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MANUAL

6 - ACIDO CIANHIDRICO Y CIANUROS ALCALINOS


Identificacion y dosaje de acido cianhidrico en medios biologicos
El cido cianhdrico (HCN) es un lquido voltil, incoloro de olor caracterstico a almendras amargas que presenta gran difusibilidad debido su elevada tensin de vapor. Las sales de cianuro (sodio o potasio) son de inters toxicolgico. El cianuro de sodio es ms txico que el de potasio porque desprende mas HCN por gramo de compuesto. El mecanismo de accin txica lo ejerce inhibiendo la citocromooxidasa bloqueando de este modo la respiracin celular generando

hipoxia o anoxia citotxica. Tambin inhibe protenas que posean hierro en su mximo estado de oxidacin (+3) como es la metahemoglobina. La sintomatologa puede ser de tipo superaguda con prdida inmediata del conocimiento, convulsiones, rigidez muscular, la muerte ocurre en pocos minutos. La intoxicacin aguda presenta tres perodos. En el primero se presenta ardor y anestesia en la boca estmago, luego vrtigos y zumbidos. En el segundo perodo se manifiesta prdida del conocimiento con convulsiones, contractura espasmdica de maxilares, pulso irregular, cianosis. En el tercer perodo se presenta relajacin muscular y muerte por parlisis del centro respiratorio bulbar y paro cardaco. . La etiologa de la intoxicacin con cido cianhdrico (HCN) descripta es muy variada. Las principales fuentes de compuestos cianurados son ciertas industrias en las cuales el HCN presenta aplicaciones comerciales como son la galvanoplastia, extraccin de metales preciosos (oro y plata), produccin de gomas sintticas como resinas acrlicas, poliuretano, manufactura de plsticos, as como el empleo de HCN para desinfeccin como insecticida y raticida.

Otra fuente de compuestos cianurados son los alimentos, como algunos productos vegetales que contienen glucsidos cianogenticos que por hidrlisis (cida, alcalina o enzimtica) dan origen al HCN. Entre estos se encuentran especies de porotos, semillas de lino, sorgo, almendras amargas, mandioca, habas, as como en semillas de manzanas y peras y en bebidas fermentadas como el Kirsh, aguardiente de cerezas fermentadas. Tambin se ha descripto otra fuente de compuestos cianurados en el uso farmacolgico como los antitusgenos como agua de laurel cerezo de uso en el pasado. Se lo ha empleado en ejecuciones en la llamadas cmara de gas y se han registrado muchos casos de intoxicaciones voluntarias y homicidas. 1. Consideraciones generales de la analtica toxicolgica La investigacin de cido cianhdrico puede realizarse con diferentes tipos de muestra: vsceras (que necesitarn de una previa disgregacin), lquidos biolgicos, sangre u orina, alimentos (productos vegetales o animales) y medicamentos. La sangre venosa presenta un color rojo vivo

caracterstico. En cadveres frescos se observa color rojo cereza as como manchas de color rojo mas o menos intenso. Junto al olor tpico a almendras amargas que desprenden los rganos se observan numerosas hemorragias pequeas en las serosas. El recipiente que contiene la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado hermticamente para evitar prdidas. Si el material es visceral, no debe conservarse en formol porque reacciona con el cido cianhdrico formando cianhidrinas de las que no se puede liberar CNH. Las muestras deben conservarse en fro para evitar la accin enzimtica y bacteriana sin agregado de conservantes. Existen tres tipos de determinaciones del cido cianhdrico: los ensayos inmediatos o preliminares, los ensayos mediatos y los ensayos cuantitativos.

