Universidad Central de Venezuela Facultad de Ciencias Escuela de Biologa Departamento de Biologa Celular Unidad Docente de Gentica Electiva 1451

Fundamentos de Gentica Molecular

Manual de Laboratorio

Autores: Dra. Palmira Guevara Lic. Riward Campelo Morillo Lic. Richard Clark Lic. Vernica Guariglia Lic. Flix Moronta Lic. Kamran Rizzolo

INDICE
1er BLOQUE Tcnicas bsicas en Gentica Molecular INTRODUCCION Prctica 1 Transformacin bacteriana Anexo 1 Genes reporteros in vivo: La protena de fluorescencia verde y vectores de clonamiento Prctica 2 Aislamiento de ADN plasmdico Minipreparacin de ADN plasmdico Prctica 3 Anlisis del ADN en geles horizontales de agarosa Prctica 4 Cuantificacin de ADN por espectrofotometra Prctica 5 Caracterizacin de plsmidos recombinantes por anlisis de restriccin Anexo 2 Patrones de restriccin esperados para pEGFP y pEYFP 2do BLOQUE Aplicacin de tcnicas de la gentica molecular al diagnstico de enfermedades hereditarias humanas INTRODUCCION Prctica 6 Anlisis de perfiles genticos humanos mediante PCR-RFLP: deteccin de una mutacin puntal o single nucleotide polymorphism (SNP) en el gen de la -globina Parte I Preparacin y tratamiento de muestras 1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal Anexo 3 Consentimiento informado Parte II Parte III Ensayos de amplificacin mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Digestin del amplicn con la enzima Bsu36 I y anlisis del patrn de restriccin. Anexo 4 Resultados esperados del diagnstico por PCR-RFLP en el gen de la -globina humana Anexo 5 Lectura: Gentica y Sociedad BIBLIOGRAFIA 54 55 60 51 44 34 37 39 42 29 32 20 26 16 15 5 5 8

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<!> GLOSARIO DE BIOSEGURIDAD DE MATERIALES PELIGROSOS<!>

cido actico (concentrado) manipular con gran cuidado. Puede causar dao por inhalacin, ingestin, o absorcin cutnea. Utilizar guantes y lentes apropiados. Utilizar dentro de una campana. Ampicilina puede causar dao por inhalacin, ingestin, o absorcin cutnea. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana. Bromuro de Etidio mutagnico poderoso y txico. Evitar inhalacin del polvo. Utilizar guantes al trabajar con soluciones de BrEt. Consultar para su descarte. Cloroformo irritante a la piel, ojos, membranas mucosas, y tracto respiratorio. Es un carcingeno votil y puede causar dao al hgado y riones. Evitar inhalacin de vapores. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana. Dodecil sulfato de sodio (SDS) es txico, irritante, y posee un alto riesgo de dao a los ojos. Puede causar dao al ser inhalado, ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana. No inhalar el polvo. Etanol puede causar dao si es inhalado, ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes apropiados. Hidrxido de sodio y las soluciones que contengan hidrxido de sodio son altamente txicas y custicas, deben ser manipuladas con mucho cuidado. Utilizar guantes apropiados y mascarilla. Todas las bases concentradas deben ser manipuladas de igual manera. Isopropanol es irritante puede causar dao al ser inhalado, inherido, o absorbido por la piel. Utilizar guates apropiados y lentes de seguridad. El vapor no debe ser respirado. Mantener alejado del calor, chispas, y la llama. Luz UV y/o radiacin UV es peligrosa y puede causar daos a la retina de los ojos. Jams se debe ver directamente la luz UV desprotegida. La luz UV es tambin mutagnica y carcinognica. Para minimizar el riesgo de exposicin, la fuente de luz UV debe ser resguardada adecuadamente. Utilizar guantes protectores adecuados al sostener materiales bajo una fuente de luz UV.

Fenol es extremadamente txico, altamente corrosivo, y puede causar quemaduras graves. Puede causar dao por inhalacin, ingestin, o absorcin cutnea. Utilizar guantes, lentes, y bata. Utilizar dentro de una campana. Enjuagar con mucha agua y lavar con agua y jabn cualquier rea de la piel que tenga contacto con el phenol. !No utilizar etanol! Tris puede causar dao si es inhalado, ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes apropiados.

1ER BLOQUE Tcnicas Gentica Molecular INTRODUCCIN

bsicas

en

La contribucin de la gentica y en particular de la gentica molecular, disciplina que nace con la publicacin del modelo de la doble hlice para la molcula de ADN propuesto por Watson y Crick en 1953, ha transformado la visin y la dimensin de las ciencias biolgicas. Esta transformacin, que conlleva el entender el funcionamiento integrado de la clula desde la molcula responsable de la herencia y los procesos que resultan de su mantenimiento y la expresin de esta informacin en el fenotipo, han tenido un impacto en todas las reas relacionadas a la biologa. Este alcance tiene dimensiones cotidianas si consideramos que la transferencia horizontal de conocimientos y tecnologas estn presentes en la agroindustria y en los nuevos medicamentos a nivel mundial. Gran parte de esta rpida transferencia tecnolgica es producto de un conjunto de metodologas de rutina del trabajo en el laboratorio conocidas como ingeniera gentica. Es posible aislar e identificar secuencias especficas de genes o fragmentos del genoma de una especie, insertarlos en vehculos o vectores de clonamiento y transferirlos y expresarlos en otra especie, fundamentalmente con objetivos asociados a la investigacin bsica. Sin embargo la inmediata aplicabilidad derivada de la relativa accesibilidad de las metodologas, incentivadas por su gran potencial de desarrollo biotecnolgico, ha empujado los lmites de la biologa molecular y sus aplicaciones fuera del mbito netamente acadmico, teniendo hoy da una marcada presencia en la medicina, el desarrollo agropecuario, el estudio de poblaciones, e inclusive la identificacin de individuos a travs del perfil de su genoma y el desarrollo de armas biolgicas. Las herramientas de la biologa molecular y el
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conocimiento generado permiten derivar aplicaciones tiles y con valor comercial que alcanzan a todos los sistemas biolgicos. El conocimiento bioqumico de los procesos asociados al funcionamiento y mantenimiento del ADN, fundamentalmente la replicacin, la transcripcin, la recombinacin, la reparacin, su empaquetamiento en los cromosomas y la segregacin durante la divisin celular, han sido la base de las metodologas utilizadas en la manipulacin de los genomas desde las primeras experiencias de clonamiento de genes en los aos 70, la secuenciacin de genomas completos durante los 90 y continan siendo punto de partida para el diseo de nuevas tcnicas de anlisis en investigacin en el siglo XXI. El dominio tecnolgico hoy permite la masificacin del anlisis con el surgimiento de nuevas disciplinas como la genmica y la protemica que investigan en masa los eventos celulares a nivel molecular. Con el objetivo de iniciar al estudiante de biologa en el proceso de construccin y adquisicin del conocimiento en la disciplina de la gentica molecular hemos diseado un manual de prcticas que complementan los conceptos discutidos en la teora. En esta primera parte, se describen las herramientas bsicas utilizadas para el anlisis gentico molecular en el quehacer diario de un laboratorio de investigacin. Estas herramientas aprovechan enzimas y reacciones qumicas que ocurren naturalmente en las clulas desde las formas de vida ms simples, tales como las clulas bacterianas y los virus, hasta clulas eucariotas. El conjunto de estas herramientas y reacciones dirigidas a la manipulacin del material gentico se conocen como tecnologa del ADN recombinante. Las enzimas ms importantes en este conjunto de herramientas son aquellas que actan sobre la misma molcula de ADN: las enzimas de restriccin que cortan el ADN en sitios especficos, las ligasas que permiten unir dos molculas de ADN o ARN, las polimerasas que sintetizan nuevas

hebras de ADN, y las transcriptasas reversas que sintetizan ADN complementario a partir de ARN. La reaccin bioqumica no-catalizada ms importante para los anlisis en la gentica molecular es la hibridacin mediante la cual ocurre el enlace de dos hebras de ADN con secuencias nucleotdicas complementarias. La hibridacin resulta de la tendencia natural de molculas de ADN o ARN cadena-sencilla complementarias para formar una doble-cadena estable. El primer bloque comprende los ejercicios de transformacin bacteriana, aislamiento de ADN plasmdico, minipreparacin de ADN plasmdico, anlisis del ADN en geles horizontales de agarosa, registro y anlisis de resultados, cuantificacin de ADN por espectrofotometra y la caracterizacin de recombinantes por anlisis de restriccin. Todas estas experiencias ponen en prctica los fundamentos y conceptos bsicos presentados en la teora e ilustrados en las referencias escogidas para su discusin. El trabajo est dirigido para que al finalizar el curso el estudiante domine los conocimientos fundamentales de la metodologa del ADN recombinante y su aporte a los progresos en la biologa molecular. interpretar una Igualmente, deber estar en capacidad de sobre esta materia, tanto en la publicacin

escogencia de una metodologa adecuada para alcanzar un objetivo, como en la correcta interpretacin de los resultados.

PRCTICA 1 TRANSFORMACIN BACTERIANA

Objetivos Familiarizar al estudiante con el fenmeno de transformacin bacteriana y la transferencia horizontal de genes. Conocer los mtodos de transformacin bacteriana en el laboratorio. Hacer competente una cepa de E. coli con tratamiento qumico y transformarla con un plsmido. Analizar transformantes a travs de medios selectivos. Reconocer los usos prcticos de los genes reporteros y marcadores selectivos. Introduccin La transformacin es un proceso por el cual las clulas procariotas captan ADN libre presente en el medio. Es un fenmeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero con variaciones en su eficacia entre especies. Para que ocurra la transformacin, la bacteria tiene que encontrarse en un estado de competencia, en el cual la clula presenta modificaciones en su pared y membrana, que permiten la entrada del material gentico desde el exterior celular. En el laboratorio se han normalizado tcnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de Escherichia coli. Estas tcnicas se basan en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen poros en la pared celular. El tratamiento qumicos con cloruro de calcio (CaCl2) y la electroporacin, que consiste en inducir la competencia mediante la aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso, son dos mtodos utilizados con frecuencia en el laboratorio de investigacin.

