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TEMA 6 (2). TOMA DE MUESTRAS. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA EL ANALISIS.

1. TOMA DE MUESTRAS EN ANALISIS MICROBIOLOGICOS. La toma de muestras es una operacin que consiste en separar un nmero determinado de muestras de un lote, remesa, partida, etc., con el fin de obtener unos resultados fiables. 1. Se debe obtener una muestra representativa del total. 2. La necesidad de un muestreo adecuado se hace patente cuando cabe la posibilidad de que existan grmenes patgenos o sus toxinas, distribuidos de forma escasa o irregular en un alimento o alimentos del mismo origen. 3. Es igualmente necesario para saber si una remesa de productos alimentarios cumple o no las normas microbiolgicas legales establecidas para dichos productos. 1.1. NMERO DE MUESTRA Esta en relacin con la precisin que se desee obtener en los resultados. Este nmero se suele fijar cuando se dispone de muchas unidades, sobre todo en forma de lote. En un plan de muestreo eficaz no oficial el nmero de muestras son: 100% de la poblacin Raiz cuadrada de la poblacin. 10% de la poblacin si el lote es pequeo o 1% de la poblacin si el lote es grande.

Estos dos sistemas citados se aplican a lotes procedentes de industrias cuyo control se desconoce. Si se trata de productos sometidos a un control regular, es suficiente analizar 5-10 muestras de cada lote. El nmero de muestras recogidas en el muestreo constituye la muestra de campo o poblacin. 1.2. MTODO DE MUESTREO ALEATORIO. Consiste en separar del lote un nmero de muestras calculado previamente, utilizando la tabla de nmeros al azar. Dicha tabla esta formada por columnas y filas de dgitos obtenidos mediante clculos estadsticos, y su manejo es como sigue:
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1. Establecer el nmero de muestras que se deben tomar del lote 2. Enumerar ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del producto por muestrear. 3. Elegir de una tabla un nmero al azar, coincidiendo con un dgito cualquiera o su proximidad 4. Este dgito sirve de punto de partida para obtener toda la muestra. Por ejemplo tenemos un lote que est integrado por 200 unidades, se numeraron del 1 al 200, de forma correlativa. Con un lpiz se seala un lugar cualquiera de la tabla de nmeros al azar. Supongamos que el lpiz se ha punteado un lugar que corresponde a la fila 15 y la columna 10. Este nmero es el 1 y los que le siguen en las columnas 11 y 12 son 4 y 6. En este supuesto, la unidad que se tiene que separar del lote es la marcada con el nmero 146. A continuacin se pasa a la fila 16 y a las mismas columnas 10, 11 y 12, a las que les corresponde el nmero 078, una nueva unidad que se separa del lote. Pasando a la fila 17, columnas 10, 11 y 12 figura el nmero 152, que ser tambin separado del lote. As se sigue procediendo hasta obtener el nmero de muestras sealado previamente. 1.2.1. MTODO DE MUESTREO OFICIAL SEGN LA UNION EUROPEA. Segn la unin europea hay dos clases de planes de muestreo. Plan de muestreo de dos clases, cuyo resultado ser. o Satisfactorio-. Ausencia, por lo tanto acepto. o Insatisfactorio-. Presencia. Rechazo o Ejemplo salmonella en pollos n =5 c = 0 Plan de muestreo de tres clases. Para microorganismos que estn por debajo de unos lmites, pero aceptable hasta un tope aerobios mesfilos totales o Satisfactorio-. Limite por debajo o Aceptable o Insatisfactorio-. Lmite por encima Segn los criterios microbiolgicos, se definen:

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n-. nmero de unidades que componen la muestra-. Normalmente n = 5. Algn caso histamina (en peces) en algo preparado para lactantes n =9. m-.lmite por debajo del cual todos los resultados se consideran satisfactorios. M-. lmite de aceptabilidad-. Lmite por encima del cual todos los resultados no son satisfactorios. o M = 10 m en recuentos en medio slido o M = 30 m en recuentos en medio lquido. c-.nmero de unidades de muestra que tienen valores comprendidos entre m y M.

plan de tres clases. Satisfactorio o En medio slido Todos los valores 3m o En medio lquido Todos los valores 10m Aceptable o En medio slido 3m < valor obtenido < 10m (=M) o En medio lquido 10 m < valor obtenido < 30m (=M) o Y cuando c/n sea < 2/5 Insatisfactorio o Si hay algn valor > M o O cuando c/n sea > 2/5

