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Mrquez Vizcano et al.

ALCALOIDES INDLICOS DEL EXTRACTO ETREO DE LAS SEMILLAS DE LA Tabernaemontana coronaria APOCYNACEAE Y EFECTO SOBRE EL CRECIMIENTO VEGETATIVO EN UN CULTIVO DE Hellianthus annus (GIRASOL).
RITA LUZ MARQUEZ VIZCAINO1, CATALINO RAFAEL DE LA ROSA TORRES2, Grupo de Investigacin Fotoqumica GIFUS, Departamento de Biologa y Qumica Universidad de Sucre, fitorita@yahoo.es. Sincelejo Sucre; *Departamento de qumica, Universidad Atlntico, cdelarosa@yahoo.com. Barranquilla Atlntico. Resumen: La qumica del extracto etreo de las semillas de la planta Tabernaemontana coronaria present seis alcaloides indlicos, identificados por cromatografa de gases acoplada a masa usando la base de datos Wiley 138.L C 19H24N2; C20H26N2O; C20H24N2O; C21H24N2O3; C20H26N2O2; C19H20N2. Respectivamente. ibogamina, 12- metoxyibogamina, voaluteina . La base alcaloide del extracto de las semillas de la Tabernaemontana coronaria produjo un aumento en la elongacin de las races, tallos, y rea foliar a una concentracin de 1x10-7 ppm, a esta concentracin present un incremento en biomasa. Confirmado lo anterior por los ndices de crecimiento absoluto, relativo y tasa absoluta de crecimiento. Key Word Index: Tabernaemontana coronaria, Apocynaceae, Hellianthus annus, Alcaloides indlicos, ibogamina, 12- metoxyibogamina, voaluteina, cromatografa de gases. INTRODUCCION Las plantas, elaboran una inmensa serie de productos naturales, ya que debido a su inmovilidad, son las especies de seres vivos que ms han tenido que desarrollar mecanismos de interaccin qumica con su entorno, establecindose as una pirmide de relaciones de la planta con el resto del ecosistema. Ante esta forzada inmovilidad a que se ven sometidas las plantas ha hecho que se desarrollen, de forma ms pronunciada, mecanismos qumicos de defensa. La qumica de la especie T. coronaria (BRAKO, 1993) presenta alcaloides de tipo indlico derivado del triptfano, (MIET, 1979) que genera muchas respuestas fisiolgicas y con frecuencia puede ser decisivo en procesos de crecimiento.

