AO DEL CENTENARIO DE MACCHUPICCHU PARA EL MUNDO INSTITUTO TECNOLOGICO PRIVADO SANTA ROSA DE LIMA

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS II MICROBIOLIGIA DE LA LECHE FRESCA DETERMINACION DE COLIFORMES Y MESOFILOS

PROFESOR:

JOSE LANDA DELGADO

ESCUELA:

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

ALUMNO:

ANTN RAMOS, GIOMAR

INTRODUCCIN

La leche debido a su composicin qumica y a su elevada actividad de agua, es un magnfico sustrato para el crecimiento de una gran diversidad de microorganismos. De entre los que se pueden encontrar en la leche, unos son beneficiosos, algunos son alterantes y otros son perjudiciales para la salud. La contaminacin de la leche ocurre ya en las zonas inferiores del interior de la ubre y cuando el producto abandona sta, la leche est expuesta a mltiples contaminaciones externas. Actualmente la contaminacin que alcanza ms relevancia es la del utillaje de lechera. (Ordeadoras, tanques, cisternas, transportadoras, tuberas, silos, etc.). La recogida, almacenamiento y transporte de la leche son operaciones que deben realizarse con la mxima higiene posible para conseguir una leche cruda de gran calidad microbiolgica. Es necesario que llegue a la industria en el tiempo ms corto y a la temperatura de refrigeracin ms baja posible (mximo a 4C). Los grupos microbianos ms importantes en lactologa pueden dividirse, desde un punto de vista funcional, en: bacterias lcticas, bacterias esporuladas, bacterias de origen fecal y bacterias patgenas.

OBJETIVOS

Emplear los mtodos adecuados para determinar el nmero de microorganismos viables en los medios de cultivos. Mantener la seriedad y fomentar la disciplina a la hora de realizar la prctica de laboratorio. Manejar con mucho cuidado los equipos y materiales expuestos en la prctica. Efectuar minuciosamente el pesado de compuestos para elaborar los medios de cultivos. Realizar un recuento de bacterias mesfilos viables en los medios de cultivos. Interpretar los resultados obtenidos mediante los parmetros propuestos. Aplicar criterios de exactitud y precisin en los clculos y preparacin de los medios de cultivos. Verificar el aprendizaje de las tcnicas de preparacin del material de laboratorio, mediante el resultado obtenido. Analizar las implicaciones de trabajar con instrumentos de laboratorio no acondicionados y practicar como acondicionarlos. Determinar los coliformes empleando el agar rambach.

FUNDAMENTO TEORICO MICROBIOLOGA DE LA LECHE La leche es un excelente medio de cultivo para numerosos microorganismos por su elevado contenido en agua, su pH casi neutro y su riqueza en alimentos microbianos. Posee una gran cantidad de alimentos energticos en forma de azcares (lactosa), grasa y citrato, y compuestos nitrogenados. Los alimentos nitrogenados se hallan en numerosas formas: protenas, aminocidos, amonaco, urea, etc. Por poseer azcares fermentescibles, en condiciones ordinarias lo que ms frecuentemente ocurre es una fermentacin cida a cargo de las bacterias; si no existen grmenes formadores de cido o si las condiciones son desfavorables para su actividad, pueden sufrir otros tipos de alteracin. Las principales alteraciones son las siguientes: Agriado o Formacin De cido Cuando la leche se agria suele considerarse alterada. La formacin de cido se manifiesta inicialmente por el olor agrio y la coagulacin de la leche, que produce una cuajada de consistencia gelatinosa o ms dbil, que libera un suero claro. La fermentacin cido lctica tiene lugar en general cuando se abandona la leche cruda durante algn tiempo a temperatura ambiente. Los grmenes lcticos causantes de esta fermentacin pueden ser homofermentativos que producen casi exclusivamente cido lctico y cantidades mnimas de otras sustancias, o heterofermentativos, que producen adems de cido lctico, cantidades apreciables de productos voltiles. El agriado de la leche cruda a temperaturas entre 10 y 37 C es generalmente causado por el streptococcus lactis, ayudado quiz por coliformes, micrococos, lactobacilos y enterococos. Las bacterias termfilas crecen a temperaturas superiores a stas, y se destacan: bacillus calidolactis, y lactobacillus thermophilus. A temperaturas prximas a 0 C, apenas si hay produccin de cido, pero la leche puede sufrir procesos proteolticos (escisin de las cadenas proteicas). Los grmenes lcticos no son los nicos capaces de provocar la fermentacin cida de la leche; pueden producirla muchos otros, especialmente si las condiciones no son favorables a las bacterias cido lcticas. Entre los grmenes capaces de acidificar la leche, fundamentalmente por producir cido lctico, se encuentran diversas especies de los gneros micrococcus, microbacterium y bacillus, pero en general ordinariamente son incapaces de competir con los grmenes lcticos. Diversas especies del gnero clostridium producen cido butrico en condiciones que impiden o inhiben la formacin normal de cido lctico. La leche, sometida a un tratamiento trmico capaz de destruir todas las formas bacterianas pero no los esporos de clostridium, puede sufrir la fermentacin acidobutrica con formacin de hidrgeno y dixido de carbono. Produccin De Gas: La produccin de gas por las bacterias va siempre acompaada de la formacin de cido. Las especies formadoras de gases ms importantes son las del gnero

