En este trabajo se describe el desarrollo de una forma de dosificacin farmacutica estable para NAMI-A, una novela antimetastsica complejo

de rutenio, para la primera fase de prueba. NAMI-A sustancia frmaco fue caracterizada usando varias tcnicas de espectrometra y cromatografa.En estudios de preformulacin, se encontr que NAMI-A en la solucin acuosa no era lo suficientemente estable como para permitir la esterilizacin por calor hmedo. El efecto de varios excipientes sobre la estabilidad de la solucin de formulacin fue investigado. Ninguno de ellos proporcionan estabilidad suficiente para permitir almacenamiento a largo plazo de una solucin acuosa de NAMI-A. Por lo tanto, un producto liofilizado se desarroll. Cinco diferentes formulaciones se prepararon y se sometieron a termogravimtrico (TG) y el anlisis de los estudios de estabilidad en diferentes condiciones para el 1 ao. Degradacin mnima durante el proceso de produccin se logra con una solucin de formulacin de pH 3-4. De los cidos ensayados, slo el cido clorhdrico (HCl 0,1 mM) tanto estabiliz la solucin de formulacin y era compatible con el producto liofilizado. Este producto fue estable durante al menos 1 ao cuando se almacena a -20 C, 25 C/60% de humedad relativa (HR) y 40 C/75% de HR, y era tambin fotoestables. Palabras clave

NAMI-A ; Formulacin farmacutica ; Estabilidad

1. Introduccin NAMI-A (imidazolio trans -tetracloro (dimetilsulfxido) imidazoleruthenium (III), H 2 im [ trans -RuCl 4 (DMSO) l], la fig. 1 ( Sava y col., 1999a ) es un agente anticncer novedoso rutenio. preclnicos farmacolgico de estudios toxicolgicos y mostr actividad selectiva contra las metstasis pulmonares de tumores murinos ( Mestroni et al., 1994 , Sava y col., 1998 , Sava y col., 1999a y Sava y col., 1999b ) y baja toxicidad en ratones y perros ( Bergamo et al., 1999 ,Cocchietto y Sava, 2000 y Sava y Cocchietto, 2000 ). Su accin parece ser independiente del origen (tipo de tumor primario) y la etapa de crecimiento de las metstasis ( Bergamo et al., 1999 y Sava et al., 1999b ). NAMI-A posee ninguna citotoxicidad directa de clulas tumorales ( Sava y col., 1998 , Bergamo et al., 1999 , Sava y col., 1999b y Sava y col., 2000 ), si bien la interaccin con regulacin del ciclo celular se ha observado con una acumulacin transitoria de clulas en el G 2 / M fase. Adems, aumenta la disposicin del tejido conjuntivo alrededor de las clulas tumorales y los vasos sanguneos, reduciendo as intravasation y suministro de sangre del tumor, sino tambin evitar que las clulas tumorales de invadir circundante tejido y vasos sanguneos o linfticos ( Sava y col., 1998 , Sava y col., 2000 y Zorzet et al., 2000 ). Basndose en la actividad prometedora y perfil de toxicidad, NAMI-A fue desarrollado como un agente antimetastsico.

La figura. 1. Estructura qumica de NAMI-A, peso molecular 458,18 g / mol. Opciones Figura

El objetivo de este estudio fue desarrollar una forma estable, parenteral dosificacin farmacutica para uso en la Fase I de ensayos clnicos. La dosis inicial para estos estudios se fij en un diario de cinco veces horario de 2,4 mg / m 2 . Sin embargo, debido a que hasta 400 mg / m 2 haba sido administrado a perros, la dosis de la Fase I de los ensayos se espera que aumente sustancialmente. Por lo tanto, un contenido de unidad de dosificacin de 100 mg se considera ms adecuado para cubrir la Fase I esperado intervalo de dosis recomendado. El desarrollo de una formulacin parenteral adecuada se realiza en base a las directrices de EORTC / CRC / NCI Formulacin conjunta del Grupo de Trabajo ( Davignon et al., 1988 ). 2. Material y mtodos
2,1. Productos qumicos y materiales

NAMI-A frmaco fue suministrado por SIGEA Srl (Trieste, Italia). NAMI-A los productos liofilizados se fabricaban en casa (Departamento de Farmacia y Farmacologa, Slotervaart Hospital, Amsterdam, Pases Bajos). Agua estril para inyectables (WFI, Ecotainer ), 0,9% (w / v) NaCl (solucin salina normal) y 5% (w / v) de dextrosa se obtuvieron de B. Braun (Melsungen, Alemania). Metanol (calidad HPLC) se obtuvo de Biosolve Ltd. (Amsterdam, Pases Bajos). cido trifluorometanosulfnico, cido ctrico, acetato sdico trihidrato, cido actico 96% (v / v), fosfato dihidrgeno sdico dihidratado, di-sodio decahidrato tetraborato, carbonato de sodio (anhidro), cloruro de sodio, cido perclrico (70-72% (w / v)), grnulos de hidrxido de sodio, dihidrato de monohidrocloruro de quinina, y dimetil sulfxido (seco) fueron todos adquiridos en Merck (Darmstadt, Alemania). Dodecilsulfato de sodio se obtuvo de Fluka Chemical GmbH (Buch, Suiza), hidroxipropil-ciclodextrina (substituttion molar de 0,8) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), y manitol a partir de BUFA BV (Uitgeest, Pases Bajos). Todos los reactivos fueron de grado analtico y se utilizaron sin purificacin adicional. Excipientes y envases primarios usados en la fabricacin de NAMI-Un producto liofilizado fueron de la Farmacopea Europea III (Ph. Eur.. III) de grado. Excipientes fueron aprobadas despus del control de calidad dentro de la empresa (con base en las monografas de la Farmacopea Europea.).
2,2. 1 H resonancia magntica nuclear (RMN)