Sin embargo tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo se hacen competentes y se afecta la viabilidad de la clula. La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir plsmidos recombinantes en casi cualquier tipo de bacteria. El mtodo que se describe a continuacin es, por su simplicidad, uno de los ms utilizados para transformar E. coli. Para seleccionar las clulas transformantes, el ADN introducido llevar un marcador selectivo de resistencia a antibiticos que proporciona una ventaja selectiva bajo las condiciones de crecimiento, con respecto a las clulas no transformadas y un gen reportero, que confiere un fenotipo de emisin de fluorescencia fcilmente detectable. Ambos marcadores genticos permitirn identificar las clulas transformantes.

Materiales, reactivos y equipos Cultivo de Escherichia coli DH10B. Genotipo: F- mcrA (mrr-hsdRMS-mrcBC) 80dlacZM15 lacX74 deoR recA1 endA1 araD139 (ara, leu) 7697 galU galK - rpsL nupG ADN del plsmido pEGFP o pEYFP 2 mL de medio LB lquido 10 mL de medio LB lquido+ estreptomicina 40 g.mL-1 3 Placas de agar LB +estreptomicina 40 g.mL-1 2 Placas de agar LB +ampicilina 100 g.mL-1 +estreptomicina 40 g.mL-1 20 mL 0,85% Solucin Salina 15 mL CaCl2 50 mM Rastrillo de vidrio Cava y hielo para incubaciones a 4C Microcentrfuga. 3 Tubos de microcentrfuga estriles 1,5 mL 4 Tubos estriles 15 mL 6 Tubos de dilucin estriles Baos de incubacin. Micropipetas Puntas para micropipetas 20-200 L y 1 mL Pipetas estritles de 10 mL, 5 mL y 1 mL

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Protocolo Nota: Durante todo el proceso trabaje en condiciones de esterilidad. Preparacin de clulas competentes 1. Previo al da de la prctica, partiendo de una colonia aislada, inocular las bacterias en 2 mL de medio LB+ estreptomicina (40 g.mL-1) en un tubo estril. 2. Incubar a 37C con agitacin toda la noche. cultivo en fase estacionaria de la noche anterior. 4. Incubar a 37C con agitacin por 1 hora. 5. Transferir el cultivo a un tubo estril de 15 mL. 6. A partir de este paso trabajar a 4 C. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m. 7. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 2 mL de solucin salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego completar el volumen a 10 mL. 8. Centrifugar estrilmente a 4 C a 5000 r.p.m por 10 minutos. 9. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 10 mL de CaCl2 50 mM recientemente preparado y fro. 10. Incubar 1 hora en hielo. 11. Centrifugar estrilmente y a 4 C a 5000 r.p.m por 10 minutos. 12. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de bacterias en 1 mL de CaCl2 50 mM y guardar a 4C. 3. Agregar 8 mL de medio LB+estreptomicina (40 g.mL-1) al

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Transformacin 1. Pre-incubar dos tubos de 1,5 mL estriles en hielo. Marcarlos como A y B. Colocar en cada uno 200 L de las clulas competentes del paso 11 del protocolo de preparacin de las clulas competentes. 2. Al tubo A, aadirle aproximadamente 0.1 g del ADN plasmdico en un volumen no mayor a 10 L. Al tubo B no colocarle el plsmido. 3. Incubar 1 hora en hielo cada tubo. 4. Someter las clulas a un choque trmico a 45C por 90 segundos exactos. 5. Agregar 1 mL de medio LB e incubar a 37C por 60 min. 6. Sembrar por rastrilleo 100 L de cada tubo en una placa de LB+ampicilina (100 g.mL-1)+ estreptomicina (40 g.mL-1). 7. Para el clculo de la eficiencia de transformacin y control de viabilidad realizar una titulacin del cultivo transformado (tubo A) hasta un factor de dilucin de 10-7 y 10-8. Sembrar por 10-8 en placas de rastrilleo 100 L de las diluciones 10-7 y agar LB. 8. Incubar las placas a 37C por 24 horas. 9. A las 24 horas registre el nmero de colonias en cada tipo de placa y calcule el ttulo de clulas receptoras y de clulas transformantes. 10. Evalu la expresin de los genes reporteros GFP o YFG segn sea el caso, en las colonias transformadas exponiendo la placa a la luz UV. Nota: utilice lentes para protegerse la vista. 11. Sembrar por agotamiento al menos cuatro colonias transformantes en placas de LB+ampicilina (100 g.mL-1)+ estreptomicina (40 g.mL-1) que utilizar en la prctica 2 para el aislamiento del ADN plasmdico.

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Preguntas de la prctica 1. Calcular la eficiencia de transformacin en base a la concentracin de ADN plasmdico y en base al ttulo de las clulas receptoras con las frmula: n de colonias transformantes / g ADN aadidos)x10 n de colonias transformantes / ttulo de clulas receptoras) 2. Describa qu se observa en la placa de LB+ampicilina sembrada con 100 l del tubo B. Sabras explicar por qu? Para qu se realiza este control? 3. Discuta el genotipo de la cepa utilizada E. coli DH10B. Por qu se utiliza estreptomicina en el medio? 4. Desde el punto de vista gentico Qu caractersticas

especiales deben tener las cepas bacterianas a ser usadas en experimentos de transformacin? 5. Discuta las caractersticas de los vectores pEGFP y pEYFP y su relevancia para el clonamiento de genes. Qu importancia tienen los sitios mltiples de clonamiento ubicados en las regiones 5 y 3 de los genes GFP y YFP? Por qu es posible observar el fenotipo de fluorescencia en las clulas E. coli DH10B transformadas con los plsmidos pEGFP y pEYFP? 6. 7. 8. Describa otros tipos de tipos de vectores de y estrategias de clonamiento. Explique qu otros mtodos son utilizados para hacer competente a una cepa bacteriana. Desde el punto de vista evolutivo Cul es la importancia de los fenmenos de transformacin bacteriana en la naturaleza?

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Figura 1. Mapa de los plsmidos pEGFP y pEYFP. Se muestran: el tamao del plsmido en kb, los sitios nicos de restriccin, los sitios mltiples de clonamiento (MCS), los genes de resistencia a ampicilina (Ampr), los genes reporteros EGFP/EYFP, el promotor del operon Lactosa (PLac) y el origen de replicacin de pUC (pUCori). Los nmeros en parntesis indican la ubicacin en pb desde el sitio 1. (http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3078-5.pdf y http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3175-5.pdf).

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ANEXO 1. Genes reporteros in vivo:

La protena de fluorescencia verde y vectores de clonamiento

La Protena de Fluorescencia Verde (GFP por sus siglas en ingls Green Fluorescent Protein), aislada originalmente de la medusa Aequorea victoria, se utiliza como una molcula reportera para analizar el funcionamiento in vivo de regiones reguladoras, as como para determinar la localizacin subcelular de protenas. La GFP emite una fluorescencia de color verde brillante al ser expuesta a luz UV, lo que la hace fcilmente detectable. La en Protena ingls de Fluorescencia Amarilla (YFP por sus siglas Yellow

Fluorescent Protein) se deriva de una mutacin puntual en el gen de la GFP por lo que absorbe a una longitud de onda diferente y emite una fluorescencia ms tenue. Ambas protenas son fcilmente detectables y de amplio uso en el anlisis funcional de genes. Los vectores de clonamiento pEGFP y pEYFP tienen su origen en el plsmido pUC19 al cual se le ha insertado un fragmento de ADN conteniendo a los genes GFP y YFP respectivamente (Figura1). La estructura base del pUC19 proporciona el gen de resistencia al antibitico ampicilina y un origen de replicacin relajado que permite su propagacin en E. coli y genera mltiples copias del plsmido en la clula. Los genes GFP y YFP estn insertados en fase al codn de iniciacin del gen lacZ por lo que la protena de fusin del marcador fluorescente se expresa a partir del promotor de lac. De esta forma, el fenotipo de resistencia al antibitico ampicilina y la presencia de fluorescencia servirn como indicativo de la presencia del plsmido en una clula bacteriana hospedera. En este caso, nos servir para determinar si el ensayo de transformacin tuvo xito. Sin embargo las aplicaciones y usos de este tipo de plsmidos son muy amplias. Podras sugerir en qu tipo de experimentos seran tiles los plsmidos pEGFP y pEYFP?

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PRCTICA 2 AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO Minipreparacin de ADN plasmdico

Objetivo Manejar fundamentos tericos y prcticos del aislamiento de ADN plasmdico y genmico en bacterias. Estudiar el efecto de detergentes aninicos, como el Dodecil Sulfato de Sodio (SDS por sus siglas en ingls Sodium Dodecyl Sulfate), sobre la clula bacteriana. Extraer y aislar de la clula bacteriana E. coli DH10B el plsmido transformado en la prctica 1.

Introduccin La lisis alcalina, en combinacin con el detergente Dodecil Sulfato de Sodio, SDS, ha sido usada por ms de 20 aos para aislar ADN plasmdico de E. coli. La exposicin de suspensiones bacterianas a detergentes aninicos fuertes en valores de pH altos desestabiliza la envoltura celular, desnaturaliza el ADN cromosomal y las protenas, y libera el ADN plasmdico al sobrenadante. Aunque la solucin alcalina separa completamente las bases apareadas del ADN, las hebras de un plsmido circular no se separan completamente unas de otras debido a que estn topolgicamente entrelazadas. Mientras la intensidad y la duracin de la exposicin al OH- no sea demasiado larga, ambas hebras del ADN plasmdico se renaturalizarn cuando los niveles de pH retornen a sus valores neutros reconstituyendo una molcula de ADN doble cadena circular. Durante la lisis, las protenas bacterianas, la pared celular rota y el ADN cromosomal desnaturalizado constituyen grandes complejos que se agregan y son cubiertos con SDS. Estos complejos

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son precipitados eficientemente de la solucin acuosa cuando los iones sodio son reemplazados por potasio. Despus que este material ha sido removido por centrifugacin, el ADN plasmdico puede ser recuperado del sobrenadante. La lisis alcalina en presencia de SDS es una tcnica flexible que trabaja muy bien con todas las cepas de E. coli y con cultivos bacterianos en fase logartmica en un rango de 1 mL a >500 mL. El ADN plasmdico circular cerrado recuperado del lisado puede ser purificado de distintas maneras y en diferentes grados, dependiendo de las necesidades del experimento.