2. ENSAYOS CUALITATIVOS O INMEDIATOS

La identificacin directa del HCN en el recipiente que contiene el material es posible gracias a su elevada presin de vapor a temperatura ambiente y procesos hidrolticos que ocurren con cierta rapidez por las condiciones del medio, pH, temperatura, etc. En la atmsfera del recipiente se libera CNH que puede deberse a dos tipos de procesos: hidrolticos y putrefactivos Hidrolticos CN- + H2O CNH + OH-

El equilibrio se desplaza hacia la derecha. En vsceras en estado putrefactivo se libera CNH de acuerdo con CN- + CO2 + H2O CNH + CO3H-

Los ensayos inmediatos son tcnicas que se realizan en la atmsfera del recipiente que contiene la muestra mediante el empleo de los llamados papeles sensibles. Se utilizan papeles impregnados en diferentes reactivos: 2. 1. Utilizacin de papel de guayaco:

El ensayo se fundamenta en el aumento del potencial de oxidacin de las sales cpricas al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas. El ensayo es identificativo dado que al sistema Cu(II)-cianuro se acopla un compuesto reductor (resina de guayaco) que por oxidacin origina un derivado coloreado (de color castao vira al azul). Tecnica Reactivos Solucin acuosa de sulfato de cobre al 0.2% Solucin alcohlica de resina de guayaco al 10% recin preparada. Procedimiento En el momento de su uso, se embebe una franja de papel de filtro en una solucin de SO4Cu al 0.2 % dejando escurrir el exceso. Luego se embebe en una solucin alcohlica de resina de guayaco al 10% de reciente preparacin. El reactivo del papel de guayaco puesto en la boca del recipiente que contiene el material a analizar y el O2 producido en la reaccin forman un compuesto de color azul en forma inmediata.

8HCN + 8 SO4Cu + 4 H2O 2 (CN Cu)2(CN Cu)2 + 8 SO4H2 + 2 O2 Un ensayo negativo permite descartar la presencia de HCN dada su sensibilidad. Un ensayo positivo no entrega mayores datos y requiere confirmacin con ensayos especficos. El ensayo presenta interferencias de tipo oxidantes directos de la resina de guayaco y reductores que actan de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre. Es un ensayo clsico, sensible pero inespecfico. Algunos autores indican que puede reconcerse hasta 0.25 g de cido cianhdrico. 2.2. Ensayo con O-toluidina: Presenta igual fundamento que la reaccin anterior pero la visualizacin se realiza con Otoluidina. Tambin se puede usar bencidina, fenoftalena o cualquier sustancia que al oxidarse forme un complejo coloreado. Esta reaccin es altamente sensible pero inespecfica. Tcnica Reactivos

Solucin acuosa de sulfato de cobre al 0.2% Solucin alcohlica de O-toluidina al 1%. Procedimiento El ensayo es similar al anterior. En presencia de cido cianhdrico se observa en forma inmediata color azul verdoso que rpidamente vira al azul neto. Presenta mayor sensibilidad que el ensayo guayaco-cprico. 2.3. Ensayo de Grignard: El ensayo se fundamenta en que el cido pcrico en presencia del HCN, liberado de la muestra cida, forma isopurpurato alcalino, de color rojo al rojo naranja en el transcurso de cinco minutos. Tcnica Reactivos Solucin acuosa de cido pcrico 1% caliente que antes del enfriamiento se agregan 10 gr de CO3Na2. Procedimiento

Embeber tiras de papel filtro con solucin acuosa de cido pcrico y escurrir el exceso. Si el papel se prepara en el momento, el ensayo presenta su mxima sensibilidad. El reactivo dura indefinidamente. El papel es puesto en la boca del recipiente que contiene la muestra a analizar. Un color rojo naranja indica resultado positivo. 2. 4. Ensayo de Magnin: Se basa en la formacin de azul de Prusia. HCN + OHLuego 6CN- + Fe+2 Fe+2 + 2OHverde [Fe(CN)6] -4 Fe(OH)2 precipitado CN- + H2O

2Fe(OH)2 + 1/2O2 + H2O en medio HCL

2Fe(OH)3

Fe(OH)3 + [Fe(CN)6] -4 + 3H + + Na+

Tcnica Reactivos Solucin acuosa de hidrxido de sodio al 2% Solucin acuosa de sulfato ferroso al 2% recientemente preparada. Procedimiento Se impregna una tira de papel con hidrxido de sodio al 2% y se expone en el interior del recipiente unos minutos. Se retira y se extiende sobre una cpsula de porcelana. Se distribuyen sobre la superficie expuesta 4 gotas de solucin de sulfato ferroso 2%. Se observa un precipitado verdoso que luego pasa a castao (hidrxido frrico). Finalmente por agregado de unas gotas de cido clorhdrico concentrado se observa color azul por formacin azul de Prusia. Es una reaccin poco sensible pero muy especfica Siempre se efectan por lo menos dos reacciones: una muy sensible y otra muy especfica. Si las dos reacciones arrojan resultados positivos se realiza el aislamiento.