H RMN se registraron a temperatura ambiente con un instrumento Gemini-300 (RMN Varian Instruments, Palo Alto, CA, EE.UU.). La muestra se disolvi en DMSO- d 6 (2.1 mg en 0,65 ml). La lnea central de DMSO a 2,505 ppm fue utilizada como lnea de referencia.
1

2,3. Espectrometra de masas (MS)

Los espectros de masas de electropulverizacin positiva y negativa se registraron con un Fisons VG Platform II (Micromass, Manchester, Reino Unido) solo espectrmetro de masas cuadrupolar.El instrumento fue calibrado con yoduro sdico en el intervalo de m / z 100-1000. Se utiliz nitrgeno como gas nebulizador y como gas de cortina, y el voltaje del cono era 30 V.
2,4. Infrarrojos (IR) espectroscopia

Los espectros de IR de NAMI-A se registraron con un Modelo PU 9706 IR espectrofotmetro (Philips Nederland BV, Eindhoven, Pases Bajos) utilizando el bromuro de potasio (KBr) tcnica de pellet. El sedimento consisti de 2 mg NAMI-A frmaco a granel o producto liofilizado y 300 mg de bromuro de potasio. El modo de grabacin proporcin era de auto-suave y el mnimo tiempo de ciclo 8.
2,5. La luz ultravioleta / visible (UV / Vis) Espectrofotometra

Los espectros de UV / Vis se registraron con un modelo UV / VIS 918 espectrofotmetro (GBC Scientific Equipment, Victoria, Australia). Los espectros se registraron desde 800 hasta 225 nm.Las muestras se prepararon por dilucin de

las soluciones de ensayo de NAMI-A con agua destilada hasta una concentracin final de 100 mg / ml.
2,6. De alto rendimiento de cromatografa lquida (HPLC)

El sistema HPLC consisti en una bomba modelo ternario SP8800 (Productos Thermo Separation (TSP), Fremont, CA, EE.UU.), un modelo 996 fotodiodo detector array (PDA) (Waters, Milford, MA, EE.UU.) y un inyector automtico modelo SP8880 ( TSP). Los cromatogramas se procesaron utilizando software Millennium (Waters). La separacin se realiz con una columna Bondapak C18 (Waters), protegido con una columna C8 guardia (Guardia de seguridad, Phenomenex, Torrance, CA, EE.UU.). La fase mvil consisti en 0,50 mM de dodecilsulfato de sodio en metanol al 3%, se acidific a pH 2,5 con cido trifluorometanosulfnico (cido trflico).La tasa de flujo fue de 0,5 ml / min y el sistema se hizo funcionar a temperatura ambiente. La longitud de onda de deteccin fue 358 nm y el anlisis en lnea espectral se llev a cabo con el detector PDA. El volumen de inyeccin fue de 20 l. Un tiempo de ejecucin de 10 min fue empleado para las muestras patrn (curvas de calibracin y los controles de calidad), y una duracin de 30 min para las muestras bajo investigacin. Las curvas de calibracin estndar de NAMI-A soluciones en agua destilada fueron lineales ( r > 0,98) en el intervalo de concentracin de inters (10-600 g / ml). En este sistema de HPLC, NAMI-A produce un pico con un tiempo de retencin de aproximadamente 4,1 min. El mtodo ha demostrado ser indicadores de estabilidad, precisa y exacta ( Bouma et al., 2002c ).

2,7. Punto de fusin

El punto de fusin de NAMI-A se determin con un aparato de punto de Bchi B-540 de fusin (Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Suiza).
2,8. Estudios de preformulacin
2.8.1. Solubilidad y estabilidad en agua

La solubilidad de NAMI-A en agua a temperatura ambiente (21 2 C) se examin por exactamente un peso de aproximadamente 100 mg NAMI-A en un tubo de ensayo de vidrio y aadiendo agua en incrementos de 100 mu l. Despus de cada adicin, la solucin se agit durante 30 s, si no se disuelve coloc en un bao de ultrasonidos durante 15 min, y se examinaron visualmente bajo luz polarizada para la disolucin completa de NAMI-Una sustancia medicamentosa. La estabilidad de 100 g / ml de soluciones de la sustancia de frmaco en agua destilada se determin por duplicado a temperatura ambiente (21 2 C), temperatura elevada (37 2 C) y temperatura de refrigeracin (5 3 C), bajo todas las condiciones protegidas de la luz. Partes alcuotas de las soluciones bajo examen se extrajeron peridicamente y se analizaron por HPLC.Adems, UV / VIS anlisis se realiz en las mismas muestras: su absorcin se midi directamente a 390 nm y se cuantific en relacin con una curva de calibracin estndar (20-120 g / ml NAMI-A en agua destilada). Los dos mtodos de anlisis fueron demostrado ser equivalente. Las constantes de velocidad

observadas en las diversas temperaturas se calcularon a partir de las pendientes de las ln concentracin-tiempo de parcelas (multiplicada por -1).
2.8.2. pH-rate perfil