Materiales y reactivos Medio LB lquido+estreptomicina 40 g.mL-1+ampicilina 100 g.mL-1 Solucin Salina (NaCl 0,85 %) Solucin I (glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris pH 8.0 25 mM) Solucin II (NaOH 0.2 M, SDS 1%) Solucin III (Acet. de potasio 3 M, cido actico glacial 5 M, pH 4.5) Solucin cloroformo:fenol (1:1) Isopropanol grado Biologa Molecular Etanol 70% v/v Tampn TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 1 mM) Microcentrfuga 3 tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1.5 mL Micropipetas Puntas para micropipetas 20-200 L Hielo/cava

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Protocolo 1. Previo al da de la prctica, partiendo de una colonia aislada, crecer toda la noche un cultivo de 4 mL de medio LB+ampicilina (100 g.mL-1) + estreptomicina (100 g.mL-1) de la cepa bacteriana transformada con el plsmido pEGFP o pEYFP obtenida en la prctica 1. 2. Transferir el cultivo a un tubo estril de 15 mL. 3. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m. 4. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 2 mL de solucin salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego completar el volumen a 10 mL. 5. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m. 6. Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 100 L de solucin I con agitacin. 7. Transferir este sobrenadante a un tubo de 1,5 mL. 8. Aadir 200 L de solucin II. Tapar el tubo y mezclar las dos soluciones invirtiendo dos o tres veces el tubo muy suavemente. Incubar en hielo por 5 min. 9. Aadir 150 L de solucin III fra. Mezclar por inversin del tubo e incubar en hielo de 5 a 8 min. 10. Centrifugar a 14000 r.p.m. por 15 min. 11. Tomar el sobrenadante CON MUCHO CUIDADO, evitando tomar del sedimento, pues ste es la principal fuente de contaminacin por ADN cromosomal. De ser necesario, centrifugue este sobrenadante una vez ms para asegurarse que no contiene ninguna contaminacin. 12. Calcular el volumen de sobrenadante y extraer con un volumen igual de mezcla cloroformo-fenol (1:1). Mezclar bien. Nota: el fenol es muy corrosivo, evite su contacto con la piel.

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13. Centrifugar esta mezcla por 3 min. a 14000 r.p.m. Deben separarse dos fases. 14. Tomar la fase acuosa superior, con cuidado de no tocar la interfase ni la fase fenlica, y transferirla a un nuevo tubo de 1,5 mL. 15. Agregarle un volumen de isopropanol igual al volumen del sobrenadante. Mezclar por inversin e incubar por 10 min. en hielo. 16. Centrifugar a 14000 r.p.m. por 15 min. 17. Eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento con etanol 70% y centrifugar por 5 min. a 14000 r.p.m. 18. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y dejar el tubo en posicin invertida sobre un toalln a fin de que drene todo el etanol. Dejar secar completamente a temperatura ambiente. 19. Resuspender el sedimento con los cidos nucleicos en un volumen no mayor a 50 L de tampn TE y guardar en la nevera. Esta muestra que contiene al ADN del plsmido ser examinada en un gel de agarosa en la prxima prctica.

Preguntas de la prctica 1. Explique cmo y por qu se logra separar el ADN plasmdico del ADN cromosmico durante la lisis alcalina. 2. Explique qu se logra al aadir consecutivamente las soluciones I, II y III? 3. En qu paso del protocolo se elimina al ARN? Con qu tratamiento adicional podra eliminar al ARN? 4. Cmo se desnaturalizan las protenas? 5. Cmo se eliminan los lpidos de la preparacin? 6. Por qu se realiza un lavado con etanol 70%?
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PRCTICA 3 ANLISIS DEL ADN EN GELES HORIZONTALES DE AGAROSA

Objetivo Manejar los fundamentos tericos de la electroforesis en geles de agarosa. Conocer y evaluar las ventajas de la tcnica de electroforesis en geles horizontales de agarosa para el anlisis y caracterizacin de cidos nucleicos. Separar cidos nucleicos segn su tamao y configuracin. Comprobar si la minipreparacin de plsmidos realizada en la prctica 2 fue exitosa. Reconocer las diferentes conformaciones del ADN circular.

Introduccin La electroforesis en geles de agarosa es una de las tcnicas analticas utilizadas en la caracterizacin de cidos nucleicos en base a la forma y tamao de las molculas. La carga neta negativa, producto de los grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en una migracin de las molculas hacia el nodo cuando se aplica un campo elctrico; sin embargo la matriz, formada por la agarosa (un polisacrido ramificado de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidrogalactosa altamente hidrofbico) en la sales del tampn, ofrece una resistencia al movimiento (Figura 2). Las molculas lineales de mayor tamao tendrn dificultad para pasar por los poros de la matriz, quedndose en la regin superior del gel, mientras que los fragmentos de menor tamao se movilizarn con facilidad, alcanzando la parte inferior del gel.

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BOLSILLOS

Figura 2. Esquema representativo de una corrida electrofortica Dependiendo de la concentracin de agarosa en el gel, la matriz formada permitir la separacin efectiva de diferentes tamaos de ADN durante la electroforesis (Tabla 1), en consecuencia, la masa molecular relativa puede ser calculada utilizando un marcador de ADN de peso molecular conocido, como referencia. Sin embargo existen otros factores que influyen en el grado de resolucin de los geles de agarosa. La conformacin de las molculas afecta la migracin. El ADN plsmidos migra en orden de velocidad desde el ms rpido al ms lento, de acuerdo a si est en forma superenrollada, lineal o circular abierta. Tabla 1. Rango de separacin de molculas lineales de ADN doble cadena por electroforesis en geles horizontales de acuerdo al porcentaje de agarosa.

% de Agarosa en el gel 0,6 0,7 0,8 1,3

ADN (kb) 20-1,0 10-0,8 7-0,5 4-0,2

El voltaje es otro factor que influye en la velocidad de migracin del ADN, a mayor voltaje una migracin ms rpida; sin

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embargo el calor generado produce que el gel se derrita adems de desmejorar la resolucin de la separacin de las molculas. Generalmente los geles de agarosa en corrida horizontal son utilizados para separar fragmentos entre 100 pb hasta 20 kb. Para la separacin de molculas de menor tamao se utilizan geles de poliacrilamida y para molculas mayores a 0,1 Mb hasta 2 Mb se han diseado los sistemas de electroforesis de campo pulsado (Pulse Field Gel Electrophoresis o PFE) y electroforesis de campos invertidos a 2 %). Previa a la colocacin de la muestra en los bolsillos del gel, se mezcla con el tampn de carga, compuesto por un reactivo que incremente la densidad, como el glicerol o la sacarosa, y uno o dos colorantes que permitan hacer el seguimiento de la corrida en tiempo real. Generalmente se utiliza el azul de bromofenol y el cileno cianol, los cuales estn cargados negativamente y migran a un peso molecular equivalente a 5 kb y 300 pb de ADN doble cadena respectivamente. El mtodo ms conveniente y comnmente usado para la visualizacin del ADN separado en estos geles de agarosa es la tincin con el colorante fluorescente bromuro de etidio (BrEt), el cual contiene grupos planares tricclicos que se intercalan entre las bases del ADN, sin especificidad de secuencia. Bajo estas condiciones, el colorante aumenta su fluorescencia, de modo que emite luz visible (color naranja) cuando es excitado por radiacin ultravioleta. Para el registro del resultado de la electroforesis que se visualiza mediante la exposicin a la luz UV del gel teido con BrE, desde hace algunos aos se utiliza un aparato de fotodocumentacin que digitaliza la imagen, el cual hace uso de programas especialmente diseados para este fin. (Field Inverted Gel Electrophoresis, FIGE), ambos realizados en geles de agarosa de alta concentracin (agarosa 1,5%

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Materiales y reactivos. Agarosa 0,8% en tampn TAE 1X Tampn TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM). Tampn de carga III 6X. (azul de bromofenol 0,25% p/v; cileno cianol 0,25% p/v; Glicerol 30% v/v) Bromuro de etidio 0.5 g.mL-1 Agua destilada Cmara de electroforesis horizontal/Fuente de poder Peines, moldes y bandeja para la preparacin de geles Balanza Horno microondas Fiola de 125 mL Bandeja para tincin Cilindros graduados de 100 y 500 mL Papel Parafilm Micropipetas Puntas para micropipetas 20-200 L Agujas de inyectadotas Transiluminador UV/sistema de fotodocumentacin Guantes desechables

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Protocolo 1. Preparar 100 mL de la solucin de agarosa 0,8% en tampn TAE 1X. Para ello, pesar 0,8 g de agarosa requeridos en una fiola y agregar 100 mL del tampn TAE 1X. 2. Disolver la agarosa calentando hasta hervir en el microondas por 2-5 minutos evitando la evaporacin. Dejar enfriar. Cuando la temperatura se acerque a los 50C (temperatura tal que se pueda visualizar a la solucin an como lquido), verter la agarosa en el molde con los peines. Evite la formacin de burbujas, en caso de que se formen, removerlas con una aguja. Dejar solidificar el gel a temperatura ambiente. 3. Una vez solidificada la agarosa, remover los peines y colocar el gel en la cmara de corrida con tampn TAE 1X. 4. En un trozo de papel Parafilm fijado al mesn, mezclar 5 L de la solucin de ADN con 2 L del tampn de carga 6X y colocar cada muestra en el bolsillo correspondiente. Recuerde colocar un marcador de peso molecular mezclado con tamn de carga y tomar nota de la ubicacin de sus muestras. 5. Aplicar un voltaje no superior a 5 V.cm-1 y dejar correr hasta que el primer colorante alcance partes del gel. 6. Al finalizar la corrida, y utilizando guantes, teir el gel en una solucin de Bromuro de etidio a 0,5 g.mL-1 durante 1 minutos. Transferir el gel a una bandeja con agua destilada. Registre la imagen mediante la exposicin sobre un transiluminador de luz UV (312 nm) y utilizando el aparato de fotodocumentacin. 7. NOTA: El BrEt es un poderoso agente mutgeno. Use siempre guantes. No permita su contacto con la piel. No exponga ninguna parte de su cuerpo a la luz UV.

