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Hans Bisswanger

Enzymkinetik
Theorie und Methoden
Enzymkinetik: Theorie und Methoden, 3. Auflage. Hans Bisswanger
Copyright 2000 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim
ISBN: 3-527-30096-1
Hans Bisswanger
Enzymkinetik
Theorie und Methoden
3., vllig neu bearbeitete Auflage
Weinheim New York Chichester Brisbane Singapore Toronto
Prof. Dr. Hans Bisswanger
Physiologisch-Chemisches Institut
der Universitt Tbingen
Hoppe-Seyler-Strae 4
72076 Tbingen
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Printed in the Federal Republic of Germany
Fr Anna und Michael
Vorwort
Die Zeit, innerhalb welcher eine bestimmte Menge
Substrat verndert wird, also das Ma der
Reaktionsbeschleunigung durch den Katalysator, hngt
in erster Linie von seiner Menge ab. In sehr vielen Fllen
ist sie sogar direkt proportional der wirksamen Menge
des Fermentes, in anderen Fllen bestehen
kompliziertere Beziehungen, die man in den
sogenannten Fermentgesetzen hat ausdrcken wollen,
die aber zum groen Teil sehr mangelhaft fundiert sind.
Carl Oppenheimer (1919) Biochemie
Georg-Thieme-Verlag Leipzig
Nachdem sich bereits die erste Auflage der Theorie und Methoden der Enzymkinetik als
Standardwerk einfhrte, wurde der Text zur zweiten Auflage vllig berarbeitet mit
umfangreichen Ergnzungen im theoretischen und methodischen Teil, um den Stoff
zu aktualisieren und das Gebiet auch fr Experten in breiterem Rahmen abzudecken.
Allerdings mute damit in Kauf genommen werden, da der Umfang des Lernstoffes
fr Studenten selbst der Biochemie berschritten wurde, doch kann diesen eine sinn-
volle Auswahl zugemutet werden. Das erscheint auch dahingehend gerechtfertigt, als
ein Fachbuch noch nach dem Studium als Nachschlagewerk dienen soll.
Eine weitere grundlegende Umgestaltung war daher fr die dritte Auflage nicht
angezeigt, mit der Hinzufgung eines zustzlichen Kapitels ber Isotopenaustausch
und Isotopeneffekte wurde aber eine gravierende Lcke geschlossen. Zustzlich gab
die Neuauflage die Gelegenheit, durch Konvertierung der Textvorlage in ein moder-
nes Textprogramm das Schriftbild zu verbessern und dringliche Korrekturen vorzu-
nehmen. Bei dieser Gelegenheit sei fr die zahlreichen wertvollen Hinweise auf Feh-
ler und Verbesserungen gedankt.
Eine grundlegende Vernderung, uerlich bereits erkennbar an der neuen Form als
CD-ROM, erfuhr das dem Buch beiliegende Enzymkinetik-Programm EKI3.exe durch
Dmitriy Degtiarev, einem Informatikstudenten aus Moskau, der das Programm vllig
neu konzipierte. Gegenber der frheren Version enthlt es mehr Diagramme, auch
ist nun ein direkter Ausdruck der Diagramme mglich. Keine besondere Rcksicht wur-
de dabei auf die Kompatibilitt mit der lteren Version gelegt. Beigegeben sind Muster-
dateien reprsentativer Mechanismen. Das Programm arbeitet unter den Betriebssyste-
men Win95/98/NT. Im Interesse eines breiten Nutzerkreises wurden englischsprachige
Bezeichnungen gewhlt. Da davon ausgegangen wird, da sich PC-Nutzer weitgehend
durch Ausprobieren in ein Programm einarbeiten, ist die beigegebene Anleitung kurz
gehalten. Die meisten Funktionen verstehen sich von selbst. Der Benutzer mge die
gegenber den meist kostspieligen kommerziellen Graphikprogrammen einfache Ge-
staltung nachsehen, da sich das Programm als begleitend zum Buchtext versteht.
Tbingen, November 1999 Hans Bisswanger
Enzymkinetik: Theorie und Methoden, 3. Auflage. Hans Bisswanger
Copyright 2000 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim
ISBN: 3-527-30096-1
Inhalt
Symbole und Abkrzungen XIII
Einleitung 1
1 Multiple Gleichgewichte 5
1.1 Diffusion 5
1.2 Wechselwirkung von Liganden mit Makromoleklen 10
1.2.1 Bindungskonstanten 10
1.2.2 Herleitung der Bindungsgleichung 11
1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 12
1.3.1 Allgemeine Bindungsgleichung 12
1.3.2 Graphische Darstellungen der allgemeinen Bindungsgleichung 18
1.3.2.1 Direkte Auswertung 18
1.3.2.2 Auswertung von Bindungskurven aus optischen Titrationsverfahren 20
1.3.3 Bindung verschiedener Liganden, Kompetition 23
1.4 Makromolekle mit nicht-identischen, unabhngigen Bindungs-
stellen 27
1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen,
Kooperativitt 30
1.5.1 Hill-Gleichung 30
1.5.2 Adair-Gleichung 32
1.5.3 Paulingsches Modell 33
1.5.4 Allosterische Enzyme 34
1.5.5 Symmetrie-Modell 34
1.5.6 Sequenz-Modell und negative Kooperativitt 39
1.5.7 Physiologische Aspekte der Kooperativitt 43
1.5.8 Nachweis der Kooperativitt 46
1.5.9 Beispiele allosterischer Enzyme 48
1.5.9.1 Hmoglobin 48
1.5.9.2 Aspartat-Transcarbamylase 49
1.5.9.3 Aspartokinase 49
1.5.9.4 Andere Beispiele 50
1.6 Nicht-identische, sich beeinflussende Bindungsstellen 51
1.7 Literatur 51
2 Enzymkinetik 53
2.1 Reaktionsordnung 53
2.1.1 Reaktionen erster Ordnung 53
Enzymkinetik: Theorie und Methoden, 3. Auflage. Hans Bisswanger
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ISBN: 3-527-30096-1
2.1.2 Reaktionen zweiter Ordnung 55
2.1.3 Reaktionen nullter Ordnung 56
2.2 Steady-State-Kinetik und Michaelis-Menten-Gleichung 57
2.2.1 Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung 57
2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 60
2.3.1 Graphische Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung 60
2.3.1.1 Nicht-lineare Darstellungen 60
2.3.1.2 Direkt-lineare Diagramme 66
2.3.1.3 Linearisierungsverfahren 68
2.3.1.4 Graphische Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven 71
2.3.1.5 Integrierte Michaelis-Menten-Gleichung 71
2.3.2 Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit 74
2.3.2.1 Experimentelle Bestimmung 74
2.3.2.2 Graphische Verfahren 75
2.4 Reversible Enzymreaktionen 78
2.4.1 Geschwindigkeitsgleichung fr reversible Enzymreaktionen 78
2.4.2 Haldane-Beziehung 80
2.4.3 Produkthemmung 81
2.5 Enzymhemmung 84
2.5.1 Reversible Enzymhemmung 84
2.5.1.1 Allgemeine Geschwindigkeitsgleichung 84
2.5.1.2 Nicht-kompetitive Hemmung, graphische Darstellung
von Hemmdaten 87
2.5.1.3 Kompetitive Hemmung 94
2.5.1.4 Unkompetitive Hemmung 97
2.5.1.5 Partielle Hemm-Mechanismen, partiell nicht-kompetitive
Hemmung 99
2.5.1.6 Partiell unkompetitive Hemmung 101
2.5.1.7 Partiell kompetitive Hemmung 102
2.5.1.8 Nicht- und unkompetitive Produkthemmung 105
2.5.1.9 Substrathemmung 106
2.5.2 Irreversible Enzymhemmung 108
2.5.2.1 Unterscheidung reversibler und irreversibler Hemmstoffe 108
2.5.2.2 Charakterisierung irreversibler Hemmungen 109
2.5.3 Enzymreaktionen mit zwei konkurrierenden Substraten 111
2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 113