clostridium, las bacterias coliformes, los aerobacilos (especies del gnero bacillus formadoras de gas) que liberan tanto hidrgeno como dixido de carbono y las levaduras y grmenes propinicos y lcticos heterofermentativos que producen slo dixido de carbono. La probabilidad de que se produzca gas o no y el tipo de microorganismos que lo originan depende del tratamiento a que previamente se halla sometido la leche y de la temperatura a la que se mantenga. En la leche cruda, a temperaturas comprendidas entre la de la sangre y la del hielo, los grmenes productores de gas con ms probabilidad de multiplicarse son los coliformes porque pueden competir bien con otros formadores de cido. El agriado de la leche o la crema por las bacterias favorece el subsiguiente desarrollo de las levaduras que se multiplican y actan mejor en un medio cido. A la temperatura que se mantienen la leche y la crema en la nevera es difcil que se desarrollen los clostridium y bacillus formadores de gas, que no son capaces de competir ventajosamente con los acidiformes a temperaturas elevadas, pero pueden actuar si stos no existen o si su actividad no es muy grande. Protelisis: La hidrlisis de las protenas lcticas por accin microbiana se acompaa en general de la produccin de un sabor amargo producido por algunos polipptidos. Las alteraciones producidas por los microorganismos proteolticos son: protelisis cida en la que tienen lugar simultneamente la protelisis y la produccin de cido, protelisis con acidez mnima e incluso con alcalinidad, leche cortada producida por enzimas bacterianas del tipo de la renina en una etapa inicial de la protelisis, y protelisis lenta por endoenzimas liberadas por bacterias despus de su autlisis. La protelisis cida puede estar producida por diversas especies del gnero micrococcus, algunos de los cuales se hallan en la ubre de la vaca. Uno de los estreptococos intestinales, el S. faecalis es un organismo cido lctico muy proteoltico. Como los dems enterococos es termodrico y capaz por tanto de producir protelisis en la leche pasteurizada. Los esporos de las cepas proteolticas de algunas especies de bacillus fermentadores de la lactosa, como el B. cereus, sobreviven a la pasteurizacin, e incluso a tratamientos trmicos ms drsticos, produciendo luego protelisis cida. Entre las especies de los gneros micrococcus, pseudomonas, proteus, achromobacter, flavobacterium y serratia hay grmenes muy proteolticos Obsrvese que estas especies desarrollan a temperaturas bajas por lo que son capaces de producir protelisis y amargor an en leche refrigerada. La protelisis lenta carece de importancia en la leche en circunstancias normales, pero la posee cundo las bacterias disponen de una cantidad considerable de tiempo.

CONTAMINACIN DE LA LECHE La leche se contamina por dos vas: Mamaria: Los mocroorg. Alcanzan la ubre, pueden llegar a contaminar la leche antes o despus del ordeo. Estos pueden alcanzar la leche por va mamaria por dos vas; 1) Ascendentes: Lo que hacen las bacterias que se adhieren a la piel de la ubre y posterior al ordeo, entran a travs del esfnter del pezn ( STAPHILOCOCCUS AUREUS,STREPTOCOCCUS, COLIFORMES). 2) Descendentes: o hematgena, son los microorganismos que pueden causar enfermedad sistmica o tienen la propiedad de movilizarse por la sangre y a travs de los capilares mamarios llegan a infectar la ubre (SALMONELLAS, BRUCELLAS, MYCOBACTERIUM TUBERCULOSO). Medio externo: La contaminacin se produce una vez extrada de la glndula mamaria. Los utensilios, tanques de almacenamientos, transportes e incluso el personal que manipula la leche, son Fuentes Principales de fuentes contaminacin de de la leche contaminacin. cruda fuentes

