FISIOLOGIA MICROBIANA - 2003/2004 Docente Responsvel, Aulas Tericas Prof. M. Conceio Loureiro Dias mcdias@isa.utl.pt Aulas Prticas Prof.

M. Malfeito Ferreira mmalfeito@isa.utl.pt AULAS TERICAS

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(21 Fev) Apresentao do programa, seminrios e avaliao. Perspectiva da Fisiologia Microbiana face Biotecnologia. Apresenta-se uma viso da Fisiologia Microbiana como integradora de vrias cincias bsicas e com capacidade de transferir os seus conhecimentos at tecnologia dos processos de fermentao e bioconverso. Procura-se transmitir a necessidade de compreender qual a vantagem para o microrganismo de dispr de determinado mecanismo biolgico que lhe permitiu sobreviver ao longo da presso da seleco natural. Explica-se que um processo biotecnolgico exige optimizao a trs nveis: da gentica, da fisiologia e da engenharia. O exemplo da produo da penicilina. Leis de Perlman para a Microbiologia Aplicada: O Microrganismo tem sempre razo um amigo um parceiro sensvel No h microrganismos estpidos Os microrganismos so (ou sero) capazes de fazer seja o que for Os microrganismos so mais espertos, mais sbios, mais energticos do que os qumicos, os engenheiros, etc. Se cuidarmos bem os nossos amigos micrbios, eles tomaro conta do nosso futuro (e viveremos felizes para sempre)...

A. N. Glazer, H. Nikaido (1998) Microbial Biotechnology, Fundamentals of Applied Microbiology. W. H. Freeman and Company, NY, pp 9-47

(21, 24, 28 Fev, 3 Mar) (Teste 10 Mar) Bioenergtica, primeiro exemplo: movimentos de ies na membrana plasmtica de leveduras Descreve-se a energtica e os gradientes de ies a nvel da membrana plasmtica em fungos e leveduras. Referem-se as especificidades dos ambientes propcios ao desenvolvimento de leveduras e o papel da ATPase plasmtica.
A. Goffeau & M. Boutry (1986) Three proton-pumping ATPases in yeast, Microbiological Sciences, 3, 164- 168

Transporte. Difuso atravs de lpidos. Transporte mediado Transduo de energia. Teoria quimiosmtica. Criao e utilizao de potenciais electroqumicos. Fosforilao a nvel de membranas

Analisam-se os mecanismos de transporte em funo da estrutura qumica dos substratos, referindo a impermeabilidade ou especificidade de transporte para os compostos hidrfilos e a permeabilidade por difuso simples atravs dos lpidos de compostos hidrfobos. Salienta-se o carcter eventualmente txico destes ltimos. A teoria quimiosmtica apresentada em termos gerais discutindo-se a transduo de energia biolgica em termos de correntes de ies, gerao de potenciais electroqumicos pelos transportadores activos primrios (metabolismo vectorial) e formas de utilizao de trabalho (em particular fosforilao oxidativa e transporte activo secundrio). Diferentes tipos de tranportadores activos secundrios. Referem-se os sistemas fotossintti cos e a bacteriorrodopsina como exemplos de geradores de fora protomotriz. Do-se exemplos de utilizaes da fora protomotriz, com algum detalhe, para o movimento de flagelos. Medio de fora protomotriz.
F. H. Harold (1986) The vital force: A study of bioenergetics (Energy coupling by ion currents pp. 5869), W. H. Freeman & Company, N. Y. D. A. Harris, (1995) Bioenergetics at a glance, Blackwell Science Ldt, London

