UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU

Escuela de Post Grado - Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias Maestra en Tecnologa y Gestin de la Calidad de Alimentos

Proyecto de Investigacin:

Anlisis de compuestos fitobioactivos del aceite esencial de Satureja Incana por Cromatografa de Gases Espectrometria de Masa

Presentada al programa de Post Grado

Para optar al Grado Acadmico de Magister Scientia en Tecnologa y Gestin de la Calidad de Alimentos

Presentado por: Joseph Obed Ricaldi Sarapura

Asesora: MSc. Libia Gutirrez Gonzales

Huancayo, 24 de Abril del 2013

1.

Aspecto Informativo:

1.1. Ttulo: Anlisis de compuestos fitobioactivos del aceite esencial de Satureja Incana por Cromatografa de Gases Espectrometria de Masa 1.2. Tesista y Asesor: 1.2.1. Tesista : Ing. Joseph Obed Ricaldi Sarapura 1.2.2. Asesora: MSc. Libia Gutirrez Gonzales 1.3. Tipo de Investigacin: Investigacin Bsica - Descriptiva 1.4. Lugar de ejecucin: Laboratorio Acreditado de Anlisis Cromatogrfico 1.5. Escuela de Post Grado: Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias 2. Aspectos de la Investigacin 2.1. Ttulo del proyecto. Anlisis de compuestos fitobioactivos del aceite esencial de Satureja Incana por Cromatografa de Gases Espectrometra de Masa. 2.2. Descripcin del proyecto. 2.2.1. Planteamiento y formulacin del problema: Los aceites esenciales son componentes voltiles provenientes de las plantas, que han despertado la atencin del hombre desde la antigedad solo como principios aromticos. El estudio de los aceites esenciales como materias primas bsicas para la industria de fragancias y sabores, se ha transformado en una de las reas de investigacin y desarrollo para muchos pases. Inicialmente considerados como material de desecho del metabolismo de las plantas, la importancia biolgica de los aceites esenciales ha sido reconocida recientemente, con la incursin de biocomercio sostenible y la investigacin en biodiversidad para la identificacin de quimiotipos de inters en base a la informacin primaria etnofitofarmacobotanica. Los aceites esenciales, obtenidos a partir de especies vegetales, poseen caractersticas alimenticias o medicinales, formado por una mezcla de compuestos orgnicos, guardando una relacin armnica en cuanto a su composicin. Estos compuestos son susceptibles a ser aislados y utilizados en orden a sus compuestos fitobioactivos. Las especies silvestres medicinales estn teniendo un crecimiento sostenido en los piases desarrollados, en el mbito de aprovechamiento sostenido de la biodiversidad y conservacin del medio ambiente. En nuestra regin existen diversas plantas aromticas silvestres como la mua, pacha mua, menta, japanshaco, juan alonso, berbena, pacha salvia, huilga huilga, blanca huasha, pomaishanca, descorsonera, turpo turpo, shilco shilco, zapatillahuayta, ans de monte, globo blobo, achicoria, paico, juan alonso, cola de caballos, ortiga negra, ajenjo, fumaria entre estos la especie Satureja incana conocido vulgarmente como Chiuyche, en las cuales la mayora son utilizados en la medicina folklorica en pequeas cantidades en la cura de infecciones respiratorias, estomacales, circulatorias, renales; y entre otros de aplicacin farmacocultural en la localidad de Palca Tarma. El desarrollo de conocimiento cientfico validado de compuestos qumicos fitobioactivos mediante mtodos analticos instrumentales que reducen el tiempo de anlisis y mayor precisin de los resultados de mnimas fracciones de muestra, ayudando a identificar y cuantificar compuestos fitoqumicos en los analitos. Existe un inters creciente por instituciones internacionales, empresas privadas y centros de investigacin en realizar la valoracin de especies con potencial de rasgos