Aplicable para contaminacin con aerobios mesfilos, E. coli, S. aureus. Ejemplo: criterios microbiolgicos para carne picada. Grmenes aerobios mesfilos n= 5; c=2 E. coli n= 5; c=2 Salmonella n= 5; c=0 S. Aureus n= 5; c=2 m 5 105/g 50/g Ausencia en 10 g 102/g 103/g
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M 5 106/g 5 102/g

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1.3. NORMAS GENERALES PARA EL MUESTREO. Finalidad del muestreo: Obtener una muestra representativa del alimento para su anlisis inmediato. Conseguir resultados fiables sobre el estado higinico-sanitario.

Es necesario El producto, en el momento de su anlisis, rena las mismas condiciones microbiolgicas que tena al muestrear. Por lo tanto son necesarias unas pautas para conseguir la muestra idnea.

Material utilizado en el muestreo Envases: o Perfectamente limpios, secos y estriles. o Su tamao guardar relacin con la muestra que se vaya a tomar. o Han de ser hermticos e inaccesibles a cualquier contaminacin posterior a su esterilizacin. o Se pueden utilizar. Envases de vidrio de boca ancha. Envases de plstico esterilizable. Bolsas de plstico esterilizable. Envases metlicos. Instrumentos para abrir envases. o Tijeras estriles o Pinzas estriles o Cuchillos, bisturs estriles. o Cucharas, esptulas estriles. Etiquetas y material para marcar. o Etiquetas adhesivas. Etiquetas de cartulina Lpiz graso, Rotuladores permanentes Bolgrafos Equipo de esterilizacin o Autoclave o Horno por calor seco. o Mechero de gas o alcohol, estufa elctrica.
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Equipo de refrigeracin o Nevera o Cajas de plstico aislantes para muestras congeladas o refrigeradas. Lquido desinfectante. o Alcohol etlico al 70% o Algodn hidrfilo Control de temperatura: o Termmetro que marque entre -20C y 120C

1.4. CONDICIONES PARA EL MUESTREO Para obtener la muestra representativa que se va a analizar posteriormente en el laboratorio, se deben cumplir ciertas condiciones: La persona destinada a hacer el muestreo debe conocer perfectamente su finalidad e importancia. Una prctica de toma de muestras correcta influir muy positivamente en los resultados de los anlisis. En ocasiones las muestras son nicas, circunstancia frecuente cuando se trata de alimentos sospechosos de toxiinfeccin alimentaria. Si se trata de cajas grandes que contienen paquetes pequeos, se escogen al azar dichas cajas y, por el mismo procedimiento, se separan los paquetes pequeos. Cuando los envases son muy grandes y difciles de transportar, se toman aspticamente, muestras representativas y se pasan a envases estriles ms pequeos. Los alimentos a granel se muestrean tomando porciones de distintas zonas con material estril y pasndolas aspticamente, a envases esterilizados. Los frutos secos pueden estar contaminados por micotoxinas. Si el producto por muestrear tiene salida por un conducto, se desechan las primeras porciones antes de tomar la muestra. Si son principios lquidos, se agitaran en su envase y se pasarn aspticamente a recipientes estriles. Si la muestra es de agua de un grifo, se desinfecta ste con alcohol. Luego se abre y se desecha el agua que sale en las primeras porciones. Para productos slidos (queso, jamn cocido, congelados y similares) se tomaran las muestras en varias zonas con un sacabocados, unas pinzas, taladro, sierra, etc., estriles. Las muestras se introducirn aspticamente en recipientes estriles.

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Es conveniente anotar tambin la temperatura del producto y del local donde se toma la muestra. Estos datos sern remitidos al laboratorio.

