CROMATOGRAFA

1. Introduccin La cromatografa, es la tcnica de anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. Esta tcnica depende del principio de adsorcin selectiva (no confundir con absorcin). La cromatografa fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, Mijal Tswett en 1906, pero su uso no se generaliz hasta la dcada de 1930. Tswett separ los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. A medida que la disolucin va filtrndose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente. 2. Objetivo Aplicar la tcnica de cromatografa en columna para separar una mezcla de azul de metileno anaranjado de metilo. Trabajar con placas de cromatografa en capa fina (c.c.f.) y de papel de dimensiones particularmente menores. Para el analizar la relacin de frente. Y observar el comportamiento en esta tcnica cromatografa. Conocer que es la electroforesis y sus aplicaciones en la biologa. Diferenciar entre la c.c.f. y la de papel. Interpretar los valores de Rf

3. Metodologa

A. CROMATOGRAFA EN COLUMNA Materiales: Algodn Columna cromatografa Etanol (solvente) Silicagel Mezcla (azul metileno + anaranjado de metilo)

Procedimiento:

A. PREPARACIN DE LA COLUMNA:
Introducir un trozo de algodn hasta el fondo de la columna. Adicionarle etanol hasta las3/4 parte. Agregar una suspesion formada al agitar 10g de Silicagel y etanol. Abrir la llave hasta que la altura del solvente sea de 1cm por encima de la superficie del adsorbente.

B. SIEMBRA:
Depositar 20 gotas de la mezcla a separar. Abrir la llave hasta que todo el colorante sea absorbido por la fase fija.

C. ELUCIN:
Ir adicionando mas etanol hasta que se eluya todo el naranja de metilo. Cambie de recipiente y eluya el azul de metileno; agregando el solvente agua acidulada para eluir este segundo coloarnate.

B. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY) Materiales: Dos placas portaobjetos. Mezcla de silicagel y cloroformo Mezcla de anaranjado de metilo + azul de metileno Anaranjado de metilo Recipiente (cmara de desarrollo) Solvente (1 propanol butanona agua)

Procedimientos:

Preparamos las placas introduciendo 2 lminas portaobjetos (juntas) en una mezcla (Silicagel + Cloroformo).

Dejar secar y sealar 2 puntos (equidistantes de los bordes entre s) en una lnea imaginaria a 1cm del borde inferior.

En uno de los puntos se siembra 3 gotas de la mezcla (anaranjado de metilo + azul de metileno) y el otro anarajando de metilo. Cuando el solvente est por llegar al borde superior de la plaquita, retire est, marque el frente del solvente, dejar secar y calcule el Rf.

Introducir la placa en una cmara de desarrollo que contiene la fase mvil (1propanol-butanona-agua 4:1:1)

C. CROMATOGRAFA SOBRE PAPEL Materiales: Tubo de ensayo Papel filtro Azul de metileno Mezcla ( Azul de metileno y anaranjado de metilo) Tubo capilar

Procedimiento:

un papel filtro. Establecer dos puntos equidistantes (de los bordes entre s) que se encuentre en una lnea imaginaria a 1cm del borde inferior.

1. Sobre

2. Sealar los puntos de siembra. En uno de los puntos con un tubo capilar, depositar 3 gotas de la muestra, en la otra 3 gotas del azul de metilo.

4. Cuando la fase mvil haya ascendido unos 8-10 cm, retire el papel y marque el frente del solvente.

3. Dejar unos minutos para que se evapore el solvente de siembra. Introducir la tira en un tubo de ensayo que contiene la fase movil (1- propanol butanona).

4. Conclusiones En la cromatografa en columna observamos que la cromatografa se basa en la diferencia de velocidad con que se desplazan los componentes de una mezcla de compuestos que se encuentran entre dos fases en ntimo contacto. El azul de metileno que es mas polar queda retenido y se necita un solvente mas polar como el agua acidulada para su adsorcin; mientras que el anaranjado de metilo es menos polar por lo que sale ms rpido y solo necesita de etanol debido a que es menos polar para su disolucin. En la cromatografa en capa fina (Thin Layer Chromatography) el uso de un adsorbente eficiente como el Silicagel que se aplica en al portaobjetos formando una capa delgada y uniforme; esto hace de la c.c.f. un mtodo verstil, sensible, rpido y eficiente. La distancia recorrida por el anaranjado de metilo es 1cm y la distancia recorrida por la mezcla (naranja de metilo + azul de metileno) es 2cm. En la cromatografa sobre papel, se da el fenmeno de adsorcin. Se utiliza el papel filtro como soporte de la fase fija (que puede ser normalmente el agua que contiene en un 22% u otro lquido con el que se ha impregnado el papel). Y la fase mvil es (1-propanol-butanona-agua). La relacin de frente respecto al azul de metileno fue de 2,2/8; y la relacin de frente de la mezcla fue de 2,6/8.