caractersticos y especficos en la expresin quimio-gentica de compuestos fitobioactivos, para orientarlos sosteniblemente a la industria y promoviendo la conservacin de la biodiversidad y generando valor de uso, basados en un conocimiento cientfico. La calidad de productos derivados de la flora est bastante relacionada a su composicin qumica de compuestos fitobioactivos presentes en los aceites esenciales, los cuales a su vez tienen relacin directa con sus condiciones microbiolgicas, climticas, edafolgicas y agroecolgicas de desarrollo, lo que resultara provechoso contar con informacin sobre su composicin cantidad de componentes y su concentracin. El problema identificado es el desconocimiento de las caractersticas en relacin a los componentes fitobioactivos presentes en el aceite esencial de Satureja incana, De persistir este problema: Se estaran perdiendo la posibilidad de: Identificar y valorar la riqueza natural de compuestos qumicos fitobioactivos provenientes de la especie Satureja incana contenido en su aceite esencial en el mbito de la provincia de Tarma. Para conducir la investigacin de formula las siguientes preguntas de investigacin: - Cuantos compuestos fitobioactivos se encuentran presentes en el aceite esencial de Satureja incana procedente de la localidad de Tarma analizados mediante cromatografa de Gas - SM? - Cul es la concentracin de los compuestos fitobioactivos presentes en el aceite esencial de Satureja incana procedente de la localidad de Tarma analizados mediante cromatografa de Gas - SM? 2.2.2. Objetivo Identificar y cuantificar los compuestos fitobioactivos presentes en el aceite esencial de Satureja Incana por Cromatografa de Gases Espectrometra de Masa. 2.2.3. Justificacin La valoracin del biorecurso proveniente de la flora peruana forma parte de las polticas nacionales e internacionales de aplicacin de tecnologas y gestin de las calidades orientadas a la conservacin ambiental, y las polticas de transformacin agroindustrial, considerado en el Per, por el Comit BIOCOMERCIO PERU y el Ministerio del medio ambiente. Al trmino del trabajo de investigacin se aportara importante informacin cientfica sobre los compuestos fitobioactivos presentes en el aceite esencial de Satureja incana de muestra procedente de la Provincia de Tarma validada de los anlisis realizados en un Laboratorio Acreditado, generando una herramienta de biocomercio. 2.3. Marco terico: 2.3.1. Satureja Incana Planta herbcea perenne, muy aromtica, tallos semileosos, altura variable; hojas opuestas, ovaladas, agudas, haz liso, envs blanquecino, 1 a 2 cm. de largo; flores rojianaranjados, jaspeado amarillo al interior, vertlicios pedunculados, cliz tubular. Las propiedades que le atribuyen a esta planta contra las afecciones respiratorias (bequico), gripes, dolores estomacales (carminativo) y calambres. 2.3.2. Aceite esencial Los aceites esenciales son las fracciones liquidas voltiles, generalmente destilables por arrastre de vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas (Sellar, 2000), dichas sustancias odorferas de naturaleza oleosa estn ampliamente distribuidos en distintas partes del tejido vegetal (raz, tallos, hojas, flores y

