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UNIVERSIDADE TIRADENTES UNIT PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS E BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

PRECIPITAO DE BIOMOLCULAS: ANLISE DAS TCNICAS UTILIZADAS EM CINCO ARTIGOS DISTINTOS

Fernada Menezes Pereira Gustavo de Brito Cardoso Jaci Lima Vilanova Neta Luana carvalho Garcia Moniky Santana Santos Osiris Ashton Vital Brazil Sabrina Maria R. J. Costa Vanina Cardoso Viana

ARACAJU, SE BRASIL JULHO DE 2011

SUMRIO

1.INTRODUO...........................................................................................................4 2.MATERIAIS E MTODOS.........................................................................................6 2.1.FONTE DA ENZIMA A SER ANALISADA.............................................................6 2.1.1.ARTIGO A: XILANASE - ASPERGILLUS SP. 5 E ASPERGILLUS SP. 44......6 2.1.2.ARTIGO B: XILANASE - BACILLUS SP. MIR 32.............................................6 2.1.3.ARTIGO C: AMILASE - GRMEN DE TRIGO....................................................6 2.1.4.ARTIGO D: PEROXIDASE BATATA DOCE...................................................6 2.1.5.ARTIGO E: BSA SORO DE ALBUMINA BOVINA..........................................6 2.2.MTODO DE PRECIPITAO UTILIZADO..........................................................6 2.2.1.ARTIGO A............................................................................................................6 2.2.2.ARTIGO B............................................................................................................7 2.2.3.ARTIGO C............................................................................................................7 2.2.4. ARTIGO D..........................................................................................................8 2.2.5.ARTIGO E............................................................................................................9 2.3.DETERMINAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA E PROTICA.......................10 2.3.1.ARTIGO A..........................................................................................................10 2.3.2. ARTIGO B.........................................................................................................10 2.3.3.ARTIGO C..........................................................................................................10 2.3.4.ARTIGO D..........................................................................................................10 2.3.5.ARTIGO E..........................................................................................................11 2.4.VISUALIZAO EM ELETROFORESE..............................................................11 2.4.1.ARTIGO A..........................................................................................................11 2.4.2.ARTIGO B..........................................................................................................11 2.4.3.ARTIGO C..........................................................................................................12 2.4.4.ARTIGO D..........................................................................................................12 2.4.5.ARTIGO E..........................................................................................................12 2.5. RESULTADOS E DISCUSSES.......................................................................13 2.5.1. ARTIGO A.........................................................................................................13 2.5.2.ARTIGO B..........................................................................................................14 2.5.3.ARTIGO C..........................................................................................................15 2.5.4. ARTIGO D.........................................................................................................15 2.5.5.ARTIGO E..........................................................................................................16

3.CONSIDERAES FINAIS.....................................................................................17 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:.........................................................................19

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: ARTIGOS ANALISADOS.........................................................................5

