La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras

clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndoseBacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella

Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las clulas gram positivas y gram negativas se tien de color azul-prpura. Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. Enjuagar con agua. Agregar acetona y/o alcohol y esperar de 8 a 15 segundos aproximadamente (parte crtica de la coloracin). Enjuagar con agua. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 45 segundos. Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.

Tcnica de la coloracin gram

[editar]Fijar

un frotis

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa.

Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina.

Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

[editar]Tincin Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C. [editar]Enjuague Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% . [editar]Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias.. [editar]Decoloracin

(paso critico)

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul. [editar]Lavado

y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. [editar]Tincin

de contraste

Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. [editar]Nuevo

enjuague

Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica. [editar]Bacterias

resistentes a la tincin Gram

La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tien como gramnegativas:

Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared). Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).

[editar]Utilidades En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin. Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor nmero de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin.

A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular ( Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos). Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de " coma", o curvados, entonces se los designa vibrios. [editar]Fundamentos

de diferenciacin de Gram positivo y Gram negativo

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglicano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea. [editar]Causas

que alteran la tincin de Gram

I: Edad de la bacteria. II: Errores del operador. III: Uso de antibiticos

A pesar de la gran utilidad del la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teirse como gram negativos) y la tcnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian como gram negativas),Es por esta situacin que junto a la muestra deben teirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli). [editar]Fuentes [editar]Bibliografa

Aulton Michael E., Ciencia y diseo de formas farmacuticas, 2 edicin, Ed. Elsevier Espaa, 2004. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7.

Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2.

Sgaard M, Nrgaard M, Schnheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113.

Existen en la naturaleza unos centenares de especies de microorganismos(bacterias, levaduras, mohos, algas unicelulares) que producen sustancias que presentan algn inters para la especie humana. Los productos que tienen un inters comercial se pueden agrupar en cuatro clases: a) productos del metabolismo primario( dixido de carbono, etanol, cido actico, aminocidos, etc.).

b) productos del metabolismo secundario (antibiticos, toxinas). c) macromolculas (polisacridos, enzimas); y clulas microbianas (pienso animal llamado protenas microbianas).

TUBERCULOSIS producida por el bacilo de kosh nombre cientifico: mycobactrium tuberculosum TETANO bacilo de nicolaiev nombre cientifico :clostridium tetam TIFOIDEA salmonela nombre cientifico: salmonelo sp COLERA Vibrio cholerae nombre cientifico: vibrio cholerae NEUMONIA neumococo nombre cientifico: deplococcus neumonial PESTE BUBONICA bacilo de yersin nombre cientifico :yersenia sp LEPRA bacilo de hansen nombre cientifico: mycobacterium leprae

LEPTOSPIROSIS leptospira nombre cientifico: Leptospira interrogans GONORREA gonococo nombre cientifico: Neisseria gonorrhoeae DIFTERIA bacilo de Loeffler nombre cientifico: Corynebacterium ANTRAX Staphylococcus aureus nombre cientifico: Bacillus anthracis DIAERREA E. Coli nombre cientifico: Escherichia coliforme SALMONELOSIS Salmonella nombre cientifico:Salmonella typhimurium FIEBRE DE MALTA Brucella nombre cientificoBrucella melitensis SFILIS espiroqueta nombre cientifico: Treponema pallidum