2.6.1 Nomenklatur 113
2.6.2 Random-Mechanismus (Zufalls-Mechanismus) 114
2.6.3 Ordered-Mechanismus (geordneter Mechanismus) 118
2.6.4 Ping-Pong-Mechanismus 121
2.6.5 Haldane-Beziehungen bei Mehrsubstrat-Reaktionen 123
2.6.6 Mechanismen mit mehr als zwei Substraten 124
2.6.7 Andere Schreibweisen fr Mehrsubstratreaktionen 126
2.7 Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen komplexer
Enzymmechanismen 126
2.7.1 King-Altman-Verfahren 126
X Inhalt
2.7.2 Vereinfachtes Verfahren nach der Graphentheorie 132
2.7.3 Kombination von Gleichgewichts- und Steady-State-Annahmen 133
2.8 Kinetische Behandlung allosterischer Enzyme 135
2.8.1 Hysteretische Enzyme 135
2.8.2 Kinetische Kooperativitt, Slow-Transition-Modell 137
2.9 Spezielle Enzym-Mechanismen 138
2.9.1 Kinetik immobilisierter Enzyme 138
2.9.1.1 Externe Diffusionslimitierung 140
2.9.1.2 Interne Diffusionslimitierung 142
2.9.1.3 Hemmung immobilisierter Enzyme 144
2.9.1.4 pH- und Temperaturverhalten immobilisierter Enzyme 144
2.9.2 Polymere Substrate 145
2.10 pH- und Temperaturverhalten von Enzymen 146
2.10.1 pH-Optimumskurve und Bestimmung von pK-Werten 146
2.10.2 pH-Stabilitt von Enzymen 148
2.10.3 Thermische Stabilitt von Enzymen 149
2.10.4 Temperaturabhngigkeit enzymatischer Reaktionen 150
2.11 Isotopenaustausch 153
2.11.1 Isotopenaustauschkinetik 153
2.11.2 Isotopeneffekte 157
2.11.2.1 Primre kinetische Isotopeneffekte 157
2.11.2.2 Einflu des kinetischen Isotopeneffekts auf K
m
und V 158
2.11.2.3 Andere Isotopeneffekte 160
2.12 Anwendung statistischer Methoden in der Enzymkinetik 160
2.12.1 Allgemeine Bemerkungen 160
2.12.2 In der Enzymkinetik gebruchliche statistische Begriffe 164
2.13 Literatur 166
3 Methoden 169
3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 169
3.1.1 Gleichgewichtsdialyse und allgemeine Aspekte von Bindungs-
messungen 171
3.1.1.1 Prinzip der Gleichgewichtsdialyse 171
3.1.1.2 Kontrollexperimente und Fehlerquellen 173
3.1.2 Kontinuierliche Gleichgewichtsdialyse 177
3.1.3 Ultrafiltration 179
3.1.4 Gelfiltration 181
3.1.4.1 Batchverfahren 181
3.1.4.2 Elution breiter Zonen 182
3.1.4.3 Verfahren nach Hummel und Dreyer 182
3.1.4.4 Verfahren nach Brumbaugh und Ackers 183
3.1.5 Ultrazentrifugationsmethoden 184
3.1.5.1 Einfache Ultrazentrifugation 184
3.1.5.2 Zentrifugationsmethode von Chanutin et al. (1942) 184
3.1.5.3 Rohrzuckergradientenzentrifugation nach Draper und Hippel 186
AInhalt XI
3.2 Elektrochemische Methoden 189
3.2.1 Sauerstoffelektrode 190
3.2.2 CO
2
-Elektrode 192
3.2.3 Potentiometrie, Oxidations-Reduktions-Potentiale 193
3.2.4 pH-Stat 193
3.2.5 Polarographie 195
3.3 Kalorimetrie 196
3.4 Spektroskopische Methoden 197
3.4.1 Absorptionsspektroskopie 200
3.4.1.1 Lambert-Beersches Gesetz 200
3.4.1.2 Spektrale Eigenschaften von Enzymen und Liganden 200
3.4.1.3 Aufbau von Spektralphotometern 204
3.4.1.4 Doppelstrahl-Spektralphotometer 207
3.4.1.5 Differenzspektroskopie 208
3.4.1.6 Doppelwellenlngen-Spektralphotometer 210
3.4.1.7 Photochemische Aktionsspektren 211
3.4.2 Biolumineszenz 212
3.4.3 Fluoreszenz 212
3.4.3.1 Quantenausbeute 212
3.4.3.2 Strungen von Fluoreszenzmessungen 213
3.4.3.3 Fluoreszierende Verbindungen (Fluorophore) 214
3.4.3.4 Aufbau von Spektralfluorimetern 218
3.4.3.5 Strahlungslose Energiebertragung 219
3.4.3.6 Fluoreszenzpolarisation 221
3.4.3.7 Pulsfluorimetrie 223
3.4.4 Circulardichroismus und optische Rotationsdispersion 224
3.4.5 Infrarot- und Raman-Spektroskopie 230
3.4.5.1 IR-Spektroskopie 230
3.4.5.2 Raman-Spektroskopie 230
3.4.5.3 Anwendungen 231
3.4.6 Elektronenspinresonanz-Spektroskopie 232
3.5 Messung schneller Reaktionen 234
3.5.1 Flumethoden 236
3.5.1.1 Continuous-Flow-Methode 236
3.5.1.2 Stopped-Flow-Methode 238
3.5.1.3 Messung von Enzymreaktionen durch Flumethoden 242
3.5.1.4 Bestimmung der Totzeit 243
3.5.2 Relaxationsmethoden 244
3.5.2.1 Temperatursprung-Methode 245
3.5.2.2 Drucksprung-Methode 248
3.5.2.3 Feldsprung-Methode 250
3.5.3 Flash-Photolyse, Pico- und Femtosekunden-Spektroskopie 250
3.5.4 Auswertung schneller kinetischer Reaktionen (Transient-Kinetik) 252
3.6 Literatur 256
Register 261
XII Inhalt
Symbole und Abkrzungen
(Einheiten in Klammern)
Spezielle Abkrzungen sind im Text definiert
A, B, C Liganden, Substrate
A Absorptionsma
c Konzentration
D Diffusionskoeffizient
e Eulersche Zahl (e =2,71828)
E Enzym, Makromolekl
E
a
Aktivierungsenergie
F relative Fluoreszenzintensitt
e molarer Absorptionskoeffizient
g Viskositt
g
e
Effizienzfaktor
g
e1
Effizienzfaktor fr Reaktionen erster Ordnung
U optische Rotation
U
F
Quantenausbeute
U
s
Substrat- bzw. Thielemodul
DG8 freie Standard-Energie
G elektrischer Leitwert (S)
DH8 Standard-Reaktionsenthalpie
h Plancksche Konstante (6,62610
34
Js)
h
s
Transportkoeffizient des Substrats
I Hemmstoff
I Lichtintensitt
J Flu
IU Enzymeinheit (engl. international unit, lmol/min)
K mikroskopische Gleichgewichtskonstante
K' makroskopische Gleichgewichtskonstante
K
a
Assoziationskonstante
K
app
apparente Gleichgewichtskonstante
K
d
Dissoziationskonstante
K
g
Gleichgewichtskonstante einer Reaktion
K
i
Hemmkonstante
K
ic
Hemmkonstante fr kompetitive Hemmung
K
iu
Hemmkonstante fr unkompetitive Hemmung
K
m
Michaelis-Konstante
K
mA
Michaelis-Konstante fr Substrat A
k
1
Geschwindigkeitskonstante der Hinreaktion
k
1
Geschwindigkeitskonstante der Rckreaktion
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k
cat
katalytische Konstante
k
B
Boltzmann-Konstante (k
B
=R/N=1,38
.
10
23
JK
1
)
kat Katal, Enzymeinheit nach dem SI-System (mol/s, 1 nkat =0,06 IU;
1 IU=16,67 nkat)
M
r
relative Moleklmasse (dimensionslos)
m Anzahl der Bindungsklassen pro Makromolekl
n Anzahl identischer Bindungsstellen pro Makromolekl
n
h
Hill-Koeffizient
N
A
Avogadro-Konstante (6,022 10
23
mol
1
)
Or Ordinatenschnittpunkt
P, Q, R Produkte
P Polarisation
R Gaskonstante (8,314 JK
1
mol
1
)
r Fraktion der pro Makromolekl gebundenen Liganden
q Dichte (kgm
3
)
DS Standard-Reaktionsentropie
St Steigung
T absolute Temperatur (K)
t Zeit (s)
H Elliptizitt
s Relaxationszeit
U elektrische Spannung (V)
v Reaktionsgeschwindigkeit
v
0
Anfangsgeschwindigkeit fr t =0
V Maximalgeschwindigkeit fr Substratkonzentration ??
Y Fraktion der pro Bindungsstelle gebundenen Liganden
XIV Symbole und Abkrzungen
Einleitung
Enzymreaktionen erscheinen in der blichen Formulierung als einfache Prozesse, wie
der Fall einer Einsubstratreaktion:
E A
k
1
B EA
k
2
3 E P Y
k
1
A
doch bei genauer Formulierung erweist sich selbst ein solch simpler Mechanismus
als komplexer, aus mehreren Teilschritten zusammengesetzter Vorgang:
E A
k
1
B EA
k
2
B E