1. INTRODUO
Em uma anlise protemica essencial que a preparao de amostras seja realizada de forma adequada com alta concentrao de protenas, livres de sal e outros fatores pertubadores, tais como detregentes inicos, cidos nuclicos, lipdeos, entre outros, para que se obtenha resultados confiveis (FOUNTOULAKIS, JIANG el. al., 2004). A precipitao uma das operaes mais adotadas, tanto em escala de laboratrio quanto industrial, para a purificao de protenas de origem microbiana, animal ou vegetal. Devido a sua simplicidade uma tcnica bastante utilizada para a separao de protenas de uma mistura devido a simplicidade da tcnica, as tcnicas de precipitao muitas vezes utilizadas so baseadas em alta concentrao de sal ou solvente (BRECCIA et. al. 1998; PESSOA JR. & KILIKIAN, 2005). Alm da tcnica baseada na alta concentrao de sal ou solvente existem vrias tcnicas, dentre elas podemos destacar a precipitao por afinidade como tambm a precipitao por ultrafiltrao. Os mtodos de afinidade so definidos como procedimentos de purificao que utilizam uma interao especfica e seletiva de uma protena com um ligante, normalmente um substrato ou um inbidor, em casos em que a protena uma enzima, que pode ser ligada a uma matriz insolvel ou livre de soluo. A precipitao por afinidade envolve ligao da protena a ligante que co-precipita com a protena. A precipitao pode ocorrer de duas formas: primeiramente, pela ligao cruzada de protenas com ligantes, na maioria das vezes corantes, com formao de um retculo tridimensional; na segunda, pela diminuio da solubilidade de um polmero que possui um ligante de afinidade, reversivelmente solvel-insolvel, por variao na concentrao de sal, pH, temperatura, ou adio de ons metlicos. A precipitao por afinidade especfica e pode fornecer uma protena pura em uma nica etapa. A alta recuperao global geralmente atingida. um processo econmico, no requer equipamento especial e o consumo do polmero mnimo (PESSOA JR. & KILIKIAN, 2005). A ultrafiltrao um porcesso de separao por membranas, baseado na excluso pela diferena do tamanho entre as molculas, normalmente estas membranas possuem poros que variam na faixa de 10 a 1000. Esta tcnica no baseada somente no tamanho das 2001; FOUNTOULAKIS , 2002;

molculas, a interao qumica do soluto com a membrana tambm importante (CHERYAN, 1986). O presente trabalho apresenta de maneira sucinta as tcnicas de precipitao empregadas pelos autores em cinco artigos (TABELA 1) e faz uma breve anlise e discusso comparando as tcnicas de precipitao apresentadas em cada artigo.
Tabela 1: Artigos Analisados. Artigo Titulo Purification of Aspergillus SP xylanase by precipitation with A na anionic polymer Eudragit S100 B Separation of bacterial xylanase by precipitation using eudragit S100 Purification of Wheat Germ Amylase by precipitation Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis Desenvolvimento de um spot test para o monitoramento da atividade da peroxidase em um procedimento de purificao

Autores P.V. Gawande, M.Y. Kamat Javier D. Breccia, Bo Mattiasson, Faustino Sineriz Aparna Sharma, Shweta Sharma e M. N. Gupta Lei Jiang, Lin He, Michael Fountoulakis Ana Eliza Zeraik, Fernanda SantAna de Souza, Oldair D. Leite e Orlando Fatibello-Filho

Publicao Process Biochemistry 34 (1999) 577-580 Journal of Biotechnology 61 (1998) 219223 Protein Expression and Purification 18, (2000) 111-114 Journal of Chromatography A, 1023 (2004) 317-320 Quimica Nova, vol. 31 N 4, 731 734

Ano 1999

1998

2000

2004

2008

2. MATERIAIS E MTODOS

2.1.Fonte da Enzima a ser Analisada

2.1.1. Artigo A: Xilanase - Aspergillus sp. 5 e Aspergillus sp. 44. 2.1.2. Artigo B: Xilanase - Bacillus sp. MIR 32. 2.1.3. Artigo C: Amilase - Grmen de trigo. 2.1.4. Artigo D: Peroxidase Batata doce. 2.1.5. Artigo E: BSA Soro de Albumina Bovina.

2.2.Mtodo de Precipitao Utilizado

2.2.1. Artigo A

Foi adicionado Sulfato de Amnio ao filtrado da cultura at obteno de 30-80% de saturao. Aps 30 min o precipitado foi recuperado atravs de centrifugao. Em seguida o precipitado foi dissolvido em 50mM de tampo de acetato de sdio em pH 5,5 e dialisado quatro vezes quatro vezes contra 250ml do mesmo tampo a 4C por 10h. A purificao da xilanase do Sulfato de Amnio precipitado foi descrita por Gupta et al., 1 ml de xilanase foi misturado com uma soluo Eudragit S100 (0,4% em 50mM de tampo de acetato de sdio pH 5.5). Aps a incubao por 15 min a temperatura ambiente, o polmero foi precipitado em pH 4.3 por adio de cido actico 0,1 M. Lavou-se o precipitado com tampo de acetato de sdio 50 mM pH 4,3. Para a eluio o precipitado de Eudragit - ligante enzima - foi dissolvido em 2ml de tampo fosfato 0,1 M pH 7,0. Aps 5 min de agitao ocasional, o polmero foi precipitado pela adio de cido actico para baixar o pH para 4.3. A suspenso foi centrifugada a 5000 rpm por 20 min.