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Preguntas de la prctica 1. Explique por qu la matriz del gel de agarosa ofrece resistencia al paso de las molculas de ADN? 2. Por qu un fragmento de ADN de 10 kb no migra ms rpido que un fragmento de 0,5 kb, cuando se someten a un campo elctrico en la electroforesis en geles de agarosa, si el primero posee mayor nmero de grupos fosfato y por tanto ms cargas negativas? 3. Cules son las funciones de los tampones de electroforesis como el TAE 1X? Qu otros tampones de electroforesis son frecuentemente usados en laboratorio? 4. Con qu propsito se mezcla la solucin de ADN con el tampn de carga? Cules son las funciones de cada uno de de los componentes, el glicerol, el azul de bromofenol y el cileno cianol? 5. Qu otros mtodos existen para la visualizacin del ADN en geles de agarosa? 6. La electroforesis en geles de agarosa a diferentes

concentraciones resuelve fragmentos desde 100 pb hasta 20 kb. Con qu otra metodologa se logra resolver fragmentos menores a 100 pb? Explique. 7. En la prctica se utiliz un marcador de ADN de molculas lineales. Sirve este marcador para calcular el peso molecular de molculas circulares? Explique.

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PRCTICA 4 CUANTIFICACIN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRA

Objetivos Conocer y manejar el fundamento de la tcnica de

espectrofotometra para la cuantificacin de la concentracin de una muestra de ADN. Estimar la concentracin de ADN plasmdico aislado de las clulas transformantes de E. coli DH10B en la prctica 2.

Introduccin Existen diversos mtodos para estimar la concentracin de cidos nucleicos en una preparacin. Si la muestra es pura (no contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol, agarosa o incluso otros cidos nucleicos), su medicin mediante espectrofotometra de la luz UV absorbida por las bases nitrogenadas es la ms adecuada. Por el contrario, si la cantidad de ADN o ARN es muy pequea, o si la muestra contiene grandes cantidades de impurezas, la estimacin de los cidos nucleicos se puede llevar a cabo por la intensidad de fluorescencia emitida por compuestos como el bromuro de etidio. En esta prctica se cuantificar la cantidad de ADN mediante espectrofotometra, donde se tomarn lecturas de la Densidad ptica (D.O.) a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permite calcular la concentracin del ADN en la muestra. Una D.O.260 de 1.0, corresponde aproximadamente a 50 g.mL-1 de ADN doble cadena, a 33 g.mL-1 de ADN cadena sencilla, a 20-30 g.mL-1 de oligonucletidos entre 20 a 40 bases y a 40 g.mL-1 de RNA. La relacin entre las medidas a 260 y 280 (D.O.260:D.O.280)

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proporciona

un

estimado

de

la

pureza

de

la

muestra.

Las

preparaciones puras de ADN deben tener un valor D.O.260:D.O.280 de 1,8 a 2. Valores por debajo de este rango son un indicativo de contaminacin con protenas o fenol. Debido a su rapidez, simplicidad y ausencia de dao, la cuantificacin de ADN por espectrofotometra ha sido ampliamente utilizada. Sin embargo, esta tcnica es poco sensible, y para la mayora de los espectrofotmetros se requiere una concentracin de ADN de al menos 1 g.mL-1 en la muestra para poder realizar estimaciones vlidas. En esta prctica utilizaremos la tcnica de cuantificacin de cidos nucleicos mediante espectrofotometra, para evaluar la muestra de ADN plasmdico aislado de las clulas transformantes de E. coli en la prctica 2.

Materiales y Reactivos Tampn TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 0.1 mM) Tubos de microcentrfuga de 1,5 mL Micropipetas P20, P200 y P1000 Puntas para micropipetas 20-200 L Cubetas de cuarzo de 1 mL Espectrofotmetro con lmpara de luz UV

Protocolo 1. Realizar una dilucin 1:200 (5 L en 1 mL) de la muestra de ADN plasmdico aislado en la prctica 2 utilizando tampn TE, en un volumen final de 1 mL. 2. Calibrar a cero el espectrofotmetro con tampn TE. Colocar el volumen total de la dilucin de la muestra en una cubeta de cuarzo de 1 mL. Mida y registre el valor de la D.O. a 260 y 280 nm.
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3.

Estime la concentracin de ADN en la muestra utilizando la siguiente relacin: [ADN] = 50 g.mL-1 x D.O.260nm x factor de dilucin Como alternativa a la estimacin directa de la concentracin

de ADN utilizando el espectrofotmetro, es posible correr la muestra problema simultneamente con una serie de diluciones de ADN plasmdico de concentracin conocida. Una vez realizada la corrida electrofortica, teido el gel en una solucin de BrEt y registrada la imagen, siguiendo las indicaciones del paso 6 del protocolo de la prctica 3, estime la concentracin de la muestra por comparacin con los ADNs de las diluciones.

Preguntas de la prctica 1. Por qu considera usted que es necesario realizar la estimacin de la concentracin del ADN aislado? 2. Por qu se debe realizar una dilucin de la muestra antes de medir la D.O. en el espectrofotmetro? 3. Por qu slo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la estimacin de la concentracin del ADN? Qu informacin nos provee la D.O. a 280 nm? Por qu utiliz el valor de 50 g.mL-1 en la frmula para calcular la concentracin de su muestra? 4. Calcule el grado de pureza de la muestra aislada en la prctica 2 y compare con el valor terico. Discuta sus resultados. 5. Compare sus resultados (Concentracin de ADN y relacin de pureza D.O.260:D.O.280) con los del resto del curso. Discuta.

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PRCTICA 5 CARACTERIZACIN DE PLSMIDOS RECOMBINANTES POR ANLISIS DE RESTRICCIN

Objetivos Manejar los principios metodolgicos bsicos del uso de las enzimas de restriccin para la caracterizacin de molculas de ADN. Evaluar mediante la tcnica de electroforesis en geles de agarosa, los tamaos de los fragmentos generados por la digestin con enzimas de restriccin de los plsmidos aislados en la prctica 2 y comparar el patrn obtenido con el reportado en los mapas fsicos.

Introduccin Las enzimas o endonucleasas de restriccin, ER, son protenas que reconocen secuencias definidas del ADN entre 4, 6 o ms nucletidos, cortando en sitios especficos dentro de esta secuencia o en sitios vecinos a ella. Desde su descubrimiento en los aos 70 se han aislado ms de 300 enzimas de restriccin dndoles denominaciones de acuerdo a las diferentes especies de bacterias donde se originan; por ejemplo EcoR I fue aislada de E. coli, Hind III de Haemophilus influenzae y Hpa I de Haemophilus parainfluenzae. Las secuencias reconocidas por las enzimas de restriccin son generalmente palndromos y cada enzima reconoce una secuencia diferente. En su conjunto las ER constituyen una herramienta para obtener fragmentos discretos de ADN con extremos cuya secuencia es conocida. Los fragmentos de ADN resultantes de una digestin con enzimas de restriccin pueden ser separados por electroforesis

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en geles de agarosa en un rango de 200 pb a 20 kb. A la combinacin de digestin con enzimas de restriccin y al anlisis mediante electroforesis en geles se le llama anlisis de restriccin. La representacin de una molcula de ADN, ya sea circular o lineal, donde se indiquen a escala con el tamao en pb, la ubicacin de los sitios de restriccin que poseen, se denomina mapa de restriccin. En este ejercicio prctico se realizar la verificacin del mapa de restriccin de los plsmidos pEGFP y pEYFP aislados en la prctica 2 (Figura 1). Materiales y reactivos ADN plasmdico aislado en la prctica 2 Enzimas Hae II, Xba I y EcoR I Tampn 10X especfico de cada enzima Agua bidestilada, autoclavada Estufa a 37C Tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1,5 mL Micropipetas P20 y P200 Puntas para micropipetas 20-200 L

Protocolo Nota: Cada equipo va a realizar tres digestiones por separado para la muestra de ADN plasmdico, con cada una de las enzimas Hae II, Xba I y EcoR I. Previo a montar las digestiones, registre los reactivos, sus concentraciones y el volumen a utilizar en un cuadro similar al descrito en la Tabla 2. 1. Siguiendo el orden de la Tabla 2, colocar la solucin de ADN (pEGFP o pEYFP proveniente de la miniprep de la prctica 2), en un tubo de 1,5 mL estril. Estime el volumen de la solucin

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de ADN de acuerdo a la evaluacin del rendimiento del aislamiento en el gel de agarosa y a la concentracin estimada en el espectrofotmetro o a travs de comparacin en geles. 2. Aadir 1,5 L del tampn de la enzima (10x). 3. Agregar 0,5 L la enzima (Hae II, Xba I o EcoR I) . 4. Completar hasta 15 L con H2O bidestilada y autoclavada. 5. Incubar a 37C por 2 horas. 6. Analizar la digestin en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% en tampn TAE 1X. Mezclar 4 L de tampn de carga con cada tubo de digestin previo a colocarla en el gel. Incluir un marcador de peso molecular. 7. Utilizando guantes para manipular el gel, teirlo en una solucin de BrEt 0.5 g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a una bandeja con agua destilada. 8. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin. Tabla 2 Registro de los reactivos, concentraciones y volmes a utilizar en las digestiones con las enzimas Hae II, Xba I y EcoR I de los plsmidos pEGFP y pEYFP. Concentracin Reactivo DNA Tampn enzima H2O bd Volumen final 15 15 15 10X 8-10 u.L-1 del stock Digestin HaeII (L) Digestin XbaI (L) Digestin EcoRI (L)

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ANEXO 2. Patrones de restriccin esperados para pEGFP y pEYFP.