A
k
3
B E

P
k
4
B EP
k
5
B E P X
k
1
A
k
2
A
k
3
A
k
4
A
k
5
A
In einem schnellen Gleichgewicht bildet sich zunchst ein loser Assoziationskomplex
zwischen Enzym E und Substrat A. Daraufhin nimmt das Enzym seine aktive Form
E

an und ist nun in der Lage, Substrat in Produkt P zu berfhren. Nach der Rck-
verwandlung des Enzyms in seine ursprngliche Form dissoziiert das Produktmolekl
ab und das Enzym ist zur Wechselwirkung mit einem weiteren Substratmolekl be-
reit. Der gesamte Mechanismus besteht aus einer Abfolge von fnf Teilreaktionen,
von denen jede zur Gesamtreaktion beitrgt. Um die Reaktion vollstndig zu be-
schreiben, mten fnf Gleichgewichtskonstanten bzw. zehn Geschwindigkeitskon-
stanten ermittelt werden. Noch viel komplexer und unbersichtlicher werden Enzym-
mechanismen durch die Beteiligung von zwei und mehr Substraten, von Cofaktoren
und Regulatoren.
Durch enzymkinetische Messungen solcher Mechanismen werden kinetische Kon-
stanten, die Michaelis-Konstanten und die Maximalgeschwindigkeiten, erhalten, die
sich aus den angegebenen Geschwindigkeitskonstanten zusammensetzen. Ist die Re-
aktion, wie in der zweiten Formel dargestellt, reversibel, kann sie in beiden Richtun-
gen gemessen und analysiert werden und man erhlt den doppelten Satz kinetischer
Konstanten. Enzymkinetische Studien erfassen nur den Gesamtproze. Um den Reak-
tionsablauf auch in seinen Teilschritten vollstndig zu verstehen, mssen diese aufge-
lst und getrennt analysiert werden.
Jeweils der erste und der letzte Teilschritt einer solchen Reaktion sind schnelle As-
soziationsgleichgewichte, die dem katalytischen Umsatz vorangehen. Durch spezielle
Bindungsmethoden auf der Grundlage der unter dem Begriff multiple Gleichgewichte
zusammengefaten theoretischen Beschreibung (vgl. Kapitel 1) knnen diese Pro-
zesse zugnglich gemacht werden. Man geht dabei davon aus, da eine zumeist nie-
dermolekulare Verbindung, ein Ligand, mit einem Makromolekl eine spezifische
Wechselwirkung eingeht, d. h. das Makromolekl verfgt ber distinkte Bindungsstel-
len fr diesen Liganden (im Gegensatz z. B. zu ionischen Bindungen von Kationen
und Anionen zur Absttigung von berschuladungen an Proteinoberflchen oder un-
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spezifischen hydrophoben Assoziationen). Die in diesem Teil behandelten Gesetzm-
igkeiten gelten, da katalytischer Umsatz hier ausdrcklich ausgeschlossen ist, nicht
nur fr Enzyme, sondern allgemein fr Makromolekle, so auch fr Transportpro-
teine, Rezeptoren oder Nucleinsuren. Der Ligand kann ein Substrat, Produkt, Cofak-
tor, Hemmstoff, Aktivator, Regulator, Hormon, Neurotransmitter oder Pharmakon
sein. Enzymsubstrate drfen allerdings nicht umgesetzt werden. Mit Hilfe der Gesetz-
migkeiten der multiplen Gleichgewichte werden Gleichgewichtskonstanten (Asso-
ziations- bzw. Dissoziationskonstanten) erhalten und es ist mglich, Wechselwirkun-
gen zwischen Enzym und Liganden in Abwesenheit eines katalytischen Umsatzes zu
analysieren. Dadurch vereinfacht sich die Behandlung komplexer Mechanismen, wie
der allosterischen Enzyme. Solche Mechanismen, die bereits vollstndig ber multi-
ple Gleichgewichte beschreibbar sind, werden auch dort behandelt, auch wenn sie,
aufgrund der besseren Nachweisbarkeit enzymatischer Umstze gegenber Bindungs-
gleichgewichten vielfach durch enzymkinetische Messungen analysiert werden.
Enzymkinetische Methoden bentigen wegen der auerordentlichen katalytischen
Potenz von Enzymen nur katalytische Mengen, die um Grenordnungen unter der
Substratkonzentration liegen. Das sich chemisch vom Substrat unterscheidende Pro-
dukt lt sich durch geeignete Methoden zumeist deutlich nachweisen. Dagegen ms-
sen bei Messungen reversibler Gleichgewichte Makromolekl und Ligand in ver-
gleichbarer Menge vorliegen. Ausgangszustand, also die getrennten Komponenten,
und Endzustand, der Makromolekl-Ligand-Komplex, sind chemisch nicht unter-
schieden und daher schwer nachweisbar. Aufgrund der Reversibilitt der Bindung
sind diese Komplexe nicht stabil und knnen nicht isoliert werden. Um die oft sehr
geringen durch die Bindung verursachten Vernderungen doch noch sichtbar zu ma-
chen, sind sehr hohe Makromolekl-Konzentrationen erforderlich. Schlielich sind,
solange keine strenden Nebenreaktionen auftreten, die Reinheitsanforderungen bei
enzymkinetischen Messungen geringer als bei den direkt auf die Molaritt des Ma-
kromolekls bezogenen Bindungsmessungen, teilweise kann sogar in rohen Extrakten
gemessen werden. Es zeigt sich daran, da vielfach weniger die theoretischen Analy-
sen als vielmehr praktische Erwgungen der Enzymkinetik den Vorzug gegenber
Bindungsmessungen geben.
Mit Hilfe der Methoden der Messung schneller kinetischer Reaktionen ist es mg-
lich, Teilprozesse zeitlich voneinander zu trennen und die Geschwindigkeitskonstan-
ten der einzelnen Reaktionsschritte zu berechnen. So erfordert die detaillierte Ana-
lyse einer enzymkatalysierten Reaktion die Kombination sehr unterschiedlicher Ver-
fahren. Dieses Vorgehen ist auch im folgenden Text zugrunde gelegt, der damit ins-
besondere hinsichtlich der Gleichgewichtsbetrachtungen ber die eigentliche Enzym-
kinetik hinausgeht, die sich entsprechend dem Wortsinn (griech. jimgrir, Bewegung)
mit zeitabhngigen Prozessen beschftigt. Der Zusammenhang zwischen den ver-
schiedenen Kapiteln wird durch eine einheitliche Nomenklatur verdeutlicht. Das En-
zym, aber auch nicht-enzymatische Makromolekle bei Bindungsprozessen werden
E, Enzymsubstrate bzw. Liganden A, B, C, Produkte P, Q, R und Hemmstoffe I (von
engl. inhibitor) bezeichnet.
Zur Vereinheitlichung der heterogenen Bezeichnungen und Definitionen in der Li-
teratur werden hier soweit mglich Symbole und Terminologie nach den NC-IUB-
Empfehlungen (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry,
2 Einleitung
1982) und den IUPAC-Regeln (International Union of Pure and Applied Chemistry,
1981) verwendet. Konzentrationen werden durch eckige Klammern ([A] etc.) ange-
zeigt. Die folgende Literaturliste ist eine Zusammenfassung wichtiger Standardwerke
zu den hier behandelten Gebieten.
Literatur
Allgemeine Literatur zu Theorie und Methoden der Enzymkinetik
Ahlers, J., Arnold, A., v. Dhren, F. R. & Peter, H. W. (1982) Enzymkinetik, 2. Aufl. Fischer Verlag,
Stuttgart.
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Cornish-Bowden, A. (1976) Principles of enzyme kinetics. Butterworth, London.