2.2.2. Artigo B

O processo de precipitao da xilanase deu incio com adio de 50 ml do sobrenadante de B. Amyloliquefaciens por 15 min a temperatura ambiente misturada a uma soluo de 10 ml de 10 g/l de Eudragit S100. O pH da soluo caiu para 4.0 com a adio de 4 ml de cido actico 2 M. Feito este processo o precipitado foi separado por centrifugao a 4300g por 15 min e logo em seguida lavado com tampo de acetato de sdio 10mM com pH 4.5 e centrifugado novamente a 4300g por 15 min. A eluio do precipitado foi feita em duas condies: a) precipitado dissolvido em 7,5 ml de 0,2 M de Tris-HCL, tampo pH 7.5, seguido pela adio de 7.5 ml de NaCl, 0,4 % (v/v) de Triton X -100 em 0.2M de tampo Tris-HVL pH 7.5. b) precipitado dissolvido em 14 ml 0.2M de Tris-HCL, tampo pH 7.5 e NaCl slido e Triton X-100 (100%) adicionados para alcanar uma concetrao final de 1M e 0,2% (v/v) respectivamente. Estas solues foram incubadas durante 10min a temperatura ambiente, o pH baixou para 4.0 com aproximadamente 3,0ml de cido actico 2M. Aps 20min o precipitado foi centrifugado (esse procedimento foi repetido duas vezes). Para comprovao da precipitao foi feita uma cromatografia de excluso por tamanho.

2.2.3. Artigo C

Foram adicionados separadamente a 0,5,ml de soluo de alginato (0,2% p/v), 1mililitro de BAN 240L (9.2U) ou starchzyme (9.2U) ou amilase de grmen de trigo (9.5 U) ,em 50mM de tampo acetato pH 5.6 e 1ml de -amilase do pncreas suno (8.3 U) em 20mM de tampo Tris pH 6.9. Aps 1h de incubao com agitao contnua em banho maria a 25C o alginato, enzima-ligante alginato, foi precipitado pela adio de 0,1ml da soluo de CaCl2 1M. O precipitado foi centrifugado a 8000g por 15min a 25 C, aps 15 min de incubao a 25C. A lavagem foi feita duas vezes com 1ml de tampo de acetato 50mM, pH 5.6. A enzima foi recuperada pela precipitao do alginato com 0,1ml de CaCl2 1M.

2.2.4.