3. ENSAYOS MEDIATOS 3.1. Aislamiento e identificacin del cido cianhdrico de cianuros alcalinos. Aislamiento Cuando se sospecha la presencia de cido cianhdrico mediante los ensayos antes especificados, se procede al aislamiento y posterior identificacin. Para la realizacin de los ensayos mediatos, se requiere de una separacin previa del CNH de la muestra. Son adecuadas una destilacin simple o una microdifusin. En la destilacin simple se agrega al material cido tartrico. El destilado se recoge en hidrxido de sodio para evitar prdidas del cido cianhdrico liberado. En el caso de muestras en estado de putrefaccin se debe agregar al material a destilar acetato bsico de plomo para retener el cido sulfhdrico.

Tcnica Reactivos Acido tartrico al 10% Hidrxido de sodio al 10% Equipos Aparato de destilacin Procedimiento Colocar 10 g. del material biolgico en un matraz de destilacin y cubrir con agua (aproximadamente 60 ml). Agregar 10 ml de cido tartrico al 10% y destilar recogiendo sobre 5ml de NaOH 10%. Se calienta al principio suavemente para evitar la formacin de espuma y una vez alcanzado el punto de ebullicin se eleva lentamente la temperatura. Es importante que la extremidad del tubo de desprendimiento conectado al extremo del refrigerante tome contacto con la solucin alcalina. Suspender la destilacin cuando hayan pasado alrededor de 1/3 del volumen inicial. Medir el volumen destilado.

3.2. Tcnica del azul de Prusia modificada o tcnica de Chellen-Klassen El ensayo se fundamenta en la formacin de un precipitado azul por formacin de azul de Prusia (ferricianuro frrico) a partir del destilado, efectuando un ajuste previo del pH a un valor de 8 para favorecer la precipitacin. Tcnica Reactivos Solucin alcohlica de fenoftalena al 1% Acido sulfrico 0.1N Solucin acuosa de carbonato de calcio al 10% Solucin de sulfato ferroso al 1% recientemente preparada. Acido clorhdrico concentrado Solucin acuosa de hidrxido de bario al 10% Procedimiento A 1ml de destilado se le agrega 2 gotas de solucin de fenolftalena (medio bsico rosada), y luego lentamente solucin diluida de cido sulfrico hasta vivar el indicador a incolora . Luego se lleva a pH alcalino con solucin de

carbonato de calcio al 20% gota a gota hasta viraje al rojo. Agregar 3 gotas de solucin de sulfato ferroso al 2% y dejar reposar 3 minutos. Acidificar con clorhdrico concentrado. Color azul indica HCN. Si aparece color verde suave agregar gotas de cido fosfrico. Si an no se observa color azul, se puede aumentar la sensibilidad de la reaccin y agregar gotas de solucin de cloruro de bario al 10% y dejar reposar unas horas. Si se observan puntos azules sobre fondo blanco, indica presencia de HCN. Las reacciones correspondientes son las siguientes: 2 CNK + Fe(OH)2 Fe(CN)2 + CNK Se agrega HCl y se agita: [Fe(CN)6]K4 + Fe(OH)3 [Fe(CN)6]FeK + H2O [Fe(CN)6]FeK + FeCl3 (Azul de Prusia ) + KCl [Fe(CN6]3Fe4 Fe(CN)2 + KOH [Fe(CN)6K]4

Se intensifica con H3PO4 o Cl2Ba, pues forman sales insolubles de SO4Ba que sedimentan

arrastrando el Azul de Prusia al fondo del tubo, donde se observar un botn blanco azulado. La sensibilidad de la reaccin es de hasta 10 g de in cianuro. Con el agregado de cloruro de bario se puede revelar hasta 5 g de in cianuro. 3.3. Reaccin sulfocinica o de Von Liebig. El mtodo consiste en el agregado de un exceso de polisulfuro al destilado y posterior calentamiento para formar sulfocianuro. Luego se acidifica la solucin formndose cido sulfocianhdrico que con cloruro frrico aparece color rojo. Tcnica Reactivos Solucin de sulfuro de amonio amarillo (polisulfuro) Acido clorhdrico concentrado Solucin rojo Congo Solucin acuosa de cloruro frrico al 0.5% Eter etlico Procedimiento