Un perfil de pH de tasa de NAMI-A en la solucin acuosa tamponada que se construy como se ha descrito previamente ( Bouma et al., 2002a ).
2.8.3. Influencia de los excipientes

La estabilidad de una 10 mg / ml solucin de NAMI-A en una solucin que contiene hidroxipropil--ciclodextrina en una proporcin molar 1:1 y 2:1 se investig por HPLC. Adems, la velocidad de degradacin de 10 mg / ml NAMI-A a pH 3 y 4 en tampn de acetato (1 y 0,1 mM, respectivamente), cido clorhdrico (HCl) (1 mM y 0,1 para el pH 3 y 4, respectivamente) o ctrico cido (1,5 y 0,15 mM para pH 3 y 4, respectivamente), se almacenaron a temperatura ambiente (21 2 C) en la oscuridad, se investig por HPLC. El efecto de la adicin de 2,5% (w / v) de manitol y / o 5% (v / v) de DMSO en la estabilidad de NAMI-A en la solucin cida (0,15 mM de cido ctrico y 0,1 mM de HCl, tanto pH 4) se investig a temperatura ambiente (21 2 C) en la oscuridad.
2.8.4. Calorimetra diferencial de barrido

Las propiedades trmicas de 5 diferentes soluciones de formulacin de NAMI-A como se describe en el "proceso de formulacin 'se examinaron mediante calorimetra

diferencial de barrido (DSC). Estos experimentos se realizaron con un DSC Q1000 6,2 V en el modo de T4 equipado con un accesorio de enfriamiento refrigerado (RCS) para bajas temperaturas (TA Instruments, New Castle (DE), EE.UU.). Las muestras se colocaron en un recipiente de aluminio, que se sell posteriormente y se medirn en un recipiente vaco como referencia. Escala de temperatura y flujo de calor se calibr con indio. Los anlisis se realizaron bajo una purga de nitrgeno a 50 ml / min. Las muestras (mg 5-10) se enfri a -50 C a una velocidad de 5 C / min, despus de lo cual se calienta a una velocidad de 2 C / min a -2 C. Posteriormente, las muestras se enfri de nuevo a -50 C y se calent a 30 C a las mismas tasas. Despus de cada etapa de enfriamiento y calentamiento, una etapa que dura 5 min isotrmico fue construido adentro Como referencia, todas las soluciones de formulacin (sin NAMI-A) se sometieron a los mismos procedimientos de DSC.
2,9. Formulacin proceso

Basndose en los resultados obtenidos en los estudios de preformulacin, cinco formulaciones diferentes de NAMI-A se prepararon mediante liofilizacin y se someti a control de calidad y estudios de estabilidad. Las soluciones de formulacin consisti en 10 mg / ml NAMI-A en: La WFI (pH 4,4), B 0,15 mM de cido ctrico (pH 3,9),

C 1,5 mM de cido ctrico (pH 2,8), D 0,1 mM de HCl (pH 3,8), E 5 mM de cido ctrico en 2,5% (w / v) de manitol (pH 2,8).
2.9.1. La liofilizacin

NAMI-A producto liofilizado se prepar aspticamente. Cada solucin de formulacin contena 10 mg / ml NAMI-A y se disolvi con agitacin a temperatura ambiente. Despus de la disolucin completa, la solucin se ajust al volumen final con la solucin de formulacin y se filtra estrilmente a travs de un 0,22 micras Millipak 40 de filtro (Millipore, Milford, MA, EE.UU.).Posteriormente, alcuotas de 10 ml se cargaron en 30 ml de tipo I vidrio viales de liofilizacin (Mnnerstdter Glaswarenfabrik, Mnnerstadt, Alemania). Siliconizados grises tapones de caucho de bromobutilo (Tipo FM 157/1, Helvoet Pharma NV, Alken, Blgica) se coloca en cada vial. Dos viales se equipado con termopares y todos los viales fueron cargados en un modelo LYOVAC GT 4 liofilizador (STERIS, Hrth, Alemania) previamente enfriada a 10 C. Los productos fueron congelados a -40 C en 1 h, despus de lo cual se aument la temperatura a -20 C en 2 h, luego se redujo a -40 C en 2 h (etapa de templado). Esta temperatura se mantuvo durante 1,5 h. Despus de este perodo, la fase de secado primario se inici mediante la creacin de un vaco de 0,2