Cornish-Bowden, A. & Wharton, C. W. (1988) Enzyme kinetics. IRL Press, Oxford.
Dixon, M. & Webb, E.C. (1979) Enzymes. Academic Press, New York.
Edsall, J. T. & Gutfreund, H. (1983) Biothermodynamics. J. Wiley & Sons, New York.
Eisenthal, R. & Danson, J. M. (1992) Enzyme assays. A practical approach. IRL Press, Oxford.
Engel, P. C. (1977) Enzyme kinetics. Chapman & Hall, London.
Fersht, A. (1977) Enzyme structure and mechanism. Freeman & Co., San Francisco.
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Klotz, I. M. (1986) Introduction to biomolecular energetics including ligand-receptor interactions.
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Laidler, K. J. & Bunting, P. S. (1973) The chemical kinetics of enzyme action, 2. edn. Clarendon
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Lthje, J. (1990) Enzymkinetik. Urban & Schwarzenberg, Mnchen.
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Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB) (1982) Symbolism
and terminology in enzyme kinetics. European Journal of Biochemistry 128, 281291.
International Union of Pure and Applied Chemistry (1981) Symbolism and terminology in chemical
kinetics. Pure and Applied Chemistry 53, 753771.
ALiteratur 3
1 Multiple Gleichgewichte
Im Gegensatz zu chemischen Reaktionen, bei denen zwei verschiedenartige Verbin-
dungen in einer Lsung zueinander entweder vllig inert sind oder beim Zusammen-
treffen unmittelbar miteinander reagieren und zu Produkten umgewandelt werden:
A B P Q
haben biologisch aktive Makromolekle, wie Enzyme, die Fhigkeit, den Reaktions-
partner spezifisch zu binden, ohne da sich die Natur beider Partner dadurch vern-
dert:
E A
k
1
B EA
k
1
A
Spezifische Bindung ist die Voraussetzung fr alle funktionellen Prozesse, wie Mem-
brantransport, Hormonwirkung oder Substratumsatz. Daher kommt dem Studium spezi-
fischer Bindungsprozesse groe Bedeutung zu. Zunchst mu das Vorliegen einer spe-
zifischen Bindung sichergestellt und unspezifische Assoziation, bedingt beispielsweise
durch hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Makromolekl
und Ligand, ausgeschlossen werden. Einen Hinweis dafr gibt die Gre der Dissozia-
tionskonstanten, die bei spezifischen Bindungen in der Regel unter 10
3
M liegt (aller-
dings gibt es hier auch Ausnahmen, wie die Bindung von H
2
O
2
an das Enzym Katalase
oder die Bindung von Glucose an die Glucose-Isomerase). Spezifische Bindungen ste-
hen in striktem stchiometrischem Verhltnis zur Makromoleklkonzentration und sind
absttigbar, sie streben einem bestimmten Sttigungswert zu. Eine weitere Eigenschaft
spezifischer Bindung ist die Mglichkeit der Verdrngung des Liganden durch struktur-
analoge Verbindungen. Es soll zunchst eine Vorstellung vermittelt werden, wie der Li-
gand seine Bindungsstelle am Makromolekl findet und welche Faktoren die Affinitt
zur Bindungsstelle bestimmen. Im Anschlu daran erfolgt eine Darstellung der wesent-
lichen Arten der Wechselwirkung von Liganden mit Makromoleklen.
1.1 Diffusion
Voraussetzung fr die Reaktion eines Makromolekls mit seinem Liganden ist, da
beide Partner zueinanderfinden. Ein Partikel bewegt sich entlang einer Achse mit der
kinetischen Energie k
B
T/2. T ist die absolute Temperatur, k
B
die Boltzmann-Kon-
stante. Nach der Einsteinschen Beziehung hat ein Partikel der Masse m, das sich in
einer Richtung mit der Geschwindigkeit v bewegt, die kinetische Energie mv
2
/2, d. h.
Enzymkinetik: Theorie und Methoden, 3. Auflage. Hans Bisswanger
Copyright 2000 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim
ISBN: 3-527-30096-1
v
2
= k
B
Tam X (1X1)
Demnach wrde ein Makromolekl der Gre der Lactat-Dehydrogenase
(M
r
=140000) pro Sekunde 4 m zurcklegen, whrend ihr Substrat, die Milchsure
(M
r
=90,1), in der gleichen Zeit 170 m und ein Wassermolekl (M
r
=18) 370 m
durchmessen wrden. Enzym und Substrat flgen gleich Schrotkugeln aneinander
vorbei und erreichten in Sekundenbruchteilen die Zellgrenzen. Im dichtgedrngten
Medium des Zellinneren stellen sich den sich bewegenden Teilchen jedoch bestndig
Hindernisse in den Weg, wie Wassermolekle, Ionen, Metabolite, Makromolekle
und Zellorganellen, so da die Wanderung der Molekle eher dem Torkeln Betrunke-
ner als einer geradlinigen Bewegung gleicht. Diese Taumelbewegung verzgert nicht
nur die Fortbewegung der Molekle, sie erhht auch ganz betrchtlich die Wahr-
scheinlichkeit des Aufeinandertreffens bestimmter Molekle.
Die Strecke x, die ein Molekl in einer Lsung in der Zeit t in einer Richtung zu-
rcklegt, hngt ab vom Diffusionskoeffizienten D nach der Beziehung:
x
2
= 2Dt X (1X2)
Der Diffusionskoeffizient ist seinerseits eine Funktion der Konzentration des diffun-
dierenden Stoffes, kann aber bei verdnnten Lsungen als konstant angesehen wer-
den. Er ist weiterhin abhngig von der Partikelgre, der Art des Mediums und der
Temperatur. Fr kleine Molekle in Wasser betrgt er D=10
5
cm
2
/s. Um eine Zelle
der Gre 1 mm zu durchwandern, bentigt das Molekl 0,5 ms, fr 1 mm dagegen
8,33 min, d. h. fr die tausendfache Strecke ist die millionenfache Zeit erforderlich.
Man erkennt daran, da es keine Diffusionsgeschwindigkeit gibt, die Bewegung ei-
nes Molekls im Medium ist nicht der Zeit proportional, sondern deren Quadratwur-
zel. Ein diffundierendes Molekl erinnert sich nicht an frhere Zustnde, d. h. es
sucht ein Gebiet rein zufllig ab und hat nicht das Bestreben, neue Rume zu er-
schlieen. So hat ein 10 cm hoher Rohrzuckergradient, der der Partikeltrennung oder
der Grenbestimmung von Makromoleklen dient, bei einem Diffusionskoeffizien-
ten von D=5 10
6
cm
2
/s fr Saccharose eine Lebensdauer von etwa vier Monaten.
Gleichung (1.2) beschreibt die eindimensionale Diffusion eines Molekls. Da die
Diffusion in den drei Raumrichtungen x, y und z unabhngig voneinander erfolgt, gilt
fr die Diffusion ber die Strecke r im dreidimensionalen Raum:
r
2
= x
2
y
2
z
2
= 6Dt X (1X3)
Fr das Zustandekommen einer spezifischen Bindung gengt nicht alleine das Auf-
treffen des Liganden auf dem Makromolekl, vielmehr mu der Ligand seine Bin-
dungsstelle am Makromolekl suchen. Dies geschieht durch Translokation seines Vo-
lumens 4pR
3
/3 um jeweils die Distanz seines eigenen Radius R. Nach einer Zeit t hat
das Molekl nach Gl. (1.3) fr r =R ein Volumen von:
6Dt
x
R
2

