Composicin qumica y la respuesta a diluir cido sacarificacin enzimtica y pretratamiento de alfalfa, reed canarygrass y csped Panicum virgatum Resumen

Tallos de alfalfa, reed canarygrass y switchgrass; especies herbceas perennes que tienen potencial como cultivos de energa de biomasa en las regiones templadas; se evaluaron para su potencial como cultivos energticos de bioconversin. Cada especie de forraje fue cosechado en dos o tres etapas de madurez y analizado para carbohidratos, lignina, protenas, lpidos, cidos orgnicos y composicin mineral. Tambin se evaluaron las muestras de biomasa para rendimientos de azcar despus de pretratamiento con diluir sulfrico seguido de sacarificacin enzimtica utilizando un comercial preparacin de la celulasa. Contenido de carbohidratos de las plantas vari entre 518 y 655 g kg_1 materia seca (DM) y la concentracin de la celulosa de 209 a 322 g kg_1 DM. carbohidratos y lignina contenido fueron menor para las muestras de muestras de madurez temprana en comparacin con muestras de cosechas de madurez tarda. Se observaron varias tendencias importantes en cuanto a la eficiencia de recuperacin de azcar despus de tratamientos con cido diluido y celulasa. En primer lugar, una cantidad significativa de los carbohidratos disponibles eran en forma de azcares solubles y almacenamiento de carbohidratos (4.3 16.3% peso/peso). Recuperacin de azcares solubles despus de pretratamiento cido diluido fue problemtico, sobre todo la de fructosa. Fructosa result para ser extremadamente lbil a los pretratamientos cidos diluidos. En segundo lugar, la eficiencia en la que se recuper la glucosa disponible se correlacion inversamente con madurez y lignina contenido. Sin embargo, glucosa total rendimientos fueron mayores para los vencimientos posteriores debido a mayor contenido de celulosa en comparacin con las anteriores muestras de madurez. Finalmente, polisacridos de la pared celular, segn lo determinado por el sistema de fibra detergente ampliamente aplicada fueron encontrados para ser inexactos. La fibra detergente mtodo sobreestimado constantemente celulosa y hemicelulosa y lignina subestimada por cantidades sustanciales. Resumen Tallos de alfalfa, reed canarygrass y switchgrass; especies herbceas perennes que tienen potencial como cultivos de energa de biomasa en las regiones templadas; se evaluaron para su potencial como cultivos energticos de bioconversin. Cada especie de forraje fue cosechado en dos o tres etapas de madurez y analizado para carbohidratos, lignina, protenas, lpidos, cidos orgnicos y composicin mineral. Tambin se evaluaron las muestras de biomasa para rendimientos de azcar despus de pretratamiento con diluir sulfrico seguido de sacarificacin enzimtica utilizando un comercial preparacin de la celulasa. Contenido de carbohidratos de las plantas vari entre 518 y 655 g kg_1 materia seca (DM) y la concentracin de la celulosa de 209 a 322 g kg_1 DM. carbohidratos y lignina contenido fueron menor para las muestras de muestras de madurez temprana en comparacin con muestras de cosechas de madurez tarda. Se observaron varias tendencias importantes en cuanto a la eficiencia de recuperacin de azcar despus de tratamientos con cido diluido y celulasa. En primer lugar, una cantidad significativa de los carbohidratos disponibles eran en forma de azcares solubles y almacenamiento de carbohidratos (4.3 16.3% peso/peso). Recuperacin de azcares solubles despus de pretratamiento cido diluido fue problemtico, sobre todo la de fructosa. Fructosa result para ser extremadamente lbil a los pretratamientos cidos diluidos. En segundo lugar, la eficiencia en la que se recuper la glucosa disponible se correlacion inversamente con madurez y lignina contenido. Sin embargo, glucosa total rendimientos fueron mayores para los vencimientos posteriores debido a mayor contenido de celulosa en comparacin con las anteriores muestras de madurez. Finalmente, polisacridos de la pared celular, segn lo determinado por el sistema de fibra detergente ampliamente aplicada

fueron encontrados para ser inexactos. La fibra detergente mtodo sobreestimado constantemente celulosa y hemicelulosa y lignina subestimada por cantidades sustanciales. Departamento de energa y el switchgrass (Panicum virgatum L.) fue seleccionada para el estudio intensivo [10,11]. La UE investiga 20 hierbas perennes y seleccionado 4 como los ms prometedores: miscanthus (Miscanthus spp. Anderss.), reed canarygrass (Phalaris arundinacea L.), caa (Arundo donax L.) y el switchgrass [12]. Alfalfa (Medicago sativa L.) tambin ha sido considerada como un cultivo de energa en los Estados Unidos [13]. Tres forrajes fueron seleccionadas para este estudio: alfalfa (slo los tallos), reed canarygrass y switchgrass. Seleccin de los tres cultivos de forraje evaluado en este estudio se bas en el alto potencial de rendimiento y otras consideraciones agronmicas. Ampliamente todas estas especies se adaptan a una gama de regiones ambientales, pero cada especie tambin est especialmente preparado para situaciones especiales. Por ejemplo, reed canarygrass es un csped de temporada fresca que es muy tolerante de las inundaciones y su productividad es muy sensible a altos niveles de fertilizacin nitrogenada, convirtindolo en un cultivo til para la eliminacin del estircol de ganado [14]. Por el contrario, switchgrass es un csped de temporada clida que requiere temperaturas ms altas de crecimiento para obtener la mxima productividad, pero esta especie es extremadamente sequa tolerante y productiva con un mnimo de fertilizantes [10]. Caractersticas nicas de alfalfa incluyen el hecho de que esta legumbre no necesita fertilizantes de nitrgeno y las hojas son una protena suplementaria valiosa alimenta para ganado, proporciona otra fuente de ingresos por el uso de esta especie como un cultivo de biomasa [15]. De las tres especies de forrajeras evaluadas en el presente estudio, la alfalfa puede ser ms adecuada para su uso en terrenos aptos para el cultivo de fila porque disminuye la productividad