frutos), en los distintos gneros y especies de naturaleza vegetal (Gutierrez, 2008). Segn la 8. Edicin de la farmacopea francesa de 1965, los aceites esenciales son productos de composicin general muy complejas que contienen los principios voltiles que se encuentran en los vegetales ms o menos modificados durante su biosintesis (Shiva R., 2007). 2.3.3. Anlisis Instrumental Cromatografa de Gas Una de las mejores herramientas para el anlisis de mesclas orgnicas y bioqumicas complejas orgnicas y bioqumicas complejas es la cromatografa de gases espectrometra de masas (GC-MS), mtodo de anlisis acoplado en el cual se toma el espectro de masas de cada uno de los compuestos que salen de la columna cromatografa; siendo estos guardados en un ordenador para su subsiguiente procesado. As mismo, la espectrometra de masas se puede acoplar a la cromatografa liquida para anlisis que contienen componentes voltiles. Es importante el desarrollo de mtodos de eliminacin del eluente antes de la introduccin de la muestra en el espectrofotmetro de masas, ya que la muestra est muy diluida por el lquido o el as portador en el interior de la columna (Skoog, Koller, & Nieman, 2001). 2.3.4. Compuestos fitobioactivos en aceites esenciales Los aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta ms de 100 componentes (Mayer, 2001), heterogneos, todos ellos separables ya sean por mtodos qumicos o fsicos como la destilacin, refrigeracin, centrifugacin, separacin cromatogrfico, etc. (Martnez M., 2003), como se puede apreciar en la siguiente tabla. Tabla 1: Compuestos Terpnicos en aceites esenciales. Compuesto terpenico Monoterpenos: Sesquiterpenos Monoterpenoles Sesquiterpenoles steres terpnicos xidos terpnicos Cetonas terpnicas Aldehdos Lactonas sesquiterpnicas Monoterpenonas Hidrocarburos sesquiterpnicos Principio activo y -pineno, canfeno, limoneno , mirceno, pcimeno -cariofileno, -farneseno, germacraneno, camazuleno -terpineol, borneol, citronelol, geraniol, linalol, nerol espatulenol, fenchol, nerolidol acetatos de nerilo, geranilo y bornilo, 1,8-cineol (eucaliptol) xido de cariofileno pulegona, tuyona citrales, fotocitrales crispolida alcanfor santanelos, curcumenos

2.3.5. Compuestos fitobioactivos en aceites esenciales de Satureja La composicin qumica de fitobioactivos de los aceites esenciales de varias especies del genero Satureja, de la familia Lamiaceae, evidencian muchos componentes, siendo sin embargo los fenoles: timol y carvacrol, los caractersticos en la mayor parte de las Saturejae, como se muestra en el cuadro siguiente:

CUADRO 02: Composicin qumica de aceites esenciales de Saturejae. Saturejae *Rend.(%) Componente ** Conc.(%) pineno 1,09 canfeno 1,68 terpineol 38,96 p cimeno + terpineno 0,88 S. 0,74 linalol 4,25 salzmannii alcanfor 0,29 borneol 2,66 timol 0,59 carvacrol 4,44 pineno 0,08 canfeno 0,38 p cimeno + terpineno 12,47 S. montana linalol 0,91 Sub especie 0,57 alcanfor 0,58 Montana borneol 8,80 timol 5,55 carvacrol 37,69 pineno 8,26 canfeno 7,94 mirceno 5,56 p cimeno 5,50 S. innota 0,42 linalol 1,68 alcanfor 11,14 borneol 1,09 carvacrol traza pineno 5,59 canfeno 13,65 mirceno 0,81 S. cuneifolia p cimeno + terpineno 13,26 Sub especie 0,97 linalol 4,10 obovata alcanfor 35,12 borneol 10,32 carvona 0,21 pineno 2,26 canfeno 3,29 p cimeno + terpineno 36,99 S. cuneifolia linalol 9,79 Sub especie 0,95 alcanfor 7,11 gracilis borneol 8,03 timol 5,54 carvacrol 1,78
* Rendimiento de la extraccin de aceite esencial de materia vegetal seca. ** Determinado por cromatografa de Gases en una columna Q, cargada de silicona OV 1, a 5% sobre Crhomosorb, junto con espectrofotometra de Infrarrojo Pye-univam SP-200

Fuente: Velasco y Prez, 1983.

