y especificidad, las pruebas serolgicas ms utilizadas para la deteccin de la infeccin por el T. cruzi son: 1. Hemaglutinacin Indirecta (HAI); 2. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI); 3. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). La sensibilidad de una prueba es su capacidad de dar un resultado positivo cuando el individuo est verdaderamente infectado. La especificidad de una prueba es su capacidad de dar un resultado negativo cuando el individuo no est infectado.

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PRUEBA DE HEMAGLUTINACIN INDIRECTA - HAI

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En qu se basa la reaccin de HAI?

La reaccin de HAI se basa en la aglutinacin de hemates sensibilizados con antgeno T. cruzi, en la presencia de suero conteniendo anticuerpos contra ese parsito. Vea en la Figura 2.
anticuerpo hemate sensibilizado con antgeno aglutinacin

Figura 2 Representacin esquemtica de una reaccin de hemaglutinacin indirecta (HAI).

Observeque: En la etapa 1, se adiciona la muestra, que, siendo reactiva, contiene anticuerpos anti-T. cruzi. El soporte, en general, es una placa de microtitulacin;
!

Placa de microtitulacin producida, generalmente, en poliestireno transparente con 96 pocillos o en tiras (strips) de 8 12 pocillos, con fondo en V o en U.
! !

En la etapa 2, se adicionan hemates sensibilizados con antgeno de T. cruzi; En la etapa 3, la reaccin antgeno-anticuerpo es visualizada debido a la aglutinacin de los hemates.

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Cmo se hace la lectura de la reaccin y cules son los criterios para considerar una muestra reactiva, no reactiva o indeterminada en la prueba de HAI?
Lalecturasehaceasimplevista,conlaplacademicrotitulacincolocadacontra la luz o en un espejo especfico. Vea, en el Cuadro 1, los criterios para la lectura.
Cuadro 1 Criterios para definir muestra reactiva, no reactiva o indeterminada en la prueba de HAI.
Muestra reactiva Hemates distribuidos de modo homogneo, en forma de malla o red, ocupando rea mayor que el 50% del fondo de la placa. Hemates acumulados en forma de botn en el fondo del pocillo. Cualquier forma diferente de las anteriores.

Muestra no reactiva Muestra indeterminada

Verifique esos criterios en la Figura 3:

Reactiva

No reactiva

Indeterminada

Figura 3 Visualizacin de muestra reactiva, no reactiva e indeterminada en la reaccin de HAI.

La prueba HAI puede ser cualitativa o cuantitativa.

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Cundo se utiliza la prueba HAI cualitativa y cundo la HAI cuantitativa o para titulacin?
!

La prueba de HAI cualitativa es utilizada para definir si una muestra es reactiva o no reactiva. La muestra de suero para la realizacin de HAI cualitativa es diluida una nica vez. La prueba de HAI cuantitativa, o para titulacin, es utilizada para confirmar los resultados de las muestras reactivas o indeterminadas en la HAI cualitativa y para definir el ttulo de las muestras reactivas. Para la titulacin se realiza la dilucin seriada de las muestras de suero.

Cmo se hacen las diluciones de la muestra para la prueba de HAI cualitativa y cuantitativa?
El fabricante del conjunto de diagnstico suministra el diluyente especfico y define la dilucin inicial de la muestra para la prueba cuantitativa. Las diluciones de la muestra para la prueba cuantitativa son preparadas, en general, multiplicando por 2 a partir de la dilucin de la prueba cualitativa. Acompae un ejemplo: Una muestra fue reactiva en la HAI cualitativa en la dilucin nica de 1/20 de acuerdo con las orientaciones del fabricante. Para la prueba HAI cuantitativa se hicieroncincodilucionesdelamuestraapartirdeladilucin1/20comopresentado en la Figura 4.

10 l 190 l

50 l de la dilucin 1/20

50 l de la dilucin 1/40

50 l de la dilucin 1/80

50 l de la dilucin 1/160

50 l de la dilucin 1/320

50 l

50 l

50 l

50 l

50 l

Diluyente

Suero

Figura 4 - Ejemplo de dilucin seriada de la muestra para la prueba de HAI cuantitativa.

Atencin: es necesario homogeneizar cada dilucin antes de hacer la siguiente.

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

Despus de diluir, es necesario determinar el ttulo de la muestra.

Cmo se determina el ttulo de una muestra en la prueba de HAI?

Para determinar el ttulo usted prueba cada una de las diluciones de la muestra en un pocillo de la placa de microtitulacin. El ttulo corresponde a la ltima dilucin en que la muestra an fue reactiva, desde que la dilucin siguiente tenga un resultado negativooindeterminado. Continuando el ejemplo del punto anterior, vea, en la Figura 5, el resultado obtenido con cada una de las diluciones de la muestra:

R = Reactiva; I = Indeterminada;

NR = No Reactiva.

Figura 5 Representacin de las reacciones de cada una de las diluciones de la muestra en la HAI.

Observe que el ttulo fue de 160, porque la dilucin 1/160 fue la ltima donde la muestra an fue reactiva.

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Qu materiales son necesarios para realizar la prueba de HAI cualitativa o cuantitativa?

En el Cuadro 2 estn los materiales generalmente suministrados por el fabricante y los materiales necesarios pero que no son suministrados.
Cuadro 2 Materiales utilizados para la ejecucin de la prueba de HAI.
MATERIALES GENERALMENTE SUMINISTRADOS POR EL FABRICANTE

! ! ! ! ! !

placas de microtitulacin con fondo en V o en U diluyente para los sueros o plasmas suero control negativo suero control positivo hemates sensibilizados con antgeno T. cruzi 2 mercaptoetanol (2 ME)

Atencin: el 2 ME es recomendado por algunos fabricantes e incluido en el conjunto de diagnstico. Esa sustancia, cuando se la mezcla con el suero, elimina la reactividad inespecfica, disminuyendo la posibilidad de que se obtengan resultados falso-positivos e indeterminados.
MATERIALES NO SUMINISTRADOS POR EL FABRICANTE

! ! ! ! ! ! ! ! ! !

pipetas manuales de volumen ajustable (de 5 a 50 l, de 50 a 200 l y de 200 a 1.000 l) puntas descartables para las pipetas de volumen ajustable pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml y 10 ml y pera de goma suero control positivo (CP) y negativo (CN) producido en su propio laboratorio cinta adhesiva transparente para sellar la placa espejo para lectura de placas de microtitulacin (opcional) agitador de placas (opcional) protocolo de trabajo (ver bloque de Anexos) equipamientos de proteccin individual: guantes, barbijos, delantal o guardapolvo recipiente de paredes rgidas, boca ancha y tapa conteniendo hipoclorito de sodio al 2%

Siga las orientaciones del fabricante para conservar y almacenar los reactivos.

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Cmo realizar una prueba de HAI cualitativa y cuantitativa o para titulacin?