de la alfalfa despus de 3 a 5 aos y alfalfacan la mayora del nitrgeno requisitos de fertilizante para 2 aos de produccin de maz (Zea mays L.) despus de que el soporte de la alfalfa es arado hacia abajo. Switchgrass y reed canarygrass siguen siendo productivos durante perodos prolongados de tiempo y son ms adecuados para tierras de cultivo marginales porque estos pastos perennes son ms efectivos en el control de erosin y lixiviacin de nutrientes. Claramente, la eleccin de cultivos de biomasa debe incluir su aplicabilidad a sistemas agrcolas y las caractersticas de la base de tierra disponible. La eficiencia de conversin de biomasa en etanol depende de las caractersticas de la materia prima y composicin, procesos de tratamiento previo y las tecnologas de fermentacin que se utilizan[1.216]. Calidad de la materia prima para cultivos herbceos energticos ha sido extensamente estudiada para su uso como alimento para el ganado, pero no para la conversin de etanol. Legumbres, pastos con el sistema de fotosntesis C3 y pastos con el sistema de fotosntesis C4 difieren en caractersticas anatmicas de la planta que afectan su composicin qumica y la utilizacin de animales rumiantes [17]. Otros factores importantes que se conocen para impactar fuertemente la composicin qumica y la digestin de rumiantes incluyen forraje ambiente genotipo, madurez y crecimiento, as como, la interaccin entre estos factores [18]. Este estudio se centr en la influencia del tipo de la planta y madurez. Los forrajes seleccionados para este estudio incluyen una leguminosa (alfalfa), hierba de C3 (reed canarygrass) y pasto de C4 (switchgrass) cada una de ellas fue cosechada en dos o tres vencimientos. Biomasa muestras fueron caracterizadas por composicin qumica total, incluyendo hidratos de carbono, protenas, lpidos, lignina Klason, ceniza, etc.. Rendimientos de azcar recuperable, siguiente se evaluaron midiendo monosacridos liberados de la matriz celular despus del tratamiento con cido sulfrico diluido (en 121 y 150 1) y sacarificacin enzimtica con una celulasa comercial. Finalmente, se combinaron los datos composicionales y rendimiento para calcular la cantidad relativa de azcares recuperables para cada muestra. Los resultados mostraron claros distinciones entre las muestras basado en madurez tanto de tipo planta y cosecha.

2. Materiales y mtodos 2.1. Planta de material Herbceos muestras de cultivos de biomasa fueron cultivadas y cosechadas en 2003. Las muestras de dos alfalfa fueron creadas por cosecha y numerosas plantas individuales de varios viveros genticas en Rosemount y Becker, MN que abulta. Estos viveros fueron fundadas en 2001 y consisti en plantas maduras derivadas entrecruzar las variedades comerciales de alfalfa. El material vegetal de reed canarygrass provena de una poblacin bajo-alcaloide seleccionada para capacidad mejorada del establecimiento que fue plantado en Arlington, WI. Se recogieron muestras de switchgrass de un stand establecido de la variedad Cave-in-Rock a Mead, NE. Todas las parcelas de campo fueron fertilizadas para alta productividad bajo condiciones locales del suelo. Materiales de planta se cosecharon a una altura de rastrojo de 10 cm. Las etapas de madurez especfica y la descripcin morfolgica de las muestras se detallan en tabla 1. Despus de la cosecha, la biomasa fue secado en bancos de invernadero (switchgrass) o en horno de aire forzado a 60 1 (alfalfa y reed canarygrass). La alfalfa deshidratada fue mano separado en componentes de hoja y tallo. Tamaos de la muestra total fueron _12 para cada uno del tallo de la alfalfa y reed canarygrass cosechas de forraje y _100 kg para las cosechas de forraje switchgrass. El csped Panicum virgatum forraje y alfalfa tallo muestras molieron a travs de una pantalla de 2 milmetros en un molino Wiley. Las muestras de reed canarygrass molieron usando una pantalla de 1 milmetro en un molino Wiley. Muestras de biomasa posteriormente se muelen en un molino tipo cicln para pasar de una pantalla de 1 mm para el anlisis de la composicin, pero no para los experimentos de la conversin. 2.2. Composicin anlisis Un completo anlisis compositivo fue hecho para las muestras de biomasa. Se determin el contenido de nitrgeno por combustin, y se estim la concentracin de protena cruda como N_6.25 [21]. Se determin el contenido de lpidos por extraccin exhaustiva con ter dietlico [22]. cidos orgnicos fueron extrados con agua y analizados por HPLC con detector de ndice de refraccin [23]. Contenido de ceniza total se midi como prdida de peso despus de la combustin en 450 1 durante 16 horas en un horno de mufla. Principales componentes minerales en las muestras de biomasa se determinaron utilizando los procedimientos descritos por Knudsen et[24]. Carbohidratos y lignina se determinan usando un procedimiento secuencial. Carbohidratos solubles se extrajeron con 80% vol/vol etanol a 60 1 noche [25]. El sobrenadante fue analizado por HPLC para monosacridos (glucosa y fructosa) y oligosacridos (sacarosa, rafinosa y estaquiosa). Los residuos insolubles en alcohol fueron extrados con agua a 1 4 durante la noche para quitar fructanos [25]. Fructanos en el sobrenadante del extracto acuoso se determinaron utilizando el ensayo de Cetosa de Boratynski [26]. El residuo insoluble en agua fue tratado con aamylase termoestable y amiloglucosidasa en 0.1 M tampn de acetato, pH 5, para liberar la glucosa del almidn[27]. Suficiente 95% vol/vol etanol aadi para alcanzar una concentracin de alcohol de 80%, despus de lo cual el sobrenadante fue quitado y se analizaron por HPLC para la glucosa liberada del almidn. El crudo restante, residuo de la pared celular de alcoholinsoluble fue sometido a una hidrlisis de cido sulfrico de dos etapas mediante el mtodo de fibra diettica Total de Uppsala [27]. Una alcuota de la primera etapa de la hidrlisis cida se analiz para cidos urnicos [28], utilizando cido galacturnico como el estndar de referencia de cido glucurnico y alfalfa como el estndar para las dos hierbas. Azcares neutros de la hidrlisis cida de dos etapas se analizaron como derivados de la

