Proyecto Bioinsectisida Taller Parte1a

TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
Ingeniera Bioqumica
Mtodo de Elaboracin de un Bioinsecticida A base de Bauveria bassiana

Equipo No. 5
De la Cruz Angeles Diana Carolina.
Guerrero Chvez Arturo. Grupo:3551 Fecha de entrega:

08/04/2013
Vo.Bo. Dr. Hugo Minor Prez Div. Ingeniera Qumica y Bioqumica
Gobierno del Estado de Mxico.
Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec

Ingeniera Bioqumica.
Taller de Investigacin II Elaboracin de Bioinsecticida
INDICE
RESUMEN..pg. 3
PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA..pg. 4
DESCRIPCION DE PROYECTO.pg. 4
JUSTIFICACION....pg. 5
OBJETIVO GENERAL.pg. 6
OBJETIVOS ESPESIFICOS....pg. 6
INTRODUCCION...pg. 8
MARCO TEORIOCO..pg. 11
BIBLIOGRAFApg. 44

RESUMEN
En los ltimos aos, varios sistemas agrcolas han sido seriamente afectados por plagas insectvoras que de ser, en general, una especie de importancia secundaria, se ha convertido en un problema agrcola principal presente en todos los continentes.. Aunque es difcil cuantificar su impacto sobre la produccin, las prdidas ocasionadas por las plagas de esta especie, equivalen a decenas, y quizs cientos de millones de dlares. Adems, a las perdidas per se debe sumarse el aumento en los costes de produccin debidos sobre todo al uso de insecticidas. Varias especies de parasitoides, depredadores y hongos entomopatgenos han sido estudiadas para este fin. Los hongos entomopatgenos tienen la particularidad de invadir a sus hospedantes a travs del tegumento por lo que se consideran de gran utilidad para el control de las poblaciones de insectos chupadores. Varios autores han apuntado la posibilidad de empleo, en programas de control integrado de moscas blancas, de hongos como Paecilomyces fumosoroseus Aschersonia aleyrodis, Verticillium lecanii, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Estos agentes pueden ser aplicados de forma inundativa, con medios convencionales, dado que se multiplican con facilidad y son susceptibles de posterior manejo para la elaboracin de formulados insecticidas, donde la eficacia de un producto de estas caractersticas reside en la correcta seleccin de la cepa que formar el ingrediente activo.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El uso excesivo de plaguicidas provoca efectos negativos en el suelo, el agua y el ambiente. Adems ha contribuido a aumentar los problemas de plagas debido al desarrollo de resistencia y a la destruccin de los enemigos naturales. Muchos plaguicidas tambin afectan la salud de las personas. Para reducir estos efectos se procura la implementacin de sistemas agrcolas sostenibles, basados en el conocimiento de las relaciones entre los cultivos, el ambiente y los organismos presentes en el campo. Una de las alternativas es el uso de organismos entomopatogenos, los cuales tienen la capacidad de reducir las poblaciones de plagas. Existen varios tipos de organismos entomopatogenos, tales como virus, hongos, bacterias y nematodos. Actualmente, se han identificado y estudiado diversas especies de hongos que afectan plagas de cultivos de importancia econmica; muchos de ellos son utilizados exitosamente en programas de control biolgico. Algunos de estos entomopatogenos son reproducidos masivamente y se venden comercialmente. DESCRIPCIN DEL PROYECTO
Montaje de una planta productora de plaguicidas biolgicos, en donde el producto principal sea esporas, que son producidas por un hongo entomopatgeno llamado Beauveria bassiana.

JUSTIFICACIN
Debido a la ingestacin de insectos sobre distintos cultivos en el pas se generan cuantiosas prdidas econmicas, obligado a los agricultores a buscar medidas para eliminar a estos insectos y dndoles la posibilidad de exportar sus productos a mercados donde se pagan mejor por sus productos como Estados Unidos de Norteamrica y Asia. En estos las medidas de sanidad son ms rigurosas que en nuestro pas por lo que los productores deben cuidar aspectos que eviten residuos txicos sobre sus cultivos. Beauveria bassiana es un hongo entomopatgeno especfico para algunos insectos que atacan cultivos de algodn, aguacate, caf, chile, ctricos, flores, frambuesas, fresas, frjol, papa, pltano, tomate, jitomate, tabaco, soya y zarzamora. Este se puede aplicar como medida preventiva al ataque de plagas, evitando aspectos desagradables sobre frutos, o aplicarse directamente en cultivos siniestrados e inclusive en el producto cosechado con plaga. Las plagas agrcolas han sido controladas durante aos mediante el empleo de plaguicidas qumicos de fuerte impacto negativo sobre los organismos benficos presentes en el ambiente. Con el objetivo de promover y acelerar el uso de hongos en el control de plagas en los cultivos es necesario el desarrollo de formulaciones eficaces y estables que permitan su manejo y aplicacin en el campo. En este trabajo se presentan consideraciones que se deben tener en cuenta para el desarrollo de productos de origen fungoso, los tipos de formulaciones en que pueden ser presentados y los logros obtenidos en este tema considerando que la forma

granulado y polvo humedecible son las ms usada hasta estos momentos en la presentacin de este tipo de producto. OBJETIVOS
Objetivo general Desarrollo de una nueva tecnologa para la produccin de un insecticida biolgico, por medio de fermentacin slida, orientado a la produccin de productos de exportacin en Mxico. Objetivo especficos Adaptar tecnologa limpia. Mercado de Bioinsecticida. Estudio de la biodinmica poblacional de la plaga. Tcnica: La tcnica usada para que el microorganismo produzca esporas, consiste en una fermentacin slida utilizando una cepa mejorada originaria de Mxico. Econmica: Retorno de capital Generacin de empleo Evitar tratamientos contra plagas de alto costo Ahorros de costos a largo plazo para el manejo integrado de la broca

Inversin en la calidad del producto Social: Las armas de la industria qumica como lo son los plaguicidas que se ofrecen para el combate de las plagas, como insecticidas, herbicidas y fungicidas; los cuales provocan el envenenamiento a corto y largo plazo de la naturaleza, los trabajadores, las comunidades rurales y los consumidores. Los secretarios de salud de los pases de Centroamrica estiman en casi 400 000 los envenenamientos causados por los plaguicidas cada ao. En Brasil se estiman 300 000; en Mxico, las autoridades registraron 2 800 casos en el 2002, en Chile se registraron 1 000; pero en la mayora de los pases de mayor parte de las intoxicaciones no se reportan a las autoridades. Ambiental: Entorno favorable para el caficultor Uso de productos que preserven el ambiente Contribucin a la calidad de vida de la fauna Proliferacin de ecosistemas benficos