5. Bibliografa Lederer E. y Lederer M. Cromatografa: Revisin de sus principios y aplicaciones. Editorial EL ATENEO. Buenos Aires. Argentina. Harris D.C., Anlisis Qumico Cuantitativo, 2 edicin. Editorial Revert. Espaa. 2001 Campbell N., Mitchell L. y Reece J., Biologa conceptos y relaciones. 3 edicin. Editorial Prentice Hall. Mxico.

CUESTIONARIO 1 1.- Cul es la principal utilidad de la cromatografa en columna? La importancia de esta tcnica radica en: Podemos separar mezclas, por adsorcin, particin y separacin inica. Adems esta tcnica se realiza en forma descendente

2.- Qu fenmenos fsicos intervienen en una columna cromatografa que utiliza silica gel como fase fija? Adsorcin Desorcin Dilucin Solubilidad

3.- Cules son las principales diferencias entre el HPCL y una columna cromatografa simple? La cromatografa HPLC es ms eficiente y de resolucin que la de columna simple. En la cromatografa de columna simple se pude separar mezclas por adsorcin, reparto, intercambi inico. En cromatografa HPLC se pude usar distintos tipos de relleno de la columna: Adsorbentes de distinto grado de polaridad materiales no polares, resinas de intercambio inicos soportes de seleccin por tamao molecular y otros materiales especiales. Adems la cromatografa HPLC puede ser automatizada, pero esta implica un costo muy elevado.

4.- Cul es el principal factor que hace que la HPLC sea mucho ms eficiente que una columna cromatografa simple? La eficiencia de la columna cromatografa HPLC se debe a que la fase estacionaria est formada por partculas esfricas muy pequeas y de tamao uniforma. As, se usan a menudo micro esferas con un tamao de 5 a 10 micrones 5.- Estamos operando una columna cromatografa usando como absorbente silica gel y casi todos los compuestos se han eluido, excepto un compuesto que no es eluido con este solvente Qu cambios introducir para poder eluirlo? Si el solvente elegido no consigue eluir todas las sustancias de la mezcla es recomendable agregar 2 3 gotas de solventes de distinta polaridad, que resultan ser ms eficientes que solventes puros.

6.- Como se puede trabajar con sustancias incoloras en una columna cromatografa, sino es posible localizar las sustancia dentro de la columna? Podemos realizar el anlisis del eluato por cromatografa en capa fina o sobre papel, por lo que se hace necesario el uso de un revelador para la localizacin de las sustancias. 7.- que tipo de cromatografa utilizara para eliminar sales minerales que estn contaminando una muestra de cafena? Usaremos la cromatografa de intercambio inico. 8 - Que es un colector de fracciones y cul es su principal utilidad? Es un instrumento que se usa para el anlisis del eluato al final de la cromatografa. El colector de fracciones nos permite un alto grado de automatizacin de nuestro sistema de separacin cromatografa, aumentando la precisin, el rendimiento as como la comodidad de funcionamiento.

9 - Qu diferencias encuentra usted entre la cromatografa de gases y la cromatografa en columna? Una de las diferencias seria que la cromatografa en columna se hace con fase fija en estado solid o lquido a cambio la cromatografa de gases se realiza con fase fija necesariamente tiene que ser un gas. Adems la cromatografa en gases se realiza ah una temperatura superior a la del medio ambiente.

10 - Que son las resinas de intercambio inico y cul es su utilidad? Son sustancias insolubles con un alto peso molecular que tienen grupos inicos en su molcula que pueden ser intercambiados cuando estn en una solucin que tenga sales. Al entrar en contacto con la solucin cambia su ion (H+) por un catin de la solucin y su (OH-) por un anin de la solucin. CUESTIONARIO 2 1. Qu entiende Por Rx?