Artigo D

Foi utilizado plasma de indivduos controle com concentrao de protena de cerca de 65 mg / ml. Todos os mtodos de precipitao e ultrafiltrao foram realizados com a mesma amostra de protena e quantidade (0,8 mg), somente o fracionamento com sulfato de amnio foi realizada com 2mg do total protena. Precipitao com TCA A 12.3 L de plasma (0,8 mg) foram diludas a 200L com tampo fosfato-salina (PBS) e 40 L de TCA 60% foram adicionados ao diludo. A mistura foi incubada no gelo durante a noite e centrifugado a 10 000 g, 4 C por 30 min. O sobrenadante foi removido e 100 microlitros de acetona gelada 90% foram adicionados para lavar os pellets. A amostra foi incubada em gelo por 15 min e centrifugada como descrito acima. O sobrenadante contendo acetona foi removido e os pellets foram secos ao ar. Para eletroforese em gel 2D, o pellet foi suspenso em 200 microlitros de tampo de amostra, composta de uria 7M, tiouria 2M, Tris 20mM, pH 7,5, 2% 3 - [(cholamidopropyl) dimetilamino]-1-propanesulfonate (CHAPS), 0,4% 1,4-Ditioeritritol e uma gota de bromofenol azul e centrifugado a 10 000 g temperatura ambiente por 5 min. Precipitao com Acetona Plasma diludo a 50L com PBS. Trs volumes de 150L de acetona gelada foram adicionados a soluo e mantidos durante a noite no gelo, e centrifugado a 10 000 g, 4 C por 30 min, sobrenadante removido e o pellet foi seca ao ar. A eletroforese em gel 2D, o pellet foi suspenso em 200 microlitros de amostra buffer como acima. Precipitao com clorofrmio/metanol Diluiu-se 12,3 microlitros do plasma foi a 200 L com PBS e 0,5 ml de clorofrmio / metanol (70:30 v/v). Depois do banho de gelo, a camada inferior orgnica foi descartada. E a mistura no tubo centrifugado a 10 000 g, 4 C / 30 min, sobrenadante (cerca de 200microlitros) foi transferida para tubos Ultrafree-4 e concentrada a 50L (2000 g, 10 C). Sobre 1ml de amostra foi adicionado tampo e centrifugadas a 2000 g, 10 C at que o volume do concentrado atingiu cerca de 200 L.

Precipitao de sulfato de amnio Foi diludo 12,3L de plasma com 200L de PBS, e 132,4 mg de p de sulfato de amnio e agitadas por 10 min. Aps 2 h no gelo, centrifugou a 10 000 g, 4 C por 30 min. O sobrenadante foi removido, e 200L de acetona gelada adicionada para lavar o pellet. Depois de ficar sobre o gelo por 15 min, a mistura foi centrifugada novamente como acima. O sobrenadante foi removido e o pellet foi seca ao ar. O pellet foi suspenso em 200L de amostra. Ultrafiltrao Foram colocados 12,3 L de plasma e 1ml de 20mM Tris HCl, pH 7,5 em um dispositivo Ultrafree-4 e centrifugado a 2000 g, 10 C at que o volume atingiu cerca de 50L. Em seguida, 1 ml de tampo de amostra foi adicionado e centrifugada a 2.000 g, 10 C at que o concentrado atingiu o volume necessrio para o primeira separao (cerca de 200L). Fracionamento com sulfato de amnio Diluiu-se 30L do plasma com PBS para 500L e 88mg sulfato de amnio foi adicionado para saturao de 30%, e centrifugada a 10 000 g, 20 C por 30 min. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e foi adicionado sulfato de amnio para atingir uma saturao de 50%. As protenas no sobrenadante foram ainda fracionadas e saturadas com sulfato de amnio 90% (77 e 85 mg de sulfato de amnio foram adicionados, respectivamente).

2.2.5. Artigo E Estudos preliminares da precipitao das protenas foram realizados na presena de diferentes concentraes de saturao de sulfato de amnio. A partir destes estudos realizouse a precipitao das protenas em 100 mL da soluo de extrato bruto, em duas etapas. Na primeira etapa, ao extrato foram adicionados 24,3 g de sulfato de amnio, de modo a se obter 40% de saturao para obter uma clarificao da soluo de extrato, proveniente da precipitao dos materiais cito-plasmticos e nucleares e/ou protenas presentes. Essa soluo foi mantida a 4oC por 15 h. A seguir, o sobrenadante foi separado do precipitado por centrifugao a 5000rpm durante 5 min. O precipitado foi descartado e ao sobrenadante adicionaram-se mais 36,78 g de sulfato de amnio (85% de saturao) e a soluo foi mantida a 4 oC por mais 15 h.