1.5. ENVIO DE LA MUESTRA AL LABORATORIO. Tomadas las muestras, se empaquetan adecuadamente, segn sea su naturaleza, para evitar su rotura o deterioro. Los paquetes se etiquetaran y marcarn correctamente, cuidando de que la etiqueta quede bien fijada para que no se pierda. La etiqueta ir numerada y adecuadamente identificada para que concuerde con el informe del muestreo que debe acompaar siempre a la muestra representativa. Este informe ir junto con los datos de envase y todos los dems que puedan ser interesantes para el analista. Los datos que ms frecuentemente acompaan a la muestra son: o Nombre de la persona que ha tomado la muestra. o Nombre y direccin del lugar, empresa, etc., donde procede la muestra. o Fecha, lugar y hora en que se han tomado las muestras. o Clase de alimentos que integran las muestras. o Nombre del fabricante, importador, vendedor, comprador, etc. o Razn por la cual se ha procedido al muestreo o Nmero, tamao y marca de las unidades que forman el lote. o Forma de transporte. o Punto de origen y lugar de destino. o Fecha de embarque y llegada del lote o Mtodo de muestreo utilizado. o Temperatura del producto en el momento del muestreo. o Temperatura ambiental del almacenamiento. o Forma de transporte y condiciones del envi de las muestras al laboratorio. o Todos estos datos y otros ms que se consideren oportunos en cada caso, contribuirn a obtener unos resultados analticos correctos y coherentes y son de una ayuda extraordinaria para el microbilogo, que le ayudarn a obtener resultados en el menor tiempo posible. o Las muestras, debidamente preparadas, etiquetadas e informadas se precintarn, de tal forma que, para abrirlas, sea preciso romper el precinto.

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1.6. TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS. el tiempo entre la toma de muestras y el comienzo del anlisis en el laboratorio debe ser: o lo ms corto posible o para que en los resultados de los anlisis quede reflejada, con mayor fidelidad, la flora que, cualitativa y cuantitativamente, estaba presente en el alimento en el momento del muestreo. Respecto al transporte. o Rpido o Mantendr temperaturas de refrigeracin o congelacin para los productos que lo requieran. DE LAS MUESTRAS PARA UN ANLISIS

2. PREPARACIN MICROBIOLGICO.

Las muestras en el laboratorio, deben seguir unos pasos dentro de la sistemtica analtica, que sern establecidos por el microbilogo teniendo en cuenta la clase de alimento, procedencia y fines del anlisis. La operacin de preparacin de muestras para el anlisis microbiolgico exige, para evitar la contaminacin exterior del alimento: Unas reglas de manipulacin asptica muy estrictas La utilizacin del material y diluyentes estriles

El uso de cmaras de flujo laminar adecuadas para la toma de muestras, que suponen una gran ayuda para evitar el riesgo de cualquier contaminacin exterior. 2.1. TRITURACIN Y HOMOGENEIZACIN DE ALIMENTOS. En alimentos slidos, se prepara primero una suspensin con un diluyente estril. Esta preparacin consta de las siguientes fases: Toma de muestras para el anlisis Pesada de la muestra Diluyente Triturado de la muestra.

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2.1.1. TOMA DE MUESTRAS PARA EL ANLISIS. La fraccin de alimento debe ser siempre representativa de la totalidad de la muestra. En general, la muestra analtica debe estar constituida, aproximadamente, por 200 gramos de la misma. Para las determinaciones se utilizan 100g; el resto sirve de reserva, por si es necesario repetir el anlisis. Si el alimento est integrado por distintos componentes se tomaran fracciones representativas de cada uno de ellos en superficie y en profundidad. Se har en condiciones aspticas muy estrictas y con el material estril. o Cmaras de flujo laminar o En las proximidades de la llama de un mechero o instrumento similar. El material utilizado para la apertura de los envases estar de acuerdo con la naturaleza del producto, y debidamente esterilizado. o Abridores o Pinzas, o Bisturs o Tijeras o Esptulas

2.1.2. PESADA DE LA MUESTRA. No es fcil pesar la muestra con exactitud sin que se pueda evitar una excesiva manipulacin, la tcnica ms adecuada a seguir para esta operacin es: o Tarar el recipiente estril que se vaya a utilizar para la trituracin. o Introducir, aspticamente, una porcin de un volumen adecuado en el recipiente. o Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento. o Con una probeta graduada estril, se aadir la cantidad de diluyente estril necesaria para obtener la dilucin deseada. Si la suspensin madre debe tener un ttulo de 1:10, la cifra de pesada obtenida del alimento se multiplica por 9 y el resultado de esa multiplicacin ser el nmero de mililitros de diluyente que hay que aadir a la muestra para obtener dicha dilucin. Supongamos que la muestra ha pesado 13.5 g, entonces el volumen que ha de aadirse de diluyente ha de ser de 13.5 9 = 121.5 mililitros.