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El gnero Tabernaemontana presenta compuestos del tipo terpenoides lignanos, glicosidos y alcaloides ms especficamente indlico y bisindlicos (GARCIA, 1975) que han despertado inters como, anticancergenos (vinblastina y vincristina); antivirales y citotxicos (lanchnerina); hipertensivos (yohimbina) y antifertilizante (coronaridina) ( TORRENEGRA RUBEN y PEDROZO JULIO, 1984); lo que conlleva a la investigacin en este gnero, para contribuir en el desarrollo de la investigacin fitofarmacolgica en nuestro pas a travs de la utilizacin de los recursos naturales. La capacidad de cada pas de dominar y apropiar nuevas metodologas cientficas y tcnicas, conjuntamente con la riqueza de sus recursos naturales, son las armas fundamentales para lograr un crecimiento econmico, desarrollo social y ambiental sostenido, ya que facilitar nuevas posibilidades para acceder a un mercado cada vez ms globalizado, altamente competitivo y exigente. DISTRIBUCIN GEOGRFICA Las especies pertenecientes al Genero Tabernaemontana ocupan extensas regiones a nivel mundial; desde el este de Asia, hasta Australia (T. pandacaqui ) hasta pequeas regiones de distribucin en el Caribe y la costa norte en Sur Amrica ( T. heterophyla, T. sanenho, T. siphilitica, T. amygdalifolia, T. angulata, entre otras). Algunas de las cuales han sido introducidas como especies ornamentales, siendo posible encontrarlas en zonas residenciales; otras ocupan zonas o reas restringidas en las que actan como indicadoras de la vegetacin predominante del sector o, propias o endmicas, permitindole adaptarse a todos los tipos de climas, generalmente desde alturas que van desde los 0 hasta los 3200 m.s.n.m.(LEEUWENBERG, A.J.M. 1991,1987, 1983 y 1980). En Colombia, las especies del gnero Tabernaemontana suelen encontrarse en las regiones clidas de las costa Caribe, desde la Sierra Nevada de Santa Marta y sus estribaciones, hasta regiones de sabanas, siendo los bosques hmedos, bosques de niebla y los bosques premontanos sus habitts naturales, sin descartar su presencia en sectores de bosques secundarios dentro de las formaciones de bosque seco tropical, con enclaves hmedos definidos los cuales presentan una diversificada vegetacin.(MARQUEZ, 1999) Tabernaemontana coronaria es una especie difundida en clima templado, es cultivada en el municipio de Medelln Antioquia, Colombia. Se encuentra identificada botnicamente en el Herbario FAC. NAL. De Agronoma, Medelln, Colombia, por el seor G. Gutirrez V. con el N 476 de Agosto 28 de 1966 y fue reidentificada por el Sr. Ramiro Fonnegra G. bajo el N 1479 del 3 de Marzo de 1980. . (MARQUEZ, 2000) Es un arbusto originario de Centroamrica conocido vulgarmente como "cojn de fraile", produce un ltex queratoltico. El arbusto alcanza aproximadamente 2 m. de altura, tallo ramificado, hojas opuestas de forma entera, presenta inflorescencia de color blanco; con aroma (ACHENBACH, 1980). En Colombia el ltex se utiliza para el tratamiento de verrugas, que con un tratamiento largo y continuo de 7 a 12 das la verruga de la piel se seca sin dejar cicatriz (GARCIA, 1975).

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Las plantas pertenecientes al gnero Tabernaemontana producen alcaloides indlicos, derivados del triptofano, adicionalmente agrupados como unidades mono terpenoides o indol-terpenoides (iridoides), con diversos subgrupos los cuales dependen del modo de ciclizacin posterior a la remocin de la glucosa de la estrictosidina sintaza (Roberts & Wink, 1998); al igual que muchas otras especies de plantas incluidas en la misma subfamilia, Plumerioidae, la subfamilia Apocynoidae se caracteriza por la acumulacin de glicsidos esteroidales como principal metabolito secundario. (TORRENEGRA, 1987). EXPERIMENTAL Material Vegetal: Semillas recolectadas en la ciudad de Medelln (Colombia). Identificada botnicamente en el Herbario FAC. NAL de agronoma, Medelln (Colombia) por el Sr. G. Gutirrez con el N 476 de agosto 28 de 1966 y fue reidentificada por el Sr. Ramiro Fonnegra G. bajo el N 1479. Cromatgrafo de gases acoplado a masa modelo HP5890A series II (GC), detector HP5972, temperatura 100C hasta 280C a 5C/minuto, corriente de Helio 99,9995%, MS 70 eV; placas cromatogrficos de silica gel con fluorescencia, Columnas; fases mviles (P-1) ter de petrleo-acetato de etilo (8:2); (P-3) ter de petrleo-acetato de etilo (7:3); Deteccin UV y sulfato crico amnico (MEYER et-al, 1973). EXTRACCION Y AISLAMIENTO Semillas (900 g) secas y trituradas extradas con ter de petrleo; concentrado a presin reducida obteniendo 329 g; present un precipitado de color amarillo 76,5 g y un aceite que fue separado por decantacin. Al aceite se le realiz extraccin sucesiva liq-liq con HCl al 2%; la solucin cida se ajust a pH 9 con [NH3] obteniendo un precipitado blanco 21,58 g. 5 gramos de aceite se saponific con 20 mL de solucin de NaOH al 12.5% (1:1) agua etanol; ms 20 mL de solucin hidroalcohlica al 95% por 3 horas en reflujo. Se dej enfriar, se lav con solucin saturada de NaCl y agua helada; disolvi el precipitado en agua destilada con agitacin constante y acidificado con HCl; el material insaponificable fue separado, secado al vaco y solubilizado en ter de petrleo, se cromatografi ccd con ter de petrleo y revel con vainillina; observndose 5 manchas de color azul. Se pas por una columna de 25 cm de largo por 3 cm. de dimetro fase estacionaria slica gel-60 y fase mvil Ep y Ep:AcOEt (9:1; 8:2) colectndose 14 fracciones. FRACCIN SAPONIFICABLE. Se extrajo sucesivamente con CHCl3 se concentr y cromatografi ccd con Ep: AcOEt (7:3) y revelada con vainillina observndose dos manchas rosadas. Las fracciones saponificables present un slido soluble en CHCl3, se purifica por una microcolumna se obtienen dos slidos codificados como S 1 y S2, solubles en CHCl3 se sometieron a separacin e identificacin por cromatografa de gases acoplada a gases con una columna de 50 cm de longitud, 0.20 mm de dimetro fase HP-5 espesor 0.33m, velocidad del gas de arrastre 1.01mL /min. El cromatograma mostr una