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Novamente, o sobrenadante foi separado do precipitado por centrifugao a 5000rpm durante 5 min, sendo que nesta etapa o sobrenadante foi descartado e o precipitado (concentrado de protenas) foi ressuspendido em 10,0 mL de uma soluo tampo fosfato 5,0 mmol L-1 (pH 6,0), pois foi observado nos estudos preliminares que, nas concentraes entre 85 e 90% de saturao, a atividade da peroxidase no sobrenadante diminuiu cerca de 85%, quando comparada com a atividade inicial da enzima no extrato de referncia (extrato bruto), indicando que quase toda a peroxidase foi precipitada.

2.3.Determinao da Atividade Enzimtica e Protica

2.3.1. Artigo A

A atividade da xilanase foi estimada pelo mtodo do cido dinitrossaliclico descrito por Gawande e Kamat. A protena extracelular foi medida pelo mtodo de Lowry utilizando BSA como padro.

2.3.2. Artigo B

A atividade da xilanase foi estimada pela determinao da quantidade de acar reduzido, como xilose, a 50 C . A reao foi interrompida com 750 l de 3,5- cido dinitrossaliclico. O contedo protico foi determinado pelo mtodo do cido bicinchoninic usando BSA como padro.

2.3.3. Artigo C A atividade da -amilase foi estimada usando amido como substrato. A protena foi estimada de acordo com o mtodo de Bradford usando BSA como padro.

2.3.4. Artigo D

No artigo D no houve estudo de atividade enzimtica.

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2.3.5. Artigo E

A atividade da peroxidase presente no extrato bruto foi determinada utilizando-se o guaiacol como substrato. Em uma alquota de 1,0 mL de soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 (pH 6,5) foram adicionados 1,0 mL de guaiacol 15,0 mmol L-1 e 1,0 mL de perxido de hidrognio 3 mmol L-1. Aps a homogeneizao dessa soluo, adicionaram-se 50L de extrato enzimtico. Depois de 1 min de reao, a absorbncia do tetraguaiacol formado foi medida em 470 nm. Foram realizados controles (brancos) do substrato e da enzima, para verificar se estes no absorviam no mesmo comprimento de onda do produto de oxidao formado (tetraguaiacol). Onde uma unidade da atividade da peroxidase representa a quantidade de enzima que catalisa a oxidao de 1mol de guaiacol em 1 min. A atividade especfica (U/mg de protena) foi calculada pela razo da atividade da enzima (U mL-1) e o teor de protena total (mg mL1).

2.4.Visualizao em Eletroforese

2.4.1. Artigo A

A eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida com 10 % de gel de acordo com Laemmli usando uma mini unidade de eletroforese. O gel foi corado com 0,25 % de Coommassic Brilliant blue R-250 em metanol 40%. Colorao Zymogram de atividade da xilanase foi realizado fora, como descrito por Schwarz et al..

2.4.2. Artigo B

A eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida com 10 % de gel de acordo com Laemmli.

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2.4.3. Artigo C

A eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida com 12 % de gel de acordo com Hames usando BioRad Mini Protean II.

2.4.4. Artigo D

Eletroforese bidimensional (depois de dissolvido em tampo de amostra e centrifugada, o amostras foram aplicadas em IPG pH 3-10 no-linear tiras. Focando comeou a 200V e a tenso foi gradualmente aumentada para 5000V menos 3 V / min e mantida constante para mais 24 h (cerca de 180 000 KVH totalmente). O segunda-dimensional de separao foi realizada em 12% dodecilsulfato de sdio (SDS) gel de poliacrilamida. Os gis (180 milmetros 200 milmetros 1,5 mm) foram executados em 50 mA por gel, em um aparelho ISO-DALT. Aps a fixao de protenas por 2 h com metanol 50%, contendo cido fosfrico 5%, os gis foram corados com Coomassie coloidal azul por 24 h. Excesso de corante foi lavada com H2O e os gis foram digitalizadas em um DUOSCAN Agfa densitmetro (resoluo 400).