Animal: Cualquier lesin en el animal puede causar una elevada contaminacin, la ubre esta en contacto con el suelo, heno, etc., animales enfermos (mastitis) causantes de esta enfermedad es el STAPHILOCOCCUS AUREUS, el cual es resistente al tratamiento de antibiticos y no es destruida por la pasterizacin, la entero toxina que produce por su resistencia pudiendo llegar a causar enfermedades al consumidor.

Aire: Representa uno de los medios ms hostiles por la constante exposicin al oxigeno, cambios de temperaturas y humedad relativa, radiacin solar, etc. En el aire se pueden encontrar MICROCOCUS, STREPTOMYCES Y ESPIRGILLUS Y PENICILLIUM. Agua: usada para la limpieza de los equipos y utensilios de ordeo, higiene del animal y del personal, y encontramos microorganismos como PSEUDOMONAS y por contaminacin de estos de BACTERIAS Suelo: Principal fuente de microorganismos termoduricos y COLIFORMES. termfilos.

El oredeador o personal: juega un papel importante si se ordea de manera manual, si no se lava las manos y peor an se las humedecen e la leche misma para lograr lubricacin que facilite el ordeo. Aparece la contaminacin de con microorganismos PATOGENOS. macroorganismo COLIFORMES.

Estiercol: fuente

principal

Utensilios y transportes: Es importante una buena higiene por medio de agentes desinfectantes, afecta significativamente la calidad de la leche. La flora microbiana de esta fuente puede ser diversa, pero la ms frecuente es la flora termoresistente, razn ms que suficiente para exigir al mximo Control de la higiene. contaminacin

El empleo de sistemas de ordeo mecnico ayuda a reducir la contaminacin a partir del animal, ordeadoras, aires y suelo. De manera que la contaminacin en este caso estar mayormente en los tanques de almacenamiento y en el sistema de ordeo en s mismo; a travs de campaas de educacin se puede reducir la contaminacin por parte del personal, as como una supervisin cercana para evitar que personas enfermas participen en la labor diaria del ordeo. Deben ejecutarse programas sanitarios preventivos sobre el rebao, con lo cual no solo se logra un producto de buena calidad sino que tambin se incrementa la productividad. Adems debe evitarse ordear animales enfermos o bajo tratamiento medicinal, tomando en cuenta las principales fuentes de contaminacin, pueden tomarse diversas medidas encaminadas a evitar el contacto de estas con la leche y mejorar su calidad sanitaria final.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS Balanza digital Incubadora Balanza analgica Mechero Placas petri Vaso beacker Pizetas Agua destilada Enlermeyer Tubos de ensayo Papel Gradilla AGAR RAMBACH APC AGUA PEPTONA Algodn Pabilo Autoclave Muestra de leche Suplemento del agar rambach Esptula

PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Primeramente realizamos la preparacin del material , todos los materiales a utilizar son forrados con papel de molde, excepto tubos de ensayo, enlermeyer a los cuales se les crea tapones de algodn y solo la parte superior de estos son forrados con papel, posteriormente son llevados al autoclave para ser esterilizados.

MEDIO DE CULTIVO PLATE COUNT AGAR Composicin: Triptona (5g), extracto de carne (2,5g), Dextrosa (1g), agar (15g) y agua destilada.

Preparacin:

22.5 X x=1.125g

1000ml 50ml

AGUA PEPTONADA (LQUIDO DE DILUCIN) Composicin: Peptona (10g), cloruro de sodio (5g), y agua destilada.

Preparacin:

1g X

1000ml 280ml X= 0.28g

 AGAR RAMBACH: Peptona 5.0 g, Cloruro de sodio 5.0 g, Desoxicolato de sodio 1.0 g, Mix cromognico 1.5 g, Cloruro de sdio 5.0 g, Proplylene glycol 10.5 g, Agar agar 15.0 g Preparacin: 7.6g X 250ml 50ml x= 1.52g

El APC se diluyen por calentamiento en bao mara debido a que contiene agar en su composicin. Al agar RAMBACH debido a qu contiene sustancias cromgenas solo se diluye en bao mara y no se lleva a la autoclave a diferencia del APC y el AGUA PEPTONA.