mbar en 1 min y elevando la temperatura a -20 C en 1 h. Esta temperatura y presin se mantuvieron durante 55 h. Posteriormente, la fase de secado secundario fue iniciado por linealmente elevando la temperatura a 15 C en 5 h mientras se mantiene una presin de cmara de 0,2 mbar. Despus de alcanzar 15 C, esta temperatura del estante se mantuvo durante 2 h. Posteriormente, la presin de la cmara se redujo en 1 min a 0,02 mbar, mientras que mantiene la temperatura a 15 C. Esta temperatura y presin se mantuvieron durante otras 5 h, despus de lo cual el ciclo de liofilizacin se detuvo. Despus de la terminacin, los viales se cerraron neumticamente, y nitrgeno filtrado estril de grado mdico se aadi a levantar el vaco, y los viales fueron recuperados de la liofilizador. El producto se tap con cpsulas de aluminio y etiquetados. Controles en el proceso consisti en las pruebas de integridad del filtro, variacin de peso del volumen de llenado, y la determinacin de la concentracin de NAMI-A y biocarga antes y despus de la filtracin. Adems, la plataforma, producto, y temperaturas de condensador, as como la presin de la cmara se controlaron rutinariamente durante el proceso de liofilizacin.Slo limpia, materiales estriles, inertes y material de vidrio se utiliza en todo el proceso de fabricacin. Todas las manipulaciones se llev a cabo en una clase 100 (A) de flujo descendente gabinete dentro de una clase 100 (B) Habitacin limpia (interflujo, Wieringerwerf, Pases Bajos).Cuenta con aire de partculas en las reas crticas y la contaminacin microbiolgica de

rea y el personal fueron monitoreados durante el proceso de fabricacin. Fabricacin se realiz en cumplimiento de la buena prctica de fabricacin (GMP) ( Comisin Europea, 1997 ).
2,10. NAMI-A liofilizado
2.10.1. Control de calidad

NAMI-A los productos liofilizados se caracterizaron utilizando los mtodos descritos para la sustancia farmacolgica, as como mediante la inspeccin visual de la apariencia y el color y la determinacin de las caractersticas de la reconstitucin (velocidad de disolucin y el pH despus de la reconstitucin, la presencia de materia insoluble exterior) y contenido de humedad residual.
2,11. Estabilidad de NAMI-Un producto liofilizado
2.11.1. El anlisis termogravimtrico

Las cinco formulaciones liofilizadas fueron sometidos a termogravimtrico (TG) que emplea un anlisis TGA7 Perkin-Elmer TG analizador. Las muestras duplicadas de aproximadamente 2 mg se calentaron a 10 C / min desde 30 hasta 200 C en una atmsfera de nitrgeno.
2.11.2. Estabilidad durante el almacenamiento

NAMI-A los productos liofilizados se almacenaron a -20 2 C, 25 2 C/60 5% de humedad relativa (RH), y a 40 2 C y 75 5% de humedad relativa (ambas temperaturas elevadas en HEKK 0057 cmaras climticas obtenidas de

Weiss Technik Ltd., Buckinghamshire, Reino Unido) durante 1 ao y muestras por duplicado o triplicado fueron tomadas en diferentes momentos.Estas muestras se analizaron visualmente para caractersticas de aspecto y de reconstitucin (tasa, la presencia de sustancias extraas, y el pH despus de la reconstitucin) y se sometieron a anlisis por HPLC para determinar su contenido y pureza. Adems, al final del perodo de almacenamiento 1ao, el contenido de humedad residual se determin para muestras por duplicado en cada condicin de almacenamiento.
2.11.3. Fotoestabilidad

NAMI-A los productos liofilizados en sus contenedores primarios sometieron a pruebas de fotoestabilidad en un Suntest CPS + aparato equipado con una lmpara de xenn (NXE 1500 B) con un plato recubierto de cuarzo y vidrio de la ventana de filtro para permitir que slo la luz con una longitud de onda de 320-800 nm y un distribucin espectral similar a la ID 65 estndar, como se requiere en la directriz ICH ( ICH Directrices Q1B, 1996 ) (todos los Atlas Material Testing Technology LLC, Chicago, IL, EE.UU.). Las muestras y controles oscuros (muestras colocadas junto a las muestras expuestas envueltos en papel de aluminio) fueron expuestos por duplicado a la luz en el ms alto nivel de irradiacin (tras el paso de los filtros: 68,9 W / m 2 a <400 nm y 170 Klux a> 400 nm ). El Suntest unidad se conect a un enfriador de Suncool (Atlas) y la temperatura mnima y mxima durante la exposicin se controlaron con un termmetro mnimo-mximo (Merck). Un hidrocloruro de 2%

(w / v) de quinina dihidrato solucin sirvi como el sistema Actinomtrica para supervisar la intensidad de la luz ultravioleta (UV) en torno a 330 nm ( Yoshioka et al., 1994 ) de acuerdo con las directrices de la ICH ( ICH Directriz Q1B, 1996 ). La solucin de quinina Actinomtrica y su control se expusieron en oscuridad estndar cubetas de 1 cm de cuarzo con dos lados helados y ajustada PTFE tapas (4 ml de volumen total, HELLMA GmbH y Co., Mllheim, Alemania). 3. Resultados y discusin
3,1. Caracterizacin de NAMI-A frmaco