M)Marcador PM escalera de 1kb 1) pEYFP sin digerir 2) pEYFP colonia 1 dig. HaeII + RNasa 3) pEYFP colonia 2 dig. HaeII + RNasa 4) pEGFP sin digerir 5) pEGFP colonia 1dig. XbaI + RNasa 6) pEGFP colonia 2 dig. Rnasa XbaI +

Figura 3. Resultado esperado del aislamiento de los plsmidos pYGFP y pEGFP y de su caracterizacin con las enzimas Hae II y Xba I. Corrida electrofortica de las digestiones especificadas para cada carril en un gel de agarosa 1% p/v en tampn 1x TAE.

Preguntas de la prctica 1. Investigar la nomenclatura de las enzimas de restriccin. Por qu las enzimas utilizadas en la prctica se denominan Hae II, Xba I y EcoR I? 2. Indar sobre el origen de las enzimas de restriccin y la importancia de su uso en la biologa molecular. 3. Cules son los componentes del tampn de cada ER y cules son sus funciones? 4. Estimar el tamao de los fragmentos generados en cada digestin y comprelo con el mapa de restriccin en cada caso. Visite el sitio www.bdbiosciences.com. Por qu en el carril 6 de la figura 3 se observan cuatro bandas?
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2DO BLOQUE Aplicacin de tcnicas de la gentica molecular al diagnstico de enfermedades hereditarias humanas INTRODUCCION
En la gentica clsica o Mendeliana el estudio del genotipo implica la realizacin de cruces y el anlisis de las proles en las diferentes generaciones que revelen la expresin de los genes y las interacciones allicas a travs del fenotipo. Para el estudio de enfermedades hereditarias en humanos se analizan los pedigres familiares, no siempre disponibles, en la bsqueda de patrones hereditarios directamente asociados al genotipo al de fenotipo un de la Las enfermedad. herramientas Afortunadamente, hoy en da existe la posibilidad de analizar individuo. disponibles, producto de la biologa molecular, permiten establecer de manera exacta la secuencia de nucletidos en el ADN de un gen determinando la presencia de mutaciones asociadas a un fenotipo en particular. El potencial de las nuevas tecnologas radica en su resolucin y sensibilidad. La combinacin de metodologas que permiten aislar fragmentos especficos de ADN utilizando la reaccin de amplificacin en cadena de la polimerasa o PCR, por su siglas en ingls Polymerase Chain Reaction, y mtodos anlogos de amplificacin de cidos nucleicos, as como estrategias que detectan variaciones en la secuencia de nucletidos, como lo son la hibridacin molecular, secuenciacin directa del ADN o la ganancia o prdida de sitios de reconocimiento y corte de enzimas de restriccin proporcionan certera detectados las mediante tcnicas de para electroforesis, identificar Con la las herramientas de hacer necesarias diagnstico

presencia de mutaciones asociadas a enfermedades hereditarias y la posibilidad gentico.

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metodologas existentes y disponibles es posible detectar y analizar la nica copia de cada uno de los genes presentes en una clula. Histricamente fue Linus Pauling en 1941 quien acu el trmino enfermedad molecular al directamente relacionar la causa de la inmunoglobulinopata o anemia drepanoctica sickle cell con la molcula de la hemoglobina. Por primera vez fue demostrado que una protena anormal poda causar una enfermedad y que los genes determinaban la estructura de las protenas. Utilizando el anlisis electrofortico, Pauling y sus colaboradores observaron que la hemoglobina Hb-SS mostraba un cambio en la movilidad electrofortica respecto a la hemoglobina normal Hb-AA; este cambio era producto de una mutacin en el gen de la -globina que daba lugar a un cambio en un aminocido en la protena madura. La hemogloblina Hb-SS se origina de la sustitucin A -> T en el sexto codn del gen de la cadena de -globina. Este cambio en un nucletido cambia al sexto aminocido en la cadena peptdica de cido glutmico a valina, cambio que a su vez afecta la forma y funcin de la molcula de hemoglobina adulta. Los eritrocitos que portan estas molculas pueden tener formas anormales que obstruyen los capilares o son degradados en los riones. El individuo que hereda un alelo mutado de -globina de uno de sus padres y un alelo normal, se dice que porta el carcter y tendr una hemoglobina adulta del tipo Hb-AS. Si tiene ambos alelos normales para la -globina, este individuo tendr una hemoglobina adulta del tipo Hb-AA. En caso de heredar ambos alelos mutantes el individuo tendr una hemoglobina adulta Hb-SS. La anemia drepanoctica es una enfermedad hereditaria autosmica recesiva introducida en el continente Americano con el trfico de esclavos desde frica y que afecta 1 de cada 600 afrodescendientes norteamericanos. Fue el primer desorden hereditario en ser diagnosticado utilizando mtodos moleculares dirigidos al genotipo. A finales de los aos 70, se realiz el diagnstico
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molecular combinando tcnicas de hibridacin Southern utilizando una sonda del gen de la -globina, marcada radiactivamente, para detectar polimorfismos en el tamao de los fragmentos generados por la digestin con una enzima de restriccin (diagnstico RFLP por sus siglas en ingls Restriction Fragment Length Polymorphism). Esta primera prueba era indirecta y detectaba el ligamiento gentico de la mutacin en el gen de la -globina a la presencia/ausencia de un sitio polimrfico Hpa I vecino al gen. En 1982 se identific la mutacin puntual en el gen de la -globina que da origen a la Hb-SS y posteriormente se determin que la mutacin destruye un sitio de corte para la enzima Mst II y sus isoesquizmero Bsu36 I, asociando directamente un RFLP al diagnstico gentico. La metodologa del RFLP requiere del aislamiento de clulas fetales mediante amniosistesis para la obtencin de suficientes cantidades de ADN genmico a analizar en las hibridaciones Southern. Este requerimiento del ensayo constitua una limitante que ha sido solventada acoplando la amplificacin de la regin del gen de -globina mediante PCR a la digestin del amplicn con la enzima MstII o la Bsu36I. Luego del anlisis electrofortico de los patrones de fragmentos generados en la digestin, genotipo. Las pruebas de diagnstico molecular estn disponibles en la actualidad para un gran nmero de desrdenes genticos y permiten evaluar familias completas, as como el realizar el diagnstico prenatal del feto con profundas implicaciones sociales que deben ser consideradas mucho antes de su implementacin. Es necesario que se establezcan criterios y marcos referenciales, conjuntamente con los programas de diagnstico, en los que se contemplen aspectos como la certeza y efectividad de la prueba, su verdadera utilidad, particularmente para enfermedades genticas sin cura, y el asesoramiento o consejo gentico que debe acompaar al programa de diagnstico. En el caso de la anemia
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es posible identificar el

drepanoctica, para la cual no existe un tratamiento curativo, se considera que la nica medida a nivel mundial para prevenir enfermedad es ser realizadas el diagnstico de forma prenatal. El procedimiento en muchos pases, la del lo

diagnstico molecular ha sido simplificado y estas pruebas pueden segura suficientemente temprano como para permitir una eleccin segura de terminacin del embarazo. En este segundo bloque del laboratorio realizaremos la aplicacin de mtodos de biologa molecular para el anlisis directo del genotipo con la finalidad de identificar la presencia de los alelos salvajes y mutantes del gen de -globina asociados al fenotipo de la anemia drepanoctica. Utilizaremos una metodologa sencilla para el aislamiento del ADN del epitelio bucal, a partir del cual ser amplificada una regin del gen de -globina que contiene la regin N-terminal de la protena donde se ubica la mutacin. Mediante el patrn de RFLP de este amplicn con la enzima Bsu36 I, ser posible identificar el genotipo de la muestra con respecto al gen de la globina. Consideraremos en este bloque dos aspectos asociados y consecuencia de la aplicacin de tcnicas moleculares al anlisis del genoma para el diagnstico de enfermedades hereditarias y la identificacin de individuos: la incorporacin del consentimiento informado para los individuos participantes en las pruebas y una lectura que ilustra la pertinencia de estas metodologas para resolver problemas legales en los tribunales con un verdadero impacto en la sociedad. De esta manera, el contenido del segundo bloque del manual de laboratorio cubre los aspectos tcnicos bsicos del anlisis a nivel del genoma de las enfermedades hereditarias humanas como las implicaciones ticas de su aplicacin.

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PRCTICA 6 ANLISIS DE PERFILES GENTICOS HUMANOS MEDIANTE PCR-RFLP: DETECCIN DE UNA MUTACION PUNTUAL O SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISM, SNP, EN EL GEN DE LA -GLOBINA
Objetivos Aislar ADN genmico de clulas de epitelio bucal humano para anlisis de RFLP-PCR Manejar los fundamentos de la tcnica de amplificacin de ADN por PCR. Analizar mediante la tcnica de PCR-RFLP, la presencia de mutaciones puntuales o del Single Nucleotide Polymorphism, SNP, en el gen de la -globina humana responsable de la anemia drepanoctica.

PARTE I
PREPARACIN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS La efectividad en la aplicacin de una reaccin de

amplificacin de ADN o ARN depende principalmente de la calidad del material de partida para el anlisis. En primer lugar es imprescindible la seleccin adecuada de la fuente del material gentico del organismo a identificar. El origen del material gentico a evaluar puede ser variado. En el caso de bacterias y parsitos la fuente ideal es el cultivo del organismo. Sin embargo, no siempre es posible tener un cultivo por razones tcnicas y/o biolgicas, en consecuencia se debe obtener una muestra que contenga al microorganismo o su genoma, como
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muestras de suelos, biopsias, sangre o suero. Para el anlisis de genotipos humanos en el diagnstico de enfermedades hereditarias, determinacin de filiacin e investigaciones fornsicas, se asla ADN a partir de muestras de sangre o de clulas fetales provenientes del lquido amnitico en el caso del diagnstico prenatal. Sin embargo, la altsima sensibilidad de las tcnicas de amplificacin de ADN in vitro permiten ampliar la fuente del ADN a todo tipo de muestras que contengan clulas del individuo; clulas del epitelio bucal son utilizadas humanos. Una vez seleccionada la fuente de ADN, la muestra debe ser sometida a un proceso de extraccin de cidos nucleicos con el fin de preservarlos y evitar la accin degradativa de enzimas u otros compuestos presentes inicialmente en la misma; as como eliminar sustancias que interfieran o inhiban de alguna manera la reaccin de amplificacin. El protocolo de procesamiento previo de la muestra depende exclusivamente del tipo y origen de la misma, as como de la calidad del material que se desea obtener. En general, los mtodos de preparacin de muestras buscan degradar protenas y extraer el ADN. Las protenas son desnaturalizadas o degradadas enzimticamente y posteriormente separadas de los cidos nucleicos. Luego de descartar las protenas, el ADN puede extraerse por separacin del precipitado proteico o con extraccin fenlica. Es importante saber que, siempre que se trabaje con muestras Informado de del origen sujeto humano al cual debe se existir le un Consentimiento la muestra. El extrae rutinariamente en el anlisis de perfiles genticos

Consentimiento Informado es un proceso mediante el cual un sujeto confirma voluntariamente su deseo de participar en un estudio en particular, despus de haber sido informado sobre todos los aspectos de ste que sean relevantes para que tome la decisin de participar. El Consentimiento Informado se documenta por medio de un formulario donde se registra por escrito la informacin del estudio y
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la manifiesta aceptacin del individuo en participar, confirmando el conocimiento de su contenido. Este documento es firmado y registra la fecha de su elaboracin.

