A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao.

. Ela est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao.

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilizao atribuda a um botnico russo ao descrever suas experincias na separao dos componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de ter de petrleo (fase mvel) atravs de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de clcio (fase estacionria), qual se adicionou o extrato, levou separao dos componentes em faixas coloridas. Este provavelmente o motivo pelo qual a tcnica conhecida como cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar errnea idia de que o processo seja dependente da cor.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, que tambm poderiam ser considerados precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia foi praticamente ignorada at a dcada de 30, quando foi redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na rea possibilitaram seu aperfeioamento e, em conjunto com os avanos tecnolgicos, levaram-na a um elevado grau de sofisticao, o qual resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas reas.

A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura.

As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando- se diversos critrios, sendo alguns deles listados abaixo:

1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico

Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP), cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e cromatografia em camada delgada (CCD), so diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais sero mais bem compreendidos quando classificados por outro critrio.

2. Classificao pela fase mvel empregada

Em se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica (CSC), usando-se na ltima um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC), na qual a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas pela fora da gravidade, e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da fase mvel. A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia lquida de alta presso, mas sua atual designao mostra-se mais adequada. No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro empacotadas com a fase estacionria.

3. Classificao pela fase estacionria utilizada

Quanto fase estacionria, distingue-se entre fases estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separao.

4. Classificao pelo modo de separao

Por este critrio, separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos.

Para se ter uma viso mais ampla dos diferentes tipos de cromatografia, os mesmos esto dispostos no diagrama da Figura 1.

Figura 1: Representao esquemtica dos diferentes tipos de cromatografia.

Dentre os vrios tipos de cromatografia, especial nfase ser dada cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia lquida clssica e de alta eficincia (CLAE) e cromatografia cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). Cromatografia planar A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio lquidolquido, estando um deles fixado a um suporte slido. Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre duas fases imiscveis, sendo geralmente a gua um dos lquidos. O solvente saturado em gua e a partio se d devido presena de gua em celulose (papel de filtro). Este mtodo, embora menos eficiente que a CCD, muito til para a separao de compostos polares, sendo largamente usado em bioqumica.

A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de adsoro lquido slido. Nesse caso, a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionria.

A Fig. 2 mostra um cromatograma obtido por CCD no qual se pode observar a diferena de afinidade das substncias 1 e 2 pela fase estacionria, sendo a substncia 1 mais retida que a 2. Por ser um mtodo simples, rpido, visual e econmico, a CCD a tcnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reaes orgnicas, sendo tambm muito utilizada para a purificao de substncias e para a identificao de fraes coletadas em cromatografia lquida clssica.

Figura 2: Esquematizao de um cromatograma obtido por CCD.

O parmetro mais importante a ser considerado em CCD o fator de reteno (Rf), o qual a razo entre a distncia percorrida pela substncia em questo e a distncia percorrida pela fase mvel. Os valores ideais para Rf esto entre 0,4 e 0,6.

A CCD pode ser usada tanto na escala analtica quanto na preparativa. Normalmente as placas utilizadas so de vidro, com espessura de 3 a 4 mm. Placas analticas usualmente tm 10 cm x 2,5 cm e preparativas 20 cm x 20 cm.

A slica gel a fase estacionria mais utilizada, sendo seguida pela alumina, pela terra diatomcea e pela celulose. Para a preparao das placas, faz-se uma suspenso do adsorvente em gua, sendo a mesma depositada sobre a placa manualmente ou com o auxlio de um espalhador. Aps a deposio, deixa-se a placa secar ao ar. A etapa final da preparao da placa sua ativao. A slica, por exemplo, ativada a 105-110 C por 30 a 60 minutos. A espessura da camada de slica a ser depositada de 0,25 mm para placas analticas e de 1,0 mm para placas preparativas. Na preparao de placas preparativas, costumase adicionar sulfato de clcio para melhorar a adeso placa de vidro. No mercado existem placas analticas e preparativas pr-fabricadas, as quais apresentam a fase estacionria depositada sobre uma lmina de material plstico ou de alumnio, sendo estas de maior eficincia.

As amostras a serem analisadas por CCD devem ser aplicadas a aproximadamente 1 cm da base inferior da placa, com a ajuda de um capilar. Aps a aplicao da(s) amostra(s) sobre a placa, a mesma deve ser introduzida numa cuba contendo a fase mvel adequada. Cubas cromatogrficas geralmente so de vidro, com fundo chato, e devem ter suas paredes laterais internas recobertas com papel de filtro, para facilitar sua saturao com os vapores do solvente.