2.4.5. Artigo E

Este trabalho no utilizou em sua metodologia a anlise em eletroforese. Porm outros mtodos foram trabalhados como spot test e anlise cromatogrfica por excluso molecular, podendo ser observados a seguir. Separao cromatogrfica por excluso molecular com Sephadex G-100. Um volume de 7,0 mL do extrato concentrado foi aplicado na coluna. A eluio na coluna foi realizada empregando se tampo fosfato 10,0 mmol L-1 (pH 6,0) numa vazo de 15 mL h1. As fraes de 5,0 mL foram coletadas em tubos de ensaio, empregando o coletor de fraes automatizado. Nestas fraes foram monitoradas as concentraes de protenas por espectrofotometria no comprimento de onda de 280 nm. Porm, antes da medida da atividade da peroxidase nas

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fraes, foi realizado um spot test (anlise de toque) a fim de se verificar em quais fraes se observava a presena desta enzima. Spot test (anlise de toque) para a seleo das fraes contendo peroxidase. Este procedimento foi realizado com as 138 fraes coletadas da coluna. Em papel de filtro Whatman n 1 de 12,5 cm de dimetro, onde foram riscados quadrados de 2 x 2 cm. No centro do quadrado respectivo ao controle adicionaram-se, com o auxlio de uma micropipeta, 20,0 L de uma soluo tampo fosfato 10,0 mmol L-1 contendo guaiacol 15,0 mmol L-1 e perxido de hidrognio 3,0 mmol L-1. Nos outros quadrados repetiu-se este procedimento e, em seguida, adicionaram-se 20,0 L das fraes obtidas na etapa de purificao e esperavamse 3 min para evoluo da reao enzimtica. A presena da peroxidase era evidenciada pelo aparecimento de uma colorao alaranjada. Posteriormente, nas fraes que apontavam a presena da peroxidase, a atividade foi determinada.

2.5. Resultados e Discusses

2.5.1. Artigo A

Precipitao de protenas com sulfato de amnio resultou em um pelota/bolinha ativa como um material de partida para a purificao adicional. Esta etapa resultou em 62% e 67,5 de recuperao e 2,15, 3,7 dobro/vezes de purificao de Aspergillus sp 5 e 44 xilanase, respectivamente. Uma carga de 354,4 IU/ml e 367,9 IU/ml de Aspergillus sp 5 e 44, respectivamente, foi possvel. O Eudragit S100 precipitou 95-93% de Aspergillus sp 5 e 44 xilanase (valor total de xilanase carregado), respectivamente. Cerca de 2% de enzima ligante no especificada foi perdida durante a lavagem. Assim, cerca de 93% de Aspergilus sp 5 e 91% de Aspergillus sp 44 do total de atividade aplicada foi mantida em Eudragit S100 prcipitado. Aps completar o total de eluio purificao de Aspergilus sp 5 respectivamente. e rendimento de 85-82% com 10.8-4.08 vezes de de Aspergillus sp 44 xilanase foi alcanado,

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SDS-PAGE Eletroforese de sulfato de amnio purificado e enzimas purificadas mostraram significativa purificao. Xilanase purificada partir Aspergilus sp 5 mostrou trs e Aspergillus sp 44 duas bandas de protenas. Anlise zymogram do filtrado de cultura, o sulfato de amnio precipitado e xilanase purificada de ambas as culturas foram realizadas para estudar as mltiplas formas da xilanase. Anlise zymogram revelou que durante a purificao por sulfato de amnio precipitao e precipitao por afinidade todas as formas de xilanase foram recuperadas a partir da cultura do filtrado de cultura.