INTRODUCCIN
El desarrollo y aplicacin de agentes de control biolgico de plagas adquiere una importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una agricultura sostenible que preserve los recursos naturales y el medio ambiente para las futuras generaciones. La aplicacin controlada en agroecosistemas de organismos vivos o sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, implica el mejoramiento de los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por agentes fitopatgenos En la naturaleza, los hongos entomopatgenos pueden eliminar o mantener las plagas en niveles que no ocasionan daos econmicos a los cultivos Estos hongos se encuentran en rastrojos de cultivos, estircol, en el suelo, las plantas; logrando un buen desarrollo en lugares frescos, hmedos y con poco sol. Constituyen, adems, el grupo de mayor importancia en el control biolgico de insectos plagas. Prcticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por hongos Se conocen aproximadamente 100 gneros y 700 especies de hongos
entomopatgenos. Entre los gneros ms importantes estn: Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erilla,
Metarhizium, Eryniopsis,
Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium Para utilizar hongos entomopatgenos como insecticidas deben producirse cantidades masivas del hongo, el cual debe mantener su capacidad infectiva por un

perodo de tiempo considerable. Los hongos se han reproducido para su uso como agentes biolgicos de plagas desde hace 100 aos, para lo cual se ha utilizado diferentes mtodos de reproduccin. Entre ellos, el uso de sustratos como arroz, trigo y medios lquidos mediante tcnicas ms sofisticadas La explotacin de los hongos para el control de plagas implica una amplia investigacin donde se involucran disciplinas como la patologa, ecologa, gentica, fisiologa, produccin masiva, formulacin y estrategias de aplicacin Una buena formulacin es la base para el xito de un bioplaguicida de origen microbiano; la posibilidad de obtener productos adecuados depende de las propias caractersticas del microorganismo y su relacin con los componentes de la formulacin (excipientes) y el ambiente de almacenamiento Para el desarrollo de nuevos productos de origen biolgico se deben tener en cuenta diferentes aspectos: primero definir un medio de cultivo ptimo y el mejor sistema para la obtencin masiva de inculo que permita una buena relacin costo rendimiento en la produccin; establecer ensayos de produccin a pequea escala; garantizar la estabilidad del producto y determinar las condiciones de
almacenamiento; poder utilizar la maquinaria standard de cualquier explotacin agrcola para su aplicacin, y ser efectivo a unas dosis parecidas a las utilizadas para los agroqumicos as como bioensayos de laboratorio, invernadero y campo que confirmen la efectividad del producto una vez formulado El objetivo de una formulacin de hongos entomopatgeno es aumentar la estabilidad durante el almacenamiento y despus de la aplicacin. Las propiedades
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fsicas y biolgicas de la formulacin deben permanecer estables por un tiempo mnimo de 12 meses, pero es recomendable que se mantengan durante 18 meses para permitir su comercializacin. Adems de mejorar la adhesin a la cutcula del insecto; aumentar o mantener la virulencia y permitir su aplicacin con equipos de volumen ultrabajo En condiciones de laboratorio es difcil mantener la viabilidad de hongos entomopatgeno por mucho tiempo. De esta manera, formular un entomopatgeno consiste en adicionarle determinados compuestos que mejoran su desempeo en el campo, facilitando su manejo, aplicacin y permita su almacenamiento en condiciones que disminuyen el costo, con una prdida mnima de las cualidades del producto Para ser formulado, la viabilidad del hongo no debe ser menor de 95 % y el contenido de humedad entre 4 - 6 %. Los materiales utilizados en la formulacin no deben tener actividad biolgica; ni afectar la actividad del hongo, deben ser inocuos al ambiente, presentar caractersticas fsicas adecuadas para mezclarse con los conidios; facilitar la aplicacin del producto y ser econmicamente rentables Existen varios tipos de formulaciones, el que una sustancia activa dada se presente de una forma u otra depender bsicamente de sus propiedades fisicoqumicas (solubilidad, tamao de partcula, densidad, fluidez), de la maquinaria de que dispone, el aplicador y de factores econmicos.
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Marco Terico.
La apreciacin que tiene el hombre acerca de los hongos que atacan insectos no est limitada al concepto moderno de su utilizacin para el control biolgico de plagas. Dos milenios atrs los chinos estaban conscientes de la momificacin de gusanos de seda por especies de Cordyceps e Isaria. Colocaban efiges de estos gusanos elaboradas en piedras preciosas y semipreciosas en la boca de sus bocas, para conferirles el mismo grado de inmortalidad. Las orugas infectadas por Cordyceps se utilizan en la medicina tradicional china, por lo menos desde hace mil aos, para el tratamiento de la adiccin al opio hasta su consumo como tnicos y aun como afrodisacos Hasta en la dcada de los noventas la mayor cantidad de investigaciones enfocadas al control biolgico se realizaban con bacterias y virus, aunque los hongos representan el grupo ms amplio de patgenos a insectos. Al parecer exista cierto rechazo a utilizar hongos entomopatgenos como biocontroladores. Debido a los factores ambientales que no favorecan el empleo exitoso y a las dificultades que se presentaban para su produccin a gran escala, junto con su formulacin adecuada como bioinsecticida. No obstante los hongos se han utilizado para el control de melazas desde 1950. Siendo producidos los primeros micoherbicidas a principios de la dcada de los ochenta en USA (Auld, 1991). Agostino Bassi (citado por Roberts y Humber, 1981) estableci la teora de los grmenes que provocaban en animales a mediados de la dcada de 1830, con sus estudios sobre las infecciones de Bauveria bassiana en larvas del gusano de seda.
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Bauveria bassiana es un candidato interesante para emplearse como bioinsecticida pues tiene ventajas con respecto a otros microorganismos como Bacillus thuringiensis (Bt.) y los virus: las cepas aisladas tiene un rango de hospederos amplio e infectan por invasin a travs de la cutcula, de tal forma que pueden atacar fidos, larvas de lepidpteros y colepteros, y otros insectos masticadores Este hongo se ha producido por fermentacin slida en Rusia, la repblica popular China y en el Brasil. La produccin de esporas de Beauveria bassiana por fermentacin en medio slido (FMS) representa una alternativa interesante para la obtencin de bioinsecticida econmicamente efectivo. Los medios de cultivo utilizados son sencillos, consisten en residuos o productos agrcolas que pueden contener todo tipo de nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos, y pueden obtenerse a bajo costo cerca de las reas de aplicacin. Requieren pretratamientos simples frecuentemente es necesario molerlos para reducir el tamao de partcula. Clasificacin taxonmica del hongo entomopatgeno Beauveria bassiana NOMBRE Beauveria bassiana Vuillemin Reino Fung Divisin Micota Subdivisin Eumicotina Clase Deuterimicetes