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seales a 18.677 - 21.077 -28.105 -31.173 -36.071 - 36,24 - 37.440 minutos (ver figura 1 y 2). PRUEBA BIOLOGICA Se prepararon tres soluciones con 5 gramos de base alcaloide del extracto de la semilla de T. coronaria para el montaje del cultivo de plantas de girasol (Helianthus annus) de, 1x10-3, 1x10-5 y 1x10-7 ppm. MONTAJE DEL CULTIVO DE Helianthus annus. Se tomaron 4 parcelas de 1m2 en un terreno con suelo orgnico preparado para la siembra, se introducen 20 semillas de girasol a una profundidad de 4cm y separadas 20 cm entre si, fueron regadas con 300mL de la solucin correspondiente a partir de la primera semana de germinacin., la parcela nmero cuatro era el blanco agua, a los 8 das de tratamiento se tomaron tres plantas por parcela y se determin rea foliar, longitud total, longitud de raz, del tallo. Cada una de las partes de las plantas se sec por 24 horas a 105 C y se determin la biomasa seca. Y se calcularon los ndices de crecimiento. DISCUSIN DE LOS RESULTADOS De la fracciones S1 y S2 por cromatografa de gases acoplada a masa se identificaron los alcaloides indlicos EM m/z (intensidad relativa),276 [M+] (28); 247(100); 218(38); 208(30) base de datos nbs75k.L, 3- metil-3H-naphth[1,2-E] indol-10-ol tiempo de retencin 36.244 minutos formula molecular C19H20N2 . EM m/z(intensidad relativa), 280[M+] (60); 265(15); 195(40); 149(38); 136(100); 122(38). Base de datos wiley138.L ibogamina, tiempo de retencin 18.677 minutos formula molecular C19H24N2. (Ver figura 3 y 4) EM m/z (intensidad relativa)308[M+] (100); 293(12); 198(14); 154(25). Base de datos NBS75K. L tiempo de retencin 31.173 minutos formula molecular C20H24N2O. EM m/z(intensidad relativa) 310[M+] (48); 295(10); 225(44); 186(15); 149(38); 136(100); 122(33). Base de datos Wiley138.L, tiempo de retencin 37.440 minutos. 12metoxyibogamina. Formula molecular C20H26N2O. EM m/z (intensidad relativa) 326[M+] (100); 311(12); 176(28); 150(73); 138(40); 122(53). Base de datos wiley 138.L, tiempo de retencin 21.077 minutos voaluteina formula molecular C20H26N2O2. EM m/z (intensidad relativa) 352 [M+] (63); 337(18); 281(19); 207 (58); 154(30); 136(100); 124(40).tiempo de retencin 36.701 minuto. Formula molecular C21H24N2O3. EM m/z (intensidad relativa) 382 `[M+] ( 57); 367(12); 297(18); 258(20); 160(28); 136(100); 122(38). Tiempo de retencin 28.105 minutos. Al tratar un cultivo de girasol con diluciones de la base alcaloide de, las semillas de T. coronaria, a las concentraciones de1x10-3 , 1x10-5 y 1x10-7 ppm y agua como control