2.5.2. Artigo B

A b. Xilanase do sobrenadante de B. Amyloliquefaciens foi precipitada com o metacrilato aninico do polmero Eudragit S100 pela acidificao com cido actico. O rendimento da b. Xilanase foi mais elevado 83,8% quando eluda em 1 M NaCl slido e 0,2 % Triton X-100. Quando eluda a 2 M de NaCl e 0,4 %Triton o rendimento da enzima reduziu para 49,8%. A separao da xilanase foi monitorada por SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida. Quando aumentado o Triton X-100 na concentrao de eluio, outras protenas foram eludas do polmero produzindo uma diminuio na atividade especfica da xilanase. Por outro lado notou-se baixo rendimento da b.xilanase quando utilizado somento o NaCl como eluente. O eudragit S100 usado para precipitao da xilanase, foi comprovada por cromatografia de excluso de tamanho mostrando que mais da enzima livre na soluo do que a atividade eluida pelo polmero. Apesar da natureza inespecfica das interaes, foi possvel usar essa tcnica de precipitao como uma etapa de purificao pelo cuidado na seleo das condies de eluio. As condies usadas para recuperar a b-xilanase do polmero tambm foram compatveis com a estabilidade de enzimas. Assim, a precipitao usando Eudragit S100 pode ser uma tcnica valiosa para a ampliao de isolamento e purificao parcial de b-xilanase de B.amyloliquefaciens.

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2.5.3. Artigo C

O estudo demonstrou que a -amilse do grmen de trigo tem uma grande afinidade com a ligao de alginato. Foi verificado que a presena de CaCl2 no inibe a atividade da amilase. O aumento da concentrao do polmero acima de 0.6%, no aumentou a ligao do polmero-enzima. A incubao do precipitado alginato - enzima com 1M maltose a 4 C por 4 h deu a melhor recuperao da atividade enzimtica. Os resultados mostraram que com a precipitao inicial com utilizao do sulfato de amnio seguido de precipitao por afinidade com alginato obteve um melhor resultado na purificao. A -amilase uma enzima que amplamente utilizado para hidrlise do amido. As inmeras aplicaes da enzima em vrias indstrias tambm esto bem documentadas. A metodologia que foi utiizada pode ser til para purificar tambm amilases de outras fontes. Alginato um polmero de baixo custo de origem marinha. Ele no txico e usado em indstrias de processamento de alimentos. Da -amilase purificada pelo simples processo pode ser usado em indstrias de processamento de alimentos tambm.

2.5.4. Artigo D A precipitao utilizando TCA, acetona, e ultrafiltrao resulta em uma recuperao de protena mais elevada em comparao com sulfato de amnio e clorofrmio / metanol, que tambm foram satisfatrios. Do ponto de vista prtico, o mtodo mais fcil de executar a precipitao com TCA, embora geralmente requeira duas etapas (com precipitao TCA e remoo dos vestgios TCA com acetona). Precipitao com acetona exige maiores volumes de solventes orgnicos (Pelo menos trs vezes de volume de amostra) e inconveniente para executar se o volume da amostra original maior que 300L. Ultrafiltrao executa muito bem, no entanto, muitas vezes trabalhoso e os passos de centrifugao so geralmente demorados, e os dispositivos de filtrao so caros. Assim, os mtodos de escolha so precipitao com TCA ou acetona, onde o tempo e os custos so fatores importantes. Fracionamento de plasma com sulfato de amnio. O efeito do sulfato de amnio na remoo de protenas elevada abundncia no plasma. Albumina representa cerca de 50%, cadeias pesadas IgG 19%, serotransferrin 10% e cadeias

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leves de IgG 9% das protenas plasmticas. Os componentes de alta abundncia no pode permitir que os sinais das protenas de baixa abundncia para ser detectado em gis 2D de total de protenas plasmticas. Assim, com este simples passo a maior parte de albumina e serotransferrin pode ser removido o que leva a um aumento dos sinais dos componentes menos abundantes.