A escolha da fase mvel, que geralmente constituda por um ou mais solventes, no tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases estacionrias mais usadas so extremamente polares, no devem ser utilizados solventes pouco polares, que no removeriam os compostos do ponto de aplicao, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os componentes da amostra at o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados so obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade mdia em relao polaridade dos componentes da amostra.

A placa deixada na cuba, onde o solvente ir subir por capilaridade, at que ele esteja a aproximadamente 2 cm da extremidade superior. Ao ascender, o solvente ir arrastar mais os compostos menos adsorvidos na fase estacionria, separandoos dos mais adsorvidos.

A linha de chegada da fase mvel deve ser marcada e a placa deve estar seca. Como a maioria dos compostos orgnicos incolor, faz-se necessria a utilizao de um processo de revelao para que se possa analisar o resultado.

Para a revelao de placas de CCD, existem processos destrutivos e no destrutivos. Os mtodos no destrutivos mais utilizados so a utilizao de 1) placas onde a fase estacionria fluorescente ou 2) iodo. O primeiro baseia-se na utilizao de substncias fluorescentes misturadas slica quando da preparao das placas, possibilitando a revelao dos compostos em cmaras de luz ultravioleta. O segundo vale-se do fato de que o iodo complexa-se com compostos insaturados, de modo que placas que os contenham, ao serem colocadas em uma cmara contendo cristais de iodo, apresentaro pontos amarronzados.

Os processos destrutivos consistem na oxidao dos compostos sobre a placa, pulverizando-os com soluo aquosa de um oxidante orgnico e/ou um cido mineral, submetendo-se a placa a altas temperaturas (~110 C) por alguns minutos. Os compostos orgnicos oxidados sero revelados na forma de pontos escuros.

Cromatografia em coluna

Cromatografia lquida clssica

Esta tcnica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionria lquida. Fases estacionrias slidas levam separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por partio. Suportes quimicamente modificados tambm tm sido usados, sendo o processo de separao misto neste caso.

Figura 3: Ilustrao de uma coluna cromatogrfica.

Esses suportes so acondicionados em tubos cilndricos geralmente de vidro, de dimetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A Fig. 3 uma ilustrao de uma coluna cromatogrfica empacotada com slica, sendo mostrados seus demais constituintes.

Os adsorventes possuem partculas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um fluxo razovel do solvente atravs da coluna.

O uso de slica de partcula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas

colunas requer a utilizao de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluio, sendo conhecido como Cromatografia Flash.

A principal etapa ao se utilizar essa tcnica o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definir a eficincia da separao. Enquanto a alumina empacotada em sua forma original, a slica deve s-lo na forma de suspenso.

coluna adiciona-se uma pequena quantidade de solvente e deposita-se na sua extremidade inferior um chumao de algodo com espessura de aproximadamente 0,5 cm para impedir a passagem de partculas da fase estacionria. A adio de slica deve ser feita com a torneira semi-aberta. O adsorvente adicionado lentamente coluna fixada na posio vertical, batendo-se continuamente ao longo da mesma para que todo o ar seja expulso, de modo a se obter uma compactao uniforme. A existncia de ar entre as partculas leva formao de canais na coluna, os quais alargam as bandas eludas.

Nunca se deve permitir que o nvel do solvente desa abaixo do nvel do adsorvente, o que poderia acarretar rachaduras, comprometendo a eficincia da coluna.

Aps o empacotamento, conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a trs vezes o volume da coluna) a ser utilizado atravs da coluna antes da introduo da amostra. Esta adicionada coluna com o auxlio de uma pipeta no momento em que o nvel do eluente esteja o mais prximo possvel do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a serem eludas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente ento adicionado cuidadosa e continuamente.

A escolha do eluente segue os princpios discutidos em CCD, mas neste caso ele pode ser mudado durante o processo cromatogrfico. Se, por exemplo, a amostra constituda por duas substncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida um eluente polar.

O volume das fraes a serem recolhidas funo da quantidade de amostra e do grau de dificuldade da separao. Para anlise das mesmas, recorre-se a alguma tcnica auxiliar, usualmente CCD.

Em vista de que geralmente algumas partculas da amostra permanecem irreversivelmente adsorvidas fase estacionria, a cada separao necessrio um tratamento para a recuperao do adsorvente.

Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

O grande avano na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilizao de suportes com partculas diminutas responsveis pela alta eficincia, as quais tornam necessrio o uso de bombas de alta presso para a eluio da fase mvel, devido a sua baixa permeabilidade. A Fig. 4 mostra um equipamento tpico de CLAE.

Figura 4: Equipamento bsico de CLAE. a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta presso; c) vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador.

As fases mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado.

As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra com uma seringa e duas posies, uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao para a coluna. Existem alas de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alas na faixa de 5-50 mL para injees analticas e 0,5-2 mL para preparativas.