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durante seis semanas, se observ que estos tratamientos influyen de una u otra forma en el normal crecimiento de las plantas; (Ver Tabla 1,2,3 y 4.) AGRADECIMIENTO Al Rubn Daro Torrenegra. Departamento de Qumica Pontificia Universidad Javeriana, por su colaboracin. Ledy Ruz; Julio Hernndez, Cristian Arrieta y Rafael. Ingenieros Agrcolas universidad de Sucre. Grupo de Investigacin Fotoqumica de la Universidad de Sucre Tifus. LABORATORIOS WACOL LTDA, J.T. BAKER por su colaboracin. REFERENCIAS ACHENBACH HANS, BENIRSCHKE MONIKA and TORRENEGRA RUBEN , Phytochemistry. Vol 45 N 2. 1997p. 325-335 ACHENBACH, Hans and RAFFELSBERGER, Bernd . Chemisches Laboratorium der Universitat Freiburg, Albertstrabe. 21, 0-7800 Freiburgi. Br. Z. Naturforsch. 35b, 885-891 (1980); eingegangen am 4. Februar 1980. Bauche. 14267. HERBARIO FAC. NAL de Agronoma Universidad Nacional de Colombia sede Medelln 1966. Bauche 17574 HERBARIO FAC.NAL de Agronoma Universidad Nacional de Colombia sede Medelln 1980. BRAKO, Lois and Zarucchi, James L.(1993) Catalogue of the Flowering plantsand Gymnosperms of Per. Missoun Botical Garden. 59-70. BRAKO, Lois and ZURUCCHI, James L. Catalogue of the flowering plants and Gymnosperms of Peru. Missouri Botanical Garden. 1993 p. 59-70. C. MIET, N. KUNESCH , J. POISSON EL C. MORETT I, communication ou colloque "Substances Naturelles d'lnteret Biologique du Pacifique 11 Noumea (Nouvelle - Caledonie), AoO 1979. GARCIA BARRIGA, H. (1975) Flora medicinal de Colombia. Vol. 451. Imprenta Nacional Bogot. LEEUWENBERG, A.J.M. 1980. In Indole and Biogenetically Related Alkaloids, Phillipson, J. D., Zenk, M. H., eds., pp. 1 10. Academic Press. London. LEEUWENBERG, A.J.M. 1983. Some Remarks on the Taxonomy of Plumerioidae (Apocynaceae). Bothalia, 14: 799 801. LEEUWENBERG, A.J.M. 1987. Series of Revisions of Apocynaceae. Part XXI XXIII. Agric. Univ. Wageningen Press, 87 5 : 1 60.

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LEEUWENBERG, A.J.M. 1991. Revision of Tabernaemontana The Old World Species. Part I. Royal Botanic Garden, Kew. Whistable Litho, Ltd, Whistable, U.K. MEYER, W. E. J. A; COPOLA and Goldeman, L. 1973. Alkaloid studies VIII Isolation and characterization of alkaloids of Tabernaemontana hey neanwall and antifertility properties of coronaridine. J. Pharm. Sci 62 : 1199. ROBERTS, M. F. y WINK, M. 1998. Alkaloids, Biochemistry, Ecology and Medicinal, Applications. Plenum Press, New York. TORRENEGRA, R y PEDROZO J. 1984. Estudio qumico de plantas colombianas de familias Compuestas y Apocynaceae. Anexo. Colciencias. TORRENEGRA, R. PEDROZO, J. A., ACHENBACH, H. AND BAUEREIB P, Phytochemistry . Vol 27 N 6.1987p.1843-1848.