alditolacetate por la GC-FID. El residuo insoluble en cido proporciona la estimacin de concentracin de lignina Klason despus de la correccin para la ceniza. Tambin se analizaron las muestras de biomasa de celulosa, hemicelulosa y lignina utilizando el sistema de fibra detergente[29]. Fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente cido (ADL) y lignina detergente cido (ADL) determinaron secuencialmente mediante el mtodo de la bolsa de filtro Ankom (Ankom Technology Corporation, Fairport, NY) [30]. Contenido de la celulosa se calcul como ADF menos ADL y hemicelulosa como la diferencia entre los valores de FDN y FDA. Contenido de energa bruta de las muestras de biomasa se determin por calorimetra de bomba utilizando cido benzoico como el estndar. 2.3. Diluir pretratamiento cido Tratamiento previo de diluir-cido dos mtodos se evaluaron; 121 1 en autoclave y 1 de 150 en un reactor de la pipa. Muestras de la planta (2 g) se mezclaron con 18 ml de solucin de cido sulfrico diluido (02.5% peso/vol) en un frasco de vidrio con una tapn de rosca tapa y calentar durante 1 hora en un autoclave a 121 1; el autoclave con ventilacin dentro de 10 minutos despus del fin del ciclo. Alternativamente, las muestras de la planta fueron pretratadas con reactores de tubos de acero y un bao de arena fluidizado calefaccin como se describi anteriormente [31]. Cada muestra de planta (2 g) se mezcl con 18 ml de una solucin de cido sulfrico diluido en un reactor de la pipa. Las muestras se calienta a 150 1, se incubaron durante 20 minutos y rpidamente enfriadas hundiendo el reactor en un bao de agua fra; el tiempo necesario para calentar las muestras fue de aproximadamente 10 minutos. Los jarabes resultantes de los dos pretratamientos de cido diluido se subsampled y se analizaron para carbohidratos solubles monomricas y totales. El sirope restante y residuos slidos de pretratamiento fueron enzimticamente hidrolizados. 2.4. Enzimtica hidrlisis Una versin modificada del procedimiento analtico NREL laboratorio 9 se utiliz para determinar la digestibilidad de la celulosa[32]. cido-pretratados muestras se diluyeron con 10 ml de agua, neutralizado con KOH de 4 M a pH 4.5 y protegido por agregar 2,5 ml de cido ctrico de 1 M (pH 4.8). Los contenidos fueron trasladados a un erlenmeyer usando dos lavados de 7,5 ml con agua para asegurar la transferencia completa de slidos de 125 ml. Celulasa (1 ml) y timol (40 ml de una solucin de 50gl_1 en etanol al 70% vol/vol) fueron agregados y los contenidos se incubaron durante 72 h en una incubadora de coctelera en 45 1 y 125 rpm. La preparacin de la celulasa utilizada fue una mezcla de igual volumen de 1.5L Celluclast y 188 b- glucosidasa (Novozyme, Dinamarca). La mezcla de la celulasa tena una actividad de 50 ml_1 de unidades de papel de filtro, como es medido por el procedimiento anteriormente descrito de Ghose [33]. Sobrenadantes de incubacin se analizaron para carbohidratos solubles. 2.5. Medicin de azcares liberados Totales carbohidratos solubles se analizaron por HPLC, despus de ser hidrolizado por tratar con 2 M TFA durante 60 min a 100 1[34]. Se analizaron muestras de azcares y cido actico usando un HPLC equipado con una columna de cidos orgnicos (Bio-Rad Laboratories, CA) y un detector de ndice de refraccin, como se describi anteriormente [31]. 2.6. Estadstica Composicin todos los anlisis se realizaron por triplicado, y los datos fueron corregidos a una base de 100% de materia seca (MS). Porque haba slo una muestra de cada especie de biomasa para cada etapa de la madurez individual, anlisis estadstico de los datos composicionales no era posible. Cada muestras de forraje de biomasa fueron sometidas a 121 y 150 1 pretratamientos de cido diluido de C y la

hidrlisis enzimtica, por triplicado. Todas las muestras de la etapa de madurez para cada especie forrajera individuales fueron sometidos a tratamiento previo como un grupo, pero las siete muestras de biomasa no se ejecutaron al mismo tiempo. Se realiz un anlisis de varianza en los pretratamiento datos utilizando un diseo completamente al azar con dos factores (muestra de biomasa y mtodo de tratamiento previo). Muestra de biomasa consider al azar y mtodo de tratamiento previo era considerado fijo. Respuesta al tratamiento previo podra no ser estadsticamente comparada entre las siete muestras de biomasa porque las siete muestras no fueron tratadas simultneamente. El efecto general del mtodo de pretratamiento se evalu mediante los cuadrados medios para el trmino de interaccin. La interaccin de la biomasa muestra y mtodo de tratamiento previo se evalu mediante los cuadrados medios residuales. Se realizaron comparaciones entre los dos mtodos de tratamiento previo para muestras individuales de la biomasa mediante la prueba de diferencia menos significativa si el parmetro de interaccin fue significativo en el anlisis de varianza (Po0.05). En la presentacin de los resultados, diferencias estadsticamente significativas de (Po0.05) estn indicadas como tal. Se determinaron los coeficientes de correlacin de Pearson y Spearman entre los rasgos de respuesta para el tratamiento previo de cido diluido y con la composicin de las muestras de biomasa. 