As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de ao inoxidvel, com dimetro

interno de cerca de 0,45 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento varivel, sendo comuns colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com suportes de alta resoluo, no sendo necessria sua regenerao aps cada separao.

O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm empregados detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e eletroqumicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada.

O registro de dados pode ser feito atravs de um registrador, um integrador ou um microcomputador.

A Fig. 5 ilustra uma separao enantiomrica por CLAE.

Figura 5: Cromatograma mostrando a separao dos enantimeros do tetramisol, princpio ativo de vrios medicamentos usados para ascaridase.

A versatilidade desta tcnica reside no grande nmero de fases estacionrias existentes, as quais possibilitam anlises e separaes de uma ampla gama de compostos com alta eficincia. Tem sido utilizada em vrias reas da cincia, no acompanhamento de snteses, em anlises de pesticidas, feromnios, no isolamento de produtos naturais e sintticos e na produo e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes.

As separaes em CLAE podem se dar por adsoro, partio ou ambos. O suporte mais comumente utilizado a slica. O uso de fases estacionrias lquidas

adsorvidas a um suporte no tem grande aplicao devido perda de fase estacionria, mas o uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqncia do problema acima, possibilita a produo de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas so chamadas de quimicamente ligadas.

Essas fases, dependendo da modificao feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionria mais polar que a fase mvel, e em fase reversa, a fase mvel mais polar.

Separaes analticas so predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilslica) a mais usada, ao passo que so preferidas fases que atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de que separaes no modo reverso utilizam fases mveis aquosas.

Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado s fases estacionrias quirais, as quais possibilitam a separao direta de enantimeros. Para tanto, necessria a presena de um seletor quiral como parte integrante da fase estacionria.

Cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR)

Em contraste CLAE, o principal mecanismo de separao da cromatografia gasosa est baseado na partio dos componentes de uma amostra entre a fase mvel gasosa e a fase estacionria lquida. A utilizao de fases estacionrias slidas, as quais levariam separao por adsoro, apresenta poucas aplicaes.

A cromatografia gasosa uma das tcnicas analticas mais utilizadas. Alm de possuir um alto poder de resoluo, muito atrativa devido possibilidade de deteco em escala de nano a picogramas (109 - 10-12 g). A grande limitao deste mtodo a necessidade de que a amostra seja voltil ou estvel termicamente, embora amostras no volteis ou instveis possam ser derivadas quimicamente. Pode ser utilizada para separaes preparativas apenas na faixa de microgramas a miligramas, no sendo muito empregada para esse fim. A Fig. 6 mostra os componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso.

Figura 6: Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso. a) cilindro do gs de arraste mantido sob alta presso; b) injetor; c) coluna; d) detector e e) registrador.

Como dito anteriormente, a diferena entre CG e CGAR est na coluna. Colunas de CGAR so maiores em comprimento, menores em dimetro, possuem a fase lquida como um filme aplicado diretamente s paredes do tubo da coluna e so mais eficientes.

Essas colunas so tubos longos de metais como ao ou cobre, vidro ou teflon. Colunas de CG tm dimetro de cerca de 3 mm e comprimento em torno de 3 m, ao passo que colunas de CGAR tm dimetro na faixa de 0,15-0,75 mm e comprimentos variados, usualmente entre 10 m e 100 m.

Os gases utilizados como fase mvel devem ter alta pureza e ser inertes em relao fase estacionria. Hidrognio, nitrognio e hlio so os mais usados.

A injeo da amostra feita atravs de microsseringas ou vlvulas semelhantes s utilizadas em CLAE.

Os detectores de maior aplicao so o detector por ionizao em chama e o detector de condutividade trmica. Os dados podem ser obtidos atravs de um registrador potenciomtrico, um integrador ou um microcomputador, sendo as amostras identificadas por seus tempos de reteno.

Nesses equipamentos necessrio o controle da temperatura do injetor, da coluna e do detector, as quais so mantidas por termostatos. Como a temperatura um fator extremamente importante, grande parte das anlises por cromatografia

gasosa feita com programao de temperatura, obtendo-se melhor separao com picos mais simtricos em menor tempo.

Para o empacotamento de colunas de CG, geralmente empregam-se terras diatomceas como suporte. A escolha da fase estacionria de fundamental importncia, sendo ela o componente crtico da coluna. As fases estacionrias podem ser polares, apolares ou quirais. Fases polares so baseadas em polietileno glicol puro ou modificado e apolares em metilsiloxano puro ou modificado. As fases quirais mais comuns so compostas de ciclodextrinas.

Atualmente, espectrmetros de massa tm sido acoplados a equipamentos de cromatografia gasosa, possibilitando a identificao imediata das substncias presentes na amostra.