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Orden Moniliales Familia Moniliaceae Gnero Beauveria Especie Bassiana El hongo Beauveria, es uno de los patgenos ms importantes que afectan insectos, ha sido recuperado de muchos insectos del orden coleptero, lepidptera y homptera y probablemente ataca a todos los artrpodos. De acuerdo a la literatura existen dos especies: Beauveria bassiana y B.brogniartii. La primera ha sido la ms estudiada. En la actualidad Beauveria bassiana se encuentra en los mercados de algunos pases europeos como Rusia, en forma comercial con el nombre de Beauverin o Boverin Beauveria bassiana es un hongo filamentoso que produce micelio de color blanco o ligeramente colorado dentro del sustrato o areo. Forma conideoforos constituidos por filides simples, en manojos o en ramilletes esfricos de simpdulos que crecen en forma de cuellos ramificados. Las conidias son unicelulares y transparentes, crecen en los plegamientos de los cuellos de los simpdulos, y pueden tener formas diferentes: globosas, ovales o elipsoidales. Las colonias crecidas sobre medio PDA son de color blanco, aspecto lanoso y alcanzan una altura de 1-2mm. Durante la esporulacin intensa adquieren forma
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circular (con aspecto de algodn con polvo), de color blanco o cremoso. El reverso de las colonias es incoloro (Fassatiov, 1986). Caractersticas del proceso de infeccin de B. bassiana Usualmente invade a travs de la cutcula (exoesqueleto quitinoso) del insecto. Las unidades infecciosas casi siempre son esporas, que se unen a la superficie del integumento, germinan y penetran la cutcula. En algunos casos penetra a travs del tracto digestivo (Debach y Rosen, 1991). En el interior del insecto, B. bassiana se propaga y coloniza el hemolinfo. Roberts y Humber (1981) dividieron el proceso de infeccin en diez pasos: unin de las conidias a la cutcula del insecto, germinacin de las conidias en el insecto, penetracin de la cutcula, crecimiento del hongo en el hemolinfo, produccin de toxinas, muerte del hospedero, crecimiento micelar e invasin de todos los rganos del hospedero, salida de la hifas a travs de la cutcula, produccin de esporas, y dispersin de las esporas por el entorno La unin de las conidias a la cutcula de los insectos es el evento inicial en el establecimiento de la micosis. Cuando se produce el contacto las esporas se unen fuertemente a la epicutcula (superficie externa de la cutcula) mediante interacciones hidrfobas no especficas que juegan un papel fundamental en la adhesin (Boucias et al., 1988). La superficie exterior de la pared de las esporas y la epicutcula contienen los elementos determinantes para la unin. La superficie de las conidias de B. bassiana est cubierta de una capa bien organizada de haces entretejidos de fibras,
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compuestas fundamentalmente por carbohidratos que le confieren resistencia contra la deshidratacin, su hidrofobicidad caracterstica, y facilitan su dispersin en el aire (Boucias et al., 1988). Los carbohidratos como -D-manosa -D-glucosa y -galactosamina y glicoprotenas como las lecitinas, presentas en la pared de las conidias, estn implicados en procesos de quimiotaxis, adhesin e infeccin (Hegedus et al. 1992). Es probable que la formacin de estos carbohidratos pueda ser facilitada con la correcta formulacin del medio de cultivo utilizado en la produccin de esporas (Lane et al., 1991). En la fase de crecimiento micelar y produccin de esporas, el hongo invade prcticamente todos los rganos del insecto provocando su muerte. Si las condiciones de humedad y temperatura ambientales no son las adecuadas, el hongo permanece dentro del cadver que sirve como su reservorio. Cuando se restablecen las condiciones apropiadas el hongo emerge a travs de la cutcula y produce esporas (conidias), que se dispersan con las corrientes de aire o agua. En esta fase B. bassiana puede restablecer relaciones endofticas con diferentes plantas, colonizarlas sin daarlas o interactuar de forma especfica con estas, pues no es un hongo fitopatgeno. Se ha demostrado que este hongo puede colonizar plantas de maz a nivel de los verticilos, moverse por su sistema vascular de forma pasiva, y persistir en su interior por largos perodos. Esta capacidad puede aprovecharse para su utilizacin en el control de plagas.
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La produccin de toxinas es una caracterstica de la gran mayora de las especies de hongos entomopatgenos. Estas sustancias pueden, en muchos casos, originar la muerte del insecto debido a sus propiedades biocidas; adems actan como inhibidores de las reacciones de defensa del hospedante por alteraciones en los hemocitos y retraso en la agregacin de las clulas de la hemolinfa (Vey yGtz, 1986). Las toxinas que producen los hongos entomopatgenos pueden ser macromolculas proteicas o molculas de tamao medio a pequeo con bajo peso molecular (Roberts, 1981; Vey et al. 2001). Entre las toxinas producidas por hongosentomopatgenos destacan las destruxinas producidas por M. anisopliae como las ms estudiadas. Otros compuestos txicos producidos por otras especies son listados en La muerte del insecto puede resultar de una combinacin de factores incluyendo agotamiento de nutrientes, obstruccin fsica o invasin de rganos y Toxinas producidas por algunas especies de Hifomicetos entomopatgenos. MORFOLOGIA. Beauveria bassiana (Blsamo) Vuillemin: colonias en PDA o MEA con aspecto aterciopelado a polvoriento, raras veces formando sinemas; blancas en los bordes que se vuelven amarillo-plidas, algunas veces rojizas, incoloras al reverso, amarillas o rojizas. Conidiforos abundantes, que se levantan a partir de las hifas vegetativas sosteniendo grupos de clulas conidigenas que se pueden ramificar para originar ms clulas conidigenas, globosas a forma de botella, con un raquis bien desarrollado Conidios hialinos, lisos, globosos a ligeramente elipsoidales,
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Clamidosporas ausentes. Difiere de B. brongniartii en que tiene las clulas conidigenas ms agrupadas y los conidios globosos. Existen, adems, las bolsas hidrosolubles que ms que una formulacin es un modo de presentacin de una WP o SP mediante la cual se eliminan los riesgos de malas dosificaciones, se elimina el manipuleo y se minimizan los riesgos por la toxicidad de los productos. Estos envases predosificados se dejan caer en el agua del tanque del equipo de aplicacin y all la envoltura plstica se disuelve rpidamente, se libera la formulacin y se mezcla uniformemente con el agua. No hay riesgos de contacto, inhalacin ni salpicadura. Una vez lograda la mezcla de aplicacin, sta no es ms ni menos segura que cualquier otra formulacin similar de igual principio activo. Varios productores de biocontroles han elegido a polvos humedecibles, entre las formulaciones secas, debido a su larga vida de estante, buena miscibilidad en agua, y fcil aplicacin con un equipo de atomizacin convencional ya que sus propiedades fsicas le proporcionan la habilidad al producto de mezclarse con agua y formar una suspensin homognea atomizable Formulaciones Desarrolladas En el mundo numerosos grupos de investigadores y empresas productoras se concentran en el desarrollo de productos comerciales a partir de hongos en forma de grnulos o polvo humedecible entre los que se citan Biofox C (F. oxysporium y F. moniliforme SIAPA, Italia), Mycotal (V. lecanii, Koppert, Holanda), Mycotrol GH (B. bassiana, Mycotech, USA), Green Muscle (M. flavoviride, CABI Bioscience, UK),