La prueba de HAI, cualitativa o cuantitativa (titulacin), debe ser realizada de acuerdo con las orientaciones del fabricante. Sin embargo, algunos procedimientos generalesdebenserobservados: 1 . verifiqueelconjuntodediagnstico(componentes,materiales,diluyenteyreactivos) verificando si el mismo est en condiciones adecuadas de conservacin y dentro del plazo de validez; Atencin: homogenice los hemates sensibilizados con el antgeno verificando si estn sin grumos. Si usted observa la presencia de grumos significa que hubo autoaglutinacin de los hemates, lo que torna al antgeno impropio para su uso. 2 . lea todas las instrucciones del conjunto de diagnstico antes de iniciar la prueba; 3 . rena los otros materiales, no suministrados por el fabricante, necesarios para la realizacin de las pruebas; Separeunapuntadescartableparacadamuestrayparacadatipodereactivo que ser pipeteado. No reutilice las puntas. 4 . utilice exactamente los volmenes indicados para la preparacin de todas las soluciones. No haga cualquier alteracin con la intencin de ahorrar reactivos; 5 . deje que las muestras y los reactivos que sern utilizados alcancen la temperatura ambiente, antes de que inicie la reaccin; La temperatura ambiente en laboratorios debe estar entre los 20C y los 26C. 6 . incluya sueros control positivo y negativo suministrados por el fabricante y producidos en su laboratorio; 7 . haga un protocolo de trabajo, listando los controles, las muestras y las diluciones correspondientes. Vea un ejemplo de protocolo de HAI en el Anexo 1 de este manual; 8 . haga la dilucin de las muestras: a) para la prueba HAI cualitativa la muestra debe ser diluida en tubo, de acuerdo con la recomendacin del fabricante, y despus pipeteada en la placa de microtitulacin; b) para la prueba HAI cuantitativa la dilucin seriada de la muestra debe ser realizada multiplicando por 2, y a partir de la dilucin de la HAI cualitativa. Haga cada una de las diluciones directamente en un pocillo de la placa de microtitulacin, de acuerdo con las instrucciones del fabricante;

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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Recuerde: homogenice el contenido de cada dilucin de la muestra antes de hacer la dilucin siguiente. Utilice una punta para cada dilucin. Atencin: si el conjunto de diagnstico utiliza 2-ME, antes de las diluciones, las muestras debern ser preparadas del siguiente modo: ! diluya el 2-ME 1/100 en salina. Por ejemplo: 10l de 2-ME + 990l de solucin 0,85% NaCI (cloruro de sodio isotnico, o sea, suero fisiolgico); ! diluya cada muestra (suero puro) con 2-ME ya diluido. Haga esa dilucin en volmenes iguales, por ejemplo: para diluir 0,1 ml de suero utilice 0,1 de 2-ME ya diluido; ! incube por 30 minutos a 37C. Es fundamental que el tiempo de incubacin sea exactamente de 30 minutos. 9 . homogenice suavemente el antgeno y pipetee en cada pocillo de la placa de microtitulacin el volumen indicado por el fabricante; 10. cubra la placa con cinta adhesiva transparente de forma que quede totalmente cerrada; 11. agite, suavemente, la placa de microtitulacin, de preferencia con el agitador de placa,parahomogeneizartodosloscomponentes; 12. incube la placa a temperatura ambiente, en local sin vibraciones, por el tiempo recomendadoporelfabricante; 13. haga la lectura de la reaccin verificando si los resultados obtenidos para los controles estn de acuerdo con los criterios definidos por el fabricante. Si los resultadosdeloscontrolesnoestuvierandeacuerdo,inicienuevamentelaprueba. Slo considere los resultados de las muestras cuando los resultados de los controles estn de acuerdo con los criterios; 14. registre los resultados en el protocolo; 15. descarte las muestras y los residuos del conjunto de diagnstico utilizado, segn las orientaciones del curso TELELAB Bioseguridad en Unidades de Hemoterapia y en Laboratorios de Salud Pblica.
! !

Jams inicie la ejecucin de las pruebas antes de arreglar su mesa de trabajo reuniendo todos los materiales y equipamientos necesarios. Utilice siempre equipamientos de proteccin individual y manipule las muestrascomomaterialpotencialmenteinfectante.

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

Qu medidas deben ser tomadas en cuenta para que usted pueda garantizar la calidad de los resultados de la prueba de HAI?
1 . Lea atentamente todas las instrucciones del fabricante antes de iniciar cualquier reaccin; 2 . Rena todo el material necesario para la ejecucin de la prueba y que no est contenido en el conjunto de diagnstico; 3 . Nomezclecontroles,placasdemicrotitulacin,hematessensibilizadosconantgeno y diluyentes de diferentes lotes y/o fabricantes; 4 . Homogenice los hemates observando si no hubo aglutinacin espontanea, antes de iniciar la reaccin; Recuerde: los hemates autoaglutinados forman grumos que los tornan impropios para el uso; 5 . verifique si los reactivos presentan turbidez, precipitacin o alteracin de color, lo que los torna impropios para el uso; No use reactivos con plazo de validez vencido; 6 . ejecutelasdilucionesdelamuestraendiluyenteespecficosuministradoenelconjunto de diagnstico y de acuerdo con las orientaciones del fabricante; Recuerde que es fundamental homogeneizar cada dilucin antes de hacer la siguiente y cambiar la punta; 7 . incube la placa de microtitulacin en local sin vibraciones.

PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA IFI

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

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En qu se basa la reaccin de Inmunofluorescencia indirecta (IFI)?

La reaccin de IFI se basa en la interaccin del propio T. cruzi (formas epimastigotes) con los anticuerpos contra ese parsito presentes en el suero. Vea en la Figura 6.
anticuerpo conjugado

antgeno

Figura 6 Representacin esquemtica de la reaccin de IFI positiva.

Observe que: en la etapa 1, el propio parsito T. cruzi es fijado en una lmina de vidrio con ! regionesdemarcadas; en la etapa 2, se adiciona la muestra diluida que, siendo reactiva, contiene ! anticuerpos especficos que se juntan al antgeno T. cruzi; en la etapa 3, se adiciona el conjugado compuesto de una antiimunoglobulina ! humana reunida al isotiocianato de fluorescena, que servir como revelador de la reaccin antgeno y anticuerpo; en la etapa 4, la interaccin antgeno/anticuerpo se evidencia por medio de la ! fluorescencia del parsito. As como la prueba de HAI, la prueba de IFI tambin puede ser cualitativa o cuantitativa:
! !

IFI cualitativa: define si la muestra es reactiva, no reactiva o indeterminada; IFI cuantitativa: confirma los resultados de las muestras reactivas e indeterminadas en la IFI cualitativa y define el ttulo de las muestras reactivas.

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

Cmo se hace la lectura de la reaccin y cules son los criterios para considerar una muestra reactiva, no reactiva o indeterminada en la prueba de IFI?
Para la lectura de la reaccin, es necesario que usted utilice un microscopio de fluorescencia. La interpretacin de los resultados debe obedecer los criterios descriptos en el Cuadro 3.
Cuadro 3 Interpretacin de una reaccin de IFI para el diagnstico de la infeccin por el T.cruzi.
Muestra reactiva Muestra no reactiva Muestra indeterminada Presencia de fluorescencia uniforme en toda la membrana de los tripanosomas Ausencia total de fluorescencia en los tripanosomas que se presentan, generalmente, con coloracin rojo ladrillo Cualquier patrn diferente de los descriptos anteriormente. Generalmente, los tripanosomas presentan fluorescencia inespecfica, o sea, en varias partes

La prueba de IFI puede ser cualitativa o cuantitativa.

Cmo se hacen las diluciones de la muestra para realizar la prueba de IFI cualitativa y cuantitativa?
Las diluciones de la muestra son realizadas con PBS (Phosphate-BufferedSaline), o sea, solucin salina tamponada con fosfatos, tambin llamada de tampn fosfato.
Vea orientaciones para preparar el PBS en el bloque Frmulas de este manual.

ParalapruebadeIFI,lasdilucionessonrealizadasdeacuerdoconlasorientaciones definidas por la prctica de los laboratorios de referencia, o sea:

!