Unos 5 ml de destilado se colocan en una cpsula de porcelana y se agregan unas gotas de polisulfuro de amonio (amarillo). Se procede calentando suavemente durante 5 minutos sobre tela metlica, agitando el lquido con varilla y agregando sulfurente a medida que la solucin se decolora. Cuando el contenido se haya concentrado (1 ml) y se observe persistencia de color amarillo se considera prcticamente realizada la transferencia en sulfocianuro. Se deja enfriar y se acidifica con solucin concentrada de HCl hasta reaccin cida frente al rojo congo. El compuesto puede aislarse por tratamiento con ter etlico realizando tres extracciones con 20, 10 y 10 ml de ter cada una. Los extractos etreos se evaporan en cpsula de porcelana y dejar evaporar el eter a temperatura ambiente. Luego se trata el residuo con 2 o 3 gotas de cloruro frrico al 0.5% y aparece color rojo intenso de intensidad variable (50 g de HCN transformado en SCN- el color aparece rpidamente) CN - + (S)m-2 2SCN- + Fe+3 color rojo) SCN - + (S)n-1-2 [Fe(SCN)2]+ (complejo

El ensayo es altamente sensible y especfico. Algunos autores estiman que es posible revelar in cianuro en la proporcin de 100 g/L.

4. ENSAYOS CUANTITATIVOS Los ensayos cuantitativos permiten valorar la cantidad del txico 4.1. Mtodo de Denigs Constituye una valoracin en donde se forma una sal estable de AgCN y el exceso de Ag+ en el punto final forma un compuesto de color amarillo con el in ioduro de acuerdo con las siguientes reacciones CN- + AgNO3 AgCN + CNSoluble) AgCN +NO3 [Ag(CN)2]- (Complejo

[Ag(CN)2]- + Ag+ forma antes del pto. final) Se corrige con NH3 Ag(CN)2- + NH3 Ag(CN-)2 Ag+(exceso) + ITcnica Reactivos

Ag(CN)2Ag (se

Ag(NH3)2+ + 2

AgI

amarillo

Amonaco concentrado Ioduro de potasio al 10% Solucin de nitrato de plata 0.01N Procedimiento Tomar 10 ml de destilado y agregar 10 ml de amonaco concentrado y 1 ml de KI al 10%. Titular con solucin de nitrato de plata 0.01N hasta aparicin de turbiedad permanente. Clculos = 1 ml de NO3Ag (0.01 N) = 5.4 10-4 gr HCN = 0.54 mgr de HCN.

4.2. Determinacin de cianuro en alimentos, sangre e hgado. Mtodo de formacin de manchas de azul de prusia El mtodo se fundamenta en que el cianuro de la muestra es liberado por accin del cido sulfrico o cido tricloroactico y aspirado a travs de un disco de papel impregnado en sulfato ferroso y se forma ion frrico visualizado como manchas de ferrocianuroferrico (azul de Prusia). El disco es luego sumergido en cido clorhdrico hasta que toda la porcin sin reaccionar sea eliminada. La intensidad de la mancha es proporcional a la cantidad de cianuro presente en la muestra. Reactivos 1) - glucosidasa 2) Agente antiespumante 3) Solucin acuosa al 11% de cloruro frrico: pesar 11g de cloruro frrico y llevar a 100 ml con agua destilada. 4) Solucin acuosa de sulfato ferroso amnico al 19%: pesar 19 g de (NH4)2Fe(SO4)2) y llevar a 100 ml con agua destilada.

