MTODO DE COLORAO DE GRAM

INTRODUO
A colorao de Gram a tcnica de colorao bacteriana mais difundida em Microbiologia. A tcnica foi descrita em 1884 pelo mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram, quando este procurava uma forma de caracterizar pneumococos do tecido pulmonar de pacientes mortos de pneumonia (Barbosa & Torres, 1999). Gram observou que as bactrias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classific-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Grampositivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas (Ministrio da Sade, 2001). A tcnica se baseia nas diferenas estruturais existentes entre os envoltrios celulares de bactrias Gram positivas e Gram negativas, e originalmente consistia no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano fixado por calor com os reagentes violeta genciana, lugol, lcool-acetona e fucsina (Ministrio da Sade, 2001). No entanto, a tcnica sofreu algumas modificaes ao longo do tempo: o reagente violeta genciana foi substitudo por outro tipo de cristal violeta: o violeta de metila; o lcool-acetona foi substitudo por lcool etlico 95% por ser mais seguro ao manuseio e no causar hiperdescolorao caso o operador no fosse muito habilidoso; e a fucsina foi substituda pelo corante vermelho safranina devido sua distncia do violeta no espectro de cores, o que permite diferenciar com maior nitidez tanto as bactrias gram positivas das bactrias gram negativa quanto diferenciar ambos os tipos bacterianos da colorao de fundo, que assume a cor vermelho-claro (Ministrio da Sade, 2001). A figura abaixo exemplifica o processo de colorao de Gram.

Figura

1.

Exemplificao

do

processo

de

colorao

de

Gram

(extrado

de

http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com.br/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html)

A colorao de Gram depende das particularidades estruturais do envoltrio das bactrias Gram positivas e Gram negativas. A parede das bactrias Gram positivas formada principalmente por uma camada espessa de peptideoglicano, que consiste em uma molcula nica, gigante, formando um envoltrio completo ao redor da clula bacteriana (Barbosa & Torres, 1999). A parede celular das bactrias gram negativas tem uma composio qumica mais complexa, sendo formada por uma camada fina de peptideoglicano, que est firmemente ancorado membrana externa por lipoprotenas. Entre o peptideoglicano e a membrana externa situa-se o espao periplasmtico, regio fundamental para a sobrevivncia da clula bacteriana Gram negativa, uma vez que age como tampo osmtico e tambm apresenta muitas protenas hidrolticas, enzimas de degradao de substancias txicas, protenas especificas de ligao de solutos e protenas respiratrias (Barbosa & Torres, 1999). As figuras 2 e 3 ilustram as diferenas estruturais entre bactrias Gram positiva e Gram negativas.

Figura 3. Parede de bactria gram positiva (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2009)

Figura 2. Parede de bactria gram negativa ( Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2009)

O mecanismo de colorao de Gram pode ser descrito da seguinte maneira: as bactrias Gram positivas e as bactrias Gram negativas absorvem o corante primrio cristal violeta de maneira idntica, tornando-se roxas. Quando o lugol aplicado, com objetivo de fixar o corante primrio nas clulas, forma-se um complexo insolvel violeta-iodo (complexo iodo-pararosanilina ou CV-I) no citoplasma das clulas bacterianas. A etapa de descolorao critica para a identificao bacteriana. A lavagem com lcool etlico 95% causa a desidratao das paredes celulares das bactrias Gram positivas, o que diminui a porosidade e a permeabilidade do peptideoglicano, fazendo com que o complexo CV-I no possa sair das clulas, que permanecem roxas. J nas bactrias Gram negativas, a lavagem com lcool 95% causa a extrao dos lipdios da membrana externa, aumentando a porosidade, o que permite que o complexo CV-I seja removido das clulas. A colorao com safrarina cora apenas as bactrias que foram descoradas com o lcool. Portanto, as bactrias Gram negativas tornam-se vermelhas por serem coradas pela safranina, enquanto que as bactrias Gram positivas permanecem violetas por no terem sofrido descolorao na etapa de lavagem com lcool 95% (Departamento de Microbiologia ICB/UFMG).

MATERIAIS E MTODOS
Para a realizao do experimento foram utilizadas 5 culturas de bactrias, sendo 4 delas contendo espcies conhecidas, a saber: E. coli (A), S. aureus (B), B. subtilis (C) e S. mutans (D); a quinta cultura (E) possua composio desconhecida e era necessrio realizar a identificao da espcie ou espcies contidas na cultura atravs de diferenciao pelo mtodo de Gram.

