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Experimento clsico 3.

1 Regresando a una enzima a la vida

A lrededor del ao 1950, los cientficos se dieron cuenta que el ADN contena
el cdigo que permita a la protenas ser sintetizadas. Sin embargo, como una cadena de aminocidos se pliega en una protena funcional y completa, con la caracterstica estructura tridimensional, se mantuvo un misterio. Un mecanismo debera existir para asegurar el pliegue propio de la protena, pero de donde vino esa informacin? En 1957, Christian Anfinsen public su primera evidencia que, la informacin para el apropiado pliegue estaba contenido en la protena en s.

Antecedentes
Las protenas estn echas de una combinacin de 20 aminocidos que se pliegan en estructuras complejas. La cadena de aminocidos desplegada se llama estructura primaria. para tener una actividad biolgica, la protena debe plegarse en una correcta segunda y terciara estructura, estas estructuras se mantienen propiamente juntas debido a interacciones qumicas entre los lados de los aminocidos, incluyendo enlaces de hidrogeno, interacciones hidrofobicas y a veces, enlaces covalentes. Como estas formas estructurales tan complejas ha sido durante mucho tiempo un misterio. La protena se plegar correctamente a medida que es sintetizada o solo requiere la accin de otra protena para plegarse correctamente? Puede plegarse correctamente por su cuenta espontneamente? En los 50's, Anfinsen fue un bioqumico interesado en el plegamiento de las protenas. Especficamente, l estaba investigando la formacin de puentes de disulfuro, los cuales eran enlaces covalentes entre los lados de cistena de la cadena que serva como una de las mayores anclas, manteniendo juntas las estructuras de protenas secretadas. El crea que la protena en s, contena toda la informacin necesaria para su correcto pliegue protenico. El propuso la " hiptesis de la termodinmica", la cual declara que la biologa estructura activa de una protena era tambin la ms termodinmicamente estable dentro de "in vivo conditions"**. En otras palabras, si las condiciones intracelulares fuesen replicadas en un tubo de ensayo, luego la protena podra naturalmente plegarse en su conformacin activa. El comenz su trabajo en una enzima secretada, ribonucleasa pancretica bovina, y estudio su habilidad para propiamente plegarse afuera de la clula.

El Experimento
Las protenas realizan una amplia variedad de funciones en la clula. A pesar de su funcin, la protena debe ser correctamente plegada para llevar a cabo si rol biolgico. Para el estudio del plegado de una protena es mejor estudiar una enzima la cual su actividad biolgica pueda ser fcilmente monitoreada al ser realizada in vitro. Anfinsen escogi una pequea, protena secretada, la enzima ribonucleasa, en la cual l pudo monitorear el plegado ensayando su habilidad para catalizar la hendidura del ARN. La ribonucleosa, es activa bajo condiciones in vitro oxidantes. La estructura terciara de una ribonucleasa activa se mantiene junta gracias a cuatro puentes de disulfuro. Al agregar un agente reductor, lo cual reduce el enlace de disulfuro entre dos cadenas laterales de cistena y dos grupos sulfhidrilo libres, pueden quebrar esa interaccin covalente. La desnaturalizacin completa de la ribonucleasa requiere un tratamiento con un agente reductor. Anfinsen monitore la reduccin de la ribonucleasa por la medicin del nmero de los grupos libres de sulfhidrilo que se presentan en la protena. En un estado oxidado, no hay grupos libres de sulfhidrilo in la ribonucleasa porque cada residuo de cistena est involucrado en un enlace de disulfuro. En un estado completamente reducido, por otra parte, la ribonucleasa contiene ocho grupos libres de sulfhidrilo. Anfinsen aprovech estas diferencias para evaluar el grado de reduccin, usando un ensayo espectrofotomtrico para dar un valor al nmero de grupos de sulfhidrilo. Para estudiar el plegado de la protena afuera de la clula, uno primero debe desnaturalizar una protena. Las protenas se desnaturalizan fcilmente por calor, quiebre mecnico como batirlo y un tratamiento qumico. Las protenas con puentes de disulfuro requieren una medida adicional para el tratamiento con agente reductores para separar los enlaces covalentes. Para desnaturalizar una ribonucleasa, Anfinsen primero reduca los puentes de disulfuro con cido tiogliclico, despus el desnaturaliz la protena usando una alta concentracin de urea e incubando la solucin a temperatura ambiente. El demuestra que su tratamiento dej a la enzima inactiva mostrando que la ribonucleasa era ahora incapaz de catalizar la hendidura del ARN. Usando el ensayo espectrofotomtrico, el continuo demostrando que la ribonucleasa inactiva contena ocho grupos sulfhidrilos, lo que corresponda a los cuatro puentes rotos de disulfuro. Con una protena desnaturalizada reducida completamente en la mano, Anfinsen podra entonces preguntar puede una enzima desnaturalizada plegarse correctamente in vitro y activarse nuevamente?