Kurkcoglu, Tumen, & Baser (2001), indica que los aceites esenciales de Satureja incana contienen carvacrol como uno de los componentes maytoritarios, como se aprecia en el siguiente cuadro:

Cuadro 03 Componentes principales en aceites esenciales de Saturejas Especie Rendimiento de Componente principal (%) extraccion (%) carvacrol (25-69) Satureja cuneifolia 0.6 - 3.6 p-cimeno (12-31) Carvacrol (35-63) Satureja hortensis 1.3 4.8 -Terpineno (24-43) Carvacrol (30-49) Satureja thymbra 4.3 -Terpineno (18-27) Carvacrol (26) Satureja spicigera 0.5 -Terpineno (20) carvacrol (22-38) Satureja ciclica 0.6 0.9 p-cimeno (15-30) Satureja parnasica carvacrol (43-47) 1.5 2.6 ssp. sipylea p-cimeno (15-20) carvacrol (38-57) Satureja icarica 0.8-2.2 p-cimeno (13-18) Carvacrol (42-54) Satureja pilosa 1.1-2.7 -Terpineno (12-24) Carvacrol (63) Satureja montana 1.5 -Terpineno (10) Carvacrol (41) Satureja boissieri 2.1 -Terpineno (26) 2.3.6. Antecedentes de investigaciones en componentes fitoqumicos en aceites esenciales en la especie Satureja. Kurkcoaglu, Tumeu y Baser (2001), en su investigacin titulado Essential oil constituents of Satureja boissieri from Turkey, publicada en Chemistry of natural compounds, Vol 37, No. 4, reporta que la presencia de 4 a 5 elementos representativos identificados: carvacrol (40.8%), -terpineno (26.4%), and p-cymeno (14.5%) en aceite esencial de S. boissieri Obtenido con destilacin de vapor de agua en un aparato clevenger. El aceite fue analizado por Cromatografa de gas/Espectrometria de Masa (CG/EM) equipo SHIMADZU GC-MS QP5050A System, con una columna CPSil5B (25m x0.25mm), con una programacin de horno de inicio 60C hasta 260C con incremento de temperatura de 5C/min, con un Split de flujo de gas de 50mL/min. Mihajilov, Radnovic, Kitic, Zlatkovic, Ristic, & Brankovic (2009) en su investigacion titulado Chemical composition and antimicrobial activity of Satureja hortensis L. essential oil.pubicado en Central European Journal of Biology vol 4 No. 3: 411-416, reporta que el aceite esencial de S. hortensis tiene como componentes principales carvacrol (67%), -Terpineno (15,3%) y p-cimeno (6.73%). El aciete fue extraido en un aparato clevenger. El analisis de componentes quimicos fue realizado mediante CG/EM con una columna HP-5MS (30m x 0,25mm), la temperatura del horno fue programada linealmente de 40-260C con un incremento de 4C/min. Se preparo un solucion etanolica de la muestra de aceite esencial al 1%, injectando 200nL modo split, en el equipo Hewlwtt-Packard HP G1800C series IIGCD. Michaelakis, Theotokatos, Koliopoulos, & Chorianopoulos (2007) en su investigacion Essential oil of Satureja species: insecticidal effect on cules pipiens Larvae (Diptera: culicidae) publicada en la revista molecules con ISSN 1420-3049, reporta que, el aceite esencial de las saturejas contienen varios monoterpenos hydrocarbonados y monoterpenos fenolicos, variando en los aceites examinados. Siendo el carvacrol y timol el mayor de los componentes. Satureja Thymbra contiene monoterpenos hidrocarbonados p-cimeno y -Terpineno (30,51%) con analisis CG/EM usando un