4pR
3
3
= 8pDRt
x
(1X4)
6 1 Multiple Gleichgewichte
abgesucht. Das abgesuchte Volumen pro Zeiteinheit ist 8pDR, die Wahrscheinlichkeit
einer Kollision fr ein bestimmtes Partikel in Lsung ist proportional zum Diffusi-
onskoeffizienten und zum Teilchenradius.
Zu Beginn einer Reaktion:
A B P
herrscht in der Lsung Gleichverteilung der beiden Partner. Rasch aber verarmen die
Molekle des einen Typs (z. B. B) zwischen den noch nicht umgesetzten Moleklen
des anderen Typs (A), so da sich ein Konzentrationsgradient ausbildet. Als Konse-
quenz dieser Situation erfolgt ein Nettoflu U der B-Molekle in Richtung der im
Abstand r entfernten A-Molekle:
U =
dn
dt
= DF
dc
dr
Y (1X5)
wobei n der Nettoberschu der in der Zeiteinheit t durch eine Flche F tretenden Mo-
lekle und c die Konzentration der im Abstand r von den A-Moleklen entfernten B-
Molekle ist. Diese Beziehung in ihrer allgemeinen Form ist bekannt als das 1. Fick-
sche Gesetz der Diffusion. In unserem Beispiel der Reaktion zweier Reaktanten hat
F die Dimension einer Kugeloberflche mit dem Radius r. Gl. (1.5) wird dann zu:
dc
dr
_ _
r
=
U
4pr
2
D
/
(1X6)
D
/
ist der Diffusionskoeffizient fr die relative Diffusion der reaktiven Molekle.
Nach Integration wird:
c
r
= c

U
4prD
/
(1X7)
wobei c
r
die Konzentration der B-Molekle in der Entfernung r und c
?
diejenige in
unendlicher Entfernung von den A-Moleklen ist. Letztere entspricht nherungsweise
der durchschnittlichen Konzentration an B-Moleklen. Der Nettoflu U ist proportio-
nal der Geschwindigkeit der Reaktion und diese ist wiederum proportional der durch-
schnittlichen Konzentration c derjenigen B-Molekle, die gerade mit den A-Moleklen
kollidieren, wobei r
A+B
die Summe der Radien eines A- und eines B-Molekls ist:
U = kc
r
AB
X (1X8)
k ist die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion im Gleichgewicht, bei dem c
r
gleich c
r
A+B
und r gleich r
A+B
werden. Eingesetzt in Gl. (1.7) ergibt sich:
c
r
AB
=
c

1
k
4pr
AB
D
/
X (1X9)
A1.1 Diffusion 7
Der Nettoflu im Zustand eines Fliegleichgewichts ist
U = k
a
c

X (1X10)
k
a
ist die zugehrige Assoziationsgeschwindigkeitskonstante. Damit knnen
Gl. (1.8)(1.10) umgeformt werden zu:
1
k
a
=
1
4pr
AB
D
/