Para la prueba de IFI cualitativa se recomienda la dilucin 1/20, en la seleccin serolgica de donantes en unidades hemoterpicas, mientras que para el diagnstico en los laboratorios de salud pblica esa dilucin debe ser de 1/40; Para la prueba de IFI cuantitativa se recomienda la ejecucin de, por lo menos, 5 diluciones, multiplicando por 2 a partir de la dilucin de la prueba cualitativa.

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En la Figura 7, usted puede verificar la secuencia de diluciones de la muestra para IFI cuando sea necesaria la titulacin en la seleccin serolgica de donantes de sangre.
100 l de la dilucin 1/20 100 l de la dilucin 1/40 100 l de la dilucin 1/80 100 l de la dilucin 1/160 100 l de la dilucin 1/320

SUERO

PBS

Figura 7 Representacin de la secuencia de diluciones de la muestra en la prueba IFI cuantitativa para seleccin serolgica de donantes de sangre.

Ahora,vea,enlaFigura8,lasecuenciadedilucionesdelamuestraIFIcuantitativa para diagnstico serolgico.

100 l de la dilucin 1/40 100 l de la dilucin 1/80 100 l de la 100 l de la 100 l de la dilucin 1/160 dilucin 1/320 dilucin 1/640

SUERO

PBS

Figura 8 Representacin de la secuencia de diluciones en la prueba IFI cuantitativa para diagnstico serolgico.

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

La opcin de los laboratorios de referencia por la dilucin inicial de la muestra en 1/40 para diagnstico serolgico fue realizada despus de estudios epidemiolgicos. Esos estudios demostraron que sueros de individuos verdaderamente chagsicos presentan reactividad en dilucin igual o mayor que 1/40. Los mismos datos epidemiolgicos indicaron que, en la poblacin no chagsica, la presencia de anticuerpos naturales es responsable por un gran nmero de resultados falso positivos, cuando esos sueros son examinados en diluciones menores que 1/20. Teniendo como objetivo la proteccin de los receptores de sangre y hemocomponentes, fue establecida la dilucin inicial de la muestra en 1/20, para evitar que ocurran resultados falso negativos en la seleccin serolgica de los donantes de sangre.

Cmo es determinado el ttulo de una muestra en la prueba de IFI?

Para determinar el ttulo, cada una de las diluciones de la muestra es colocada en contacto con el antgeno, en una demarcacin de la lmina de IFI. El ttulo, como usted ya lo sabe, corresponde a la ltima dilucin en que la muestra an fue reactiva, desde que la dilucin siguiente tenga un resultado negativo o indeterminado.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

31

En la reaccin de IFI el conjugado tambin necesita ser titulado.

Por qu es necesario titular el conjugado en la reaccin de IFI?

El ttulo del conjugado vara en funcin de las condiciones de trabajo y del operador. Adems de eso, existen variaciones tanto en la calidad de los reactivos de cada lote como en la capacidad de resolucin de los diferentes microscopios de fluorescencia. Por lo tanto, aunque el fabricante indique el ttulo, la titulacin debe ser realizada:
! !

Acadanuevolotedeconjugadoodeantgeno; Siempre que el control positivo acuse la prdida de intensidad de fluorescencia.

Vea, en el prximo punto, cules son los materiales necesarios para titular el conjugado y probar las muestras por IFI.

Qu materiales son necesarios para realizar la prueba de IFI?

Para la prueba de IFI, el antgeno y los reactivos son adquiridos separadamente o juntos en un conjunto de diagnstico. En el Cuadro 4, en la pgina siguiente, estn listados los materiales necesarios para la ejecucin de la prueba de IFI.

32

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Cuadro 4: materiales necesarios para la ejecucin de la prueba de IFI

REACTIVOS Antgeno de T.cruzi (fijado en la lmina, liofilizado o en suspensin) Atencin: los antgenos liofilizados y en suspensin deben ser preparados y fijados en las lminas siguiendo rigurosamente las instrucciones del fabricante. ! Tampn fosfato PBS (phosphate buffer saline) pH 7,2 ver bloque Frmulas ! Azul de Evans (AE) (ver bloque Frmulas) ! Conjugado antiinmunogl obulina humana (total o IgG) conjugada al isotiocianato de fluorescena ! Glicerina tamponada pH (9,0 + 0,5) ver bloque Frmulas ! Sueros control (positivo y negativo) control de calidad interno de la reaccin, segn orientaciones del curso TELELAB Control de Calidad de Exmenes Serolgicos en Unidades de Hemoterapia y Laboratorios de Salud Pblica ! EQUIPAMIENTOS Y MATERIALES DE LABORATORIO ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Reloj despertador (timer) Lminas demarcadas para IFI Microscopio de fluorescencia Pipetas manuales de volumen ajustable (5 l a 50 l, 50 l a 200 l, 200 l a 1.000 l) Puntas descartables para las pipetas manuales Balanza semianaltica y accesorios para el pesaje Agitador tipo Kline (opcional) Estufa con temperatura regulable a 37C Cmara hmeda Cubetas para el lavado de lminas (cubeta de Koplin) Laminillas 24 X 50 mm. Probetas de 1.000 ml. Vaso qumico de 2.000 ml. Recipientes de paredes rgidas, boca ancha y tapa conteniendo hipoclorito de sodio al 2% Guantes descartables, anteojos, barbijos o protector facial y guardapolvo Protocolo de trabajo (ver bloque Anexos)

Cmo almacenar los reactivos de la prueba de IFI?

Laslminasyaconteniendoelantgenofijadodebenseralmacenadasa20C. Aquellos laboratorios que utilizan antgeno liofilizado o en suspensin deben conservarlos entre 2C y 8C, antes de hacer la fijacin en la lmina. La antiinmunoglobulina humana (total o IgG), glicerina tamponada y azul de Evans, deben ser mantenidos tambin entre 2C y 8C.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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Vea, en el curso TELELAB Control de Calidad de Pruebas Serolgicas en UnidadesHemoterpicasyLaboratoriosdeSaludPblica,cmoalmacenaryconservar los sueros control. Ahora que usted ya conoce los materiales y la forma de almacenarlos, vea, en el prximo punto, cmo titular el conjugado.

Cmo realizar la titulacin del conjugado?

La titulacin del conjugado debe ser hecha de la siguiente forma: 1 . lea atentamente todas las instrucciones del fabricante; 2 . Deje que el suero control negativo, el positivo y los dems reactivos alcancen la temperatura ambiente. Utilice un suero positivo con ttulo entre 80 y 320; 3 . Deje una lmina con el antgeno ya fijado alcanzar la temperatura ambiente;
Evite atrito en la parte superior de la lmina para no remover el antgeno fijado.

4 . coloque la lmina en estufa a 37C hasta su completo secado. Cuidado: la lmina no puede quedar en la estufa ms de 10 minutos, que es el tiempomximonecesarioparaesesecado; 5 . Haga la identificacin de la lmina y prepare un protocolo de trabajo, indicando las posiciones del suero control positivo (CP), del negativo (CN) y del PBS. Vea en la Figura 9.

Figura 9 Representacin de una lmina para titulacin del conjugado.

Atencin: lademarcacinconteniendoPBSesuncontrolparaverificarsielconjugado reacciona inespecficamente con los parsitos. Si hubiere fluorescencia en el PBS el procedimiento tiene que ser realizado nuevamente.