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DiTera (M. verrucaria, Valent (Sumitomo), USA, Japn) (Burges, 1998;Butt y Copping, 2000). Algunas formulaciones granuladas muy sencillas son las del hongo en arroz o arroz molido obtenidas mediante el proceso de produccin masiva del hongo. Otras como las de grnulos de aceite hidrogenado son utilizadas para conidios deB. Bassiana (Carballo, 1998). Se han evaluado formulaciones en grnulos de alginato usando agentes aumentadores como cscara de naranja seca molida. Existen, adems,
procedimientos para la preparacin de formulaciones de micelio o conidios en grnulos de alginato (Carballo, 1998). La temperatura y la humedad son las principales limitaciones para la eficacia de hongos. Varios adyuvantes mejoran la germinacin de las esporas, como es el caso del aceite de maz sin refinar, que mejora la actividad de Colletotrichum truncatum (Schwein) Andrus y Morre y reduce los requerimientos de humedad necesarios para su germinacin. Surfactantes como Tween 20 permiten a las lantas a reducir la tensin superficial y mejoran la dispersin de las esporas en las gotas. Hay que tener en cuenta la posible accin inhibitoria / estimuladora del surfactante en la germinacin de las esporas, infeccin y desarrollo (Fernndez y Juncosa, 2002) B. bassiana, fue registrada en 1999 como "Mycotrol" por la Enviromental Proteccin Agencia en Estados Unidos, que es utilizado en campo para el control de saltamontes, mosca blanca, fidos y muchos otros plagas de insectos.
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Este producto es estable por ms de 12 meses almacenado a 25 C. (Wraight, Jackson, Kock, 2001) Existen otros dos formulados a partir de B. bassiana comercializados como "BotanicGard" que es recomendado para el uso en casas de cultivos y "Mycotrol O" que contiene ingredientes en la formulacin que permite su uso por agricultores en Estados. La produccin y el uso de los entomopatgenos se han expandido rpidamente y Cuba ha desarrollado capacidades nicas en esta rea. Se han elaborado muchas tcnicas mejoradas de produccin, cosecha, formulacin, aplicacin y control de calidad para numerosas bacterias y hongos. Los bioplaguicidas basndose en hongos producidos en los CREE, de amplio uso, son: Beauveria bassiana, usada para el control de plagas de colepteros, como los gorgojos que atacan a la batata (camote) y al pltano comn; Verticillium lecanii, para controlar la mosca blanca (Bemisia tabaci), un vector de enfermedades virosas en tabaco, tomate, frjol y otros cultivos; Metarhizium anisopliae, para varias plagas de insectos; y Trichoderma spp, usado como antagonista de los patgenos del suelo en plntulas de tabaco. Entre los bioplaguicidas en proceso de desarrollo a gran escala estn Nomuraea rileyei e Hirsutella thonsomii (Rosset y Moore, 1998). El desarrollo de hongos entomopatgenos como micoinsecticidas ha tenido obstculos principalmente relacionados a la produccin masiva y la estabilidad para el almacenamiento y formulacin (Gray, y Markham, 1997; Pell, Eilenberg, Hajek, Steinkraus, 2001; Wraight, Jackson, Kock, 2001). Investigacin limitada en varias
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especies de Entomopatgenos pueden haber superado algunos de estos problemas (Pell, Barker, Clarck, Wilding y Anderson, 1998; Shah, Aebi, Tuor, 1998, 2000,2002) pero hay barreras significativas que involucran la produccin a gran escala as como la formulacin apropiada y la tecnologa de aplicacin. Estos problemas requeriran significante inversin financiera en investigacin y desarrollo que necesite unirse fuertemente con la identificacin de mercados apropiados para cualquier producto eventual basado en un hongo entomopatgeno (Shah y Pell, 2003).En general estos hongos estos hongos no forman cuerpos fructferos, tienen alta produccin de esporas, son relativamente fciles de cultivar fuera del hospedante. Los hongos entomopatgenos actan principalmente por contacto, cuando el hongo es capaz de penetrar el insecto e invadirlo, provocndole la muerte por micosis. La mayora de los autores aborda ampliamente el ciclo infectivo de estos hongos dividindolo en dos fases: una parastica y otra saproftica. La primera incluye la adhesin del conidio a la cutcula del insecto, la germinacin (estimulada por los lpidos cuticulares del hospedante en calidad y proporcin), penetracin (complejos multienzimticos con enzimas secretadas como lipasas, quitinasas y proteasas activadas secuencialmente) y multiplicacin del hongo (por blastosporas
fundamentalmente) con la consiguiente produccin o no de toxinas, en dependencia de la cepa presente, que finaliza con la muerte del insecto. La segunda fase se caracteriza por una colonizacin total con melanizacin y momificacin del individuo, emergencia del hongo y su esporulacin, cuando la humedad relativa microambiental
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sea alta. Estos conidios pueden diseminarse mediante el viento, el agua, otros organismos y el hombre, para as iniciar un nuevo ciclo infectivo. En el caso de los hongos antagonistas para el control de plagas (patgenos de plantas) se encuentran, dentro de los ms empleados, especies del gnero Trichoderma. Este hongo tiene la capacidad de parasitar a otros hongos lo que se conoce como hiperparasitismo o micoparasitismo, hacia diferentes patgenos de plantas. Su modo de accin es complejo donde estn incluidos el quimiotaxismo, la antibiosis y el parasitismo. La interaccin inicial entre el parsito y el hospedero parece ser del tipo quimiotrfico. La hifa del micoparsito crece directamente hacia el hospedero en respuesta a las lectinas secretadas por este, las que se unen a los residuos de galactosa en la pared celular de Trichoderma siendo la seal que permite dirigir el crecimiento hacia esa zona. Trichoderma secreta enzimas que actan como un complejo con accin sinrgica sobre el patgeno debilitando la pared y permitiendo la difusin de los antibiticos hacia este. Despus del contacto fsico microscpicamente se observa la presencia de haustorios, enrollamiento de la hifa del biocontrol sobre la del patgeno, vacuolizacin, formacin de grnulos, desintegracin del citoplasma y lisis celular. Este gnero actualmente se estudia a profundidad por la respuesta sistmica inducida al ataque de otros patgenos y por ser fuente de genes que codifican para protenas (enzimas como glucanasas, proteasas)) y metabolitos (fitohormonas) con accin estimuladora y defensiva en la planta, los que se estn usando en protocolos de transgnesis en especies de plantas de importancia econmica con resultados muy alentadores
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Caracterizacin de aislados fngicos para el Biocontrol El mero hecho de identificar al microorganismo taxonmicamente hasta especie implica datos que tienen importancia en la caracterizacin del aislado. Sus caractersticas morfomtricas y culturales son importantes y bsicos para estudios posteriores y ms reproducibles. Estos deben incluir estudios bioqumicos (actividad exoenzimtica, perfiles isoenzimticos especficos como patrn de esterasas, lipasas, fosfatasa alcalina. etc.). Los anlisis isoenzimticos pueden tener como desventaja que los perfiles estudiados no sean suficientemente diferentes y/o las isoenzimas expresadas no aparezcan en un aislado determinado por cuestiones fisiolgicas. Los estudios ms altamente reproducibles son los que se realizan a nivel de ADN (moleculares). Actualmente para que un aislado sea reconocido como