1
k
X (1X11)
Diese Beziehung lt sich graphisch in linearer Form darstellen, wenn 1/k
a
gegen die
Viskositt des Lsungsmittels g aufgetragen wird, da nach der Einstein-Sutherland-
Gleichung der Diffusionskoeffizient bei unendlicher Verdnnung D
0
dem Reibungs-
koeffizienten f umgekehrt proportional und dieser wiederum der Viskositt direkt pro-
portional ist:
D
0
=
k
B
T
f
=
k
B
T
6pgr
X (1X12)
1/k wird als Ordinatenschnittpunkt erhalten. Ist k4pr
A+B
D
/
, so liegt dieser Schnitt-
punkt nahe dem Koordinatenursprung, es wird dann
k
a
= 4pr
AB
D
/
X (1X13)
Diese Grenzbeziehung gilt als das Smoluchowski-Limit fr translatierende Diffusion,
die Reaktion ist diffusionskontrolliert. Bei reaktionskontrollierten Reaktionen ist da-
gegen der auf die Diffusion folgende Schritt, also der Substratumsatz, geschwindig-
keitsbestimmend. Um das Enzymmolekl entsteht eine Verarmungszone, da die Sub-
stratmolekle nicht rasch genug nachgeliefert werden. Eine diffusionslimitierte Disso-
ziation liegt vor, wenn die Abdissoziation des Produkts die Reaktion begrenzt. Betrach-
tet man zwei gleich reaktive Kugeln mit den Radien r
A
und r
B
und den Diffusionsko-
effizienten D
A
und D
B
, so erhlt man fr Gl. (1.13):
k
a
= 4pr
AB
D
/
= 4p(r
A
r
B
)(D
A
D
B
) (1X14)
unter Einsetzen von Gl. (1.12) und der Nherung r
A
=r
B
und D
0
= D
A
= D
B
:
k
a
=
8k
B
T
3g
X (1X15)
Aus dieser Beziehung ergeben sich die Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten fr
diffusionskontrollierte Reaktionen in der Grenordnung von 10
9
10
10
M
1
s
1
.
Wrde die Gre der Geschwindigkeitskonstanten ausschlielich durch Diffusion
bestimmt, so sollten weitgehend einheitliche Werte gefunden werden. Tatschlich
aber bewegen sich die gemessenen Werte von Geschwindigkeitskonstanten diffusions-
kontrollierter Reaktionen von Makromoleklen in einem Bereich von mehr als fnf
8 1 Multiple Gleichgewichte
Grenordnungen. Dies ist damit zu erklren, da fr eine erfolgreiche Bindung des
Liganden dieser mit dem Makromolekl nicht nur zufllig zusammentreffen mu,
sondern beide Molekle mssen in einer gnstigen Orientierung zueinanderstehen.
Dieser Umstand bewirkt eine betrchtliche Verzgerung des gesamten Bindungsvor-
gangs. Andererseits knnen Anziehungskrfte die Wechselwirkung begnstigen und
den Liganden in die richtige Orientierung dirigieren. Dadurch knnen Geschwindig-
keitskonstanten sogar die Werte der reinen Diffusionskontrolle bersteigen. Die quan-
titative Erfassung solcher Einflsse ist schwierig, da diese von der speziellen Struktur
des Makromolekls und des Liganden abhngen. Mit Hilfe verschiedener Theorien
wird versucht, allgemeine Regeln fr die Ligandenbindung zu formulieren.
Ein Ligand nhert sich einem Makromolekl mit einer nach Gl. (1.13) zu berech-
nenden Geschwindigkeit, es reagiert aber nur derjenige Anteil, der in der passenden
Orientierung auf die richtige Stelle auftrifft. Betrachtet man die Bindungsstelle als
Kreisflche auf dem Makromolekl, die mit dem Mittelpunkt des Makromolekls ei-
nen Winkel a bildet (Abb. 1.1), so wird die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante in
Gl. (1.13) um den Sinus des Winkels reduziert:
k
a
= 4pr
AB
D
/
sin a X (1X16)
Durch einen weiteren, von der Art der beteiligten reaktiven Gruppen abhngigen Faktor
wre noch die Notwendigkeit der geeigneten Orientierung zwischen Bindungsstelle und
Ligandmolekl zu bercksichtigen. Andererseits wird auch diskutiert, da der Ligand
zunchst unspezifisch an die Oberflche des Makromolekls assoziiert und durch eine
zweidimensionale Diffusion auf der Oberflche die Bindungsstelle sucht bzw. nach er-
folgloser Suche wieder abdiffundiert (Sliding-Modell; Berg, 1985). Solche unspezifi-
schen Bindungen knnten allerdings nicht zwischen dem gesuchten und anderen Meta-
boliten unterscheiden, die ihrerseits wieder die zweidimensionale Diffusion behindern
wrden. Weiterhin kann die Bindungsstelle durch Konformationsnderungen des Pro-
teins gleich einem Tor geffnet und geschlossen und dadurch die Zugnglichkeit fr
den Liganden beeinflut werden (Gating; McCammon & Northrup, 1981).
Ein unteres Limit der Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten fr das Substrat bei
Enzymen ist der Quotient aus katalytischer Konstante k
cat
und der Michaelis-Kon-
stanten K
m
(vgl. Abschnitt 2.2)
k
cat
K
m
=
k
cat
k
1
k
1
k
2
(1X17)
A1.1 Diffusion 9
Abb. 1.1. Schematische Darstellung der
Wechselwirkung eines Substratmole-
kls mit seiner Bindungsstelle am En-
zym.
der vielfach im Bereich von 10
8
M
1
s
1
einer diffusionskontrollierten Reaktion liegt.
Tatschlich sind es zumeist die nicht-kovalenten Schritte whrend der Substratbin-
dung und Produktdissoziation, die, mehr als die Spaltung von Bindungen, fr die
meisten Enzymreaktionen geschwindigkeitsbestimmend sind.
1.2 Wechselwirkung von Liganden mit Makromoleklen
1.2.1 Bindungskonstanten
Die Bindung eines Liganden A an ein Makromolekl E
E A
k
1
B EA (1X18)
k
1
A
lt sich nach dem Massenwirkungsgesetz durch die Assoziationskonstante K
a
oder
deren Kehrwert, die Dissoziationskonstante K
d
, beschreiben:
K
a
=
k
1
k
1
=
[EA[
[A[[E[
(1X19 a)
K
d
=
k
1
k
1
=
[A[[E[
[EA[
(1X19 b)
Beide Schreibweisen sind gebruchlich. Zur Behandlung von Gleichgewichtszustn-
den dient hufiger die Assoziationskonstante, whrend sich die enzymkinetischen
Konstanten, wie die Michaelis-Konstante, aus Dissoziationskonstanten herleiten. Zur
Verdeutlichung der Analogie zwischen beiden Bereichen wird hier durchgehend die
Dissoziationskonstante verwendet. Sie hat die Dimension einer Konzentration (M),
die Assoziationskonstante die Dimension einer reziproken Konzentration (M
1
). Glei-
chung (1.19a, b) sind genau genommen nicht ganz korrekt, anstelle der Konzentratio-
nen [c] wren die Aktivitten a=f [c] zu verwenden. Die Aktivittskoeffizienten f der
Komponenten gehen jedoch fr sehr verdnnte Lsungen, wie sie bei Enzymreaktio-
nen normalerweise vorliegen, gegen eins und knnen daher vernachlssigt werden.
Liegt ein Reaktionspartner gegenber den anderen in einem derart groen ber-
schu vor, da seine Konzentration durch die Reaktion nicht mebar verndert wird,
so kann diese in die Konstante einbezogen werden. Dies gilt insbesondere fr den
Reaktionspartner Wasser z. B. bei hydrolytischen Prozessen:
A H
2
O
Enzym
B P Q Y
A
das in seiner Eigenschaft als Lsungsmittel mit einer Konzentration von 55,56 mol/l
um Grenordnungen ber den zumeist mikro- oder millimolaren Mengen der ande-
ren Komponenten der Enzymreaktion liegt. Eine durch den Reaktionsproze verur-
sachte Vernderung der Wasserkonzentration ist praktisch nicht erfabar. Daher las-
10 1 Multiple Gleichgewichte
sen sich auch keine Bindungskonstanten fr Wasser an Enzyme angeben, wie es auch
schwierig ist, spezifische Bindungszentren fr Wasser nachzuweisen. Die Reaktion
wird so behandelt, als wrde Wasser nicht teilnehmen:
K
/
d
=
[A[[H
2
O[
[P[[Q[
= K
d
[H
2
O[ Y K
d
=
[A[
[P[[Q[
X
hnlich verhlt es sich mit den vielfach an Enzymreaktionen beteiligten Wasser-
stoffionen. Hier wird eine apparente Gleichgewichtskonstante K
app
definiert:
K
app
= K
d
[H