2.5.5. Artigo E

A atividade da peroxidase (U/mL) e a concentrao das protenas totais foram monitoradas pela determinao da absorbncia em 280 nm. Foram tralhadas 140 fraes, sendo que entre as fraes 51 a 138 praticamente no se observou a presena da enzima de interesse, sendo essa determinada at a frao 60. O perfil da purificao da enzima peroxidase demonstrou que as fraes que apresentaram maior atividade da peroxidase foram as fraes 34-50, que em seguida foram ento misturadas, analisadas e liofilizadas para serem empregadas como catalisadores em procedimentos analticos. Ao final do processo de pr-purificao, obteve- se um fator de purificao dessa enzima de 8,57 vezes. Evidencia-se a presena da polifenol oxidase (PPO) atravs da colorao amarela, devido oxidao do fenol pelo oxignio molecular dissolvido, produzindo 1,2 benzenodiol (catecol) e a oxidao deste produto produzindo a o-quinona.

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3. CONSIDERAES FINAIS
Nos artigos A e C verificou-se que a quantidade de polmero necessria para ter uma boa interao entre o polmero e enzima /protena de 0,4% e 0,6% respectivamente, e observouse uma baixa interao em cerca de 2% para o polmero utilizado no artigo A (Eudrgit S100) e 1% no artigo C (Alginato). Porm no artigo B a quantidade do polmero (Eudragit S100) no foi citada. Uma etapa inicial para a purificao da enzima/protena alvo nos artigos A e C foi a precipitao por sulfato de amnio que foi obtido um rendimento de 62% para o microrganismo Aspergillus sp 5 e 67.5% para o Aspergillus sp 44 no artigo A e, 95% no artigo C. A precipitao por afinidade um mtodo simples, rpido e eficiente como pde ser observado nos artigos A, B e C, nos quais foram obtidos, respectivamente, 85%; 83,8% e 72% de recuperao e fator de purificao de 10.8 para o microrganismo Aspergillus sp 5 e 4.08 para o Aspergillus sp 44 no artigo A, 4.5 no artigo B e 68 no artigo C. Vale ressaltar que o valor adquirido na recuperao aps a precipitao por sulfato de amnio, no artigo C no condiz com os valores obtidos na etapa posterior - precipitao por afinidade. Os valores de atividade especfica no artigo A foram 559.8 e 676.0 U/mg, no B 83 U/mg , no C 886.0 U/MG e no E 19,37 U/MG, sendo os resultados dos artigos A, B e C aps a eluio e o artigo E aps a cromatografia por excluso molecular. Nos artigos A, B, C e D a monitorao da separao foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida, o que demonstrou que as enzimas de interesse foram recuperadas a partir da cultura original. No artigo C o mesmo protocolo foi aplicado tambm para o isolamento e purificao da -amilase de trigo integral que foram obtidos resultados semelhantes. Portanto, esta metodologia pode ser til para purificar amilase de outras fontes.

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No artigo D a precipitao utilizando TCA e acetona foram definidos como mtodos de escolha, j que do ponto de vista prtico, so mtodos mais fceis de executar e o tempo e custo so fatores importantes. O propsito deste trabalho foi realizar uma breve anlise biliogrfica sobre precipitao a partir de cinco artigos, sendo que merece destaque o fato dos artigos A, B e C usarem mesmo microrganismo e metodologia semelhante, permitindo a comparao e anlise, considerando parmetros equiparveis entre si. O artigo D apresenta vrias tcnicas de precipitao que so comparadas entre si, embora os autores no tenham demonstrado mtodos de purificao. O artigo E apresenta informaes bastante consistentes com dados de avaliao de atividade enzimtica, concentrao de protenas, precipitao e purificao por cromatografia abordando todas as etapas de um processo de anlise de uma enzima, que caso do artigo foi a peroxidase. Quando realizamos comparao entre os artigos que apresentam trabalhos com a xylanase o artigo A aparentemente tem apresentado um bom resultado. Diante da anlise dos artigos foi possvel verificar que a depender dos objetivos do estudo e das caractersticas das biomolculas alvo deve-se considerar a escolha dos mtodos de precipitao, onde ser possvel alcanar resultados de forma mais rpida e menos custosa.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:
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