Los resultados de la caracterizacin de NAMI-Una sustancia medicamentosa se muestran en laTabla 1 . Los resultados son indicativos de la estructura de NAMI-A.
Tabla 1. Identificacin y caracterizacin de NAMI-Una sustancia medicamentosa (Lot O9800905) Mtodo analtico Apariencia Punto de fusin 1 H RMN espectroscopia (DMSO- d 6 ) Resultados Naranja en polvo cristalino de color rojo 172-174 C Asignaciones propuestas: = 14,16 ppm ImH + H 1 y H 3 ; 9,09 ppm = ImH + H 5 ; 7,73 ppm = ImH + H 2 y H 4 , -2,45 ppm = Im Ru H 5 ; -6 ppm = Im Ru H 2 o H 4 ; esta seal es muy amplio y apenas visible por encima de la lnea de base; no otra seal se observ para el protn restante, probablemente debido a que la seal correspondiente fue an ms amplia -13, 39 ppm = CH DMSO 3 's Frmula molecular: M = C 8 H 15 Cl 4 N 4 Orus, espectro de iones positivos (los valores para las seales ms abundantes en un clster se dan): m / z 597,9: [M +2 ImH] + ; 528,1: [M + ImH] + ; 491,9: [M + ImH] + -HCl, espectro de iones negativos: m / z 439,1: m / z 371 + Im, 371 siendo NAMI-A en la que ha sido uno Cl sustituido por OH; este puede estar presente como una impureza, o puede formarse durante el proceso de ionizacin; 389,9: [M-ImH] - 371.0: ver 439,1; 355,0: [MImH] - Cl; 321,9: [M-ImH] - Im-; 287.0: [M-ImH] - Im-Cl-; 243,9: [M-

MS

Mtodo analtico Resultados ImH] - DMSO-Im-; 209,0: [M-ImH] - Im--Cl-DMSO Espectroscopia Bandas caractersticas de absorcin (aproximadamente): 3340 cm: IR amina por estiramiento; 3150-3100 por cm: aromtico de estiramiento (imidazol); 2980-2900 por cm: CH 3 ; 1570 se extiende por cm: deformacin amina; 1540-1480 por cm: aromtico estiramiento (imidazol); 1440-1370 por cm: CH 3 deformacin grupo; 1330-1280 por cm: C estiramiento N; 1159 por cm: S O estiramiento; 830 por cm: aromtico C H deformacin (imidazol) El anlisis por t R = 4,1 min, pureza> 99,0% HPLC UV / Vis Mximos de absorcin a 288, 390 y 452 nm Opciones de tabla

3,2. Estudios de preformulacin

3.2.1. Solubilidad y estabilidad en agua

NAMI-A es soluble en agua (hasta 50 mg / ml). Sin embargo, cuando se disuelve en agua, NAMI-A se degrada rpidamente ( t 90 aproximadamente 5 horas a 20-22 C). Degradacin sigue (pseudo-) cintica de primer orden, como se indica por la linealidad de las parcelas del logaritmo natural de NAMI-Una concentracin frente al tiempo ( r 2 > 0,92, medida durante 24 h, los siete puntos en el tiempo). fig. 2 , que muestra el grfico de Arrhenius para NAMI-A en agua, demuestra que por cada aumento de 10 C en la temperatura, la velocidad de reaccin constante aproximadamente triples. Tras la degradacin, el pH de una solucin acuosa de NAMI-A cadas desde inmediatamente despus de la preparacin a aproximadamente 3,5 en 54 h (Bouma et al., 2002a ).

La figura. 2. Arrhenius parcela para NAMI-A en agua (pH 5). Opciones Figura

La figura. 3 muestra el perfil de pH de tasa de NAMIA. Como se ha observado y discutido previamente ( Bouma et al., 2002a ), a pH cido, la degradacin de NAMI-A en solucin acuosa a continuacin (pseudo-) cintica de primer orden, mientras que a pH neutro y alcalino, cintica de orden cero describen mejor el proceso de degradacin. NAMI-A en solucin se degrada por la sustitucin de sus ligandos. A pH neutro y alcalino, los grupos cloruro se sustituye por molculas de agua o iones hidrxido, a pH cido este tipo de degradacin se acompaa de la hidrlisis del ligando de DMSO ( Bouma et al., 2002a y Bouma et al., 2002c ). NAMI-A soluciones son ms estables entre pH 3 y 4, que requiere el uso de un acidulante para solucin formulacin NAMI-A.

La figura. 3. (A) pH-tasa perfil de NAMI-A a pH 1.5 (() pseudo-cintica de primer orden) (B) pH-tasa perfil de NAMI-A a pH 6-10 (cintica de orden cero) Opciones Figura

3.2.2. Influencia de los excipientes

El efecto de varios diferentes excipientes sobre la estabilidad de NAMI-A en solucin fue investigado ( Tabla 2 ). Adems de mejorar la solubilidad, HP--CD tambin ha sido reportado para aumentar la estabilidad acuosa de diversos compuestos mediante la prevencin de la interaccin entre las molculas de disolvente y el frmaco que se incorpora dentro de la cavidad de la ciclodextrina ( Rajewski y Stella, 1996 ). Sin embargo, HP--CD, ya sea en una relacin 1:1 o una relacin molar 2:1 con NAMI-A tuvo un efecto ligeramente negativo sobre la tasa de degradacin de NAMI-A en agua ( Tabla 2 ). Por lo tanto, su uso no se investig adicionalmente.
Tabla 2. Estabilidad de 10 mg / ml NAMI-A en diferentes disolventes con y sin adicin de excipientes cuando se almacena a temperatura ambiente en la oscuridad Solvente Agua Excipiente Estabilidad relacin de una Ninguno (pH 4,4) 1,00 La hidroxipropil--ciclodextrina 1:1 (pH 4,3) 0,94 La hidroxipropil--ciclodextrina 2:1 (pH 4,3) 0,91 1 mM (pH 2,9) 1,06 0,1 mM (pH 4,0) 1,5 mM (pH 3,2) 0,15 mM (pH 3,9) 0,15 mM 5% de DMSO (pH 4,0) 0,15 mM 2,5% de manitol (pH 4,2) 1,12 1,19 1,25 1,29 1,03