equipo HP 5973-6890 GC_MS system en modo de operacin IE, equipado con una columna HP 5MS 30mx0.25mm, usando gas Helio a 1mLmin-1 con una temperatura inicla de 60C y calentado has 280C a 3Cmin-1. La identificacion de los compuestos fue relaizado por comparacion con los indices de retencion IR y el espectro de masa IE con NIST/NBS, Wiley librera de esprectos. Sonboli, Fakhari, Kanami, & Yousefzadi (2004), en su investigacion Antimicrobial activity, essential oil composition and micromorphorlogy of Tricomes of Satureja laxiflora C Koch from Iran, publicado en Verlag der Zeitschriff fur Naturforschung: 777781, reporta que mediante un analisis de cromatografia gaseosa y cromatografia de gas acoplada a espectrometria de masa realizado al aceite esencial de S. laxiflora evidencia 33 componentes que representan el 99.1% del total del aceite esencial caracterizado. Los componentes majores son: timol (63.9%) y -Terpineno (11.9%), seguido por carvacrol (4.8%), p-cimeno (3.9%), geraniol (3.2%) y geranil acetato (3.1%). El aceite esencial fue extraido en un aparato Clevenger usando tejido deshidratado (25g) por un espacio de 2 horas. El analisis CG/EM fue realizado en un equipo Thermoquest-Finnigan Trace GC-MS equipado con columna DB-1 (60m x 0.25mm). la programacion de temperatura de 60C a 250C, con un incremento de 5Cmin-1. Es utilizado gas Helio con un flujo de 1.1ml.min-1. (Kan, y otros, 2006), en su investigacion GC-MS analisis and actividad antibacterial de cultivated Satureja cuneifolia Ten. Essential oil, publicado en Turk J. Chem. 30:253259, reporta que son 6 los componentes mayoritarios, en la cual el carvacrol es el compuesto mayoritario con 59.28% del aceite esencial, timol 15.72%, p-cimeno 9.69, -Terpineno 4.16%, 1.7 linalool y borneol 1.25%. La muestra fue colectado durante la floracion en Konya a 1200m de altitud, el aceite fue extraido en un aparto clevenger por espacio de 3horas obteniendo un rendimiento de 1.7%. Para el analisis cromatografico hicieron uso de un equipo Varian-Chrompach 2000 MS con ionizacion de electrones de impacto 70eV. El rango de scaner fue 30-200 unidades de masa atomica (Amu), con columna capilar silica WCOT (30m x 0,25mm). Utilizando gas Helio a un flujo de 0.7mL/min. La configuracion en sistema gradiente inicialmente a 100C por 3min incrementandose hasta 150C con 8Cmin -1, conservando la temperatura de 150C por 3min, finalmente es incrementado hasta 250C con 15C.min-1. La identificacion fue en base a la librera de masa espectral Wiley y Nist. (Dunkic, Bezic, Ljubesic, & Bocina, 2007) en su investigacion Glandular hair ultrastructure and essential oils in Satureja subspicata Vis. ssp. Subspicata and ssp. Liburnica Silic, publicado en acta biologica cracoviensia Serie botanica 49(2): 45-51, repota que la fitoquimica de estos aceites esenciales separados por hidrodestilacion tien 23 componentes volatiles libres identificados en todos los aceites. Los aceites esenciales contienen fenoles monoterpenicos carvacrol y timol en todoel estado fenolico de la planta, El mayor componente de estas subespecies fue el -pineno especialmente en el periodo de floracion (52.9% - 42.6%) en un analisis por cromatografia de Gas/ Espectrometria de Masa. Con una columna (50m x 0.2mm), flujo de gas Helio 1ml.min-1 , con una programacion de temperatura isoterma 4min a 70C, luego elevar hasta 180C a 4C.min-1, isoterma 10min a 180C y luego elevar a 250C. Mahbouni & Kazempour (2011) en su investigacion Chemical composition and antimicrobial activity of Satureja hortensis and Trachyspermum copticum essential oil publicado en Iranian Journal of microbiology 3(4):194-2000, reporta que los componentes quimicos mayoritarios del aceite esencial de Satureja hortensis son: timol (28.2%), p-cimeno (19.6%), -Terpineno (16%) y carvacrol (11%); y, en menor porcentaje -pineno (4.5%), sabineno (4.4%), -pineno (2.7%). Timol y carvacrol consisten el 39.2% del total de la composicion del aceite esencial. El analisis fue realizado en un equipo Aligent technology HP 6890 sistem con una columna HP-5MS