1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal. El epitelio bucal est en constante regeneracin y sus clulas son reemplazadas continuamente. Aprovechando esta propiedad, este protocolo permite extraer ADN genmico de clulas provenientes la capa ms superficial del epitelio estratificado mediante el raspado de las paredes internas de las mejillas y de las encas, utilizando para ello hisopos de algodn. La proteinasa K rompe enlaces peptdicos, lo que permite digerir las protenas que se encuentren junto al ADN en el lisado celular.

Materiales y reactivos Proteinasa K 10 mg.mL-1 Tampn de lisis 1X (Tris-HCL 0,05 M pH 8; EDTA 0,05 M pH 8; glucosa 0,05 M; SDS 0,5%; NaCl 0,1 M) Hisopos estriles Micropipetas P20, P200 y P1000 Puntas para micropipetas 20-200 L, 1 mL Baos de incubacin Centrfuga refrigerada alcance a 10000 r.p.m. Tubos plsticos estriles de 1,5 mL y 15 mL

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Protocolo NOTA: Recuerde rotular todo el material que vaya a utilizar. 1. Con un hisopo estril raspar o rayar generosamente la parte interna de su mejilla derecha y el espacio entre su mejilla y enca durante un minuto; intente recolectar tanto material como le sea posible. 2. Colocar el hisopo con las clulas del epitelio bucal en el tubo que contiene 1 mL de tampn de lisis 1X. Agitar vigorosamente el hisopo para liberar las clulas en el tampn, para transferir la mayor cantidad de clulas posibles. 3. Usando un segundo hisopo estril, raspar o rayar la parte interna de su mejilla izquierda y el espacio entre su mejilla y enca, as como en la parte ms interna de la boca como lo hizo en el paso (1). Trate de recolectar la mayor cantidad posible de material que le sea posible. Coloque el segundo hisopo en el tubo con tampn de lisis como hizo en el paso (2). 4. Tapar e invertir gentilmente el tubo 5 veces para mezclar el contenido. 5. Agregar 1 L de proteinasa K (10 mg.mL-1) al tubo. 6. Tapar nuevamente el tubo e invertir gentilmente varias veces para mezclar el contenido. 7. Incubar los tubos en un bao de temperatura a 37 C durante 20 minutos. 8. Pasado este tiempo, colocar los tubos en un bao de temperatura a 50 C durante 10 minutos. 9. Aadir 200 l de NaCl 8 %. Tape el tubo e invierta suavemente 5 veces.

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10. Trasvasar el contenido de este tubo a un tubo de 15 mL. Aadir lentamente por las paredes del tubo, 2 mL de etanol 100%. Deje reposar durante 5 min. 11. Transcurridos los 5 min., sellar el tubo con parafilm e invertir 5 veces para ayudar a precipitar el ADN. 12. Centrifugar durante 15 min. a 10000 r.p.m. Descartar el sobrenadante y dejar secar todo el alcohol. 13. Resuspender el ADN en un volumen no mayor a 200 L de tampn TE o agua MiliQ (calidad PCR, libre de ADNasas y ARNasas) 14. Correr 5 L del ADN en un gel de agarosa 0.8% para verificar la cantidad e integridad del ADN aislado. 15. Diluir el ADN 1/100 antes de iniciar el protocolo de PCR.

Observaciones La recoleccin de un nmero abundante de clulas es crtica para lograr los objetivos. Asegrese de emplear el tiempo recomendado para la coleccin y transferencia de las clulas del epitelio bucal. Es muy importante incubar la solucin junto con la proteinasa K a 37 C para purificar el ADN que se encuentra en la solucin. Asegrese de realizar las digestiones durante el tiempo recomendado, note que un mayor tiempo de digestin permitir obtener un ADN mucho ms puro.

Preguntas de la prctica Compare los pasos y reactivos utilizados en el aislamiento de ADN plasmdico (Prctica 2) y ADN genmico (Prctica 6, Parte I). Qu diferencias y similitudes observ?

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ANEXO 3

CONSENTIMIENTO INFORMADO
En el Laboratorio de Gentica Molecular, como parte de la Prctica 6, se propone realizar un anlisis de perfiles genticos humanos mediante RFLP-PCR. El objetivo del trabajo es evaluar, mediante esta tcnica, la presencia de una mutacin puntual en el gen de la -globina humana, responsable de la anemia drepanoctica. Los datos obtenidos en este estudio contribuirn inicialmente a la realizacin de la prctica, y posteriormente, con la acumulacin de datos ao tras ao, podr llevarse a cabo la construccin de un banco de datos de este polimorfismo, que eventualmente permitir calcular la frecuencia de esta mutacin en la poblacin venezolana. Yo, _______________________________C.l.:_________________, Nacionalidad___________________Estado Civil ___________siendo mayor de 18 aos, en uso pleno de mis facultades mentales y sin que medie coaccin ni violencia alguna, en completo conocimiento naturaleza, forma, duracin, propsito, inconvenientes y riesgos relacionados con el estudio que mas abajo se ndica, declaro mediante la presente: 1.- Haber sido informado de manera objetiva, clara y sencilla, de todos los aspectos relacionados con la prctica nmero 6 del laboratorio de la materia electiva Gentica Molecular. 2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo del trabajo antes sealado es: es evaluar, mediante la tcnica RFLP-PCR, la presencia de una mutacin puntual en el gen de la -globina humana, responsables de la anemia falciforme. 3.Conocer bien el protocolo experimental expuesto por el investigador; en el cual se establece que mi participacin en el trabajo consiste en donar al laboratorio de la materia electiva Gentica Molecular de la Escuela de Biologa, Facultad de Ciencias,
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Universidad Central de Venezuela, una muestra de clulas del epitelio bucal. 4.- Que la muestra de clulas del epitelio bucal que acepto donar as como la informacin que suministre al equipo de profesores del laboratorio de la materia electiva Gentica Molecular coordinados por la Dra. Palmira Guevara, ser utilizada nica y exclusivamente para determinar la presencia de mutaciones puntuales en el gen de la globina humana. 5.- Que el equipo de profesores coordinados por la Dra. Palmira Guevara, me ha garantizado confidencialidad, relacionada tanto a mi identidad como de cualquier informacin a la que tengan acceso, por concepto de mi participacin en el proyecto antes mencionado. 6.- Que bajo ningn concepto podr restringir el uso, para fines acadmicos, de los resultados obtenidos en el presente estudio. 8.-.Que mi participacin en dicho estudio no implica riesgo ni inconveniente alguno para mi salud, as como que dicho estudio no forma parte de una terapia paliativa o curativa. 7.- Que cualquier pregunta que yo tenga en relacin con este estudio, me ser respondida oportunamente por parte del equipo de profesores antes mencionados con quienes me puedo comunicar por el telfono 0212-605 1044 de la direccin de la Escuela de Biologa con la Dra. Palmira Guevara. 8.- Que bajo ningn concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir ningn beneficio de tipo econmico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido proyecto de investigacin. 9.- Que los resultados de las pruebas realizadas me entregados oportunamente. Caracas a los ____das del mes de ___________ del 20___ Firma: Nombre y apellido: sern

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PARTE II
ENSAYOS DE AMPLIFICACIN MEDIANTE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE GLOBINA HUMANA

El desarrollo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR (del ingls Polimerase Chain Reaction) es uno de los avances tecnolgicos de mayor impacto en las tcnicas de Biologa Molecular y debido a sus mltiples aplicaciones constituye un importante progreso en el rea de diagnstico e identificacin molecular. Posiblemente, una de sus mayores ventajas corresponde a la simplicidad de la reaccin y la relativa facilidad en los pasos de manipulacin de material de trabajo, permitiendo la adopcin de la tcnica de PCR en diversos mbitos. En esta tcnica, la amplificacin de un fragmento especfico de ADN, por ciclos sucesivos, es un proceso de multiplicacin exponencial, que genera suficiente producto que puede acumularse y ser visualizado. De esta manera, una sola molcula puede generar ms de un billn de copias de si misma, luego de 30 ciclos de replicacin exponencial. El PCR se utiliza para amplificar un fragmento definido de ADN a partir de una mezcla compleja de material, usualmente llamada ADN templado. Para la obtencin del templado se precisa de un proceso de purificacin a partir de la muestra, tal como se seala en la Prctica 6, Parte I del presente manual. Adems del templado, se requiere el conocimiento de las secuencias de ADN que flanquean al fragmento a ser amplificado, conocido como ADN blanco. A partir de esta informacin se pueden disear y sintetizar qumicamente dos oligonucletidos iniciadores. Cada uno de estos oligonucletidos es complementario al extremo 3 de la hebra de ADN de la secuencia blanco, un oligonucletido para cada una de las