34

ENFERMEDAD DE CHAGAS

6 . Haga y homogenice la dilucin del suero CN a 1/20 (190 l de PBS + 10 l del CN); , de acuerdo con el ttulo del suero que usted est 7 . Haga la dilucin con PBS del CP utilizando (1/80, 1/160 1/320); 8 . Pipetee en las demarcaciones correspondientes de la lmina: 10 l del PBS, 10 l del CN ya diluido y 10 l del CP ya diluido; Recuerde:tengaunapuntadescartableparacadatipodecontrolydereactivo a ser pipeteado. No reutilice las puntas. 9 . Coloque la lmina en cmara hmeda e incube en estufa a 37C durante 30 minutos; 10. haga el lavado de la lmina, despus de la incubacin, de la siguiente forma: a ) b ) c ) sumrjala, rpidamente, en un recipiente conteniendo PBS pH 7,2; coloque la lmina en la cubeta y adicione PBS pH 7,2 hasta cubrirla completamente; coloque la cubeta en agitacin durante 5 minutos. Caso usted no tenga un agitador tipo Kline, haga sucesivas y cuidadosas agitaciones manuales por el mismo perodo de tiempo; repita los pasos b y c 2 veces ms, cambiando el PBS a cada vez; laverpidamentelalminaenaguadestilada; colquela en estufa a 37Chasta su completo secado. Recuerde: la lmina no puede quedar en la estufa ms de 10 minutos. Mientras aguarda la agitacin y el secado de la lmina, usted puede ejecutar los pasos 11 y 12. 11. prepare la solucin PBS y el Azul de Evans (AE) al 0,01%, para diluir el conjugado, siguiendo las orientaciones del bloque Frmulas de este manual; 12. haga las diluciones del conjugado como presentado en la Figura 10.

d ) e ) f)

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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100 l de la dilucin 1/50

100 l de la dilucin 1/100

100 l de la dilucin 1/200

Figura 10 Diluciones recomendadas para titular el conjugado

Atencin: es fundamental homogeneizar cada tubo antes de hacer la dilucin siguiente y cambiar la punta. 13. pipetee10ldecadadilucindelconjugadoenlasdemarcacionescorrespondientes de la lmina. Verifique en al Figura 11.

Figura 11 Lmina con el PBS y suero positivo y negativo ya diluidos para la titulacin del conjugado.

14. haga la incubacin y el lavado de la lmina siguiendo los mismos procedimientos descriptos en los pasos 9 y 10; 15. preparelalminaparalalecturaaplicando2a3gotasdeglicerinatamponadapH 9,0 (+ 0,5) sobre la misma; 16. cubra la lmina con una laminilla 24 X 50 mm evitando la formacin de burbujas. Mantenga la lmina al abrigo de la luz y en local seco hasta la lectura; 17. haga la lectura de la reaccin de la lmina en microscopio de fluorescencia, utilizando objetivo de 40 veces; 18. registre los resultados en el protocolo.

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

Cmo interpretar los resultados para determinar el ttulo ideal del conjugado?
Se considera como ttulo ideal del conjugado la mayor dilucin que presente:
!

fluorescencia uniforme en toda la membrana del parsito en el suero de control positivo; ausencia de fluorescencia en el control negativo y en el PBS.

Paracomprendermejorvea,enelCuadro5,losresultadosobtenidos,paracada dilucin del conjugado.

Cuadro 5 Ejemplo 1 resultados obtenidos en la titulacin del conjugado
Dilucin del Conjugado 1/50 RESULTADOS CP Fluorescencia uniforme en toda la membrana del parsito CN Fluorescencia descontinuada en la membrana del parsito Ausencia de fluorescencia Ausencia de fluorescencia Ausencia de fluorescencia PBS Ausencia de fluorescencia

1/100 1/200

Fluorescencia uniforme en toda la membrana del parsito Fluorescencia inespecfica o dbil en varias partes del parsito Ausencia de fluorescencia

Ausencia de fluorescencia Ausencia de fluorescencia Ausencia de fluorescencia

1/400

Comoustedpuedever ,enelejemplo,elttuloidealdelconjugadofueencontrado en la dilucin 1/100, que es la mayor dilucin donde fue observada fluorescencia uniforme en la membrana del parsito en el control positivo, sin fluorescencia en el control negativo y en el PBS. Vea, ahora, en el Cuadro 6, otro ejemplo.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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Cuadro 6 Ejemplo 2 resultados obtenidos en la titulacin del conjugado.

Dilucin del Conjugado 1/50 RESULTADOS CP Fluorescencia uniforme en toda la membrana del parsito CN Fluorescencia descontinuada en la membrana del parsito Fluorescencia descontinuada en la membrana del parsito Ausencia de fluorescencia Ausencia de fluorescencia PBS Ausencia de fluorescencia

1/100

Fluorescencia uniforme en toda la membrana del parsito

Ausencia de fluorescencia

1/200 1/400

Fluorescencia uniforme en toda la membrana del parsito Fluorescencia uniforme en toda la membrana del parsito

Ausencia de fluorescencia Ausencia de fluorescencia

Observe que, en el ejemplo 2, no fue encontrado el ttulo ideal y, en este caso, usteddeberepetirlosprocedimientosdetitulacinconotrasdosdilucionesdelconjugado (1/800 y 1/1600). Es necesario repetir los procedimientos hasta que el ttulo ideal del conjugado seaencontradoparaqueustedpuedaexaminarlasmuestras. Recuerde que usted debe titular el conjugado:
! !

acadanuevolotedelconjugadoodeantgeno; siempre que el control positivo acuse la prdida de intensidad de fluorescencia.

38

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Cmo realizar la prueba de IFI cualitativa y cuantitativa (titulacin)?

1. 2. Lea las instrucciones del fabricante de cada reactivo antes de iniciar la prueba; Deje que los sueros control y las muestras alcancen la temperatura ambiente. Incluya el control de calidad interno, segn orientaciones del curso TELELAB Control de Calidad de Exmenes Serolgicos en Unidades de Hemoterapia y Laboratorios de Salud Pblica; Deje que el conjugado, la glicerina tamponada y el azul de Evans alcancen la temperaturaambiente; Haga el protocolo de trabajo. Usted encuentra un ejemplo de ese protocolo en el Anexo 2 de este manual; Retire del congelador el nmero de lminas correspondientes a la cantidad de muestrasquesernexaminadasydjelasquesedescongelenhastaquealcancen latemperaturaambiente; coloque esas lminas en estufa a 37Chasta su completo secado (como mximo 10 minutos); haga en PBS la dilucin de las muestras; a ) para la prueba de IFI cualitativa:
! !

3. 4. 5.

Atencin: las lminas ya deben estar con el antgeno fijado. 6. 7.

haga la dilucin a 1/20 en las unidades de hemoterapia; haga la dilucin a 1/40 en los laboratorios de salud pblica.

b ) para la prueba de IFI cuantitativa (titulacin), las diluciones de la muestra deben ser hechas multiplicando por 2 a partir de la dilucin de IFI cualitativa, siguiendo las orientaciones ya presentadas; Recuerde: homogenice el contenido de cada dilucin de la muestra antes de hacer la dilucin siguiente. 8. pipetee, en cada demarcacin de la lmina, 10 l de las diluciones de los sueros control (CP y CN) y de las muestras, de acuerdo con su protocolo de trabajo; coloque las lminas en cmara hmeda e incbelas en estufa a 37Cdurante 30 minutos;

9.

10. haga el lavado de las lminas, despus de la incubacin, siguiendo los mismos procedimientos descriptos en la titulacin del conjugado;

ENFERMEDAD DE CHAGAS

39

11. diluya el conjugado de acuerdo con la titulacin ya realizada, mientras aguarda el tiempo de incubacin de las muestras. Calcule el volumen del conjugado a ser diluido de acuerdo con el nmero de muestras a ser examinadas. En general, 150 l son suficientes para examinar cada lmina;
! !

prepare solamente el volumen de PBS AE al 0,01% necesario para diluir el conjugado. Jams utilice el conjugado diluido de un da para el otro.