TABLA 1

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Longitud total promedio de plantas de girasol tratadas unas en condiciones normales (H2O) y otras con diluciones de 1x10-7, 1x10-5, 1x10-3 ppm de base alcaloide del extracto de las semillas de T. coronaria durante 6 semanas.

Semana N 1 2 3 4 5 6

Longitud total en m 1X10 0.134 0.206 0.371 0.453 0.748 1.175


-7

1X10 0.197 0.276 0.354 0.431 0.502 0.608

-5

1X10 0.129 0.206 0.268 0.351 0.383 0.458

-3

Normal 0.166 0.265 0.382 0.566 0.780 0.883

GRAFICA 1 Relacin de la longitud total promedio de plantas de girasol tratadas, unas en condiciones normales (H2O) y otras con diluciones de 1x10-7, 1x10-5, 1x10-3 ppm del extracto de las semillas de T. coronaria con el tiempo
1,400 1,200 1,000

Longitud (m)

0,800 0,600 0,400 0,200 0,000

1X10-7 1X10-5 1X10-3 H2O

Tiempo en semanas

TABLA 2

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Incremento de biomasa promedio de plantas de girasol tratadas unas en condiciones normales (H2O) y otras con diluciones de 1x10-7, 1x10-5, 1x10-3 ppm del extracto de las semillas de T. coronaria durante 6 semanas.
Tratamiento 1X10 1X10
-7 -5 -3

Incremento 17,330 1,720 0,560 3,770

1X10 H2O

GRAFICA 2 Incremento de biomasa promedio de plantas de girasol tratadas unas en condiciones normales (H2O) y otras con diluciones de 1x10-7, 1x10-5, 1x10-3 ppm del extracto de las semillas de T. coronaria durante 6 semanas

TABLA 3 Diferencia de biomasa de plantas de girasol a concentraciones de 1x10 -7, 1x10-5, 1x10-3 ppm del extracto de las semillas de T. Coronaria con plantas a condiciones normales.
1X10-7 -0,06 0,24 1,18 1,1 6,09 13,49 1X10-5 -0,07 -0,1 -0,49 -1,5 -2,3 -2,54 1X10-3 -0,09 -0,16 -0,57 -1,55 -2,36 -3,31

GRAFICA 3 Diferencia de biomasa de plantas de girasol a concentraciones de 1x10 -7, 1x10-5, 1x10-3 ppm del extracto

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TABLA 4 Tasa de crecimiento absoluto (TCA), crecimiento relativo (TCR), tasa foliar unitaria (TFU), relacin del rea foliar (RAF), de plantas de girasol, tratadas unas en condiciones normales (H2O) y otras con diluciones de 1x10-7, 1x10-5, 1x10-3 ppm del extracto de las semillas de T. coronaria durante 6 semanas. Tratamiento Normal [] 1 x 10-7 ppm [] 1 x 10-5 ppm [] 1 x 10-3 ppm TAC (g/m2 x Sem) 0.755 3.466 0.344 0.112 TCR (G/g x Sem) 0.622 1.013 0.580 0.416 TFU (g/m2) 0.531 0.835 0.529 0.415 RAF m2/g 2.980 3.043 2.914 2.257

Figura 1 Cromatograma de S2

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Figura 2. Cromatograma de S2

Figura 3 Espectro de masa de ibogamina

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Figura 4. Espectro de masa de 12- metoxi- ibogamina

H H N H N H CH3O 2C H
N CH3O N H

H H H CH3 CH3O2C

CH3

CORONARIDINA

VOACANGINA

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