5) Solucin acuosa al 10% de hidrxido de sodio: pesar 10 g de NaOH y llevar a 100 ml con agua destilada. 6) Solucin acuosa de 1N de hidrxido de sodio: pesar 40 g de NaOH y llevar a 1000 ml con agua destilada. 7) Solucin stock de cianhdrico (1000 g/ml): pesar 0.2503 g de cianuro de potasio y transferir en un matraz de 100 ml agregar 10 ml de NaOH 1N y diluir al volumen con agua destilada. 8) Solucin standard intermedia de cianhdrico (100g/ml): diluir 1 ml de la solucin stock de cianhdrico en 10 ml de agua destilada. Preparar diariamente. 9) Solucin de trabajo de cianhdrico (10 g/ml): diluir 5 ml de la solucin intermedia standard de cianhdrico en 50 ml de agua destilada. Preparar diariamente. 10) Solucin acuosa al 20% de cido sulfrico: agregar 50 ml de agua a un frasco graduado de 100 ml. Agregar 20 ml de cido sulfrico concentrado y llevar al volumen con agua destilada. 11) Solucin de cido clorhdrico 25%: agregar 50 ml de agua en una probeta de 100 ml, agregar 25 ml de HCl concentrado y llevar a volumen con agua destilada.

12) Papel de filtro Watman N 40 cortado en forma de discos 16 mm dimetro. Aparatos y equipos 1) Aparato para cianhdrico (Fig. 3 ) 2) Bao de agua a 75C. 3) Bomba de aire 4) Bao de vapor o evaporador. Procedimiento - Pretratamiento de alimentos 1. Pesar cerca de 10 g de alimento y transferir a un homogeneizador 2. Agregar 200 ml de agua y 0.02g de glucosidasa 3. Homogenizar durante 4 minutos. 4. Dejar decantar 1 hora. 5. Proceder al paso 10 del anlisis. Pretratamiento en muestras de sangre 1. Agregar 300 ml de agua, 5 ml de sangre y 2 ml de antiespumante a un probeta de 500 ml. 2. Reemplace el tapn de goma en el aparato de cianhdrico con el tapn ajustado en la probeta de 500 ml. 4. Prepare suficiente cantidad de agua caliente

(paso 5 del anlisis) que pueda contener la probeta de 500 ml. Pretratamiento para muestras de hgado. 1. Agregue 1 gota de agente antiespumante a la muestra de hgado Procedimiento 1) Agregar aproximadamente 20 ml de agua al tubo muestra. Pipetear 0.5 ml de solucin standard de trabajo en el tubo. 2) Agregar 20 l de cada uno de los siguientes reactivos FeCl3 11%, (NH4 )2 Fe(SO4 )2 ) 19%, y NaOH 10% en el centro del papel de filtro de 16 mm de dimetro. 3) Ubicar el papel de filtro en el aparato de cianhdrico mientras est hmedo y ensamble el aparato. 4) Agregar 1.0 ml de cido sulfrico/g de standard con una jeringa a travs de la entrada del tubo de aire al tubo muestra. 5) Ubicar el tubo en bao de agua a 75. 6) Aplicar succin durante 4 minutos. Menor tiempo de succin puede dar incompleta recuperacin y mayor tiempo puede condensar agua arriba del disco.

7) Revelar el papel con HCl al 25% caliente (en bao de vapor o en plancha calefactora) hasta que el papel es vea blanco con manchas azul. 8) Enjuagar el disco con agua destilada y secar. Alinear las manchas standard en lnea sobre un fondo blanco. Si las manchas son de color oscuro excesivo, puede deberse a sulfuros que tienden a desaparecer al ubicar el papel en HCl. 9) Repetir los pasos 2-8 con standard de 10 g, 20 g y 50 g standard. 10) Colocar una porcin de la muestra homogeneizada (1-5g) estimando que contiene un total de 5-20 g de cianuro en el tubo muestra. Agregue 20 ml de agua al tubo de la muestra. 11) Agregue 1ml de cido sulfrico por gramo de muestra. Como mnimo de 1 ml, pudiendo agregarse ms volumen si la muestra es bsica. 12) Repetir los paso 5-8. 13) Repetir el anlisis de la muestra con un sobreagregado de 5 g. 14) Puede usarse una comparacin visual o cuantificar en un densitmetro. 15) Construir la curva de calibracin usando los standard de cianuro y determinar los niveles en la muestra por comparacin de absorbancia. Informar en ppm. Consideraciones generales: Medir el pH del

contenido estomacal. Si el pH es cido, el in cianuro es probable que se haya perdido.