3. Resultados 3.1. Composicin de la biomasa Como era de esperar, cada una de las tres especies de biomasa tenan caractersticas de composicin, pero tambin hubo importantes similitudes entre las especies. Tallos de alfalfa (leguminosa C3) tenan las mayores concentraciones de protena cruda y cidos orgnicos de las tres especies de biomasa mientras que reed canarygrass (hierba de C3) tena ms de lpidos de etherextractable y ceniza y menos lignina Klason, que las otras dos especies (tabla 2). Switchgrass (hierba de C4) destacaba por tener la protena ms baja y concentraciones de cido orgnicas, pero el ms alto nivel de carbohidratos totales. Las concentraciones de protena, ceniza y cidos orgnicos descendi con madurez para las tres especies, mientras que concentraciones de hidratos de carbono total y lignina Klason fueron mayores en las muestras de biomasa ms maduras (tabla 2). Recuperacin total del DM por los anlisis compositivos utilizado era alto para las muestras de tallo de alfalfa (_960 g kg_1 DM), pero menor para las muestras de la hierba (889917 g kg_1 DM). Contenido de energa bruta de todas las alfalfa tallo y switchgrass muestras fueron muy similar, mientras que reed canarygrass muestras fueron inferiores (tabla 2). Madurez de las muestras de biomasa no afectan el contenido de energa bruta apreciable. Composicin de los carbohidratos totales en trminos de solubilidad, almacenamiento y fracciones de la pared celular se diferenci entre muestras de biomasa (tabla 3). Sacarosa fue la forma predominante de carbohidratos solubles en todas las muestras de forraje. Hubo una tendencia general hacia los niveles reducidos de sacarosa con vencimiento posterior, con la excepcin de que la muestra de la fase de antesis para switchgrass tena elevados niveles de sacarosa en comparacin a ambas muestras de mayor y menor edad switchgrass. Alfalfa tallos generalmente tenan mayores concentraciones de glucosa y una concentracin de fructosa que las dos hierbas. Switchgrass tena ms glucosa y fructosa en la muestra de antesis que las otras dos switchgrass muestras, con cantidades aproximadamente iguales de cada monosacrido en una muestra determinada. Por el contrario, tallos de alfalfa no tenan prcticamente fructosa, y reed canarygrass tena concentraciones similares de glucosa y fructosa en la etapa vegetativa pero fructosa seis veces ms que la glucosa en la etapa de la semilla madura. Slo pequeas cantidades de los oligosacridos rafinosa y la estaquiosa fueron detectados en las muestras de biomasa. Almidn era la forma de carbohidratos de

almacenamiento en tallos de alfalfa y switchgrass, con ms almidn en switchgrass especialmente durante la antesis. Etapa vegetativa reed canarygrass contena 35 g kg_1 DM fructanos. La cantidad de fructanos era prcticamente la misma para el estado de madurez de la semilla madura de reed canarygrass, y esta muestra tambin contena 17 g kg_1 DM de almidn (tabla 3). La cantidad total de carbohidratos no - la pared celular en las muestras de forraje presentes como soluble y carbohidratos de almacenamiento oscil entre 34 g kg_1 DM para la muestra postfrost switchgrass 116 g DM kg_1 tanto de las muestras de hierba menos maduras. Glucosa era el residuo monosacrido dominante en la fraccin de polisacridos de la pared celular de todas las muestras de biomasa forrajera, xilosa siendo el segundo ms abundante componente polisacrido (tabla 3). La relacin de la glucosa a la xilosa era aproximadamente tres a uno para tallos de alfalfa, pero era menos de dos a uno para los pastos. Las concentraciones de glucosa y xilosa aumentaron con madurez para las tres especies de biomasa. Arabinosa fue el tercero ms abundante residuo monosacrido en las muestras de la hierba, en comparacin con urnico cidos siendo de mayor abundancia en los tallos de alfalfa. Entre los componentes ms pequeos del monosacrido, alfalfa tena ms residuos de manosa y ramnosa pared celular. Madurez del forraje no tuvo ningn impacto obvio sobre composicin de monosacrido menores del material de la pared celular de cualquier especie. cidos orgnicos fueron una pequea proporcin de la DM para todas las muestras (tabla 2). cido mlico fue el cido orgnico predominante en todas las muestras de biomasa y oscil entre 14 g kg_1 DM en alfalfa de etapa del brote se debe a 3 g DM kg_1 en post-frost switchgrass. cido malnico fue ms abundante en los tallos de alfalfa (11-14 g kg_1 DM) y presente en solamente pequeas cantidades (p1gkg_1 DM) en el csped Panicum virgatum. Alfalfa tallo muestras fueron el forraje nico en el que se encontr cido maleico (3 g kg_1 DM). Ninguno o se detectaron trazas de ctrico, succnico y fumrico cidos en estas muestras de forraje. Se muestra la composicin elemental de las muestras de forraje para las macro minerales enTabla 4. Las muestras de cinco hierba contenan mucho mayores concentraciones de Si hicieron las muestras de tallo de alfalfa. Estos altos valores Si indican contaminacin del suelo posible de algunas muestras. Esto era particularmente cierto de la muestra de canarygrass de caa inmadura que tambin contiene altas concentraciones de Mn (257 ppm) y Fe (554 ppm) en comparacin con menores concentraciones de Mn (1380 ppm) y Fe (68177 ppm) para los otros forrajes. De los otros macrominerales, K estuvo presente en la concentracin ms alta para todas las muestras de la biomasa. Hubo una tendencia para las concentraciones de Cl, K y S en muestras de biomasa ms maduras. Concentracin de fsforo fue menor en la muestra de tallo de alfalfa ms madura en comparacin con la muestra de alfalfa menos madura, mientras que aumentaron los niveles de P para las muestras ms maduras de la hierba. Las concentraciones de sodio estuvieron por debajo de los lmites de deteccin de todas las muestras de biomasa excepto los tallos maduros de la alfalfa y el inmaduro reed canarygrass (1.76 y 2.36 g kg_1 DM). Bajas concentraciones (o60 ppm) de los minerales menores (Br, Cr, Cu, Ni, Rb, Sr, Ti, Zr y Zn) fueron encontradas en las muestras de biomasa (datos registrados slo en el texto). Concentraciones de Al, As, Ba, Cd, Co, Cs, Hg, Mo, Pb y Se V estuvieron por debajo de los lmites de deteccin. Porque todos los forrajes no fueron cultivados en los suelos de la mismos, las comparaciones entre especies para composicin mineral no son confiables. Se presentan las estimaciones de la pared celular, celulosa, hemicelulosa y concentraciones de lignina, derivadas de la fibra diettica de Uppsala y sistemas de anlisis de fibra detergenteTabla 5. Concentracin de pared de clula de vstago de alfalfa fue consistentemente menor cuando determinado como FDN que como fibra diettica. Para reed canarygrass observ el patrn opuesto para FDN vs fibra diettica, aunque las diferencias entre las estimaciones eran ms pequeas que de tallos de alfalfa.