Las reacciones son procesos por los cuales una o ms sustancias se transforman en otras cuyas propiedades son diferentes. Para que exista una reaccin debe existir una sustancia que reacciona y otra que se transforma. Generalmente, se puede decir que ha ocurrido una reaccin si se observa que al interactuar los "supuestos" reaccionantes se da la formacin de un precipitado, algn cambio de temperatura, formacin de algn gas, cambio de olor o cambio de color durante la reaccin.

2.

Cules son las diferencias entre la c.c.f. y la de papel? Cromatografa en Capa fina Uso de portaobjeto Cmara de desarrollo Uso de silicagel + Cloroformo Cromatografa en Papel Uso de papel filtro Tubo de ensayo Solo uso de las muestras

3.

Cite algunas aplicaciones de la cromatografa en su especialidad

La cromatografa es un mtodo que sirve para hacer anlisis cualitativos de tierras y compostas y que puede ser realizado en cualquier lugar a bajo costo y de forma rpida. Separacin de pigmentos vegetales mediante cromatografa en papel. 4. Interprete los valores de Rf 0.05; 0.6 y 0.98 Rf: 0.05 = La distancia recorrida por la sustancia es la 20ava parte de la distancia recorrida del solvente. Rf 0.6 = La diferencia de las distancias recorridas entre las sustancia y el disolvente es mnima y cercana. Rf 0.98 = La distancia recorrida por la sustancia es cercana a la del disolvente.

5. Introducira algn cambio cuando se tiene un Rf. de 0.05, por qu? Al tener un Rf de 0.05 no introducira ningn cambio, ya que la distancia entra la sustancia y el disolvente es amplio y as podramos identificar mejor la muestra.

6. Explique algn mtodo para localizar las bandas de adsorcin cuando se trabaja con sustancias incoloras en una columna. PRIMER METODO: Adicin de indicadores coloreados Graff y Skau han coloreado una columna de magnesia pesada con rojo de fenol, como mtodo para seguir la separacin de mezclas de cidos grasos de la cadena larga. Criddle y Le Tourneau describieron un mtodo con un indicador fluorescente para la determinacin de hidrocarburos en el petrleo; la muestra que contiene trazas de colorantes fluorescentes, se cromatografa sobre silicagel, con alcohol como agente deslizante. Los componentes de la muestra se disponen en la columna segn su adsorbilidad, primero las parafinas, despus las olefinas, a continuacin las aromticas y, finalmente los alcohlicos. Los lmites entre las zonas se visualizan con luz ultravioleta por los colorantes fluorescentes, y la composicin de la muestra ser establecida midiendo las zonas cuya longitud es proporcional a la concentracin de los componentes de la muestra. SEGUDO METODO: Tcnica de la franja Este mtodo, propuesto por Zechmeister, consiste en pintar una franja delgada de un reactivo adecuado, con un pincel, a lo largo de la columna despus de que ha sido extrada del tubo. Bell demostr la posicin la posicin de los azucares metilados sobre una columna de silicagel, aplicando una solucin alcohlica de naftol seguida por acido sulfrico concentrado (reaccin de Molisch).

7. Qu es la electroforesis y cul es su principal aplicacin en los compuestos biolgicos? La electroforesis es la migracin de iones existentes en una disolucin por accin de un campo elctrico. Los cationes se mueven hacia el ctodo y los aniones hacia el nodo. A. Electroforesis capilar: separacin de una mezcla en sus componentes usando un campo elctrico intenso, impuesto entre los dos extremos de un tubo capilar estrecho lleno de la disolucin de electrolito. B. Electroforesis capilar de gel: forma de electroforesis capilar en la que el tubo se llena con un gel de un polmero, que sirve como tamiz de macromolculas. Las macromolculas ms grandes migran ms lentamente a travs del gel. Aplicacin en la Biologa: la electroforesis se usa: Para hallar el numero relativo de aminocidos en la protena. Se usa para separar fsicamente macromolculas, protena o cidos nuclecos; sobre la base de su carga elctrica y tamao. La electroforesis en gel separa las macromolculas de ADN por tamao, resultando una serie de bandas en cada fila del gel. Cada banda consiste en molculas de ADN de un tamao determinado. A menos que usted tenga un gemelo idntico, su ADN es diferenciable del de cualquier otra persona; nuestra secuencia total de nucletidos es nica. Los genetistas podran identificar rasgos singulares de la secuencia de ADN y rasgos particulares de la secuencia de ADN que comparten los miembros de una familia.