(60m x 0.25mm). La temperatura es programada inicio a isoterma 1 min a 40C, luego elevado a 230C a 3C.min-1, y, consevado esa temperatura por 10 min. El flujo de gas Helio fue 1ml.min-1. Azaz, Demirci, Satil, Kurkcuoglu, & Can (2002), en su investigacion Antimicrobial activity of some Satureja essential oils publicado en Z. Naturforsch 57(c):817-821, reporta que el componente mayoritario en el aceite esencial de Satureja es el carvacrol, siendo para Satureja icarica (59.2%), Satureja boissieri (44.8%) y Satureja pilosa (42.1%). El analisis fue realizado en un equipo Shimadzu GCMS-QP5050A con columna Sil 5CB, con una programacion de temperatura de inicio a 60C hasta 260C a 5C.min-1, manteniendo constante por 40 min. Con un split de flujo de 50ml.min -1. Realizando la identificacion con librera de constituyentes de aceites esenciales TBAM. Adiguzel, Ozer, Kilic, & Cetin (2007), en su investigacion Screening of antimicrobial activity of essential oil and methanol extract of Satureja hortensis on foodborne bacteria and fungi, publicado en Czech J. Food Sci. 25(2):81-89, reporta que los principales componentes encontrados en el aceite esencial por GC-SM son el timol (40.54%), -Terpineno(18,56%), carvacrol (13.98%) y p-cimeno (8.97%), usando un equipo Termofinnigan Trace GC/Trace DSQ/A1300, EI Quadrapolo con una columna SGE-BPX5MS (30m x 0.25mm). Fue usado gas Helio flujo 1ml.min -1. La programacion de temperatura fue 50 -150C a 3C.min -1 con isoterma de 10 min, y elevado a 250C a 10C.min-1. 1l es injectado manualmente. 2.4. Hiptesis: El trabajo de investigacin tiene la naturaleza de ser bsico y descriptivo. La hiptesis de trabajo bajo la premisa de que los aceites esenciales de Satureja tienen como componentes mayoritarios carvacrol, -Terpineno, y, p-cimeno, y no habiendo reportes de Satureja incana, se plantea: El aceite esencial de Satureja incana procedente de la localidad de tarma estraido por fluido de arrastre hidrotermico tiene como componente mayoritario al carvacrol determinado por analisis instrumental por cromatografia de gas/espectrometria de masa. 2.5. Metodologa: Se seguir los siguientes pasos: Paso 1: Ubicacin de punto de recoleccin, se seguir el mtodo de sistema de posicionamiento global con uso de GPS. Se realizara el recojo en una zona de crecimiento endmico de la especie Satureja incana. Paso 2: Extraccin de aceite esencial. La muestra colectada (Satureja incana) en estado vegetativo en floracin, se realizara un tratamiento de deshidratacin natural en cmara protegida de radiacin solar, la extraccin de aceite esencial ser por la metodologa arrastre de vapor hidrotermico, en extractor de acero inoxidable de 18 l en 1hora, depositndose el aceite esencial en un vial de 1 - 2ml, y almacenndose en refrigeracin. Paso 3: Identificacin y cuantificacin de compuestos fitobiactivos presentes en el aceite esencial, se realizara por el mtodo de anlisis instrumental con Cromatografo de Gases acoplado Espectrometra de masas. El mtodo se sujetara al mtodo de validacin aplicado en el laboratorio acreditado (prestacin de servicio de anlisis). Paso 4: Anlisis e interpretacin de resultados.

3. 3.1.

Aspecto Administrativo Cronograma de actividades: Actividades Presentacin y aprobacin de Tesis Extraccin y conservacin de aceite esencial de Satureja incana Revisin Bibliogrfica Identificacion y cuantificacin de Fitobioactivos por CG-SM Discusin del Anlisis Entrega de Informe Final Meses 1 2 3 4 5 6 7 8 x x x x x x x x

3.2. Presupuesto del proyecto: Detalle Materia prima Extractor de aceite esencial acero inox. Separador de flujo continuo Viales para conservacin de muestras Servicio de Anlisis Cromatogrfico Materiales de escritorio Servicio de impresin y anillado Servicio de empastado TOTAL COSTO (Nuevos Soles) Unidad Cantidad P. Unit. Glob 1 200.00 Unid 1 8500.00 Unid Unid Glob Glob Glob Glob 1 5 1 1 1 1 280.00 4.00 1400.00 200.00 80.00 60.00 Costo 200.00 8500.00 280.00 20.00 1400.00 200.00 80.00 60.00 10940.00

El presente proyecto de investigacin ser autofinanciado

4.