Tampn de acetato El cido ctrico

Solvente

HCl

Excipiente Estabilidad relacin de una 0,15 mM 5% de DMSO 2,5% de manitol (pH 1,27 4,0) 1 mM (pH 3,2) 1,20 0,1 mM (pH 3,9) 1,25 0,1 mM 5% de DMSO (pH 4,0) 1,31 0,1 mM de 2,5% de manitol (pH 4,2) 1,13 0,1 mM 5% de DMSO 2,5% de manitol (pH 1,27 4,1)

un
Relacin de Estabilidad, porcentaje NAMI-A permanece en disolvente bajo investigacin despus de 48 h / porcentaje NAMI-A que queda en el agua despus de 48 h.

Opciones de tabla

La adicin de tres acidificantes diferentes se examin. Ctrico y el cido actico se utiliza comnmente para reducir el pH de los productos parenterales ( Strickley, 1999 ), mientras que HCl en teora tena la ventaja adicional de que contiene cloruro, que podra reducir la velocidad de hidrlisis de los ligandos cloruro de NAMI-A. Los resultados en la Tabla 2 muestran que todos los acidificantes testeado estabilizadas NAMI-A. en solucin, y que las soluciones a pH 4 eran ligeramente ms estable que las disoluciones a pH 3 Esto es muy probablemente causado por la concentracin de los agentes acidificantes, que es ms alto para las soluciones a pH 3. Se ha demostrado previamente que el aumento de concentraciones de tampn disminuir la estabilidad de NAMI-A en la solucin ( Bouma et al., 2002a ). El cido ctrico y HCl estabilizado las soluciones en la misma medida, pero el acetato apareci para producir una solucin ligeramente menos estable. Por lo tanto, otros estudios se llevaron a cabo con ctrico y HCl.

La adicin de DMSO a soluciones que contienen ctrico y HCl adems estabilizado NAMI-A, probablemente por la reduccin de la hidrlisis del ligando de DMSO. La concentracin ptima fue de 5% (v / v) de DMSO, mientras que la adicin de cantidades ms altas no aumentar la estabilidad an ms. El manitol, un agente aportador de volumen se aplica comnmente en productos liofilizados, disminucin de la estabilidad de tamponadas NAMI-A soluciones, pero la adicin de 5% de DMSO a la solucin que contiene manitol contrarrestada su efecto negativo. A partir de los resultados de la estabilidad, se concluy que ninguna de las soluciones examinadas son adecuados para la esterilizacin por (hmedo) de calor en el recipiente principal, la primera opcin en la fabricacin de un producto parenteral ( Farmacopea Europea, 1997 y rboles de decisin para la seleccin de mtodos de esterilizacin , 2000 ), o tienen farmacuticamente aceptables estanteras vida en condiciones de almacenamiento factibles. Por lo tanto, se decidi desarrollar un producto liofilizado. Cinco composiciones en solucin de formulacin (A-E) fueron investigados, todos con un NAMI-Una concentracin de 10 mg / ml. Formulacin A. Contenida NAMI-A en el agua solo, como una referencia Las otras formulaciones eran todos acidificada con el fin de estabilizar la solucin de la formulacin durante las etapas iniciales del proceso de produccin (es decir, la disolucin, la filtracin estril, el llenado y congelacin). Formulacin B y C contienen diferentes cantidades de cido ctrico para investigar la influencia de diferentes concentraciones de tampn sobre la

estabilidad del producto final. Al cido congelacin, ctrico en solucin no conduce a un cambio de pH, y en teora este cido era el acidulante ms adecuado ( Shalaev et al., 2002 ). HCl podra sublimar durante la liofilizacin y el correspondiente aumento en el pH puede inducir la degradacin de NAMI-A. Por otro lado, HCl tiene la ventaja terica de que contiene iones cloruro, proporcionando un entorno ms estable para NAMI-A. Por lo tanto, la formulacin D fue tambin investigada. Por ltimo, aunque manitol disminuy ligeramente la estabilidad de NAMI-A en la solucin, su adicin se investig, porque en estado slido que podra ser til como agente de carga. Con el fin de alcanzar un pH de 3 para esta solucin, sin embargo, una concentracin de 5 mM de cido ctrico (en lugar de 1,5 mM) se aadi. La adicin de DMSO no se investig ms como la liofilizacin de una solucin de prueba de NAMI-A DMSO que contiene 5% dio como resultado un producto con aspecto inaceptable.
3,3. Estudios de formulacin
3.3.1. Calorimetra diferencial de barrido y liofilizacin