[ Y
die im Gegensatz zur echten Gleichgewichtskonstanten vom pH-Wert der Lsung ab-
hngig ist, was bei deren Bestimmung zu beachten ist.
1.2.2 Herleitung der Bindungsgleichung
Die Berechnung der Dissoziationskonstanten fr die Reaktion (1.18) nach dem Mas-
senwirkungsgesetz (1.19) setzt die Kenntnis der Konzentrationen des freien Makro-
molekls [E], des freien Liganden [A] und des Makromolekl-Liganden-Komplexes
[EA] unter Gleichgewichtsbedingungen voraus. Bekannt sind jedoch zunchst nur die
im Versuch eingesetzten Gesamtmengen [E]
0
und [A]
0
, die sich aufteilen nach den
Massenerhaltungsgleichungen in die freien und gebundenen Komponenten:
[E[
0
= [E[ [EA[ (1X20)
[A[
0
= [A[ [EA[ X (1X21)
Durch geeignete Experimente (vgl. Kapitel 3) wird der Anteil des gebundenen Ligan-
den [A]
geb
erfat, der in dem einfachen Reaktionsgleichgewicht (1.18) mit nur einer
Bindungsstelle pro Makromolekl mit [EA] gleichzusetzen ist. Durch Einsetzen von
Gl. (1.20) in (1.19b) wird [E] eliminiert:
K
d
=
([E[
0
[EA[)[A[
[EA[
[A[
geb
= [EA[ =
[E[
0
[A[
K
d
[A[
X
Im folgenden Abschnitt wird diese Gleichung fr die Bindung eines Liganden an ein
Makromolekl mit einer Bindungsstelle zusammen mit der analogen Gl. (1.23) fr
Makromolekle mit mehreren gleichen Bindungsstellen ausfhrlich besprochen.
A1.2 Wechselwirkung von Liganden mit Makromoleklen 11
1.3 Makromolekle mit identischen,
unabhngigen Bindungsstellen
1.3.1 Allgemeine Bindungsgleichung
Die Mehrzahl der Proteine, wie der Enzyme, ist aus mehreren, zumeist identischen
Untereinheiten aufgebaut. Aus Symmetriegrnden kann davon ausgegangen werden,
da jede dieser Untereinheiten eine gleichartige Bindungsstelle fr den jeweiligen Li-
ganden besitzt, so da die Zahl n an Bindungsstellen derjenigen der Untereinheiten
gleichzusetzen ist. Auch wenn das in der Regel zutrifft, sei hier darauf verwiesen,
da Identitt im Sinne der Bindung als bereinstimmung der Bindungskonstanten ver-
standen wird. Strukturell verschiedenartige Bindungszentren werden sich auch in ihren
Affinitten unterscheiden. Sind diese aber zufllig identisch, so lassen sie sich alleine
durch Bindungsmessungen nicht unterscheiden. Andererseits knnte, z. B. aufgrund ei-
ner Genduplikation, eine Proteinuntereinheit zwei oder mehrere gleichartige Bindungs-
stellen besitzen. In solchen, allerdings seltenen, Fllen weicht die Zahl n der identischen
Bindungsstellen von der Zahl identischer Untereinheiten pro Makromolekl ab.
Erfolgt die Besetzung der einzelnen Bindungszentren durch Liganden unabhngig
voneinander, d. h. ohne gegenseitige Beeinflussung, so sollte es gleichgltig sein, ob
die Bindung, wie in Gl. (1.22) angenommen, an isolierten, oder aber an miteinander
assoziierten Untereinheiten stattfindet. Das Enzym wrde durch den Liganden stufen-
weise abgesttigt und fr jede Bindungsstelle [U] glte Gl. (1.22), so da eine Sum-
me aus n gleichen Gliedern resultierte:
[U
1
A[ [U
2
A[ [U
3
A[ F F F [U
n
A[ = [A[
geb
=
n[E[
0
[A[
K
d
[A[
X (1X23)
DieseGleichungunterscheidet sichvonGl. (1.22) fr dieBindunganeinMakromolekl mit
einer einzigen Bindungsstelle durch den Faktor n fr die Zahl identischer Bindungsstellen
pro Makromolekl, auch kann hier [A]
geb
nicht mehr mit [EA] gleichgesetzt werden,
vielmehr stellt es die Summe aller mit Liganden gebundener Makromoleklformen dar.
Durch diese Ableitung wurde zwar das richtige Resultat erhalten, die Herleitung
war jedoch vereinfacht. Vernachlssigt wurde die Tatsache, da nicht ein einziges,
sondern vielmehr n Gleichgewichte mit n Dissoziationskonstanten vorliegen:
E A = EA K
/
1
=
[E[[A[
[EA[
EA A = EA
2
K
/
2
=
[EA[[A[
[EA
2
[
EA
2
A = EA
3
K
/
3
=
[EA
2
[[A[
[EA
3
[
F
F
F
F
F
F
EA
n1
A = EA
n
K
/
n
=
[EA
n1
[[A[
[EA
n
[
X
12 1 Multiple Gleichgewichte
Diese durchaus vorliegenden Gleichgewichte sind zu bercksichtigen und fhren zu
einer wesentlich komplizierteren Ableitung. Obwohl auch auf diese Weise nur die be-
reits auf einfachem Wege erhaltene Gl. (1.23) resultiert, soll hier das vollstndige
Verfahren demonstriert werden, da es besonders fr komplexere Mechanismen von
Bedeutung ist. Der eilige Leser kann getrost zu Abschnitt 1.3.2 berwechseln.
Die Konstanten K
/
der einzelnen Teilschritte werden als makroskopische Dissoziati-
onskonstanten bezeichnet. Der Unterschied zwischen diesen und den mikroskopischen
(auch intrinsischen) Dissoziationskonstanten sei an einem einfachen Beispiel verdeut-
licht. Ein Makromolekl bese drei, als 13 bezeichnete Bindungsstellen in der An-
ordnung
2
E
1
3
(vgl. Schema 1.1). Der erste an das Makromolekl bindende Ligand kann
zwischen diesen drei Bindungsstellen frei auswhlen. Fr den einfach besetzten Makro-
molekl-Ligand-Komplex sind somit drei Formen mit drei mikroskopischen Dissozia-
tionskonstanten mglich. Der zweite Ligand kann noch zwischen zwei Bindungsstellen
whlen und es ergeben sich 6 Konstanten, whrend drei Gleichgewichte zur voll gest-
tigten Form fhren. Den drei makroskopischen Bindungskonstanten des gesamten Bin-
dungsprozesses stehen somit 12 mikroskopische Dissoziationskonstanten gegenber.
Die makroskopische Bindungskonstante des ersten Schritts ist:
K
/
1
=
[E[[A[
[EA[
=
[E[[A[
[E
A
[ [
A
E[ [E
A
[
X
Die einzelnen Enzymformen werden durch die mikroskopischen Bindungskonstanten
ersetzt:
A1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 13
Schema 1.1. Makroskopische und mikroskopische Bindungskonstanten eines Makromolekls mit drei
identischen Bindungsstellen. Die linke E-Form im unteren Schema zeigt die relative Orientierung und
die Bezeichnung der Bindungsstellen. Die Benennung der Konstanten bezieht sich auf die Reihenfol-
ge der Besetzung, die jeweils letzte Ziffer gibt die aktuelle Besetzung an.
K
1
=
[E[[A[
[E
A
[
Y [E
A
[ =
[E[[A[
K
1
K
2
=
[E[[A[
[
A
E[
Y [
A
E[ =
[E[[A[
K
2
K
3
=
[E[[A[
[E
A
[
Y [E
A
[ =
[E[[A[
K
3
K
/
1
=
1
1
K
1

1
K
2

1
K
3
X
Sind die Bindungsstellen 13 identisch, dann gilt K
1
=K
2
=K
3
=K und
K
/
1
=
K
3
X
Entsprechend gilt fr den zweiten Bindungsschritt:
K
/
2
=
[EA[[A[
[EA
2
[
=
([E
A
[ [
A
E[ [E
A
[)[A[
[
A
E
A
[ [E
A
A
[ [
A
E
A
[
K
12
=
[E
A
[[A[
[
A
E
A
[
Y [
A
E
A
[ =
[E
A
[[A[
K
12
usw., daraus
K
/
2
=
K
13
K
21
K
23
K
12
K
13
K
23
K
13
K
21
K
32
K
13
K
23
K
12
K
23
K
13
K
21
X
Fr K
12
= K
13
= XXX = K wird K
/
2
= K. Der dritte Bindungsschritt ist:
K
/
3
=
[EA
2
[[A[
[EA
3
[
=
([
A
E
A
[ [E
A
A
[ [
A
E
A
[)[A[
[
A
E
A
A
[
Y
K
123
=
[
A
E
A
[[A[
[
A
E
A
A
[
Y [
A
E
A
[ =
K
123
[
A
E
A
A
[
[A[
usw.
Fr K
123
= K
132
= K
321
= K wird K
/
3
= K
123
K
132
K
321
= 3K.
Man erkennt, da auch bei Gleichheit aller mikroskopischen Konstanten sich die
makroskopischen sowohl von diesen wie auch untereinander fr jeden Teilschritt un-
terscheiden. Zwischen makroskopischer und mikroskopischer Bindungskonstanten fr
n Bindungsstellen gilt die allgemeine Beziehung:
K
/
d
= K
d
i
n i 1
/
Y (1X24)
wobei i der jeweilige Bindungsschritt ist. Ebenfalls abhngig von diesem ist die Zahl
der Orientierungsmglichkeiten X des Liganden auf dem Makromolekl:
14 1 Multiple Gleichgewichte
X =
n3
(n i)3i3
(1X25)
Zur Vereinfachung der Herleitung der allgemeinen Bindungsgleichung wird eine St-
tigungsfunktion r als Quotient aus dem Anteil des gebundenen Liganden [A]
geb
und
der Gesamtmenge des Makromolekls [E]
0
definiert:
r =
[A[
geb
[E[
0
=
[EA[ 2[EA
2
[ 3[EA
3
[ F F F n[EA
n
[
[E[ [EA[ [EA
2
[ [EA
3
[F F F [EA
n
[
X (1X26)
Die experimentell nicht zugnglichen Konzentrationen der einzelnen Formen des Ma-
kromolekls werden durch die makroskopischen Bindungskonstanten ersetzt:
K
/
1
=
[E[[A[
[EA[
Y [EA[ =
[E[[A[
K
/
1
K
/
2
=
[EA[[A[
[EA
2
[
Y [EA
2
[ =
[EA[[A[
K
/
2
=
[E[[A[
2
K
/
1
K
/
2
K
/
3
=
[EA
2
[[A[
[EA
3
[
Y [EA
3
[ =
[EA
2
[[A[
K
/
3
=
[E[[A[
3
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F
F
F
F
F
F
F
F
F
K
/
n
=
[EA
n1
[[A[
[EA[
n
Y [EA
n
[ =
[EA
n1
[[A[
K
/
n
=
[E[[A[
n
K/ K
/
2
K
/
3
K
/
n
X
Damit wird:
r =
[A[
K
/

2[A[
2
K
/
1
K
/
2

3[A[
3
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F F F
n[A[
n
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F F F K
/
n
1
[A[
K
/
1