12. pipetee 10l del conjugado diluido en cada demarcacin de la lmina; 13. hagalaincubacinyellavadodelaslminassiguiendolosmismosprocedimientos ya descriptos en los pasos 9 y 10; 14. prepare las lminas para la lectura aplicando 2 a 3 gotas de glicerina tamponada pH 9,0 (+ 0,5) sobre cada lmina; 15. cubra cada lmina con una laminilla de 24 X 50 mm, evitando la formacin de burbujas. Mantenga las lminas al abrigo de la luz y en local seco hasta la lectura; 16. haga la lectura de la reaccin en microscopio de fluorescencia, utilizando objetivo de 40 veces. Inicie la lectura por la demarcacin que corresponde al control positivo; luego, lea la demarcacin que corresponde al control negativo; y, finalmente, lea las demarcaciones correspondientes a las muestras; Atencin: los controles deben presentar patrn reactivo (CP) y no reactivo (CN). Caso contrario, descarte la lmina y repita la prueba a partir del primer paso, buscando identificar y corregir las causas de los resultados inadecuados. Slo considere los resultados de las muestras cuando los resultados de los controles estn de acuerdo con los criterios del fabricante. 17. registre los resultados en el protocolo; 18. descarte las muestras, el sobrante del conjugado y los residuos de los reactivos utilizados, segn las orientaciones del curso TELELAB Bioseguridad en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica. Jams inicie la ejecucin de las pruebas antes de arreglar su mesa de trabajo reuniendo todos los materiales y equipamientos necesarios.

40

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Qu medidas deben ser tomadas en cuenta para que usted pueda garantizar la calidad de los resultados de la IFI?
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Lea atentamente todas las instrucciones del fabricante antes de iniciar cualquier reaccin; Rena todo el material necesario para la ejecucin de la prueba; Homogenice cada dilucin antes de hacer la siguiente y cambie la punta; Verifique si los reactivos presentan turbidez, precipitacin o alteracin del color, lo que los torna impropios para su uso. No use reactivos con plazo de validez vencido; Haga la titulacin del conjugado a cada nuevo lote del conjugado y del antgeno y siempre que el control positivo acuse la prdida de reactividad; No utilice el conjugado diluido de un da para el otro; Verifique las condiciones de funcionamiento del microscopio.

PRUEBA DE ELISA

EM BRANCO

ENFERMEDAD DE CHAGAS

43

En qu se basa el ELISA?
ElELISAesunapruebainmunoenzimticaquesebasaenlainteraccinantgenoanticuerpoevidenciadaporlaaccindeunaenzimayelsustratoapropiado,yrevelada por un cromgeno.
Cromgeno sustancia que revela la accin de una enzima sobre el sustrato por medio de cambio de color.

Son componentes del ELISA: fase slida, antgeno, enzima, sustrato, cromgeno y solucin de bloqueo de la reaccin.
Fase slida: material capaz de adsorber el antgeno o el anticuerpo que ser empleado en la prueba.

Qu variaciones son encontradas en los componentes del ELISA para el diagnstico de la infeccin por el T. cruzi?
Vea, en el Cuadro 7, las variaciones encontradas en los componentes del ELISA paraeldiagnsticodelaenfermedaddeChagas.
Cuadro 7 Variaciones encontradas en los componentes del ELISA ELISA COMPONENTES
Fase Slida
!

Placas de microtitulacin producidas, generalmente, en poliestireno transparente con 96 pocillos o en tiras (strips) de 8 12 pocillos, con fondo plano o redondeado Perlas pequeas esferas de poliestireno Fracciones aisladas del parsito T. cruzi, preparadas para reducir la posibilidad de reaccin cruzada Fosfatasa alcalina o Peroxidasa Perxido de hidrgeno (H2O2) Ortofenildiamina (OPD) o Tetrametil benzidina (TMB) H2 SO 4 HCI

Antgeno Enzima Sustrato Cromgenos Solucin de bloqueo

! ! ! ! ! ! !

44

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Qu tipo de ELISA es utilizado en el diagnstico de la infeccin por el T. cruzi?

Para la deteccin de anticuerpos anti-T. cruzi se utiliza el ELISA indirecto.

Cul es la secuencia de un ELISA indirecto?

La Figura 12 presenta la secuencia de un ELISA indirecto para una muestra reactiva:
antgeno anticuerpo

fase slida sustrato conjugado color

Figura 12 Secuencia esquemtica de un ELISA indirecto para una muestra reactiva.

Observeque:
! !

En la etapa 1, los antgenos estn adsorbidos a la fase slida; Enlaetapa2,seadicionalamuestraque,siendoreactiva,contieneanticuerpos especficos que se unen a la fase slida; En la etapa 3, con la adicin de un conjugado, compuesto de una enzima unida a un anti-anticuerpo (antiinmunoglobulina), ocurre la interaccin conjugado y anticuerpo de la muestra; En la etapa 4, se adicionan el sustrato y el cromgeno;

ENFERMEDAD DE CHAGAS

45

En la etapa 5, la accin de la enzima en el sustrato es revelada por el cromgeno, que sufre un proceso de oxidacin dando origen a un producto con color en la muestra reactiva. El color vara de acuerdo con el tipo de cromgeno utilizado. En esa etapa, es adicionada una solucin de bloqueo para interrumpir el proceso de oxidacin. Si ese proceso no llega a ser interrumpido, habr el aparecimiento de color en todas las muestras llevando a resultados falso-positivos. Atencin: si no hubiere anticuerpo especfico en la muestra, o sea, si ella no es reactiva,lareaccinnosucederyconsecuentementenohabrdesarrollo de color. El color resultante de la accin de la enzima debe ser ledo en el espectrofotmetro.
!

Cmo definir si un resultado de ELISA es reactivo, no reactivo o indeterminado?

En el ELISA, el resultado de una reaccin es definido por la lectura de la absorbancia o densidad ptica (DO) en espectrofotmetro, utilizando un filtro con longitud de onda indicado por el fabricante del conjunto de diagnstico. Usualmente, cada conjunto tiene su forma de calcular el punto de corte (cut-off CO), arriba o abajo del cual las muestras son consideradas reactivas, no reactivas o indeterminadas. Las muestras indeterminadas son aquellas cuyos valores de DO estn incluidos en la zona gris (borderline). La zona gris comprende la gama de valores alrededor del cut off, dentro del cual no se puede tener seguridad del resultado.

Cmo definir la zona gris en el ELISA?

En general, el fabricante del conjunto de diagnstico indica cmo definir la zona gris. Cuando no exista la orientacin del fabricante, se recomienda que sean consideradas indeterminadas las muestras con valores de DO incluidas en el intervalo del 10% al 20% abajo o arriba del cut-off. Acompae un ejemplo del clculo del intervalo del 10% para la definicin de la zona gris:
ELISA con CO = 0,20 10% del CO = 0,20 / 10 = 0,02 Lmite inferior de la zona gris = CO 10% = 0,20 0,02 = 0,18 Lmite superior de la zona gris = CO + 10% = 0,20 + 0,02 = 0,22

En este ejemplo, son consideradas indeterminadas las muestras con DO de 0,18 a 0,22.

46

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Qu materiales son utilizados para la ejecucin del ELISA?