apropiadamente caracterizado requiere de al menos un mtodo molecular que lo identifique como tal y en la fase de registro de un producto internacionalmente esta condicin es exigida en pases lderes en Biocontrol. Los estudios moleculares ms usados en hongos para la caracterizacin son los RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) en los cuales se generan cortes por enzimas de restriccin en el ADN dando lugar a fragmentos de diversas tallas, los que son puestos en contacto con sondas especficas marcadas con un cromgeno o con un istopo radiactivo, que pueden o no acoplarse al o los fragmentos producidos por complementariedad de bases (hibridizacin) y luego de una electroforesis en gel de agarosa se genera un patrn de bandas en dependencia
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de la sonda de hibridizacin, el aislado y la enzima empleada en el corte del ADN, lo cual logra discriminar aislados aparentemente iguales como diferentes cepas. Otro anlisis molecular mucho ms barato pero menos reproducible entre laboratorio son los anlisis genticos del tipo PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction- Random Amplified Polymorphic DNA) los que consisten en un PCR clsico donde los "primers" (por ejemplo cebadores universales) suministrados para la amplificacin son conocidos como buenos para detectar variabilidad entre poblaciones (razas, cepas, etc.). En el mtodo se necesita ADN aislado del hongo mediante un proceso de purificacin clsico (el mtodo de extraccin debe ser suave para no desnaturalizar el ADN). Este ADN se lleva junto al "primer" a varios ciclos de amplificacin donde se tiene una ADN polimerasa resistente al calor y los nucletidos para la polimerizacin adems de cofactores y soluciones buffer. Se realiza una electroforesis y los fragmentos de ADN amplificados se visualizan en el gel. Los patrones de bandas para cada "primer" probado pueden ser iguales o diferentes. Se pueden probar tantos "primers" como se dispongan. La mayor desventaja del PCRRAPD es que no tiene muy buena reproducibilidad entre laboratorios aunque s tiene el mismo poder de resolucin entre laboratorios cuando se trabaja con las mismas poblaciones, o sea, los patrones de bandas son los que pueden cambiar. Mtodos de aislamiento Los mtodos para aislamiento que se usan ms ampliamente son mtodos clsicos. Para hongos antagonistas se usan races jvenes, por ejemplo, de plantas libre de sntomas tomadas de una zona donde pueda existir algn sntoma de una
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enfermedad fngica. Las races se lavan abundantemente y se desinfectan muy ligeramente, se trituran y se siembra en medios generales para hongos con antibacterianos aadidos. Se trata de obtener colonias nicas y por observacin al estereoscopio y microscopio ptico se seleccionan las posibles especies
controladoras. Tambin se procesa suelo de estas zonas donde se encuentran sorpresivamente plantas sanas o de zonas donde no se observan sntomas de enfermedades producidas por hongos lo cual resulte aparentemente inexplicable. Se realizan diluciones decimales en placa (siembra para obtener unidades formadoras de colonia). Se incuban entre 23-28 grados C y se evalan a partir de las 48 horas). Estos mtodos precisan de experiencia (Anexo 8). Para el caso de los entomopatgenos se traen del campo insectos micosados o sospechosos de micosis (insectos melanizados y/o momificados). Se realizan siembras en medios para hongos (PDA, SDA) con antibiticos y se incuban a 23-27 grados C revisando el material luego de 72 horas y hasta 14 das posterior a las siembras. Igualmente se procesan ootecas o quistes de nemtodos. En todos los casos se desinfectan suavemente en etanol 70% o hipoclorito sdico por 1 minuto al 0.5% y/o alcohol 70%. Las muestras de suelo tambin son interesantes para aislar entomopatgenos con insectostrampeadores, o sea, especies altamente susceptibles a los hongos entomopatgenos como es el caso de larvas de lepidpteros. Ejemplo de ello tenemos en Cuba el aislamiento de hongos entomopatgenos con larvas de Galleria
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mellonella o Corcyra cephalonica procedentes de cras certificadas de laboratorio, los que rutinariamente se usan para enriquecer las colecciones de cultivos Es importante destacar que los estudios no deben realizarse en zonas donde se hayan aplicado o se apliquen microorganismos de las especies que estamos tratando de aislar y siempre debe obtenerse un aislado monosprico para lograr mayor homogeneidad gentica. Mtodos de conservacin El objetivo de la conservacin es mantener el aislado con las caractersticas genticas y fenotpicas originales. Siempre debe conservarse por 2 mtodos diferentes y uno de ellos a largo plazo. Los protocolos de conservacin son muy regulares y se pueden obtener fcilmente desde libros clsicos de Microbiologa o desde INTERNET. A largo plazo tenemos la liofilizacin que se basa en la desecacin extrema al vaco del cultivo del hongo por congelacin profunda de forma que el agua pase rpidamente de slido al estado gaseoso. Tambin se cuenta con conservacin en Nitrgeno lquido pero este mtodo es engorroso pues precisa de tanques metlicos para el N que alcanzar 196 grados C bajo cero. Siempre en los mtodos de congelacin se usan agentes crioprotectores (DMSO, leche descremada, glicerol, etc.). Mtodos como conservacin en suelo previamente esterilizado y luego inoculado y desecado son tiles as como la conservacin en slica gel no indicadora (sin cobre)
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inoculada previamente con una suspensin del cultivo en leche descremada 5% y luego desecada. Ambos son baratos y de fcil ejecucin. Tambin el aceite mineral sobre cultivos previamente esporulados es un mtodo muy efectivo a mediano plazo. El mtodo ms usado a corto plazo es el de cultivos sobre cuas de medio agarizados nutritivo. En Cuba se han optimizado medios para producir masivamente las esporas (conidios, clamidosporas, etc) en alta concentracin en el cultivo segn los requerimientos de cada aislado, el que luego ser llevado a uno de los mtodos explicados anteriormente para su conservacin. Tecnologas para producciones de hongos. Tecnologas bsicas En el mundo se realizan desde muy puntuales y pequeas producciones de agentes de biocontrol como la tecnologa desarrollada sobre medio agarizado para la produccin de Phlebiopsis gigantea, hongo antagonista basidiomiceto del tambin basidiomiceto Heterobasidion annosum, que es el agente causal de la enfermedad que ms afecta la raz de las conferas en el hemisferio norte, hasta producciones a escala industrial como las desarrolladas por Mycotech Corporation que pueden llegar a varias toneladas de Beauveria bassiana anualmente. Los mtodos de produccin varan considerablemente. Muchos estn basados en fermentaciones sobre sustrato slido con granos de cereales donde el arroz es el ms universal. Otros usan sustratos no nutritivos como grnulos de arcilla. Algunos
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rinden conidios areos en la superficie de cultivos lquidos estticos. Otras tecnologas se desarrollan en tanques de fermentacin para obtener productos a base de micelio, blastosporas o conidios sumergidos. Las 4 formas de produccin fundamentales para hongos son:
1-cultivos bifsicos, donde se desarrolla el inculo en cultivo lquido agitado (de forma rpida) o lquido esttico (ms lento) y luego se pasa al soporte slido. En los sistemas bifsicos siempre se debe optimizar el cultivo de la fase lquida para que promueva un rpido crecimiento del aislado. Es el ms usado a nivel mundial por obtenerse estructuras infectivas de alta calidad y acortarse el tiempo cuando la fase lquida se hace por cultivo lquido agitado. Son semiartesanales (Anexo 10). 2-cultivos sobre soporte slido, siendo una forma de produccin donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones altas. Son artesanales 3-cultivos lquidos agitados o fermentaciones lquidas con un grado de
automatizacin del proceso que puede ser muy alto, son muy rpidos, pero tienen como desventaja el que muchos aislados tienden a crecer como pellets miceliales discretos y/o forman abundantes blastosporas (esporas formadas propagadas por gemacin a partir de fragmentos de micelio originalmente), propgalos estos que no son apropiados por la baja estabilidad intrnseca y poseer per se baj o nulo poder infectivo. En estos sistemas se logra un ptimo aprovechamiento de los nutrientes. Pueden llegar hasta niveles industriales
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4-cultivos lquidos estticos, los que constituyen una forma de produccin donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones bajas pues solamente hay formacin de estructuras deseadas en la interface lquido- gaseosa. Son artesanales Una forma especial de cultivo slido con tecnologa avanzada lo constituyen las fermentaciones en estado slido las que han dado la oportunidad a la industria de desarrollar producciones de bioplaguicidas en birreactores sellados con un grado alto de automatizacin, con principios similares a aquellos de la fermentacin lquida, lo que reduce costos de mano de obra y permite un control eficiente del proceso de produccin donde se logra biomasa de alto valor infectivo y ms resistente a condiciones ambientales adversas. En estos sistemas tambin se logra un ptimo aprovechamiento de los nutrientes pero la inversin de capital inicial es muy alta. Para los pases del tercer mundo esta tecnologa presenta menos posibilidades de aplicacin debido a las dificultades econmicas y el alto costo de capital de estos procesos automatizados. La presencia de mano de obra barata y un mercado que es regional y pequeo hace a los sistemas de produccin artesanales (baja tecnologa) viables econmicamente a pesar de requerir muchas operaciones manuales. Descripcin del proceso productivo artesanal (baja tecnologa). Parmetros clave
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CULTIVO INICIAL EN VIALES CON MEDIO AGARIZADO
INOCULACION E INCUBACION DE MEDIOSOLIDOO LIQUIDO (PREINOCULO)
INOCULACION E INCUBACION DE SUSTRATO
SECADO
COSECHA
FORMULACION
ENVASADO
Figura 1
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Diagrama de flujo general del proceso de produccin de hongos por va artesanal. En los sistemas artesanales para la produccin de hongos se establecen de manera general los pasos enunciados en la figura 1. En toda produccin de bioplaguicidas microbianos se parte de un aislado con caractersticas deseadas como agente de biocontrol, el cual es conservado previamente y subcultivado durante el escalado. Los preinculos pueden desarrollarse sobre sustratos slidos (grano arroz, grano trigo, cscara de trigo, cscara de arroz, harina de maz, etc ) incluyendo los medios agarizados de cultivo o por cultivos lquido esttico o agitado (compuestos por combinaciones de materias primas carbonadas y nitrogenadas como melaza de caa de azcar, licor de maz, almidn de maz, sacarosa, extracto de levadura torula, extracto de levadura cervecera, etc.) siendo el objetivo fundamental la obtencin de una biomasa homognea. La relacin carbono (C): Nitrgenos (N) es esencial y de este balance en lo fundamental depender el que se logre la formacin de los propgulos deseados. En los hongos, se necesita que la fuente C est en exceso en el medio y el contenido de N sea el factor limitante del crecimiento, lo que desencadena el proceso esporulativo. Los inculos se preparan a partir de subcultivos de preinculos a una concentracin final en el sustrato inoculado de 10(5)-10(7) propgalos/g
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La eleccin de los sustratos sobre los que se realizar la inoculacin, previa esterilizacin, depender de la disponibilidad local y costo de estos as como de las caractersticas del aislado a reproducir. Se han usado cereales como agentes nutritivos (arroz, trigo, cscara de trigo, cscara de arroz, maz etc.) y como agentes inertes de soporte la vermiculita, grnulos de minerales arcillosos, tela, etc. Con el uso de sustratos inertes las soluciones nutritivas en los que estos se embeben pueden ser balanceados cuidadosamente para asegurar una casi completa utilizacin de los nutrientes y ac despliegan un papel clave tambin el balance C:N. El sustrato puede ser humedecido previa esterilizacin o previa inoculacin dependiendo del tipo de materia prima o combinacin de estas y ajustes realizados. Un exceso de humedad provocara baja disponibilidad de oxgeno y por ende pobre desarrollo del microorganismo. Adems compactara el substrato impidiendo una colonizacin total de su superficie. Por otro lado, una baja humedad podra inhibir el desarrollo del microorganismo al no poner la suficiente cantidad de nutrientes en solucin para ser usado por este adems de la poca resistencia a la desecacin que tienen los hongos en el periodo activo de crecimiento micelial. Durante la incubacin se debe regular el rgimen luz-oscuridad. La luz es estimulante en determinadas especies y aislados por lo que este parmetro es ajustable solamente a travs de la experimentacin. Cuando se obtiene la biomasa conidial ptima sobre toda la superficie del sustrato se pasa al proceso de secado para que los conidios permanezcan viables en almacenamiento por mayor tiempo. Este proceso se optimiza con deshumidificadores
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o aires acondicionados o acelerando la ventilacin con ventiladores lo que depende de las condiciones locales. Posterior al secado y previo al paso final de envasado en el flujo de produccin se realiza la cosecha. Es en este momento que comienza la etapa de formulacin donde se prepara una combinacin de ingredientes de forma que el principio activo (esporas) se mantenga estable, efectivo y fcil de aplicar. Durante todo el proceso la regulacin de la temperatura ambiental es esencial la que debe ser lo ms prxima posible a la temperatura ptima de desarrollo del microorganismo. Control de calidad en la produccin de microorganismos fngicos para el control biolgico. Principales ensayos. Panormica general Un requisito esencial para la produccin de cualquier agente de control microbiano es un sistema de control de la calidad efectivo. La calidad se define como el conjunto de propiedades y caractersticas de un producto o servicio que lo hacen apto para satisfacer las necesidades a las cuales va dirigida. Las normas y procedimientos para el control de calidad de los productos y procesos conjuntamente con los registros, constituyen la garanta para la validacin de las producciones de bioplaguicidas.