(7, 14 Mar) Teste 17 Mar Respirao: mitocndrias e bactrias. Cadeias de transporte de electres e sntese de ATP. Gerao de energia metablica por transporte de solutos. Faz-se a comparao entre bactrias e mitocndrias. Analisa-se a energtica bacteriana em diferentes condies fisiolgicas. Estudam-se curvas de consumo de oxignio na presena de diversos inibidores metablicos. Discute-se o mecanismo de formao de ATP na ATPsintase. Discutem-se mecanismos descritos recentemente de gerao de ATP por transporte de solutos, como, por exemplo, na fermentao malolctica e na converso de histidina em histamina.
D. A. Harris, (1995) Bioenergetics at a glance, Blackwell Science Ldt, London H. C. Berg, (1998) Molecular Motors, Keeping up with the F1-ATPase, Nature, 394, 324 W. N. Konings, J. S. Lolkema & B. Poolman (1995) The generation of metabolic energy by solute uptake, Archives of microbiology, 164, 235-242

Bioenergtica global dos microrganismos eucariticos. Relaes entre organelos Discutem-se os diferentes tipos de ATPases em fungos. Descreve-se a energtica e os gradientes de ies a nvel da membrana plasmtica em fungos e leveduras. Referem-se caractersticas de alguns transportadoras na membrana plasmtica de leveduras. Descreve-se o estado de conhecimentos da energtica da membrana vacuolar, referindo propriedades da ATPase e de antiportes especficos para ies, presena de polifosfato no vacolo e complexao de ies e concentrao de aminocidos.
F. H. Harold (1986) The vital force: A study of bioenergetics (The proton circulation of fungi, algae and plants, pp.332-346), W.H. Freeman & Company,N.Y. A. Goffeau & M. Boutry (1986) Three proton-pumping ATPases in yeast, Microbiological Sciences, 3, 164- 168

(21, 31 Mar, 4, 11 Abr) Teste 14 Abr Degradao de polmeros por exoenzimas Ocorrncia de grandes fontes de carbono na natureza: celulose, amido, hemicelulose, lenhina. Enzimas hidrolticas extracelulares. Mecanismos de hidrlise em particular de celulose e amido. Aco concertada de enzimas.
G. Gottschalk (1986) Bacterial metabolism (Degradation of polymers by exoenzymes, pp. 141-145), Springer-Verlag New York Inc.

Perspectiva fisiolgica de algumas vias metablicas. Produo de etanol Abordam-se os seguintes temas: fosforilao da glucose (o sistema fosfotranferase fosfoenolpiruvato:glucose em bactrias); gliclise (medio e regulao de actividade de

enzimas glicolticas); fermentao (diversas vias fermentativas em bactrias); fermentao alcolica em leveduras (formao de produtos secundrios e balano de poder redutor); comparao entre gliclise e gluconeognese; o ciclo de Krebs enquanto produtor de nucleotdeos reduzidos para a cadeia respiratria e de intermedirios para as vias biossintticas; a via oxidativa das pentoses enquanto produtor de nucleotdeos reduzidos e de substratos para as vias anablicas; relaes entre as mitocndrias e o citoplasma.
L. Stryer (1988) Biochemistry (Cap. 18 Pentose phosphate pathway and gluconeogenesis pp. 427-433, 438-443) W. H. Freeman and Company, N. Y. A. H. Scragg (1988) Biotechnology for engineers. Biological systems in technological processes (Cap. 6 Catabolic pathways pp. 120-131) Ellis Horwood Limited, Chichester