Para buscar la respuesta, Anfinsen permiti que una solucin de una ribonucleasa desnaturalizada y reducida se oxide. El removi la urea de la enzima desnaturalizada por medio de precipitacin. Luego, el volvi a suspender la urea libre de ribonucleasa desnaturalizada en una solucin sellada y la incub de 2 a 3 das. La exposicin a oxigeno molecular en la atmosfera oxid los residuos de cistna, Luego el comparo la actividad de la ribonucleasa re-naturalizada a la de la enzima nativa. En experimentos iniciales, 12% - 19% de la protena inactiva anterior fue capaz de catalizar la hendidura del ARN de nuevo. Las protenas se agregaron a altas concentraciones, lo cual lo hizo complicado para ellas de plegarse correctamente. Al disminuir la totalidad concentracin de la ribonucleasa en una solucin, Anfinsen demostr que hasta el 94% de la protena podra volver a plegarse (ver Tabla 3.1). La enzima volvi a plegarse a su conformacin activa a fuera de la clula, demostrando que la informacin para el pliegue de las protenas se encontraba en la protena en s.

Discusin.
A travs de cuidadosos experimentos, Anfinsen demostr que la informacin requerida para plegar correctamente una protena se encontraba en su secuencia primaria. Sus cuidadosos anlisis de la qumica de ese proceso respondi una pregunta fundamental en la biologa. El demostr la clula libre replegada de otras enzimas, incluyendo las protenas carentes de puentes de disulfuro. Mientras es posible plegar un numero de protenas fuera del normal proceso protenico mecnico de la clula, este proceso es altamente acelerado "in vivo"** por un numero de enzimas. Anfinsen continu estudiando el tema del pliegue protenico. A pesar de todo la " hiptesis del a termodinmico" no contiene la verdad para todas las protenas, la demostracin de Anfinsen de la clula libre de replegado de ribonucleasa marc en el campo de la bioqumica. En 1972 el recibi el premio nobel de qumica por su trabajo.

Cistena: Se trata de un aminocido no esencial, lo que significa que puede ser sintetizado por los humanos. Los codones que codifican a la cistena son UGU y UGC. La parte de la cadena donde se encuentra la cistena es el tiol que es no polar y por esto la cistena se clasifica normalmente como un aminocido hidroflico. La parte tiol de la cadena suele participar en reacciones enzimticas, actuando como nuclefilo. El tiol es susceptible a la oxidacin para dar lugar a puentes disulfuros derivados de las cistena que tienen un importante papel estructural en muchas protenas **: In vivo se refiero a experimentos mdicos hechos en organismos vivos, Como animales de laboratorio o humanos. Ribonucleasa: abreviada comnmente como RNasa, es una enzima (nucleasa) que cataliza la hidrlisis de ARN en componentes ms pequeos. Sulfhidrilo: radical qumico inorgnico compuesto de un tomo de azufre y uno de hidrgeno (-SH); es monovalente y se encuentra en numerosos compuestos orgnicos de importancia biolgica, como aminocidos y protenas. http://es.wikipedia.org/wiki/Plegamiento_de_prote%C3%ADnas Traducido por: Diego Rodrguez Silva.