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Un producto con especificaciones bien definidas y con los consiguientes procedimientos de control de calidad asegura su buen funcionamiento y su seguridad, promueve la estandarizacin de los costos de produccin y garantiza su estabilidad en el mercado lo que conlleva a la ganancia de confianza en el consumidor. En el caso de los productos a base de hongos su funcionamiento no confiable por falta de calidad ha limitado su xito en pases en desarrollo donde estos requerimientos son mnimos o no existen. Una produccin con un sistema de calidad establecido tiene un control estricto sobre la salida de su producto al poder analizar la calidad en cada punto crtico implicado en la elaboracin de este. En 1992, en la Reunin del Grupo Activo de Control de Calidad de la Organizacin Internacional de Control Biolgico, se estableci llevar un control de las producciones que implique el seguimiento de la ejecucin de todas las operaciones, procedimientos, equipos y condiciones ambientales de estas con el objetivo de mantener el rendimiento. Tambin se plante controlar el proceso de forma que se le d seguimiento a la calidad del producto no terminado, incluido la deteccin de contaminantes, adems de un sistema que controle la calidad del producto final. Esto es muy significativo para el caso de los agentes microbianos fngicos de control ya que para que sean efectivos precisan de que culminen exitosamente un complejo proceso de infeccin. Comparados con los agroqumicos, los sistemas de calidad para la produccin de bioplaguicidas microbianos deben ser ms exhaustivos y especializados.
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An no existen protocolos estandarizados internacionalmente lo que ha trado como consecuencia que los productores o pases desarrollen sus propios procedimientos de Control de calidad. Puntos crticos de controles de calidad El primer punto donde se controla la calidad en cualquier sistema de produccin es en el subcultivo de la cepa del hongo del cual se parte. Esto incluye los subcultivos de trabajo y los de conservacin. En ambos casos se tienen que establecer mtodos de conservacin y mantenimiento que garanticen la estabilidad gentica y fenotpica del aislado los que deben ser verificables a travs de pruebas bioqumicas y moleculares. Las transferencias sucesivas en medios agarizados deben evitarse. Se debe verificar la pureza del cultivo y la actividad biolgica con la frecuencia necesaria. En el control del proceso de produccin se requiere una descripcin completa de este con los correspondientes controles de calidad y monitoreo de cada paso. El registro de todos los parmetros como temperatura, contenido de humedad del sustrato, pH y monitoreo de la contaminacin debe tenerse por lote de produccin para facilitar el examen de todos los pasos crticos de la produccin desde el producto final hasta el inicio del proceso (trazabilidad). En la preparacin de inculos se debe tener en cuenta su concentracin y pureza. Todos los medios de cultivo deben ser verificados para su esterilidad segura antes y despus de la inoculacin.
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En el caso de los sustratos desafortunadamente no siempre se tienen materias primas certificadas por lo que cada nuevo lote de materia prima debe ser sometido a un anlisis fsico-qumico y a un chequeo del nivel de esterilidad pre y post inoculacin. Para que la esporulacin sea mxima se necesita una buena rea superficial en relacin al volumen. Las partculas del sustrato individuales deben estar separadas despus de la hidratacin y esterilizacin porque las que quedan pegadas reducen el rea superficial con respecto al volumen cuando se adiciona el agua, limitando el espacio efectivo en que ocurrir la esporulacin. El contenido de humedad del sustrato debe ser ajustado para el crecimiento micelial y la conidiognesis teniendo en cuenta cada combinacin sustrato-aislado y su optimizacin puede ser compleja. El rango de humedad 35-60% v/p es usualmente usado. Incrementos en el contenido de humedad del sustrato tienden a disminuir la disponibilidad de oxgeno lo que se puede agravar en el escalado debido a la compactacin de grandes masas de este. La aeracin en la produccin es otro parmetro que determina la calidad de las producciones partiendo de que todos los hongos mitospricos (mixomicetos) son aerobios y requieren oxgeno para el crecimiento y la conidiacin. En los sistemas de produccin artesanales es difcil determinar el requerimiento de oxgeno de un determinado hongo y la evaluacin se hace muy cualitativamente. La mayora de los sistemas de produccin de Amrica Latina, China y del programa internacional
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LUBILOSA, estn basados en el intercambio del aire entre la cmara de crecimiento y el ambiente externo. Otro factor crtico es la temperatura de incubacin, la que vara segn el tipo de crecimiento requerido no solo entre especies sino tambin para el aislado en cuestin. Este parmetro debe ser monitoreado cuidadosamente en el escalado, debido a que el calor que se produce durante el metabolismo puede provocar reas con temperaturas por encima de la ptima en el cultivo. Tambin se debe tener en cuenta el rgimen luz-oscuridad cuando se selecciona el sistema de produccin. En la etapa de post-cosecha, previo envasado, se precisan mtodos para extraer y/o formular los propgalos (conidios generalmente). Por ejemplo, si se necesitan conidios para aplicacin a volmenes ultra bajos se requiere de un fino polvo con partculas uniformes por lo que la extraccin debe ser eficiente y selectiva para los conidios garantizando su viabilidad. Con respecto al monitoreo de la contaminacin del proceso se sabe que todas las producciones microbianas tienen el riesgo de contaminarse y en las artesanales esto puede ocurrir con ms frecuencia si no se cumplen las buenas prcticas de produccin debido al gran nmero de operaciones manuales. Las contaminaciones pueden conducir a una prdida de eficacia del ingrediente activo por la dilucin con los microorganismos que han competido, adems del posible efecto inhibitorio de los metabolitos secundarios producidos por los contaminantes donde el reconocimiento y la cuantificacin del grado de contaminacin son importantes para determinar
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cualquier posible riesgo a la salud humana y demostrar que no haya entrada de patgenos humanos. Por ello se deben registrar todos los pasos crticos del sistema de produccin y el resultado de los anlisis de contaminantes para identificar la fuente y tomar medidas preventivas. Esto incluye el subcultivo del que se parta para preparar los pre-inculos, los inculos, el sustrato antes y despus de esterilizado y el producto final. Las especificaciones para el nivel permisible de contaminantes en el producto final dependern de los mtodos de produccin y el procesamiento del producto en la cosecha, post-cosecha y la formulacin, etapas ltimas que se realizan en ambientes no estriles. Por tanto se debe establecer un nivel base de entrada de contaminantes a travs de un estudio bien controlado, chequeando los controles en las primeras etapas del proceso para demostrar que el nivel de contaminantes del producto final es debido inevitablemente a las ltimas fases. Principales ensayos En general, el control de calidad del producto final es el punto ms importante que garantiza el funcionamiento de ste y su aceptacin a largo plazo. Si el producto tiene una viabilidad alta al igual que una adecuada virulencia, se maximiza la probabilidad de que acte bien en el campo. De ah que las pruebas de ms amplia aceptacin para los productos bioplaguicidas a base de hongos sean: 1- la prueba de viabilidad, donde se evala si la clula est o no viva. Esto puede hacerse a travs de una prueba de germinacin conidial a un tiempo y temperatura