Fibra diettica anlisis dio lugar a una estimacin algo ms baja para la concentracin de la pared celular de switchgrass previo al inicio que el valor de FDN, pero anlisis de fibra diettica dio mayor pared celular estimaciones de concentracin para las dos etapas posteriores de la madurez de switchgrass, con la diferencia entre los mtodos analticos, aumentando con la ms avanzada madurez switchgrass. Todas las muestras de forraje de biomasa, celulosa y hemicelulosa estimaciones de concentracin de detergente anlisis fueron mayores que el mtodo de fibra diettica, que ADL proporciona la concentracin de lignina muy baja estima en comparacin con lignina Klason. 3.2. Optimizar las condiciones de pretratamiento Muestras de de la biomasa de la planta fueron pretratadas con diluteacid para prepararlos para la hidrlisis con celulasa. Las muestras de biomasa fueron tratadas como 10% peso/vol mezcla y calienta a 121 1 en autoclave durante 1 h. La muestra ms inmadura para cada especie de forraje se utiliz para optimizar la carga mxima no-glucosa azcar el cido sulfrico y rendimientos de la glucosa total. El efecto del cido pH final de carga se muestra en Fig. 1. Los dos pastos demostraron perfiles similares de pH para las diferentes cargas de cido. El perfil de pH de la muestra de alfalfa fue cambiado de puesto 0.4 0.5 unidades de pH superiores a las gramneas para cargas de cido similares, indicando que esta muestra de tallo de alfalfa tena una mayor capacidad de almacenamiento en bfer. El cido ptimo cargamentos fueron fijados en los que daban el rendimiento mximo no-glucosa azcar (arabinosa, fructosa, manosa y xilosa) y mayor produccin de glucosa despus de sacarificacin pretratamiento y celulasa. Los rendimientos de azcar final de tratar cada una de las muestras de biomasa de la planta en diferentes cargas cidos seguidos de celulasa aparecen en c y Fig. 1b. Azcar mximo rinde para el csped Panicum virgatum y canarygrass aparecieron al principio de la meseta en 1,25% wt/vol cido. La produccin de glucosa de alfalfa se nivel en 1,25%, pero no-glucosa rendimiento continu en aumento hasta 2,25%. En el 2,5% de carga, la produccin total de monosacridos, excepto la glucosa, el cido fue 84%. Por lo tanto, las cargas de cido se fijaron en 1.5% para los pastos y el 2,5% de alfalfa en experimentos posteriores. En las concentraciones de cido ptimas, rendimientos de azcar glucosa no fueron 84 92% de hidratos de carbono disponibles. La recuperacin de la glucosa fue menor en comparacin con los pastos (75.483.8%) de la alfalfa (58.2% del mximo). 3.3. Azcar rinde Recuperaciones de glucosa y azcares no-glucosa despus de sacarificacin enzimtica y pretratamiento cido diluido se muestran enTabla 6. Produccin de glucosa de slo el pretratamiento diluteacid solo (y antes del tratamiento con celulasa) oscil entre 44 y 112 g DM kg_1 de la biomasa forrajera muestras. Todas las muestras de biomasa eran relativamente similares en sus rendimientos de glucosa cido lanzado a excepcin de una produccin de glucosa mayor de aproximadamente doble de la antesis etapa switchgrass. Slo se observaron diferencias entre los dos mtodos de pretratamiento cido diluido (121 vs 150 1) para tres muestras de biomasa, con las ms maduras alfalfa y reed canarygrass muestras tener rendimientos ms altos de glucosa (Po0.05) en 150 que 121 1 En contraste, la antesis etapa switchgrass tuvieron un menor rendimiento de glucosa (Po0.05) despus del tratamiento en 150 1 Produccin de azcares no-glucosa de los pretratamientos diluir cido era deprimido (Po0.05) por las condiciones de pretratamiento de temperatura ms altas para todas las muestras de biomasa excepto el switchgrass postfrost (tabla 6). El mismo patrn se observ para el lanzamiento de acetato por el tratamiento previo de cido diluido. Mientras que todas las muestras de biomasa eran similares en los rendimientos de acetato, las muestras de tallo de alfalfa rindieron menos azcares glucosa-no por el tratamiento previo de cido diluido que observa las muestras de la hierba.