En el Cuadro 8 estn los materiales generalmente suministrados por el fabricante y los materiales no suministrados.
Cuadro 8 Materiales utilizados para la ejecucin del ELISA.
MATERIALES GENERALMENTE SUMINISTRADOS POR EL FABRICANTE ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Placa de microtitulacin o perlas sensibilizadas con antgeno T.cruzi Sellos o tapas de cobertura Suero control negativo Suero control positivo Soluciones tampn para la dilucin de las muestras y del conjunto Solucin tampn para el lavado Conjugado Sustrato y cromgeno Solucin tampn para diluir el sustrato Solucin de bloqueo de reaccin Reloj (timer) Pipetas manuales de volumen ajustable ( de 5 a 50 l, de 50 a 200 l y de 200 a 1.000 l) mono y multicanal Puntas para pipetas manuales de volumen ajustable Pipetas graduadas de 5 ml y 10 ml Pera de goma u otro auxiliar de pipeteado Reservorios para la utilizacin de pipetas multicanal Vaso qumico de 1.000 ml Probetas de 100 ml, 500 ml y 1.000 ml Frasco con tapa de 1.000 ml Bastn de vidrio Equipamientos de proteccin individual: guantes, barbijos, delantal o guardapolvo Recipiente de paredes rgidas, boca ancha y tapa conteniendo hipoclorito de sodio al 2% Protocolo de trabajo (ver bloque Anexos)

MATERIALES NO SUMINISTRADOS POR EL FABRICANTE

Siga las orientaciones del fabricante, para conservar y almacenar los reactivos. Adems de los materiales constantes del Cuadro 8, el laboratorio debe estar equipado con baos de mara con termostato para la regulacin de la temperatura; estufa con termostato regulable; sistema de lavado y de lectura compatibles con los mtodos empleados y con las especificaciones de los conjuntos de diagnstico disponibles.
Antes de iniciar un procedimiento, verifique si los equipamientos estn en condiciones adecuadas de uso. En el curso TELELAB Equipamientos Utilizacin y Monitoreo en Unidades de Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica usted encuentra las orientaciones necesarias.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

47

Cules son los procedimientos para ejecutar el ELISA?

Los procedimientos varan de acuerdo con el fabricante del conjunto de diagnstico. Algunos procedimientos generales, sin embargo, deben ser observados: 1. 2. 3. examine el conjunto de diagnstico, verificando todos sus componentes, si ellos estn en condiciones adecuadas de conservacin y dentro del plazo de validez; lea todas las instrucciones del conjunto de diagnstico antes de iniciar la reaccin; rena los dems materiales, no suministrados por el fabricante, necesarios para la realizacin de las pruebas;

Atencin:tengaamanounapuntadescartableparacadamuestrayparacadatipode reactivo que ser pipeteado. No reutilice las puntas. 4. 5. utiliceexactamentelosvolmenesindicadosparaprepararlassoluciones,nohaga cualquier alteracin con la finalidad de ahorrar reactivos; deje que las muestras y los reactivos que sern utilizados alcancen la temperatura ambiente, antes de iniciar la reaccin;
La temperatura ambiente en laboratorios debe estar entre los 20C y 26C.

6. 7.

homogenice las muestras;

incluya, adems de los controles suministrados por el fabricante, el control de calidad interno de la reaccin, segn orientaciones del curso TELELAB Control de Calidad de Pruebas Serolgicas en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica; 8. 9. haga un protocolo de trabajo, listando los controles y las muestras. Vea un ejemplo de protocolo de ELISA en el Anexo 3 de este manual; siga rigurosamente los tiempos de incubacin y los ciclos de lavado indicados por el fabricante, teniendo la precaucin de evitar la contaminacin cruzada de las muestras;

10. haga la lectura de absorbancia en espectrofotmetro, utilizando el filtro recomendadoporelfabricante;

Siga las instrucciones del fabricante del conjunto de diagnstico para el clculo del cut-off.

11. verifique si los resultados obtenidos para los controles estn de acuerdo con los criterios definidos por el fabricante. Caso contrario, haga nuevamente la prueba intentando identificar y corregir las causas de los resultados inadecuados. Slo considere los resultados de las muestras cuando los resultados de los controles estn de acuerdo con los criterios del fabricante; 12. registre los resultados en el protocolo;

48

ENFERMEDAD DE CHAGAS

13. descarte las muestras y los residuos del conjunto de diagnstico utilizado, segn las orientaciones del curso TELELAB Bioseguridad en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica.
!

Jams inicie la ejecucin de las pruebas antes de arreglar su mesa de trabajo reuniendo todos los materiales y equipamientos necesarios. Utilice siempre equipamientos de proteccin individual y manipule las muestras comomaterialpotencialmenteinfectante.

Qu medidas deben ser tomadas en cuenta para que usted pueda garantizar la calidad de los resultados del ELISA?
!

Verifique si los reactivos presentan turbidez, precipitacin o alteracin del color, lo que los torna impropios para su uso. No use reactivos con el plazo de validez vencido; No mezcle controles, conjugados, perlas o placas de diferentes lotes y/o fabricantes; Almacenelosconjuntosdiagnsticosdeacuerdoconlasrecomendacionesdel fabricante; No exponga el sustrato a la luz durante el almacenamiento o incubacin de la reaccin, evitando as la fotodescomposicin del mismo; No coloque el sustrato en contacto con sustancias oxidantes o metales, para evitar su degradacin, evidenciada por la alteracin del color; Hagalalimpiezayelmantenimientoperidicodelosequipamientosdelavado, evitandodeesaformalaacumulacindesalesydeotroscompuestosqumicos; Verifique si el filtro usado para la lectura de la absorbancia es aquel indicado por el fabricante.

SELECCIN SEROLGICA DE DONADORES DE SANGRE Y DIAGNSTICO SEROLGICO EN LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA

EM BRANCO

ENFERMEDAD DE CHAGAS

51

Infeccin por el T. cruzi

Seleccin serolgica de donantes de sangre en unidades hemoterpicas
Qu tipo de muestra debe ser utilizada?
El suero es la muestra ms indicada para la deteccin de anticuerpos anti-T. cruzi. Vea informaciones sobre la preparacin de las muestras en el manual Colecta de Sangre del TELELAB. Las muestras no pueden estar turbias, lipmicas o hemolisadas. En cualquiera deesoscasos,lasmismasdebenserdescartadasynuevasmuestrasdebensersolicitadas. Atencin: laexperienciade algunos investigadores ha demostrado que cuandose utiliza plasma en los exmenes serolgicos, el mismo debe ser centrifugado para separar y retirar la fibrina. El anlisis del plasma conteniendo fibrina puede llevar a resultados tanto falso positivos como falso negativos.

Cmo registrar la entrada de muestras para la seleccin serolgica de donantes de sangre?

El registro puede ser realizado por sistema manual o informatizado. De cualquier modo, es importante que usted:
!

Copie, del rtulo de la muestra, y registre en la planilla de resultados, los datos de identificacin del donante y la fecha de la colecta.

Losdatosdebensiempreserverificadospordospersonas.Erroresdeidentificacin pueden:
! !

Exponer al receptor a riesgos de contaminacin; Llevar al rechazo de un donante apto.

52

ENFERMEDAD DE CHAGAS

En cuntas cuotas deben ser distribuidas las muestras, antes de las pruebas para la seleccin serolgica de donantes de sangre?
Antes del anlisis, las muestras de suero deben, obligatoriamente,serdistribuidas en, por lo menos, dos cuotas:
! !

Una para las pruebas de rutina; y Otraparalacontraprueba.