2.1.3. DILUYENTES

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No debe producir modificaciones o cambios en la flora de los alimentos que van a ser analizados Mantenga lo ms fielmente posible la flora de la muestra, sin suprimirla ni favorecer su desarrollo. Los diluyentes habitualmente usados son: o Agua de triptona con sal (tryptona wter:TW) o Agua de peptona tamponada (APT) o Solucin Ringer

Normalmente, el diluyente utilizado para la preparacin de la suspensin madre es el mismo que se utiliza para preparar las diluciones decimales. 2.1.4. TRITURADO DE LA MUESTRA. Es una operacin importante dentro de la preparacin de la muestra para su anlisis. Hay que evitar la destruccin de los grmenes por ruptura de su membrana o por un calentamiento excesivo. Adems de una perfecta trituracin de los alimentos, es necesario obtener una mezcla homognea para lograr la distribucin equilibrada de los grmenes y sus toxinas. Existen varios tipos de trituradores. o Stomacher o triturador de paletas-. Acta golpeando rtmicamente la mezcla del alimento y el diluyente que ha sido introducida previamente en una bolsa de plstico estril y especial para esta operacin. Los choques producidos por las paletas disgregan el alimento y ponen las bacterias en suspensin. o Batidoras con hlice (Ultraturrax)

2.2. PREPARACIN DE DILUCIONES DECIMALES. 2.2.1. OBJETIVO. Partiendo de una muestra y haciendo diluciones progresivas puedan realizarse recuentos microbianos posteriores en cualquiera de las diluciones realizas.

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2.2.2. MATERIAL NECESARIO. Triturador homogeneizador Tubos de ensayo de 16 x 160 mm estriles Frascos de vidrio de 100 o 250 ml estriles Agitador excntrico o rotatubos Pipetas estriles de 10 y 1 ml Tapones ajustables de aluminio

2.2.3. DILUYENTE (AGUA DE TRIPTONA(TW)) Composicin o Triptona ... 10g o Cloruro sdico 5,0 g o Agua destilada. 1.000ml Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento. Ajustar su pH a 7.2 0,2 Distribuir en tubos de ensayo a razn de 9 ml por tubo Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

2.2.4. PROCEDIMIENTO. Disolver los ingredientes del agua de triptona en al agua destilada por calentamiento y ajustar el ph a 7.2 0,2. Distribuir en tubos de ensayo de 16 x 160mm a razn de 9ml por tubo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Colocar en un vaso ancho de 800ml una bolsa de plstico especial para el Stomacher y tarar a 0 el conjunto en la balanza granatario electrnica. Tomar con pinzas estriles (flameadas a la llama) trozos de muestra, de diferentes partes de la muestra con el fin de que la toma sea representativa, y pasndola al interior de la bolsa de plstico. Pesar la muestra y ajustar en lo posible a que este peso sea un nmero entero (entre 10 y 20 g) Con una probeta estril aadir a la bolsa tantos mililitros de agua de triptona como de el resultado de multiplicar por 9 el nmero de gramos de muestra pesados. As por ejemplo, si el peso de la muestra fuese de 12,0 gramos habra que aadir 9 12 = 108 ml de TW.

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Llevar la bolsa con la muestra y el diluyente triturador. Triturar el tiempo necesario hasta total disgregacin y que presente un aspecto de homognea sin grumos (2 minutos, depende del alimento) Esta suspensin de la muestra es la primera dilucin, a la que llamaremos Dilucin 1:10 Dilucin -1 dilucin 10-1. A una serie de 3 tubos que contienen 9ml de TW, transferir a cada tubo 1ml de la suspensin madre (dilucin -1) con una pipeta estril. Mezclar durante 30 segundos en el rotatubos. De esta forma se obtiene la dilucin -2 o 1:100. La pipeta usada se deja en una probeta con agua y unos mililitros de bactericida. De la mezcla anterior y con una pipeta nueva estril, se aade 1ml de cada tubo de la dilucin -2 a otro tubo que contenga 9ml de TW. Mezclar durante 30 segundos en el rotatubos. As se obtiene la dilucin -3. Dejar la pipeta en la probeta con bactericida. Repetir esta operacin hasta conseguir las diluciones deseadas. De esta manera se obtiene la serie de diluciones decimales que servir para iniciar las determinaciones en las que sea necesario obtener recuentos.

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