La figura. 4 muestra los termogramas DSC de 10 mg / ml NAMI-A en las cinco soluciones de formulacin diferentes. Todas las formulaciones muestran una endoterma de fusin de hielo, con inicios extrapolados de fusin a -1,9, -1,7, -1,9, -1,0 y -3,4 C para las NAMI-A soluciones en agua, 0,1 mM de HCl, 0,15 mM de cido ctrico, 1,5 mM cido ctrico, y 2,5% de manitol en 5 mM de cido ctrico, respectivamente. Aparte de la endoterma de

fusin del hielo, hay otros eventos trmicos se pueden observar en cualquiera de las soluciones, excepto la que contiene manitol en cido ctrico (vase el inserto de la fig. 4 ). Esta solucin muestra una temperatura de transicin vtrea a -31 C, seguido por una pequea endotermia y una posterior cristalizacin exotermia a -26 C, la cual desaparece al repetir el ciclo de congelacin y calentamiento. Este comportamiento se ha descrito anteriormente para el manitol y se encontr que se producen menos ligeramente mayor (2-3 C) utilizando velocidades de congelacin similares pero ms rpido velocidades de calentamiento ( Hatley, 1991 , Su y uas, 1994 y Lueckel et al., 1998 ) .Como Her and Nail (1994) describe, los puntos medios de las transiciones se producen a altas temperaturas en las tasas de calentamiento ms rpido, y los resultados obtenidos en este trabajo confirman estos hallazgos. Todos los disolventes en blanco mostr idnticos termogramas de DSC para las soluciones de formulacin (inicios extrapolados de fusin dentro de 0.2-1.0 C de las soluciones que contienen NAMI-A), lo que indica que las propiedades de congelacin y calentamiento de las soluciones de formulacin se deben a los disolventes y la adicin que de NAMI-A no tiene influencia sobre estas propiedades. Dado que no se observaron eventos trmicos en los termogramas de DSC de las formulaciones A, D-, no son necesarias precauciones especiales se requiere en el ciclo de secado por congelacin. Sin embargo, la liofilizacin de la formulacin E requiere el uso de una etapa de recocido para asegurar la cristalizacin completa de

manitol. Como la degradacin de NAMI-A es dependiente de la temperatura, los estantes del liofilizador se pre-enfriado a 10 C para evitar la degradacin despus del proceso de produccin tanto como sea posible.

La figura. 4. termogramas de DSC 10 mg / ml NAMI-A en agua (A), 0,15 mM de cido ctrico (B), 1,5 mM de cido ctrico (C), 0,1 mM de HCl (D), y 5 mM de cido ctrico con 2,5% ( w / v) de manitol (E). Opciones Figura

3,4. NAMI-A liofilizado

La Tabla 3 muestra los resultados del control de calidad realizado despus de la fabricacin de los cinco lotes de producto liofilizado. La formulacin E se haba formado una torta slida debido a la presencia de manitol, mientras que para todas las otras formulaciones, el producto estaba presente en forma de esferas dentro de los viales. Todas las formulaciones reconstituidas inmediatamente despus de la adicin de WFI estril para formar una solucin transparente, de color amarillo oscuro, libre de materia

insoluble exterior. Las formulaciones A, B, y E tenan el mismo pH despus de la reconstitucin como las soluciones de formulacin antes de la liofilizacin. El pH de la formulacin C y D se encontr que era ligeramente superior despus de la reconstitucin. Para la formulacin D, esto podra ser debido a una cierta evaporacin de HCl despus de la liofilizacin. El contenido de humedad residual de todas las formulaciones fue baja, aunque la formulacin E contenan cantidades significativamente ms altas que los otros, probablemente debido a la presencia de manitol ( Fakes et al., 2000 ).
Tabla 3. Control de calidad de NAMI-A los productos liofilizados Prueba de partida Drogas sustancia (Lote 0200) Apariencia Rojonaranja en polvo pH despus de la reconstituci n La materia insoluble Exteriores UV / VIS anlisis Formulacin Formulacin Formulacin Formulacin Formulacin A B C D E

Esfera de color amarillo oscuro 4,4

Oscuros esferas amarillas 3,9

Oscuros esferas amarillas 3,2

Oscuros esferas amarillas 4,4

Oscuros tortas amarillas 2,8

Ninguno

Ninguno

Ninguno

Ninguno

Ninguno

max 288, max 288, 390, 452 390, 452 nm b nm b

max 288, 390, 452 nm b

max 288, 390, 452 nm b

max 288, 390, 452 nm b

max 288, 390, 452 nm b

El anlisis por HPLC A. A. t R = Identidad 4,1 min B. B. Contenido C. C. 99% Pureza una

A. t R = 4,1 A. t R = 4,1 A. t R = 4,1 A. t R = 4,1 A. t R = 4,1 min min min min min B. 93,2% B. 94,7% B. 90,0% B. 95,8% B. 94,0% C. 99,2% C. 99,2% C. 99,4% C. 99,1% C. 99,2%

Prueba de partida

Contenido de humedad residual

Drogas Formulacin Formulacin Formulacin Formulacin Formulacin sustancia A B C D E (Lote 0200) <LOD c <LOD c 0,1% 0,2% 1,2%

Formulacin A agua estril para inyeccin, la formulacin B, 0,15 mM de cido ctrico, la formulacin C, 1,5 mM de cido ctrico, la formulacin D, 0,1 mM de HCl, la formulacin E, 5 mM de cido ctrico 2.5% (w / v) de manitol. un
Pureza, porcentaje de la NAMI-un rea de pico con respecto al rea total del pico.

b
Longitud de onda de mxima absorcin.

c
Lmite de deteccin.