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dos hebras del ADN (Figura 4). La tcnica de PCR es un proceso de sntesis in vitro de ADN, en el cual se copia una hebra complementaria a partir de un templando, extendindose en direccin 35 a partir de un iniciador, cebador o primer. Consiste en tres pasos definidos de tiempo y temperatura, conocidos como desnaturalizacin, alineamiento y extensin, y cada conjunto secuencial de pasos o ciclos es repetido de 30 a 40 veces (Figura 4). En el primer ciclo el templado de ADN doble cadena es inicialmente desnaturalizado por calentamiento de la mezcla de reaccin a una temperatura por encima de 90C. Con esta primera etapa, la regin de ADN que ser especficamente amplificada (secuencia blanco o diana) se hace accesible, dentro de la muestra de ADN total. Posteriormente, la temperatura se baja hasta alcanzar entre 40 a 60 C para iniciar el segundo paso, el alineamiento de los oligos o cebadores. En este perodo los cebadores, presentes en exceso en la mezcla de reaccin, se ubican mediante hibridacin por complementaridad de bases con la secuencia blanco. Los oligonucletidos alineados actan como iniciadores para la sntesis del ADN, dado que proveen del grupo hidroxilo 3 libre para la ADN polimerasa. La precisin en la temperatura de esta fase es crtica y est definida por el Tm de cada cebador, en cada sistema de PCR debe optimizarse tomando en cuenta este parmetro. Las reacciones que no estn optimizadas pueden generar productos de ADN adicionales al blanco especfico si la temperatura esta muy por debajo del Tm o pueden no producir ningn producto amplificado si son muy elevadas. El tercer paso, la sntesis del ADN o extensin, es realizada a 72 C por una ADN polimerasa termoestable, mas comnmente llamada Taq ADN polimerasa, porque es originaria de la bacteria Thermus aquaticus. Finalmente, el ADN sintetizado posee los sitios de anclaje para los oligonucletidos, sirviendo como templado para
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los sucesivos ciclos de PCR. Cada sistema de PCR sigue el mismo principio bsico, sin embargo la secuencia de los oligonucletidos, los componentes de la mezcla de reaccin, as como las temperaturas y los tiempos de cada paso de un ciclo son especficos. En la presente seccin se presentan un esquema general de los pasos de la reaccin de PCR con rangos de temperaturas para diversos sistemas.

Figura 4. Pasos de cada ciclo en la reaccin de PCR

2.1 Diagnstico molecular de la anemia drepanoctica: PCR-RFLP, amplificacin de un segmento del gen de la -globina mediante la reaccin de PCR El diagnstico de la anemia drepanoctica se realiza por diferentes mtodos, las pruebas moleculares detectan la presencia de la mutacin a nivel de la protena o directamente en el gen. En el primer caso se evala el cambio de la movilidad de la hemoglobina en electroforesis en acetato de celulosa, isoelectroenfoque o

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cromatografa lquida de alta resolucin, asociado a la presencia de una valina en lugar de un cido glumico en la posicin seis de la cadena de -globina (Figura 5). La mutacin puntual que resulta en el cambio del codn GAG del cido glutmico al codn GTG de la valina, tambin cambia el sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin MstII y su isoesquismero Bsu36I. En la prueba de PCRRFLP de la anemia drepanoctica que incluimos en este manual, luego de la amplificacin de un fragmento de 536 pb, correspondiente a la regin N-Terminal del gen de la -globina, se realizar una digestin de este amplicn con la enzima Bsu36 I y se evaluar el patrn de los fragmentos generados en la restriccin (Figura 6) para la identificacin del genotipo del individuo entre homocigoto normales HbAA, homocigotos que sufren la enfermedad HbSS y heterocigotos o portadores del caracter con hemoglobina HbAS.

GAG Mutacin en el Codn 6 GTG Acido glutmico 6 Reemplazo del aa Valina 6 Variante de hemoglobina Forma del eritrocito
Normal Falciforme

HbAA, HbAS y HbSS

Figura 5. Esquema del origen de los eritrocitos falciformes.

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Materiales y reactivos Tubos de PCR (200 L) Micropipetas P10, P20 y P200 Puntas para micropipetas 10 L, 20-200 L Termociclador H2O bi-destilada para PCR Tampn de PCR 10X dNTPs 1,25 mM Cebador A (forward) 20 M 5-GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G-3 Cebador B (reverse) 20 M 5-GCT CAC TCA GTG TGG CAA AG-3 MgCl2 50 mM Muestra de ADN 50 ng.L-1 Muestras de ADN controles (50 ng.L-1 ) de individuos HbSS, HbAS y HbAA ADN Taq polimerasa 5 U.L-1 Agarosa 500 mL Tampn TAE 1X Transiluminador de luz UV/Sistema de fotodocumentacin Solucin de Bromuro de Etidio 0,5 g. mL-1 Fiola 125 mL

Observaciones Se debe tomar en cuenta que la mezcla de reaccin debe realizarse en un rea libre de ADN (irradiada con luz UV al menos 15 minutos antes de comenzar a trabajar). Debido a
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que se utilizarn varios tubos de reaccin, se recomienda realizar una mezcla madre y luego distribuirla en los tubos por cantidades iguales, para finalmente agregarle el ADN. Todo el material debe estar identificado. A partir del ADN aislado de clulas del epitelio bucal (parte I de la prctica 6), y de los ADNs controles se amplificar un fragmento de 536 pb correspondiente al gen de la -globina utilizando los cebadores de A la (forward) muestra, y B hasta (reverse). alcanzar Dependiendo de la eficiencia del aislamiento se deben realizar previamente diluciones aproximadamente 100 ng.mL-1 de ADN. Protocolo 1. Se llevarn a cabo cinco reacciones de amplificacin una con la muestra problema, tres con cada uno de los ADN controles y el control de contaminacin sin ADN. 2. La mezcla de reaccin se debe preparar siguiendo el orden indicado en la Tabla 3. En un tubo de mezcla madre de reaccin se deben agregar los volmenes calculados de H2O calidad PCR, tampn de reaccin 10X, MgCl2 50mM, dNTPs 1,25mM, cebador A 20 M, cebador B 20 M, mezcla sea homognea. 3. Enumerar cinco tubos para cada tipo de muestra, muestra problema y controles. Repartir en cada tubo 48 L de la mezcla madre de PCR. 4. Agregar finalmente 2 L de cada una de las muestras comenzando por el control sin ADN al cual se le agregan agua calidad PCR. 5. Colocar los tubos en el termociclador e iniciar el programa de amplificacin denominado ANEMIA (Tabla 4). Taq ADN polimerasa 2U. Mezclar muy bien para garantizar que la

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6. Luego de realizar la amplificacin correr un gel de agarosa al 1% en tampn TAE 1X para verificar la presencia del producto esperado. Analice 20 L de cada reaccin ms 3 L de tampn de carga 6X. 7. Utilizando guantes para manipular el gel, teirlo en una solucin de BrEt 0.5 g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a una bandeja con agua destilada. 8. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.

Tabla 3. Reactivos para la reaccin de amplificacin

Mezcla de reaccin

Cantidad por tubo ( L) 1n

36,6 5 2 2 1 1 0,4 2 50

Total (4n) (L)

146,4 20 8 8 4 4 1,6 192,0

Concentracin final en el tubo

1X 2 mM 0,2 mM 0,4 M 0,4 M 0,04 U.L-1 -

H2O calidad PCR Tampn de PCR 10X MgCl2 50 mM dNTPs 1,25 mM Cebador A 20 M (*) Cebador B 20 M (**) ADN Taq polimerasa 5 U.L-1 ADN 50 ng L-1 Volumen final

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Tabla 4. Programa ANEMIA

No de Paso Temperatura Tiempo Ciclo repeticiones (C) Denaturalizacin inicial Denaturalizacin Hibridacin Extensin Extensin final 94 94 55 72 72 5 1 1 1 10 2 3 40 1 1 1 (min.) del ciclo

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PARTE III
DIGESTIN DEL AMPLICN CON LA ENZIMA Bsu36 I Y ANLISIS DEL PATRN DE RESTRICCIN.

A partir del producto de amplificacin del gen de la cadena de la hemoglobina humana se realizar la digestin con la enzima Bsu36 I, isoesquismero de la enzima Mst II. Los patrones de restriccin luego sern visualizados en un gel de agarosa y analizados para determinar el genotipo. Materiales y reactivos Producto de amplificacin por el programa PCR ANEMIA Enzima Bsu36 I Tampn 10X especfico de la enzima Agua bidestilada y autoclavada Solucin de EDTA 0,5 M pH 8,0 Estufa a 37C Microcentrfuga Tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1,5 mL Micropipetas P20 y P200 Puntas para micropipetas 1-10 L, 20-200 L Guantes desechables

Protocolo 1. En un tubo estril de 1,5 mL realice la mezcla de digestin siguiendo el orden de la Tabla 5. 2. 3. Incubar a 37C por un perodo de 2 h. Detener la reaccin adicionando EDTA 0,5 M (pH 8.0) a una concentracin final de 10 mM.
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4.

Analizar todo el producto de la digestin mezclado con 3 L de tampn de carga, mediante electroforesis en un gel de agarosa al 3% en tampn TAE 1X. Incluir un marcador de peso molecular.

5.

Visualice el resultado mediante tincin del gel en una solucin de BrEt 0,5g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a una bandeja con agua destilada. Recuerde utilizar guantes.

6.

Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.

Tabla 5. Reactivos de la reaccin de digestin.

Componente
Tampn de la enzima 10X H2O calidad PCR Producto PCR Enzima Bsu36 I 10U.L-1 Volumen final

Cantidad (L)
1,5 7,5 10 1 20

Preguntas de la prctica 1. Cules son las caractersticas ms importantes que debe tener la enzima ADN polimerasa para la reaccin de amplificacin in vitro? 2. Investigue sobre otras enfermedades que puedan ser

diagnosticadas mediante el uso la tcnica del PCR. 3. Por qu debe agregrsele MgCl2 a la mezcla en la reaccin de la polimerasa? 4. Por qu el EDTA detiene la reaccin enzimtica?