Regulao metablica e clculo de actividades enzimticas a partir de dados experimentais A necessidade de regulao metablica a nvel geral discutida em termos de espao celular e solubilidade e viscosidade nos espaos intracelulares. A regulao pode manifestar-se atravs da actividade e da quantidade de enzimas (ou transportadores). A regulao da actividade das enzimas funo da sua natureza e como tal depende da especificidade, de parmetros cinticos, de activadores, de inibidores. A quantidade de uma enzima depende das taxas relativas de sntese e de degradao. Do-se exemplos de fenmenos de induo, represso e inactivao. Dedica-se algum cuidado ao fenmeno de crescimento diuxico dada a importncia prtica da utilizao sequencial de substratos mistos por microrganismos. Insere-se nesta altura um exerccio de elaborao de um protocolo de preparao de mutantes desreprimidos para a produo de um sistema enzimtico de interesse biotecnolgico como forma de resumir os conhecimentos de regulao metablica. O efeito de Crabtree e o efeito Pasteur so descritos com algum pormenor tendo em conta a sua elevada importncia prtica, nomeadamente nos processos de produo industrial de levedura. A terminar esta temtica faz-se uma anlise em termos ecolgicos em que se pretende "pensar" como um microrganismo e analisar as eventuais vantagens ecolgicas que advieram para os microrganismos pelo facto de possuirem alguns dos mecanismos de regulao descritos.
C. Ratledge (1991) Yeast physiology - a micro-synopsis, Bioprocess Engineering, 6, 195-203 K.-D. Entian & J. A. Barnett (1992) Regulation of sugar utilization by Saccharomyces cerevisiae, Trends in Biochemical Sciences, 17, 506-510 D. R. Berry (ed.) (1988) Physiology of Industrial Fungi, pp39-43, Blackwell Scientific Publications, London

(18 Abr, 2, 9 Mai ) Teste 12 Mai Crescimento e nutrio. Taxa de crescimento, rendimento, manuteno, rendimento em relao ao ATP Resumem-se mtodos de quantificao de biomassa microbiana e revem-se rapidamente algumas noes de nutrio; chama-se a ateno para o efeito de concentrao de nutrientes e para outros factores ambientais que regulam o crescimento. Referem-se fontes de nutrientes utilizados na indstria. Faz-se uma abordagem a alguns parmetros cinticos e energticos de crescimento: taxa especfica de crescimento exponencial, tempo de duplicao, coeficiente de rendimento, taxa especfica de transferncia de nutrientes, rendimento de ATP. Os conceitos so manipulados com vrios exemplos concretos. Analisam-se resultados numricos e aprecia-se a possibilidade de traduzirem situaes reais.
I. W. Marison (1988) Growth kinetics, In A. H. Scragg (Ed.) Biotechnology for engineers. Biological systems in technological processes (pp. 184-198) Ellis Horwood Limited, Chichester R. L. Greasham & W. K. Herber (1997) Design and optimization of growth media, em Applied Microbial Physiology, P. M. Rodes & P. F. Stanbury (eds) pp 53-74, Oxford University Press

Fisiologia da aco de conservantes cidos fracos, resistncia a conservantes

Descreve-se o mecanismo de aco de conservantes alimentares. Discutem-se formas de resistncia e adaptao a cidos fracos. As leveduras como organismos particularmente resistentes a cidos fracos.
M. C. Loureiro-Dias (1998) Effects and resistance to weak acids in spoilage yeasts, Livro de resumos do 19th International Specialized Symposium on Yeasts, (Yeasts in the Production and Spoilage of Food and Beverages), Braga M. Henriques, I. Miranda & M. C. Loureiro-Dias (1996) Role of membrane processes in yeasts tolerance to weak acid preservatives, Livro de resumos do 9th International Symposium on Yeasts, Sydney