Pretratamiento cido diluido en 1 150 dio lugar a rendimientos ms altos de glucosa (Po0.05) de sacarificacin enzimtica para todas las muestras de biomasa excepto la caa inmadura canarygrass (tabla 6). Dado que la mayor parte de la glucosa total liberada por el tratamiento previo de cido diluido combinado seguido por hidrlisis de la celulasa fue derivada con el paso de la celulasa en el procedimiento, no fue inesperado que el rendimiento total de la glucosa tambin fue mayor (Po0.05) por la mayor temperatura de tratamiento previo para todas las muestras de biomasa excepto el inmaduro reed canarygrass. Tallos de alfalfa y muestras de forraje de caa canarygrass eran similares en rendimiento total de la glucosa, pero switchgrass solan dar mayores rendimientos de la glucosa total. Eficiencia de liberacin de glucosa por la sacarificacin diluir cido combinada de pretratamiento y enzimtica fue mayor (Po0.05) para todas las muestras de biomasa cuando pretratados en 150 1 en lugar de 121 1 (2A Fig.). Exactamente el patrn opuesto se observ para la eficiencia de recuperacin no-glucosa de las muestras de biomasa (2B Fig.). Hubo una tendencia clara de rendimientos ms bajos de la recuperacin de la glucosa para muestras de biomasa ms maduras en comparacin con los menos maduras muestras dentro de las tres especies forrajeras. Una tendencia similar no era evidente para la eficiencia de recuperacin no-glucosa azcar. Las muestras de hierba menos maduras destacadas de las otras muestras de biomasa con una mayor eficiencia de la glucosa cuando pretratados en 121 1, mientras que el tallo de la alfalfa dos muestras fueron menores en la recuperacin de la glucosa a todas las hierbas cuando pretratados en 150 1 C. cido diluido pretratamiento en la temperatura ms alta tena un efecto desfavorable sobre la eficacia de la conversin de azcar no-glucosa y rendimiento. En promedio, el rendimiento fue 12% inferior a la temperatura ms alta. Sospechamos que esta prdida de rendimiento podra explicarse por la rpida degradacin de la fructosa durante el pretratamiento cido diluido a temperaturas elevadas. La principal fuente de fructosa para la mayora de las muestras fue disacrido sacarosa, glucosa y fructosa; sin embargo, reed canarygrass tambin contiene cantidades significativas de fructanos (tabla 2). Para probar esta hiptesis, tratamos l_1 20 g de sacarosa en las mismas condiciones de pretratamiento usado para los pastos. La sacarosa fue convertida a glucosa y fructosa antes de llegar a 150 1, y la fructosa se degrad completamente dentro de los prximo 10min (datos no mostrados). Para profundizar ms sobre la influencia de fructosa en rendimientos no-glucosa, la diferencia de rendimientos no-glucosa azcar entre las dos temperaturas de pretratamiento cido diluido se enfrenta al contenido de fructosa para cada muestra de biomasa. Hubo casi una onefor - una reduccin en la produccin de azcar noglucosa entre los 121 y 150 1 temperaturas de pretratamiento con concentracin de fructosa en todas las muestras de biomasa (r 0:97, microbiolgica). 3.4. Correlaciones entre composicin y condiciones de tratamiento previo Concentracin de lignina Klason de las muestras de biomasa se correlacion con las concentraciones de glucosa de total y de la pared celular de las muestras (r 0.94 y 0.86, respectivamente, Po0.05). La concentracin de lignina Klason no era correlacionados (P40.05) con azcares no-glucosa. Las concentraciones de glucosa y azcares glucosa-no en la pared celular fueron negativamente correlacionados (r _0:85, Po0.05), y cada una de estas fracciones se correlacion positivamente con su concentracin de azcares totales respectivos (r 0,87 y 0,85 para la glucosa y no-glucosa, respectivamente, Po0.05). Las diferencias se ha sealado anteriormente para rendimientos de azcar y eficiencias de recuperacin entre las dos temperaturas de pretratamiento cido diluido se reflejaron en las correlaciones entre estas temperaturas de pretratamiento para las caractersticas de respuesta. Correlaciones lineales entre los pretratamientos de cido diluido dos fueron significativas (Po0.05) para la glucosa liberada por el cido y no-glucosa azcar rendimientos, rendimiento total de la glucosa y eficiencia de recuperacin de la glucosa (r 0.83 0.99). Rendimiento de glucosa total

entre las dos temperaturas de pretratamiento cido diluido fue similar (r 0.84 , Po0.05). Acetato cido lanzado y glucosa celulasa-lanzado rendimientos y eficiencia de recuperacin no-glucosa azcar no fueron correlacionados (P40.05) entre las dos temperaturas de pretratamiento. Correlaciones fila de las dos temperaturas de pretratamiento slo fueron significativas para la produccin de glucosa liberada por el cido (r 0.86 , Po0.05). En ambos los pretratamientos de cido diluido, acidreleased produccin de glucosa se correlacion positivamente con la concentracin de glucosa de pared noncell (0:92 r para ambos tratamientos previos, Po0.01). Tambin, cido-lanzado no-glucosa rendimiento se correlacion con la concentracin de glucosa no total de las muestras de biomasa para ambos tratamientos previos (0:96 r para ambos tratamientos previos, microbiolgica). Concentracin de lignina Klason se correlacion negativamente con la eficiencia de recuperacin de glucosa para ambos tratamientos previos (3 Fig.). Ms all de estas relaciones constantes para ambos pretratamientos de cido diluido, se observaron patrones diferentes de la correlacin de composicin con respuesta a condiciones de tratamiento previo. Produccin de glucosa desde el paso de la hidrlisis de celulasa se correlacion negativamente con la concentracin de glucosa no - de pared celular (r _0:78, Po0.05) para el 1 de 121 diluir pretratamiento cido. Eficiencia de recuperacin de la glucosa se correlacion negativamente con la pared de clula y el total de las concentraciones de glucosa (r _0.82 y _0.78, respectivamente, Po0.05), y la eficiencia de recuperacin de azcar glucosa no se correlacion negativamente con la concentracin de la glucosa total (r _0:76, Po0.05) para el 1 de 121 diluteacid pretratamiento. En contraste, cido-lanzado no-glucosa azcar, glucosa publicado celulasa y glucosa total rendimientos se correlacionaron positivamente todo con pared celular concentracin de azcares no-glucosa (r 0.91 0.78 y 0,77, respectivamente, Po0.05) cuando fueron pretratadas muestras de biomasa en 150 1 Concentracin de lignina Klason de las muestras de biomasa se correlacion con el cido lanzado acetato rendimiento y eficiencia de recuperacin no-glucosa azcar