O experimento de colorao consistiu dos seguintes procedimentos, que foram realizados com todas as culturas bacterianas: 1. Cinco lminas foram devidamente identificadas com uma letra (A,B,C,D e E). Foi, ento, feito um esfregao com cada cultura separadamente e cada lmina foi fixada pelo calor; 2. Cada esfregao foi, ento, coberto com violeta genciana durante 1 min, e posteriormente lavado com gua corrente; 3. O passo seguinte consistiu-se da aplicao de lugol sobre os materiais corados, e espera de 1 min, com posterior lavagem com gua corrente; 4. Foi, ento, feita a lavagem com lcool at que no mais se observasse a sada de corante; lavaram-se as lminas, ento, com gua corrente. 5. As laminas foram contra coradas com fucsina por 20 seg. e depois lavadas com gua. Foram, ento, secas e observadas ao microscpio ptico.

RESULTADOS E DISCUSSAO Os resultados encontrados para cada cultura em relao colorao de Gram e morfologia das clulas foram os seguintes: A: E. coli Gram negativa e possui forma de cocos; B: S. aureus Gram positiva e possui forma de cocos, mas foram encontrados alguns poucos estafilococos; C: B. subtilis Gram positivo e possui forma de bacilo; D: S. mutans Gram positivos e possui forma de cocos; E: A cultura desconhecida uma mistura de cocos Gram positivos e Gram negativos;

Os resultados encontrados para as culturas A, B, C e D testadas pelo Mtodo de Gram estavam de acordo com a literatura (Anvisa, 2008). Na cultura E, composta por bactrias desconhecidas, foi encontrado um mistura de bactrias Gram positivas e Gram negativas, sendo que as Gram positivas estavam em maior

nmero. Pela colorao apresentada e pela morfologia celular foi possvel identificar as bactrias desconhecidas como sendo E. coli (coco Gram negativo) e S. mutans (cocos Gram positivos). Em relao morfologia celular, o esfregao de B subtilis e S. mutans estavam de acordo com a literatura em relao morfologia (Anvisa, 2008; Souza, T.M.P.A). Para as outras culturas foram encontradas algumas discrepncias em relao literatura: Para E. coli o esfregao feito mostrou cocos Gram negativos. A literatura aponta que E. coli possui morfologia de bacilo (Anvisa, 2008). Para S. aureus o esfregao mostrou cocos Gram positivos. No entanto, a literatura aponta que a espcie possui morfologia de estafilococo (Anvisa, 2008), gnero ao qual pertence. As discrepncias observadas entre a morfologia encontrada e aquela apontada pela literatura se devem principalmente falta de habilidade na preparao dos esfregaos no caso de S. aureus, o que rompeu os cachos, mostrando clulas separadas e dando, portanto, a indicao errnea da morfologia dessa espcie. Para E. coli a identificao errnea da morfologia se deve dificuldade de discernimento dos bacilos, uma vez que eles so bacilos mais arredondados e podem tambm ser classificados como cocobacilos (Rangel, P.M, 2007), o que pode facilmente confundi-los com cocos.

BIBLIOGRAFIA
Anvisa. Curso de Capacitao dos Laboratrios de Microbiologia dos Hospitais Sentinelas e Lacen: Identificao bioqumica e avaliao do perfil de resistncia microbiana. 2007. Disponivel em <http://s.anvisa.gov.br/wps/s/r/EL> Acesso em 07 mar. 2013. Barbosa, Heloiza Ramos; Torres, Bayardo Baptista. Microbiologia Bsica. 1 edio. So Paulo:Atheneu, 2001. Departamento de Microbiologia. Instituto de Cincias Biomdicas. Universidade Federal de Minas Gerais. Material de apoio colorao diferencial de Gram. Disponvel em http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=19> Acesso em 07 mar. 2013.

MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., DUNLAP, P.V., CLARK, D.P. Brock: Biology of Microorganisms. 12th. ed. Pearson: Benjamin Cummings, San Francisco, Estados Unidos, 2009. 1061 p.

Microbiologia online. Microbiologia online com foco em colorao de Gram. 2010. Disponvel em http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com.br/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html Acesso em 07 mar. 2013

Ministrio da Sade. Tcnicas de colorao de Gram. Braslia: 2001. <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf > Acesso em 07 mar. 2013.

Disponvel

em

Rangel, Patrcia Merenda. PERFIL GENTICO E MICROBIOLGICO DE CEPAS DE Escherichia coli ISOLADAS DE LEITE MASTTICO BOVINO. Jaboticabal: UNESP, 2007. 73p. Tese (Mestrado) Programa de Ps-Graduao em Microbiologia Agropecuria, Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias, Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho. Jaboticabal, 2007.

Souza, Tricia Murielly Pereira Andrade de. ADERNCIA IN VITRO DE Streptococcus mutans SUPERFCIE DE DOIS TIPOS DE BRAQUETES ORTODNTICOS. Joo Pessoa: UFPA, 2007, 57 p. Trabalho de Concluso de Curso apresentado ao Curso de Graduao em Odontologia, da Universidade Federal da Paraba em cumprimento s exigncias para concluso.