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determinados en medios nutritivos agarizados o lquidos o por conteo de viables en placa (ufc/g o ml de producto) 2- los bioensayos donde se comprueba la estabilidad de la patogenicidad y la virulencia del aislado producido masivamente. Se usan individuos de la especie plaga hacia la cual va dirigida el producto. En nuestro caso, el insecto para los entomopatgenos o el hongo fitopatgeno para el caso de los hongos antagonistas como Trichoderma. 3- la determinacin del nivel de contaminantes (pureza) que se realiza tomando determinada cantidad del producto y realizndose conteo de viables posteriores a la siembra en medios nutritivos generales para hongos y bacterias 4- la concentracin de unidades infectivas que se determina por conteo directo en cmara de Neubauer o por conteo de viables en medios agarizados 5- la determinacin de la estabilidad del producto en almacenaje lo que constituye un factor crtico considerando la no necesidad de refrigeracin o algn tratamiento especial. Los mtodos de secado y cosecha, la formulacin y el embalaje deben tenerse en cuenta para preservar la calidad del conidio. DIAGRAMA DE BLOQUES DESCRIPCIN DEL DIAGRAMA REMOJADO
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Debido a que nuestra materia prima tiene una estructura muy rgida, sta debe remojarse por 24 hrs. para que los carbohidratos estn disponibles y sean fcilmente asimilables por el hongo. ESTERILIZACIN Nuestro sustrato es arroz quebrado el cual costar $3.5/Kg, nos da un rendimiento de 2.5 X 1010 esporas/Kg de sustrato, para poder comenzar con nuestro proceso debemos cerciorarnos de que nuestro proceso no ser blanco de contaminacin ya que podra disminuir el rendimiento, se llevar a cabo en una autoclave por 15 min., a 15 psi. FERMENTACIN Una vez que se tiene listo el sustrato se inocula la charola y las condiciones a las que debe estar son: 28C, con humedad de 75%, pH 5-6 durante 5 das. Esterilizacin de materia prima
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DETERMINACIONES ANALTICAS Conteo de esporas. El nmero de esporas se determin por conteo directo en cmara de Neubauer de 16 cuadros por cuadricula, se contaron 9 cuadriculas de las 25 de la cmara, utilizando la dilucin adecuada. Estas determinaciones tambin se llevan a cabo despus del tamizado, para su efectividad.
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Viabilidad La viabilidad de las esporas se determin haciendo diluciones sucesivas en agua destilada estril, hasta obtener concentraciones de esporas de 10, 100 y 1000/mL Estas tres diluciones se sembraron por triplicado, en cajas de Petri que contenan 20mL de PDA y se contaron las esporas germinadas a las 72 horas de incubacin a una temperatura de 28C. Mediciones de pH La medicin de pH se realiz directamente en la suspensin obtenida de las muestras de las fermentaciones slidas. Para realizar las mediciones se utiliz un potencimetro; este se calibr con soluciones amortiguadoras de pH 4.0 y 7.0. SECADO Se realiza en cuartos de temperatura controlada con un suministro de aire de 0.75 vkgm (litro de aire/Kg de medio hmedo por minuto) para quitar el agua que ya no es requerida ya que podra contaminarse nuestro producto adems de que facilita el manejo de ste, MOLIDO Aqu se hace otro molido con la finalidad de mezclar y homogeneizar el sustrato no consumido con las esporas pues ser nuestro vehculo, utilizando un molino de pistn.
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TAMIZADO Esta operacin tiene como objetivo homogeneizar el producto ya que los aspersores se tapan muy fcilmente, por eso debemos tener un tamao de partcula considerablemente pequeo, se utiliza un tamiz de malla 10. PRUEBAS DE CONTROL DE CALIDAD La comercializacin de controles biolgicos basados en hongos entomopatgenos requieren de un control adecuado de las propiedades biolgicas, fsicas y qumicas realizadas por el departamento de Control de la Calidad de la firma productora que asegure al usuario un producto de mxima eficacia en condiciones de campo (Vlez, 1997; Carballo, 1998; Monzn, 2001). Algunas pruebas microbiolgicas recomendadas son: Concentracin de esporas: Establece la dosificacin del producto. Germinacin de esporas: Determina la viabilidad del hongo en la formulacin. Pureza: Revela la proporcin del agente biolgico en la formulacin e identifica los microorganismos contaminantes con el objetivo de mejorar el proceso de produccin y formulacin de los entomopatgenos. Adems, es necesario realizar algunas pruebas fsicas de acuerdo al tipo de formulacin. (Vlez, 1997; Carballo, 1998) Por ejemplo los polvos humedecibles es necesario realizar pruebas de suspendibilidad, humectabilidad, contenido de humedad y tamao de partcula (Aroonrat, Manop y Uthai, 2003).
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EMPACADO Las esporas se empacarn (llenadora envasadora automtica) en bolsas de polipropileno con una capacidad de 240g., enseguida se pondrn en cajas de cartn para evitar el contacto con la luz UV ya que afecta considerablemente el producto. ALMACENAMIENTO Se debe almacenar a una temperatura de 10C evitando el contacto con la radiacin UV, ya que puede perder su viabilidad y por ltimo se distribuye.
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BIBLIOGRAFA
Anais da Academia Pernambucana de Cincia Agronmica, Recife, vols. 5 e 6, p.209-242, 2008-2009. BIOINSECTICIDAS: SU EMPLEO, PRODUCCIN Y COMERCIALIZACIN EN MXICO/CIENCIA UANL / VOL. IV, No. 2, ABRIL-JUNIO 2001/Patricia Tamez Guerra*, Luis J. Galn Wong* , Hiram Medrano Roldn**, Cipriano GarcaGutirrez***, Cristina Rodrguez Padilla*, Ricardo A. Gmez Flores* y Reyes S. Tamez Guerra 2010
Estudio de prefactibilidad para la instalacin de una planta productora de un Bioinsecticida por fermentacin slida a partir de Bauveria bassiana/cruz Aguilar Jess Fernndez Sandoval Lilia a., Jurez Martnez Nancy e., pedral Gonzlez Cintia 05 de diciembre de 2005/universidad autnoma metropolitana EVALUACIN DE CEPAS DE BEAUVERIA BASSIANA CONTRA DESCORTEZADORES (COLEOPTERA: SCOLYTIDAE) DEL GNERO IPS EN PLANTACIONES DE PINOS (PINUS CARIBAEA MORELET). Autores: Ren Alberto Lpez Castilla1, Enrique de Zayas 2, Antonio Fernndez Vera3 y Natividad Triguero Isasi1. HONGOS ENTOMOPATGENOS: IMPORTANTE HERRAMIENTA PARA EL CONTROL DE MOSCAS BLANCAS (HOMOPTERA: ALEYRODIDAE)/ Anas da Academia Pernambucana de Ciencia Agronmica, Recife, vols. 5 e 6, p.209242, 2008-2009. Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica) No. 63 p . 9 5 - 1 0 3 , 2 0 0 1/Avances en el Fomento de Productos Fitosanitarios No-Sintticos/Arnulfo Monz.n1 METODOS ARTESANALES DE PRODUCCIN DE BIOPLAGUICIDAS A PARTIR DE HONGOS ENTOMOPATGENOS Y ANTAGONISTAS Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) Ciudad de La Habana, Cuba 2006
USO DE BIOINSECTICIDAS PARA EL CONTROL DE PLAGAS DE HORTALIZAS ENCOMUNIDADES RURALES/Cipriano Garca Gutirrez y Mara Berenice Gonzlez Maldonado/Ra Ximhai, enero-abril,
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TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC

Mtodo de Elaboracin de un Bioinsecticida A base de Bauveria bassiana

De la Cruz Angeles Diana Carolina.

Guerrero Chvez Arturo. Grupo:3551 Fecha de entrega:

Vo.Bo. Dr. Hugo Minor Prez Div. Ingeniera Qumica y Bioqumica

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