para el 1 de 121 pretratamiento (r 0:87 y _0.84, respectivamente, Po0.05), pero no se encontraron correlaciones adicionales de la concentracin de lignina Klason con otras caractersticas de respuesta de. 4. Discusin 4.1. Comparacin de muestras de biomasa Diferencias amplia para los tres cultivos evaluados en este estudio. Switchgrass tenan ms hidratos de carbono totales sobre una base de peso que los otros cultivos de biomasa examinado, y tanto switchgrass y alfalfa tenan concentraciones ms altas de glucosa que reed canarygrass. Cabe sealar que la composicin de correos helada switchgrass es similar al reportado en la base de datos de materia prima DOE (www1.eere.energy.gov/biomass/feedstock_databases.html). Grandes cantidades de glucosa son ventajosas para la produccin de etanol porque glucosa (actualmente) puede convertir en rendimientos ms altos de etanol que la mayora de otros azcares, especialmente comparados con pentosas [35]y la glucosa es fermentada por levaduras industriales. Cosecha de forrajes ms maduros result en mayores concentraciones de glucosa de la pared celular y no-glucosa azcares lamentablemente, concentracin de lignina tambin aumentada para las muestras ms maduras. La relacin negativa de la concentracin de lignina Klason con eficiencia de recuperacin de glucosa despus de sacarificacin enzimtica y pretratamiento cido diluido imita el mismo impacto negativo de lignificacin en la digestibilidad de los forrajes por rumiantes [36]. Debido a una mayor temperatura pretratamiento mejorar recuperacin de glucosa, sistemas de produccin de etanol requiere optimizacin de composicin de la biomasa con costo de pretratamiento. Un aspecto nico de este estudio fue que caracterizaron a los carbohidratos no-pared de clula presentes en estos cultivos de biomasa de candidato. Estos azcares no-pared celular el 4.3 16.3% de los carbohidratos fermentables potencialmente en estos cultivos de biomasa. A

diferencia de los polisacridos de la pared celular, estos carbohidratos no - la pared celular son directamente fermentables sin pretratamiento spero. Sin embargo, estos carbohidratos no - la pared celular son particularmente susceptibles a la degradacin microbiana y las reacciones de Maillard-tipo durante la cosecha y almacenamiento. Como se muestra en el estudio actual para la fructosa, algunos carbohidratos no - la pared celular tambin son ms sensibles a la degradacin durante el pretratamiento cido diluido. Por lo tanto, la presencia de importantes carbohidratos no - la pared celular puede ser una consideracin importante en la seleccin y procesamiento de materias primas de biomasa. Se analizaron las muestras de biomasa por tanto el sistema de fibra diettica de Uppsala[27] y el sistema de anlisis de detergente [29]. Este ltimo es el mtodo estndar empleado para el anlisis de forrajes en el anlisis de la calidad del alimento. Como tal, hay una gran cantidad de informacin de la fibra detergente en forrajes e, igual de importante, rpidos y baratos de mtodos de anlisis. Mientras que los datos obtenidos del mtodo de la fibra detergente son buenos predictores de digestibilidad [37], encontramos las fracciones detergentes inexacta para medir la composicin de la pared celular real. El mtodo detergente sobreestimado constantemente celulosa y hemicelulosa y lignina subestimada por cantidades sustanciales. El mtodo detergente tambin sugiri que la alfalfa tuvo dos veces el contenido lignina en cualquier hierba, mientras que la medicin ms exacta de lignina Klason [38] indic que las muestras de biomasa tenan cantidades similares de lignina. Esto no es la primera vez que se ha cuestionado la exactitud del mtodo detergente [39]. Las imprecisiones asociadas con anlisis de fibra detergente incluyen prdida de polisacridos pcticos durante la extraccin de detergente neutra [39], una extirpacin incompleta de los xilanos con extraccin de detergente cida [40]y la prdida de lignina durante el paso de detergente cido [38]. Prediccin de datos de composicin de la pared celular de composicin de la fibra detergente no tuvo xito para tallos de alfalfa [41]. Por lo tanto, los datos de composicin de fibra detergente son de poco valor en evaluar el contenido de carbohidratos y lignina de materias primas de biomasa. 4.2. Recuperacin de glucosa Rendimiento total de la glucosa ms fueron influenciado por la madurez. Para todas las especies tratadas en 121 o 150 1, eficiencia de conversin de la glucosa se redujo con mayor madurez. Maduracin en plantas es acompaada por la reducida en hidratos de carbono no-de pared celular y aumento de carbohidratos estructurales y concentraciones de lignina[42]. Ambas de estas tendencias fueron observados en este estudio. Lignina se ha observado anteriormente para inhibir la degradabilidad enzimtica celulosa [43]. El mismo patrn de eficacia reducida de la recuperacin de la glucosa con concentracin elevada de la lignina se observ en el estudio actual. Mientras que la eficiencia en la que se recuper la glucosa disminuida con madurez, rendimientos de glucosa aumentaron porque las muestras de biomasa ms maduras tenan altas concentraciones de celulosa. Basados en nuestros resultados, la concentracin de lignina Klason puede utilizarse para predecir la eficiencia de recuperacin de glucosa a partir de biomasa herbcea en un sistema de conversin de diluir-cido/celulasa. Sin embargo, no se puede predecir el rendimiento total de la glucosa en un sistema de concentracin de lignina solo. Produccin de glucosa es una funcin de las concentraciones de glucosa y lignina de la muestra de la biomasa. Aunque la influencia de la madurez de cosecha en la digestibilidad del forraje por el ganado se ha demostrado repetidamente [18], esta es la primera madurez de biomasa de tiempo se ha demostrado que la influencia de recuperacin de glucosa biomasa es pretratado con cido diluido seguido celulasa. Eficiencia de conversin de glucosa fueron sustancialmente mayor para las muestras de la hierba inmaduros que observa la hierba ms madura y ambas muestras de tallo de alfalfa, reflejando la concentracin de lignina de las muestras. Todas las muestras de biomasa respondieron