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ANEXO 4 Resultados esperados del diagnstico por PCR-RFLP en el gen de globina humana En la figura 6 se muestra un ejemplo de los patrones de restriccin esperado cuando el producto e PCR de 536 pb del gen globina es sometido a digestin con la enzima Bsu36 I.

pb

Figura 6. Patrn de digestin del fragmento de 536 pb del gen globina cuando se digiere con Bsu36 I. M: Marcador de peso molecular X 174 Hae III. 1 en pb; Amplicn de 536 pb PCR sin digerir. 2: Digestin del ADN de un sujeto homocigoto para Hemoglobina A (HbAA). 3: Digestin del ADN de un sujeto heterocigoto (HbAS). 4: Digestin del ADN de un sujeto homocigoto para Hemoglobina S (HbSS).

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ANEXO 5

LECTURA GENTICA Y SOCIEDAD

Tomado y traducido de Hartwell y col., (2000) Genetics from genes to genome. McGraw Hill.
Pruebas de ADN mitocondrial reemplazan tipificacin HLA como evidencia de parentesco en cortes argentinas. Entre los aos 1976 y 1983, la dictadura militar gobernante de Argentina estudiantes secuestr, encarcel y asesin a ms de 10.000 universitarios, profesores, trabajadores sindicalistas

sociales, y otras personas opuestas al rgimen. Una gran cantidad de nios lactantes de meses desaparecieron en la crcel junto con los jvenes adultos, y cerca de 120 bebs nacieron en centros de detencin. En 1977, las abuelas de algunos de estos nios comenzaron a organizar vigilias en la principal plaza de Buenos Aires para servir de testigos e informar a la poblacin sobre la desaparicin de sus hijos y nietos. Estas mujeres rpidamente formaron un grupo defensor de los derechos humanos llamado Las Abuelas de la Plaza de Mayo. La meta de Las Abuelas fue localizar ms de 200 nietos a quienes sospechaban an con vida, y reunirlos con sus familias biolgicas. Para este fin, recolectaron informacin de diferentes testigos, como parteras y carceleras, y formaron as una red organizada para monitorear los documentos de inscripcin de nios en jardines de infancia. Los certificados de nacimiento dudosos podran revelar a un potencial nieto perdido. Este grupo tambin publicit su trabajo dentro de Argentina, y contactaron organizaciones de otras partes del mundo, incluyendo la United

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Nations Human Rights Comission y la American Association for the Advancement of Science (AAAS). Lo que el grupo de Las Abuelas de la Plaza de Mayo pidi a la AAAS fue su ayuda para realizar los anlisis genticos vlidos en la corte. Para el momento, la democracia haba remplazado al rgimen dictatorial militar y Las Abuelas de la Plaza de Mayo pudieron argumentar casos legales ante tribunales relativamente imparciales; los nios que haban sido secuestrados entre los 2 o 3 aos, o recin nacidos, tenan entre 7 y 10 aos de edad. An cuando Las Abuelas de la Plaza de Mayo haban recogido una gran cantidad de evidencia circunstancial, los tribunales argentinos no aceptaron esta evidencia como prueba de identidad de un infante y su relacin biolgica a una familia en particular. Sin embargo, los tribunales reconocieron que, a pesar de que el tamao y las caractersticas fsicas de los nios habran cambiado, sus genes -que los relacionaban inequvocamente a sus familias biolgicas- no lo habran hecho. Las Abuelas de la Plaza de Mayo, quienes se haban documentado de manera autodidacta sobre el potencial de estas pruebas genticas, buscaron ayudar con los detalles necesarios para obtener y analizar dichas pruebas. A partir de 1983, los tribunales argentinos acordaron aceptar los resultados de estas pruebas como evidencia de parentesco. En 1983, la mejor manera de confirmar o descartar la relacin entre dos o ms individuos (por ejemplo, un nio con sus abuelos) era comparando protenas (codificadas en genes) que constituyen los antgenos de los linfocitos humanos (HLAs por sus siglas en ingls, Human Lymphocyte Antigen). Las personas tienen una combinacin nica de marcadores HLA en sus glbulos blancos, o linfocitos, y estos marcadores son lo suficientemente diversos como para conformar una especie de huella molecular. El anlisis de HLA puede llevarse a cabo incluso si los padres del nio han fallecido, debido a que por cada marcador HLA, un nio hereda un alelo de los abuelos

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maternales y un alelo de los abuelos paternales. Los anlisis estadsticos pueden establecer la probabilidad que un nio comparta genes con unos abuelos en particular, debido a que son parientes, en comparacin con la probabilidad que el nio comparta estos genes por casualidad. La AAAS puso en contacto a Las Abuelas de la Plaza de Mayo con Mary Claire King, quien entonces trabajaba en la Universidad de California. En los aos 80, King ense a un equipo mdico argentino a analizar los diversos marcadores HLA de los glbulos blancos. Luego Las Abuelas obtuvieron los tipos de HLAs de la mayor cantidad posible de personas vivas en una familia con algn nio perdido, construyendo as un banco de datos de HLA. Cuando apareca un nio o nia a quien crean perdido, analizaban su patrn de HLAs y trataban de conseguir una correspondencia dentro del banco de datos de HLA. Dependiendo del nmero de alelos diferentes que portaba este individuo y la rareza de sus variaciones, la probabilidad que un nio en cuestin perteneciera a la familia que lo reclamaba variaba de 75% a 99%. Al final de los aos 80, la combinacin de evidencia circunstancial y gentica, haba ayudado a reunir a 49 nios con sus respectivas familias biolgicas. En uno de los casos, una abuela que haba sido secuestrada el 5 de septiembre de 1976, junto con su hija embarazada, y luego fue dejada en libertad, contact a Las Abuelas de la Plaza de Mayo buscando ayuda. Diez aos y medio despus, en abril de 1987, fue reunida con su nieta. Esta nia haba nacido el 5 de noviembre de 1976 y fue registrada a nombre de un oficial de la polica de un centro carcelario. Su lugar de nacimiento permanece desconocido. Sin embargo, su abuela en una entrevista de abril de 1987 dijo: Fue muy fcil comprobar que ella era mi nieta gracias a las pruebas de sangre. Analizaron mi sangre, la de mi esposo y la de sus otros abuelos y los resultados mostraron ms de un 99% positivo.

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A medida que transcurri el tiempo, y los casos fciles fueron resueltos, se evidenci las limitaciones de las pruebas de HLA. Para mediados de los 80, por ejemplo, haba muy pocos parientes vivos en algunas familias como para poder establecer una relacin confiable a travs de la tipificacin por HLA. Pero el surgimiento de nuevas tcnicas como el PCR y la secuenciacin de ADN hizo posible el anlisis directo del ADN. La profesora King junto a dos colegas, C. Orrego y A. C. Wilson, utilizaron las nuevas tcnicas para desarrollar una prueba de ADN mitocondrial (ADNmt) basada en la amplificacin por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls polymerase chain reaction) y la secuenciacin directa de una regin altamente variable, no codante, del genoma mitocondrial. El ADN mitocondrial tiene varias caractersticas que lo hacen una herramienta ms poderosa que la tipificacin de HLA para confirmar o descartar el parentesco en una determinada familia, como lo son: la herencia materna, la ausencia de recombinacin, una regin altamente variable y no codante de 331 pb, y un alto nmero de copias de ADNmt por clula. La herencia materna y la ausencia de recombinacin permiten que, mientras exista un pariente materno vivo con el cual comparar, este enfoque poda resolver los casos de parentesco ms disputados. La regin no codante extremadamente polimrfica hace posible la identificacin de nios a travs de la relacin directa de su ADNmt con slo una persona - su abuela materna, su ta o su hermano- en lugar de a travs de anlisis de clculos estadsticos evaluando cuatro personas; la probabilidad que dos individuos no relacionados sean idnticos en los 331 pb de ADNmt es prcticamente nula. Finalmente, el gran nmero de copias ADNmt por clula incrementa la probabilidad de aislar ADN e identificar los cuerpos de presuntos padres que han sido hallados luego de muchos aos.

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Para validar este enfoque de identificar abuelas con sus nietos, King y sus colaboradores amplificaron las secuencias de tres nios y sus tres abuelas maternas sin saber quien estaba emparentado con quien. La prueba de ADNmt relacion sin

ambigedades a cada nio con su respectiva abuela. De esta forma, luego de 1989, Las Abuelas incluyeron la informacin del ADNmt en sus registros. Hoy en da, los nietos/as-hijos/as de los desaparecidos/as, han alcanzado la adultez y han obtenido independencia legal. A pesar que la mayora de sus abuelas han muerto, pueden an descubrir el paradero de sus familias as como su identidad biolgica a travs de la data de HLA y ADNmt que Las Abuelas recopilaron.

Preguntas de la lectura 1. Qu significan las siglas HLA? 2. Cules son las limitaciones de la identificacin de relaciones de parentesco o filiacin utilizando los marcadores de HLA? 3. Por qu el genoma mitocondrial proporciona una herramienta ms poderosa para estos fines?

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BIBLIOGRAFA
Fleming A.F. (Editor) 1982 Sickle-cell disease a handbook for the general clinician. Churchill Livingstone. Edimburgo, Londres y Nueva Cork. Griffiths, A.J.F, J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 2002. Gentica. 7 Edicin. McGraw-Hill. Interamericana. Guevara, P., 2004 Identificacin y diagnstico molecular de microorganismos, manual de laboratorio. Proyecto iniciativa cientfica del milenio, red de innovacin tecnolgica IDMM. Ministerio de Ciencia y Tecnologa. IBE-UCV. http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT30785.pdf http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT31755.pdf Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White. 1990. PCR protocols: A guide to methods and applications. New York: Academic Press. Klug, W.S. y M.R. Cummings. 1998. Conceptos de gentica. 5 Edicin. Prentice Hall Iberia, Madrid. Leland H. Hartwell, Leroy Hood, Michael L. Goldberg, Ann E. Reynolds, Lee M. Silver y Ruth C. Veres 2004 Genetics from genes to genomes. Segunda edicin. Editorial MsGraw-Hill Lodish, H y Darnell, J. 2004. Biologa celular y molecular. 4ta edicin. Editorial Mdica Panamericana. Martnez, J., Blanco, Z., Hakshaw, P. y Moreno, N. 1998 Aplicacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnstico de la anemia falciforme en Venezuela. Sangre 43:63-66. Sambrook, J. y Russell, D. 2001. Molecular cloning. A laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.

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