Opciones de tabla

3.4.1. Estabilidad de NAMI-Un producto liofilizado

3.4.1.1. Termogravimtrico (TG) el anlisis

Anlisis TG se puede utilizar como una herramienta de deteccin de incompatibilidades entre los componentes de una formulacin y para la prediccin de la estabilidad a largo plazo, aunque los estudios de estabilidad formales isotrmicas son necesarios para confirmar los resultados indicativos obtenidos por este mtodo ( Ford y Timmins, 1989 ). fig. 5 muestra los perfiles de TG de las cinco formulaciones de NAMI-A. Las formulaciones A, B, y D no

muestran prdida de peso hasta 150 C y degradacin para las tres muestras comienza a 180 C. El comportamiento de estas muestras es idntica a la de NAMI-Una sustancia medicamentosa. Para la formulacin C, el inicio del proceso de degradacin de la primera es de aproximadamente 130 C, mientras que para la formulacin E, hay una pequea prdida de peso a 80 C, seguido por el comienzo de la degradacin a 140 C. TG-IR anlisis de la evolucin de los gases de las muestras mostr que la prdida de peso a 80 C era debida a la evaporacin de agua (slo se observa en la formulacin E, que contena un mayor contenido de humedad residual de las otras formulaciones), y que el inicio de degradacin corresponde a la emisin de gas HCl. Por lo tanto, la descomposicin trmica de NAMI-Un producto liofilizado implicado la liberacin de un ligando con cloruro de emisin de HCl. La presencia de cido ctrico en una concentracin mayor que 0,15 mm y / o la presencia de manitol aparentemente disminuye la estabilidad trmica de NAMI-Una sustancia liofilizada. Por lo tanto, parece que la formulacin C y E se poda esperar que muestran una menor estabilidad en almacenamiento que los otros tres formulaciones.

La figura. 5. perfiles TG de NAMI-un producto liofilizado. Opciones Figura

3.4.1.2. Estabilidad durante el almacenamiento

Las cinco formulaciones de NAMI-A fueron estables cuando se almacenan a -20 C. La Tabla 4muestra los resultados obtenidos despus de 1 ao de almacenamiento a 25 C/60% RH y 40 C/75% de HR. La condicin de almacenamiento a largo plazo se define como 25 C/60% HR, mientras que el almacenamiento a 40 C/75% RH fue considerado como la condicin acelerada.Las formulaciones A, B, y D no mostraron ningn cambio en el contenido y pureza cromatogrfica para cualquier condicin de almacenamiento, mientras que la formulacin C y E degrada lentamente. Formulacin E demostr ser el menos estable de la formulacin, con 70% del contenido inicial que queda despus de 1 ao de almacenamiento a 40 C/75% de humedad relativa en la oscuridad. En la formulacin E, la presencia de manitol (y / o su contenido relacionado con el mayor contenido de humedad) puede haber contribuido a la

inestabilidad observada. La apariencia visual de todas las formulaciones se mantuvo sin cambios en todas las condiciones de almacenamiento, excepto la formulacin E se almacen a 40 C, que palideci en el tiempo. Estos resultados confirman las estabilidades esperados inferiores de formulaciones C y E, basados en el anlisis TG.
Tabla 4. Porcentaje NAMI-A que queda con respecto al contenido inicial de desviacin estndar despus de 1 ao de

almacenamiento Formulacin Condiciones de almacenamiento La B C D E 25 C/60% de HR, oscura 100,2 0,2 93,3 6,3 86,8 5,6 99,3 0,1 82,2 8,0 40 C/75% de HR, oscura 99,1 0,9 98,5 0,3 92,1 0,7 96,0 5,2 70,6 5,7 Opciones de tabla

Los resultados obtenidos con la formulacin C indican que la presencia de cido ctrico en una concentracin mayor que 0,15 mM desestabilizado el producto liofilizado. Por lo tanto, se decidi no usar cido ctrico como acidulante. Aunque las formulaciones A y D eran igualmente estable, la formulacin D fue elegido como la formulacin que se utiliza en la fabricacin de NAMI-un producto liofilizado, ya que la presencia de HCl estabilizado la solucin de la formulacin durante el proceso de produccin ( t 90 aproximadamente 6,3 h).
3.4.1.3. Fotoestabilidad

Las cinco formulaciones de NAMI-Un producto liofilizado demostrado ser estable cuando se expone en su envase primario a la luz de alta intensidad. No se observ diferencia entre los controles oscuros y las muestras expuestas. As, NAMI-Un producto liofilizado no es necesario almacenar en la oscuridad. Sin embargo, en solucin NAMIA es sensible a la luz y despus de la reconstitucin y dilucin, debe ser protegido de la luz ( Bouma et al., 2002b ). 4. Conclusin El desarrollo de una formulacin estable, liofilizada de NAMIA se presenta. La solucin de la formulacin debe ser acidificada con el fin de estabilizarlo durante el proceso de produccin.Fuera de las cinco formulaciones diferentes de NAMI-A, que se sometieron a pruebas de estabilidad, el producto liofilizado a partir de una solucin de formulacin que contiene 0,1 mM de HCl fue seleccionado para el desarrollo adicional. Es fotoestable y estable durante al menos 1 ao cuando se almacena a 25 C/60% de HR. Anlisis TG demostrado ser predictivo de la clasificacin de la estabilidad, con el producto en la que la prdida de peso a la menor temperatura tambin ms bajo que muestra la estabilidad a largo plazo.

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