Se recomienda que la cuotas de la contraprueba tenga un volumen de aproximadamente1ml. Lacuotadelacontrapruebadebequedaralmacenada,obligatoriamente, a 20C y estar disponible durante seis meses para la Vigilancia Sanitaria. La distribucin en un nmero mayor de cuotas y el volumen de las mismas queda a criterio de cada servicio.

Cmo acondicionar y conservar las cuotas, antes de hacer las pruebas para la seleccin serolgica de donantes de sangre?
!

Distribuya las cuotas para las pruebas de rutina, en tubos o frascos con tapa y previamente identificados con los datos correspondientes;

Atencin: las cuotas de las muestras pueden ser conservadas en la heladera, entre 2C y 8C durante 72 horas, como mximo. Despus de ese perodo, las mismas deben ser congeladas a 20C.
!

Distribuya, en frascos especficos para congelamiento, la cuota de la contraprueba ydemscuotasasercongeladas; Acondicione esos frascos en cajas de cartn o plstico rgido identificadas con informaciones que faciliten la localizacin de esas cuotas.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

53

Cmo se hace la seleccin serolgica de donantes de sangre para el Mal de Chagas?

En las unidades de hemoterapia, la seleccin serolgica de donantes de sangre es obligatoria y tiene como objetivo la proteccin del receptor y no el diagnsticodelaenfermedaddeChagas. Vea, en la Figura 13, la secuencia recomendada para la realizacin de esa seleccin.

54

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Muestra

Prueba 1

Prueba 2

(I/II) (I/+) (+/I) (I/-) (-/I) (+/-) (-/+) Descartar Hemocomponentes Muestra negativa

Reanalizar (Prueba 1 y Prueba 2)

Muestra reactiva

Muestra indeterminada

Muestra negativa

Descartar hemocomponentes

Figura 13 Secuencia de seleccin serolgica de donantes de sangre para la infeccin por el T. cruzi.

Para la comprensin de esta secuencia, es importante observar que: ! En las pruebas 1 y 2:

!

La muestra debe ser examinada simultneamente en dos pruebas (1 y 2) de principios metodolgicos diferentes, elegidas de acuerdo con las condiciones del servicio: ELISA y HAI, ELISA y IFI HAI y IFI. La prueba HAI y la IFI deben ser ejecutadas de modo cualitativo. Se recomienda el ELISA como una de las elecciones, siempre que sea posible;

ENFERMEDAD DE CHAGAS

55

! ! !

La muestra reactiva en las dos pruebas tiene su resultado definido como muestra reactiva para la infeccin por el T.cruzi; La muestra no reactiva en las dos pruebas tiene su resultado definido como muestra negativa para la infeccin por el T.cruzi; La muestra indeterminada o con resultados discordantes debe ser reanalizada con la repeticin de las Pruebas 1 y 2, siendo que:
!

paraelELISAdebehacerselarepeticinenduplicadoyconelmismoconjunto dediagnstico; para la HAI debe hacerse la titulacin (prueba cuantitativa) con el mismo conjunto de diagnstico utilizado en la HAI cualitativa;

para la IFI debe hacerse la titulacin (prueba cuantitativa) con los mismos reactivos utilizados en la IFI cualitativa. ! En el reanlisis:
!

la muestra reactiva en las dos pruebas tiene definido su resultado como muestra reactiva para la infeccin por el T. cruzi; la muestra no reactiva en las dos pruebas tiene definido su resultado como muestra negativa para la infeccin por el T. cruzi; la muestra indeterminada o con resultados discordantes es definida como muestra indeterminada para la infeccin por el T. cruzi; la definicin del resultado de cada muestra analizada de acuerdo con esta secuencia debe obedecer a los criterios presentados en el Cuadro 9.

Cuadro 9 Criterios para la definicin del resultado final de la seleccin serolgica de donantes de sangre para la Enfermedad de Chagas.
Resultado de la prueba 1 y de la prueba 2 (-/-) (+/+) (+/-) (-/+) (+/I) (I/+) (I/-) (-/I) (I/I) (-/-) (+/+) (+/-) (-/+) (+/I) ou (I/+) (I/-) (-/I) (I/I) (-) no reactiva; (+) reactiva; (I) indeterminada Resultados del reanlisis en duplicado Resultado de la seleccin negativa reactiva negativa reactiva indeterminada

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

Atencin: laliberacindeloshemocomponentes solo puede ser realizada cuando todaslaspruebasserolgicas obligatorias presenten resultados negativos, segn normas vigentes del Ministerio de Salud.

Qu procedimientos seguir con los donantes que presenten resultados reactivos o indeterminados?
Los donantes con resultados reactivos o indeterminados para la infeccin por el T. cruzi deben ser encaminados a los servicios mdicos para diagnstico. Lasunidadesdehemoterapiadebennotificarloscasosreactivosparalainfeccin por el T. cruzi al servicio de vigilancia epidemiolgica local.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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Infeccin por el T. cruzi

Diagnstico serolgico en laboratorios de salud pblica
Cmo registrar la entrada de muestras en laboratorios de salud pblica?
Elregistropuedeserrealizadoporsistemamanualoinformatizado.Decualquier forma, es importante que usted: 1) verifique si la identificacin en el rtulo de la muestra es la misma de la solicitacin de la(s) prueba(s); 2) copie de la solicitacin, y registre en una planilla de resultados, los siguientes puntos bsicos:
! ! ! ! ! !

nmero de registro de la muestra; nombre; procedencia de la muestra (unidad que solicit); fechadelacolecta; sexo; edad.

Atencin: los datos deben ser siempre verificados por dos personas. Errores de identificacin pueden llevar al cambio de resultados.

Es necesario distribuir en cuotas las muestras para anlisis en los laboratorios de salud pblica?
En los laboratorios de salud pblica no existe la obligatoriedad de la cuota para contraprueba. Sin embargo, se recomienda que la muestra sea distribuida, por lo menos, en dos cuotas:
! !

una para realizar las pruebas solicitadas; otraparaatendernecesidadesrelacionadas,porejemplo,conlaejecucin depruebascomplementarias.

Para acondicionar y almacenar las muestras utilice los mismos procedimientosyapresentadosparalasmuestrasdeseleccinserolgica.

58

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Cmo es realizado el diagnstico serolgico de la infeccin por el T. cruzi en laboratorios de salud pblica?
Vea, en la Figura 14, la secuencia para el diagnstico serolgico de la infeccin por el T. cruzi en laboratorios de salud pblica.
Muestra

Prueba 1

Prueba 2

(I/II) (I/+) (+/I) (I/-) (-/I) (+/-) (-/+)

Reanalizar (Prueba 1 y Prueba 2)

Muestra reactiva

Muestra indeterminada

Muestra no reactiva

Muestra positiva Encaminar para laboratorio de referencia

Muestra negativa

Figura 14 Secuencia para el diagnstico serolgico de la infeccin por el T.cruzi.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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Para la comprensin de la secuencia del diagnstico serolgico de la infeccin por el T. cruzi, es importante observar que: ! En la prueba 1 y 2:
!