Referencia Bibliogrfica - Adiguzel, A., Ozer, H., Kilic, H., & Cetin, B. (2007). Screening of antimicrobial activity of essential oil and metanol estract of Satureja hortensis on Foodborne bacteria and fungi. Czech. J. Food. Sci., 2, 81-89. - Azaz, D., Demirci, F., Satil, F., Kurkcuoglu, M., & Can, K. (2002). Antimicrobial activity of some Satureja essential oils. Z. Naturforsch, 57(c), 817-821. - Dunkic, V., Bezic, N., Ljubesic, N., & Bocina, I. (2007). Glandular hair ultraestructure ana essential oil in satureja subspicata Vis. ssp. subspicata and ssp. Liburnica silic. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 49(2), 45-51. - Gutierrez, L. (2008). Caracterizacion e indentificacion de componentes quimicos del aceite esencial de Cedron "lippia". Tesis de Maestria, UNALM. - Kan, Y., Ucan, U., Kartal, S., Altun, M., Aslan, S., Sayar, E., y otros. (2006). GC-MS analysis and antibacterial activity of cultivated Satureja cuneifolia Ten. Essential oil. Turk J. Chem, 3, 253-259. - Kurkcoglu, M., Tumen, G., & Baser, K. (2001). Essential oil constituent of Satureja incana boissien from Turkey. Chemistry of Natural Compounds, 37(4), 329-335. - Mahbouni, M., & Kazempour, N. (2011). Chemical composition and antimicrobial activity of Satureja hortensis and trachyspermum essential oil. Iranian Journal of Microbiology, 3(4), 194-200. - Martnez M., A. (2003). Aceites Esenciales . Medelln-Colombia: Universidad de Antioquia Facultad Qumica Farmacutica. - Mayer, R. (2001). Plantas medicinales y aromticas; estudio, cultivo y procesado. Madrid. Espaa: Mundi-prensa. - Michaelakis, A., Theotokatos, S., Koliopoulos, G., & Chorianopoulos, N. (2007). Essential oils of Satureja Species: Inseccticidal Effect on Clulex pipiens Larvae (Diptera: Culicidae). Molecules, 12, 2567-2578. - Mihajilov, T., Radnovic, D., Kitic, D., Zlatkovic, B., Ristic, M., & Brankovic, S. (2009). Chemica composition and antimicrobial activity of Satureja hortensis L. essential oil. Central European Journal of Biology, 4(3), 411-416. - Sellar, W. (2000). Gua de Aceites esenciales. Madrid: Espaa. - Shiva R., C. M. (2007). Estudio de la actividad antimicrobiana de extractos naturales y acidos organicos. Posible alternativa a los antibioticos promotores de crecimiento. Tesis doctoral, Universidad Autonoma de Barcelona. - Skoog, Koller, & Nieman. (2001). Principios de analisis instrumental. (Quinta edicion ed.). Espaa: McGraw-Hill. - Sonboli, A., Fakhari, A., Kanami, M., & Yousefzadi, M. (2004). Antimicrobial activity, essential oil composition and micromorphology of trichomes of Satureja laxiflora C. Koch from Iran. Verlag der Zeitschriff fur Naturforschung, 777-781. - Velasco Neguerela, A. y Prez Alonso, M. J. Estudio qumico del aceite esencial de diversas Saturejae ibricas. Anales Jardn Botnico. Madrid 40(1):107-118.