(16, 23, 30 Mai) Teste 2 Jun Fisiologia das bactrias lcticas Faz-se uma referncia aos vrios tipos morfolgicos de bactrias lcticas. Descrevem-se as necessidades nutricionais peculiares destas bactrias. Analisam-se as vias metablicas e comparam-se do ponto de vista energtico. Discute-se o gradiente de cido lctico atravs da membrana enquanto fonte de energia. Discute-se em termos de salubridade as propriedades dos alimentos fermentados pelas bactrias lcticas. Refere-se o metabolismo de produo de aromas caractersticos de cada tipo de alimento e colocamse disposio dos alunos solues destes compostos dando-lhes a oportunidade de reconhecer aromas bem conhecidos de alguns alimentos. Apresenta-se a fermentao malolctica e discute-se a sua energtica.
T. Brock & M. Madigan (1988) Biology of microorganisms, (Lactic acid bacteria, pp. 751-754) 5. Ed., Prentice Hall S. E. Lindgren & W. J. Dobrogosz (1990) Antagonistic activities of lactic acid in food and feed fermentations, FEMS Microbiology Reviews 87, 149-164 H. J. Buckenhskes (1993) Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as starter cultures for various food commodities, FEMS Microbiology Reviews 12, 253-272 K. H. Steinkraus (Ed.) Handbook of indigenous fermented foods, pp. 277-279, Marcel Dekker.Inc, New York B. Law (1997) Biochemistry of cheese manufacturing and ripening, The Biochemist, Abril 1977, 6-10 A. Coffey, G. F. Fitzgerald & R. P. Ross (1997) Biotechnology of cheese starter cultures, The Biochemist, Abril 1977, 20-25

Vida em condies extremas: termfilos e psicrfilos, halfilos, acidfilos, alcalinfilos. Mecanismos de adaptao. Os organismos que tm a capacidade de viver em ambientes inspitos possuem mecanismos de adaptao que convm identificar, j que as possibilidades de a biotecnologia tirar deles partido so praticamente inesgotveis. So neste contexto feitas referncias, a ttulo de exemplo, polimerase de DNA de Thermus aquaticus que possibilitou a automatizao da amplificao de fragmentos de DNA a partir de um molde inicial na tcnica, hoje comum, de PCR (polimerase chain reaction) e utilizao macia de bactrias acidfilas em processos de lixiviao de minrios. A identificao de alguns mecanismos de adaptao muito recente e envolve uma boa compreenso da criao de gradientes de solutos.
M. C. Madigan & B. L. Marrs (1997) Extremophiles, Scientific American, Abril 1997, 66-71 M. T. Madigan & A. Oren (1999) Thermophilic and halophilic extremophiles, Current Opinion in Microbiology, 2, 265-269 P. Lamosa, ..., H. Santos (2000) Thermostabilization of proteins by diglycerol phosphate, a new compatible solute from the hyperthermophile Archaeoglobus fulgidus, Applied and Environmental Microbiology, 66, 1974-1979 J. Postgate (1994) The outer reaches of life. Cambridge University Press

AULAS PRTICAS
Actividade da bomba de H + da membrana plasmtica de leveduras. Medio atravs de registo de variaes de pH de suspenses celulares Medio da actividade de um transportador activo secundrio: o transporte de maltose em S. cerevisiae Deteco de respirao resistente a cianeto em leveduras. Mtodo polarogrfico de medio do consumo de O2 Preparao de um extracto enzimtico de levedura. Medio da actividade de enzimas glicolticas por acoplamento a reaces envolvendo NAD+-NADH Determinao da actividade da -glucosidase em extractos celulares. Estudo da regulao da sntese da enzima SEMINRIOS Os seminrios vo-se basear no artigo Mechanisms underlying the halotolerant way of Debaryomyces hansenii A organizao ser feita de colaborao com os alunos AVALIAO obrigatria a frequncia de 5 aulas prticas e a actividade de colaborao num grupo de trabalho para preparao de seminrios. So atribudos 13 valores parte terica, 5 valores prtica e 2 aos trabalhos/seminrios. Os testes, a realizar frequentemente nas aulas tericas, podem representar 8 valores da classificao terica. Significa que o exame final poder valer entre 13 valores, para um aluno que tenha 0 nos testes e 5 valores para um aluno que tenha capitalizado 8 nos testes. S sero aprovados alunos com nota mnima de 35% no exame terico e no exame prtico A parte prtica ser avaliada no exame final. Nesse exame os alunos podem consultar todos os protocolos e todos os apontamentos que tenham preparado durante as aulas. Datas dos testes 10 Mar, 17 Mar, 14 Abr, 12 Mai, 2 Jun Horrio de atendimento para dvidas A combinar com os alunos