! !

la muestra debe ser examinada en dos pruebas (1 y 2) de principios metodolgicosdiferenteselegidasdeacuerdoconladisponibilidaddelservicio: ELISA y HAI, ELISA y IFI HAI y IFI. Se recomienda el ELISA como una de las elecciones, siempre que posible; la muestra no reactiva en las dos pruebas tiene su resultado definido como muestra negativa para la infeccin por el T. cruzi; la muestra reactiva, indeterminada o con resultados discordantes debe ser reanalizada a travs de la repeticin de las pruebas 1 y 2, siendo que:
!

paraelELISAdebehacerserepeticinenduplicadoyconelmismoconjunto dediagnstico; para la HAI debe hacerse la titulacin (prueba cuantitativa) con el mismo conjunto de diagnstico utilizado en la HAI cualitativa;

para la IFI debe hacerse la titulacin (prueba cuantitativa) con los mismos reactivos utilizados en la IFI cuantitativa. ! En el reanlisis:
!

la muestra no reactiva en las dos pruebas tiene su resultado definido como muestra negativa para la infeccin por el T. cruzi;

Atencin: En el caso de muestras reactivas en el anlisis inicial (Prueba 1 y 2) y no reactivas en el reanlisis, no lance ninguno de los resultados obtenidos con las muestras examinadas en el mismo protocolo. Ello porque es posible que haya habido un error de transcripcin en el protocolo o cambio de muestras. Si el protocolo estuviera correcto, haga nuevamente la prueba de todas las muestras siguiendo la secuencia dada.
!

La muestra reactivaenlasdospruebastienesuresultadodefinidocomo muestra positiva para la infeccin por el T. cruzi; La muestra indeterminada o con resultados discordantes debe ser encaminadaaunlaboratoriodereferencia.

60

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Atencin: enelmanualColectadeSangredelTELELABustedencuentraorientaciones sobre el acondicionamiento de las muestras para su transporte. El laboratorio de salud pblica debe notificar los casos positivos para la infeccin por el T. cruzi al servicio de vigilancia epidemiolgica local.

FRMULAS

EM BRANCO

ENFERMEDAD DE CHAGAS

63

Tampn Fosfato (PBS pH 7,2)

!

Materiales necesarios:
!""balanza semianaltica; !""papel de pesaje; !""vaso qumico de 1.000 ml; !""1 esptula; !""1 bastn de vidrio (o agitador magntico y barra magntica); !"" pHmetro (medidor de pH).

frmula:
COMPONENTES Cloruro de sodio (NaCI) P.A. (MM 58) Fosfato de sodio dibsico anhidro (Na2HPO4) P.A. (MM 142) Fosfato de sodio monobsico anhidro (NaH2PO4) P.A. (MM 120) Agua destilada (c.s.p.) (MM 18) CANTIDAD 8,77 g 1,02 g 0,34 g 1.000 ml

P.A. = Para anlisis; MM = masa molecular, tambin conocida como peso molecular; c.s.p. = cantidad suficiente para. !

Preparacin:
!

Pesecadasalseparadamenteytransfieraparaelvasoqumico.Veainstrucciones para el pesaje en el curso TELELAB Equipamientos Utilizacin y Monitoreo en Unidades Hemoterpicas y Laboratorios de Salud Pblica. Adicioneaguadestiladaencantidadsuficientepara(c . s . p . )completarelvolumen de 1.000 ml; Mezcle todo hasta la completa disolucin de las sales. Utilice el agitador magntico o un bastn; Verifique, con el auxilio del pHmetro, si el pH de la solucin se encuentra en la siguiente gama: pH 7,2 + 0,2. Caso no est, prepare nueva solucin. Atencin: paraprepararelPBSconsaleshidratadas,lascantidadesdeben serrecalculadasenfuncindelasmolculasdeaguapresentes. Verifique siempre en el rtulo de los productos la composicin y la masa molecular de las sales.

64

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Clculo del peso de sales hidratadas:

Para la correccin del peso de cualquier sal hidratada, es necesario usar una ecuacin de tres. Vea un ejemplo:
!

Si para utilizar Na2HPO4 (sal anhidra) con MM 142 es necesario pesar 1,02 g Para utilizar Na2HPO4. 12H2O (sal hidratada) con MM 359, cunto es necesariopesar? Si MM 142 es igual a 1,02 g, entonces MM 359 es igual a X g. = 1,02 x

142 359

359 x 1,02 x 142 = x = 2,57 g En este ejemplo, donde el fosfato de sodio dibsico hidratado contiene 12 molculas de agua, se debe, por lo tanto, pesar 2,57 g para preparar el PBS pH 7,2. Recuerde: antes de pesar cualquier sal, verifique siempre en el embalaje su composicin y su masa molecular.

Solucin de Azul de Evans al 0,1% (stock)

Azul de Evans ...................... 100 mg PBS c.s.p. ............................. 100 ml Conservar en la heladera.

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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Solucin PBS-AE al 0,01%

1. coloque en un tubo 100 l de la solucin de Azul de Evans al 0,1% y 900 l de PBS pH 7,2. Usted va a obtener un volumen final de 1 ml PBS/AE que, en general, es suficiente para las diluciones necesarias del conjugado; 2. homogenice suavemente la solucin para evitar la formacin de burbujas. Prepare la solucin PBS-AE al 0,01% inmediatamente antes de la dilucin del conjugado. Recuerde que todo colorante es degradado por la accin de la luz.

Glicerina tamponada
A) solucin de carbonato de sodio al 0,5 M Carbonato de sodio anhidro (CO3Na2)...........................5,3 g H2O destilada.........................................................100 ml B) solucin de bicarbonato de sodio al 0,5 M Bicarbonato de sodio (CO3Hna)................................... 4,2 g H2O destilada.........................................................100 ml C) solucin tampn carbonato-bicarbonato (0,5 M) pH 9.5 Coloque en un recipiente de vidrio 10 ml de la solucin A + 13 ml de la solucin B. Homogeneizar y medir el pH. Frmula de la glicerina tamponada Glicerina P.A............................................................... 9partes Solucin C...................................................................1parte Atencin: descarte las soluciones a la primera seal de contaminacin.

embranco

ANEXOS

embranco

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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EJEMPLO DE PROTOCOLO DE HAI PARA LA ENFERMEDAD DE CHAGAS PRUEBA DE HEMAGLUTINACIN INDIRECTA (HAI)
Protocolo n: Fabricante:. Tcnico responsable: Lote: Fecha: Validez:

Identificacin de las muestras y resultados de la lectura

Identificacin Resultado Identificacin Resultado Identificacin Resultado Identificacin Resultado Identificacin Resultado Identificacin Resultado Identificacin Resultado Identificacin Resultado Observaciones:

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ENFERMEDAD DE CHAGAS

EJEMPLO DE PROTOCOLO DE PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) PARA LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

IFI n: Antgeno: Conjugado: Tcnico Responsable: Resultados Lmina n Lote: Lote: Fecha: Validez: Validez:

Dilucin:

Identificacin
Control Positivo ControlNegativo

Lmina n
Control Positivo ControlNegativo

Lmina n
Control Positivo ControlNegativo

Observaciones:

ENFERMEDAD DE CHAGAS

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EJEMPLO DE PROTOCOLO DE ELISA PARA LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

Protocolo n: Fabricante: Tcnico responsable: Lote: Fecha: Validez:

Observaciones: Punto de Corte (cut-off):

embranco

BIBLIOGRAFA

EM BRANCO

ENFERMEDAD DE CHAGAS

75

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embranco

Agradecimientos: Fundacin Hemocentro de Brasilia Fundacin Ezequiel Dias MG. Fundacin Hemocentro de Pernambuco HEMOPE Centro de Investigaciones Aggeu Magalhes/FIOCRUZ Universidad Federal de Gois Agradecimiento Especial: Beatriz Mac Dowell Soares, Jos Antnio de Faria Vilaa y a los funcionarios de la Fundacin Hemocentro de Brasilia, por el apoyo incondicional para la ejecucin de este proyecto. Proyecto grfico, arte final e impresin:

(61) 226-0907

Ministro de Salud
Programa Nacional de ETS y SIDA Programa de Sangre y Hemoderivados