Para preparar el agua peptona, luego de haber realizado el pesado exacto es diluido en 280ml de agua destilada y esta cantidad es distribuida en dos matraz cada uno de 90 ml y lo restante en 10 tubos de ensayo (9 ml de agua de peptona en cada tubo) y es llevado al autoclave para ser esterilizado expresados como 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5.

 Para realizar la siembra de microorganismos primeramente tomamos 10ml de muestra de leche fresca con una pipeta graduada para luego ser incorporada en un baln qu contiene agua peptona y generar la dilucin 10-1, y luego formar otras diluciones -5 incorporando 1ml de la primera dilucin hasta llegar a 10 .

Luego obtener las diluciones se prosigue a realizar la siembra por incorporacin en el APC para la determinacin de mesfilos en la muestra de leche fresca, realizndolo en dos placas con diluciones de 10-4 y 10-5 ambas placas duplicadas. Luego se rotulan.

Al igual realizamos la siembra de microorganismos en el AGAR RAMBACH pero en este caso se realiza por superficie empleando diluciones de 10-2 y 10-3en placas duplicadas.

 Por ultimo se realiza la incubacion de los medios de cultivos, previamente envueltos y rotulados a 35C por 24 horas.

RESULTADOS DETERMINACION DE BACTERIAS HETEROTROFICAS (RTMV) 1. muestra de leche fresca (mercado de Huacho) POSITIVO INTERPRETACION 10-4 1010104 5 5

193 173 25 33

366/2=183 x 104 183 x 103UFC/ml 58/2=29 x 105 290 x 103 UFC/ml 473000/2=236500 236.5 x 103ufc/ml

DETERMINACIN DE COLIFORMES (AGAR RAMBACH) 1. muestra de leche fresca (mercado de Huacho) POSITIVO INTERPRETACION 10-2 10-2

15(azul), 3(rojos) 13(azul) ,2(rojo)

2800/2=1.4 x 102 ufc/ml 500/2=2.5 x 102ufc/ml 7 x 102ufc/ml

10-

negativo 7(azul)

10-3

Colonia Rojo =citrobaccter, klebsiella o enterobacter. Colonia Azul= escherichia coli

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES En la preparacin del agar rambach se tuvo qu tener en cuenta pequeos detalles como agregar el suplemento de este medio de cultivo y tambin el de no llevar al autoclave debido a qu este medio de cultivo contiene sustancias cromgenas y estas a elevadas temperaturas se degradan y no se podr diferenciar el crecimiento de distintas colonias. En esta prctica realizada se pudo observar que no hubo un buen manejo de las tcnicas de siembra de microorganismos ya qu al momento de realizar la lectura una de las placas arrojo un resultado negativo qu no debera verse de esa manera, concluyendo a qu la siembra realizada en esa placa no fue muy buena. Para realizar la interpretacin se toma como eje principal los parmetros de RTMMV y luego se procede a realizar los clculos como lo indica las normas tcnicas peruanas. La leche fresca analizada arrojo un resultado positivo en la determinacin de mesfilos y de coliformes, ocasionando una gran preocupacin ya qu se encuentra por encima del lmite de las normas tcnicas peruanas. El anlisis microbiolgico realizado nos da como conclusin qu el expendio de leche fresca qu se realiza en el mercado es un foco infeccioso qu puede causar daos a aquellas personas qu consuman este tipo de leche sin ser pasteurizada. Se debe realizar una capacitacin de BPM y normas fitosanitarias a aquellas personas qu se dedican a la venta de productos altamente infecciosos al momento de ser consumidos. Se pudo observar cmo actan las enzimas de los distintos microorganismos, encontrando el sustrato especfico en el agar rambach y estas a la vez son diferenciados por distintos colores debidos a las sustancias cromgenas contenidas en este agar.

BIBLIOGRAFIA http://www.slideshare.net/badomicrobiologa-de-alimentos http://es.scribd.com /Microbiologa-de-Alimentos http://www.buenastareas.com/Recuento-De-Microorganismos-mesofilos http://www.ins.gob.pe/fichasins/ficha_tecnica.asp?codart=INS0900006395