4.3. Mtodo de microdifusin de FeldsteinKlendshoj. Fundamento: en la cpsula de Conway el cido cianhdrico difunde del compartimiento externo al interno siendo fijado como cianuro en la solucin alcalina. Se toma una alcuota del compartimiento interno y se agrega cloramina T, formndose cloruro de ciangeno. Luego por el

agregado de piridina se forma cloruro de cianopiridina. La accin hidroltica determina la apertura del anillo piridnico, para dar lugar a la formacin del cido glutacnico. Si este derivado se hace reaccionar con cido barbitrico se forma un complejo rojo que se lee a 580 nm. Muestra: sangre entera con heparina, orina u homogenato de vsceras. Reactivos 1) Hidrxido de sodio 0.1N 2) Acido sulfrico 10% en volumen 3) Lubricante: a base de siliconas o mezclar 2 partes de vaselina slida y 1 parte de parafina. 4) Fosfato monosdico 1M. 5) Cloramina T al 0.25%. Se guarda en heladera hasta el momento de usar. 6) Reactivo piridina-barbitrico: en un matraz aforado de 50 ml colocar 3 g. de cido barbitrico, 15 ml de piridina pursima y 3 ml de cido clorhdrico concentrado. Mezclar hasta disolucin total, llevar a volumen con agua destilada y filtrar. Instrumental

1) Espectrofotmetro 2) Cubetas de seccin cuadrada de 1 cm de paso de luz. 3) Cmaras de Conway Procedimiento Colocar en el compartimiento interno de la unidad de microdifusin de Conway 3.3 ml de hidrxido de sodio 0.1N y en el compartimiento externo 2 a 4 ml de sangre total u orina, o 5 ml de homogenato de tejido (equivalente a 1 g. de tejido). Como reactivo liberante se agregan 2 a 3 gotas de cido sulfrico al 10% en el compartimiento externo. Tapar inmediatamente y homogenizar por rotacin. El tiempo de difusin es de 3 a 4 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo indicado se toma 1 ml de la solucin alcalina del compartimiento interno y se coloca en un tubo de ensayo. Se prepara un blanco colocando en otro tubo 1 ml de hidrxido de sodio 0.1N. A cada tubo agregar 2 ml de fosato monosdico 1M y 1 ml de cloramina T al 0.25%. Mezclar y dejar en reposo 2 a 3 minutos, agregar por ltimo 3 ml de reactivo piridina-barbitrico, mezclar y dejar en reposo 10 minutos. En presencia de in cianuro aparece color rosado

cuya absorbancia se mide a 580nm. Se compara la absorbancia con testigos de cianuro en concentraciones comprendidas entre 0.1 a 2.0 g/ml de solucin de hidrxico de sodio 0.1N. 5. Valores normales de cianuro en individuo adulto El cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeas cantidades. Hasta 15 g/100 ml sangre es considerado como valor normal. 6. Interpretacin de los resultados En una intoxicacin por inhalacin de cido cianhdrico valores mayores de 100 ?g/100 ml suelen ser fatales pero puede variar de un individuo a otro. La ingestin de 150- 200 mg de NaCN puede provocar la muerte en un individuo adulto de 70 Kg pudiendo llegar la concentracin sangunea a valores 1 2 mg/100 ml o superiores. En muestras de sangre cadavrica, el cianuro desaparece rpidamente por accin enzimtica y bacteriana. Hasta 15 g/100 ml de sangre en cianuro aparece como producto del catabolismo

normal en pequeas cantidades. En sangre, niveles de cianuro mayores de 1 mg/L es asociado con casos fatales. Dosis txica: una concentracin de 1 mg/Kg de peso corporal es mortal.

7. CUESTIONARIO 1) Describa el mecanismo de accin del cido cianhdrico 2) Sobre que tipo de muestras se puede realizar las determinaciones de cido cianhdrico. Indique la forma correcta de toma de muestra y conservacin en cada caso. Que ocurre con muestras en estado de putrefaccin. 3) Como procede para la identificacin y cuantificacin de cido cianhdrico en medios biolgicos 4) De los mtodos descriptos, describa las ventajas y desventajas de cada uno as como las posibles interferencias.

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