positivamente para la eficiencia de recuperacin de glucosa cuando las temperaturas de pretratamiento se incrementaron de 121 a 150 1, aunque el impacto fue mayor para las muestras ms maduras de la hierba de tallos de alfalfa. No es inmediatamente aparente de la composicin de estas muestras de biomasa por qu se produjo esta respuesta diferencial, particularmente para ambas muestras de tallo de alfalfa en comparacin con la respuesta de los pastos. Se conoce que conversin de celulosa puede ser afectada negativamente por eliminacin ineficiente de hemicelulosa [aparejadas]. Sin embargo, las muestras de tallo de alfalfa contenan menos hemicelulosa que las gramneas, y eliminacin de hemicelulosa fue altamente eficiente para todas las muestras de biomasa en el estudio actual. Cuando Torget et al[46,47] evaluaron la degradabilidad de la celulosa de varias plantas herbceas anuales despus del tratamiento previo, tambin observaron que celulosa leguminosas era ms recalcitrante que hierbas. Probablemente la diferencia en la degradabilidad se relaciona con las diferencias en las estructuras de la pared celular de plantas entre los pastos y alfalfa. Lignina se distribuye ms uniformemente entre los tejidos de los pastos [17] que las legumbres [48]. Una hiptesis, no perseguida en este estudio, es que la celulosa ms resistente en las leguminosas se asocia a los tejidos particulares que contiene concentraciones elevadas de lignina. Dio cuenta de otra diferencia importante entre los tallos de alfalfa y las gramneas es que alfalfa tena una mayor capacidad de almacenamiento en bfer. cido cargamentos de 2.25% fueron requeridos para las muestras de tallo de alfalfa llegar a un pH final de _1.0 comparado con el 1,5% de cido para las gramneas. Torget et al[46] tambin observ que las legumbres tenan mayor almacenamiento en bfer capacidades de pastos. La mayor capacidad de almacenamiento en bfer de legumbres puede deberse a diferencias en la composicin. En primer lugar, las muestras de tallo de alfalfa tenan concentraciones ms altas de la protena que las gramneas. pastos [49]. Este polisacrido contiene grandes cantidades de cido galacturnico. cido galacturnico tanto protenas son buenos agentes de bfer. Teniendo en cuenta las diferencias en la degradabilidad de la celulosa y el almacenamiento en bfer, se necesita investigacin adicional para entender mejor la influencia de la estructura de la planta leguminosa y composicin en la recuperacin de azcar. 4.3. Recuperacin de azcares no-glucano Tendencias observadas para la recuperacin de azcares glucosa no eran muy diferentes a los observados para la glucosa. Eficiencia de conversin de estos azcares no parece estar influida por la madurez. Los factores importantes que determinan la produccin de azcares glucosa no fueron su concentracin en las distintas muestras de biomasa y temperatura pretratamiento. Las muestras de tallo de alfalfa tenan mucho menos cantidad de azcares nonglucose que las gramneas, y rendimientos de estos azcares eran por lo tanto mucho ms bajos. Produccin de azcares glucosa no aumenta con mayor madurez porque las concentraciones de estos azcares tambin aumentaron con madurez en todas las muestras de la biomasa. Este es el primer estudio para evaluar directamente la influencia de madurez en la recuperacin de onglucose azcares por hidrlisis del cido diluido. Si las muestras de biomasa fueron tratadas en 121 o 150 1 tuvieron una influencia significativa sobre los rendimientos de azcar no-glucosa. El rendimiento fue menor a la temperatura ms alta, que sospecha fue causada por la degradacin trmica de los azcares en la temperatura ms alta. De hecho, esta reduccin en los rendimientos en la temperatura ms alta fue altamente correlacionada con la concentracin de fructosa, ms cido lbil de los azcares. Normalmente la temperatura ptima para la produccin de glucosa a partir de celulosa es demasiado alta para la mxima recuperacin de azcares de xilano[50]. Esta tendencia estaba exasperada por la presencia de azcares no - de pared celular, en particular fructosa [51], en las muestras de biomasa evaluado en el estudio actual. La sensibilidad de fructosa a la degradacin a altas temperaturas de pretratamiento tuvo particular relevancia a reed canarygrass (hierba de C3)

porque tena dos veces el contenido de fructosa de switchgrass (hierba de C4). Otros pastos de estacin fra (C3) tambin a menudo acumulan fructosa en forma de fructanos [25] y presumiblemente sera igualmente sensibles a la degradacin de la fructosa por el tratamiento previo de cido diluido de alta temperatura. La eficacia del tratamiento previo resultados registrados aqu son comparables a los reportados en otros estudios. Torget y sus colegas informaron sobre pretratamiento cido diluido de las hierbas: csped Panicum virgatum y llorando annoni (Eragrotis curvula)[46,47]. Los rendimientos reportados para switchgrass (80-90%) fueron similares a los registrados aqu (7386%); aunque sus rendimientos no cuenta para la glucosa de los carbohidratos solubles. Lespedeza sericea de leguminosas herbceas (Lespedeza cuneata) informaron sustancialmente menores rendimientos (40%). Sin embargo, la obstinacin de la celulosa de leguminosas algo fue superada mediante el aumento de la temperatura de tratamiento previo a 180 1 C. 5. Conclusin Para las tres especies de biomasa examinadas, el rendimiento de azcares fermentables potencialmente fue el resultado de ambos variacin en la composicin de hidratos de carbono y la eficiencia de liberacin por el proceso de conversin de sacarificacin enzimtica/cido diluido. Contenido de azcares solubles fueron significativa, especialmente para los cultivos ms jvenes, y la extraccin de estos azcares antes de pretratamiento podra resultar beneficiosa. General contenido de hidratos de carbono aumenta con la madurez de la planta; sin embargo, extraer los glucanos se vuelve ms difcil con la madurez de la planta mayor. Por lo tanto, es probable que necesite ser incrementado para compensar la madurez, que puede disminuir el rendimiento de los azcares de la hemicelulosa severidad pretratamiento. Produccin de glucosa fue la mayor desde el csped Panicum virgatum y menos para la alfalfa. El rendimiento de la reduccin de la glucosa de alfalfa fue debido a su baja eficiencia de la hidrlisis de la celulosa. Sin embargo, se advirtieron a los lectores que las observaciones anteriores deben ser vistas como solamente preliminar y que conclusiones definitivas sobre estos temas requieren anlisis de grandes conjuntos de muestra de cada especie y madurez las etapas que se han cultivado en una amplia gama de condiciones ambientales. Reconocimiento Los autores agradecen a la Sra. Patricia O'Bryan, Sr. Richard Jeo y Sr. Steven Masterson por su excelente asistencia tcnica. Los autores tambin agradecen Dr. Paul Weimer para la medicin de cidos orgnicos y discusiones tiles.