[A[
2
K
/
1
K
/
2

[A[
3
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F F F
[A[
n
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F F F K
/
n
=

n
i=1
i[A[
i

i
j=1
K
/
j
_ _
1

n
i=1
[A[
i

i
j=1
K
/
j
(1X27)
Fr den Fall unabhngiger identischer Bindungsstellen lassen sich die makroskopi-
schen Bindungskonstanten der Einzelschritte nach Gl. (1.24) durch eine einheitliche
mikroskopische Konstante K
d
ersetzen:
A1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 15
r =

n
i=1
i

i
j=1
n j 1
j
_ _
[A[
K
d
_ _
i
1

n
i=1

i
j=1
n j 1
j
_ _
[A[
K
d
_ _
i
X (1X28)
Die Produktglieder von Zhler und Nenner sind Binomial-Koeffizienten, die in der
folgenden Weise umgeschrieben werden knnen:
n
i
_ _
=
n3
i3(n i)3
_ _
Y
so da sich Gl. (1.28) in der Form schreiben lt:
r =

n
i=1
i
n
i
_ _
[A[
K
d
_ _
i
1

n
i=1
n
i
_ _
[A[
K
d
_ _
i
X
Unter Verwendung des Binomialsatzes kann man den Nenner umschreiben als
(1+[A]/K
d
)
n
, fr den Zhler wird dagegen der abgeleitete Binomialsatz verwendet:
r =
n
[A[
K
d
_ _
1
[A[
K
d
_ _
n1
1
[A[
K
d
_ _
n
X
Durch Krzen ergibt sich schlielich die bereits bekannte Form der Bindungsglei-
chung:
r =
[A[
geb
[E[
0
=
n[A[
K
d
[A[
X (1X23)
Eine Gleichung dieser Art erstellte 1916 Irvin Langmuir fr die Adsorption von Ga-
sen an feste Oberflchen. Die Urheberschaft wird daher vielfach diesem Autor zuge-
sprochen, obwohl bereits um 1900 A. J. Brown und V. Henri eine vergleichbare Be-
ziehung entwickelten, die 1913 von L. Michaelis und M. Menten ausfhrlich be-
schrieben wurde und der als Michaelis-Menten-Gleichung zentrale Bedeutung in
der Enzymkinetik zukommt (vgl. Abschnitt 2.2).
Gleichung (1.23) stellt einen einfachen Zusammenhang zwischen den Konzentra-
tionen an freiem und gebundenem Liganden her. Bei Variation des ersteren erhlt
man fr die Zunahme des gebundenen Liganden den in Abb. 1.2A gezeigten Kurven-
verlauf, der, wie in Abschnitt 2.2 erlutert wird, der Funktion einer rechtwinkligen
16 1 Multiple Gleichgewichte
Hyperbel gehorcht. Aus dieser Darstellung kann sowohl die Dissoziationskonstante
K
d
, als auch die Zahl der Bindungsstellen n ermittelt werden. Fr sehr groe Liga-
ndenkonzentrationen, d. h. [A] ??, geht r ?n, da in diesem Fall K
d
im Nenner zu
vernachlssigen ist. Die Kurve nhert sich asymptotisch dem Sttigungswert, bei dem
alle vorhandenen Bindungsstellen besetzt sind. Bei der Hlfte dieses Sttigungswer-
tes, n/2, nimmt, wie ebenfalls Gl. (1.23) zu entnehmen, die freie Ligandenkonzentra-
tion den Wert der Dissoziationskonstanten an: [A] =K
d
.
Bei der graphischen Auswertung von Bindungsexperimenten kann der Anteil des
gebundenen Liganden [A]
geb
direkt oder in Form der um die Makromoleklkonzen-
tration [E]
0
reduzierten Sttigungsfunktion r eingesetzt werden. In beiden Fllen wer-
den bereinstimmende Kurvenverlufe erhalten. Im ersten Fall hat die Sttigung den
Wert n[E]
0
, im zweiten Fall n, d. h. die zufllig gewhlte Makromoleklkonzentration
geht nicht in die Bestimmung ein und unterschiedliche Experimente sind besser mit-
einander vergleichbar. Ist die molare Konzentration des eingesetzten Makromolekls
nicht bekannt, so kann man die um n reduzierte Sttigungsfunktion Y verwenden:
Y =
[A[
geb
n[E[
0
=
[A[
K
d
[A[
X (1X23 a)
A1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 17
Abb. 1.2. Graphische Auswertungsverfahren von Bindungsdaten. A) Direkte Darstellung, B) halbloga-
rithmische Darstellung, C) Diagramm nach Scatchard, D) doppelt-reziproke Darstellung, E) Dia-
gramm nach Hanes.
Y, der Anteil des pro Bindungsstelle gebundenen Liganden, nimmt bei Sttigung im-
mer den Wert 1 an, d. h. beliebige Mewerte knnen darauf normiert werden. Y
wird daher bei Experimenten verwendet, bei denen der Anteil an gebundenem Ligan-
den nur als relative Megre erhalten wird, wie bei spektroskopischen Titrationen
(vgl. Abschnitt 1.3.2.1). Es dient auch bei theoretischen Behandlungen, da der Kur-
venverlauf von der speziellen Zahl der Bindungsstellen unabhngig immer dem glei-
chen Sttigungswert zustrebt. Die Zahl der Bindungsstellen wird jedoch mit dieser
Funktion nicht erhalten.
1.3.2 Graphische Darstellungen der allgemeinen Bindungsgleichung
1.3.2.1 Direkte Auswertung
Abbildung 1.2A zeigt die direkte Darstellung von Daten aus Bindungsmessungen
und die Bestimmung der Konstanten nach Gl. (1.23). Obwohl diese Art der direkten
Wiedergabe experimentell erhaltener Daten grundstzlich empfehlenswert ist, da
keine durch Umrechnung bedingten Verzerrungen auftreten, birgt das Diagramm
doch einige Probleme. Umfat der freie Ligand einen breiteren Konzentrationsbe-
reich, dann schmiegt sich der vordere Kurventeil so nahe der Ordinate an, da K
d
schwer zu bestimmen ist. Wird dagegen nur der vordere Bereich aufgetragen, dann
ist die Sttigung nicht erkennbar. Man kann sich in solchen Fllen durch logarithmi-
sche Auftragung der Ligandenkonzentration auf der Abszisse behelfen (Abb. 1.2B).
Diese Form der Darstellung rckt die geringeren Werte, die fr die K
d
-Bestimmung
wichtig sind, besser ins Bild. Die Kurve erhlt eine sigmoide Form. Bei Halbstti-
gung hat die Kurve einen Wendepunkt, dessen Abszissenwert log K
d
ist.
Nicht-lineare Diagramme zeigen folgende Nachteile:
1) Der Verlauf der Hyperbelfunktion ist bei experimentell erhaltenen, d. h. streuenden
Werten, nicht immer eindeutig. Einer gegebenen Punkteverteilung knnen teilwei-
se recht unterschiedliche Kurvenverlufe mit vergleichbarer Zuverlssigkeit ange-
pat werden (vgl. Abb. 2.5, Abschnitt 2.3.1.1).
2) Die Bestimmung der kinetischen Konstanten hngt von der Anpassung der Asym-
ptoten ab, die vielfach zu niedrig geschtzt wird.
3) Abweichungen vom hyperbolen Kurvenverlauf infolge artifizieller Einflsse (sy-
stematische Fehler) oder dem Vorliegen anderer Mechanismen sind aus nicht-li-
nearen Funktionen schwer erkennbar.
Mit Hilfe nicht-linearer Regressionsverfahren lassen sich zumindest die in Punkt 2
aufgefhrten Probleme vermeiden und es werden in der Regel zuverlssige Werte fr
die Konstanten erhalten. Nicht aber garantieren solche Verfahren die Vermeidung der
anderen Nachteile. Vielmehr vermitteln sie oft den Eindruck zutreffender und objekti-
ver Interpretation der Daten. Hierin sind linearisierte Darstellungsformen, die auf der
Umformung der Gl. (1.23) in Geradengleichungen basieren, berlegen, da sie charak-
teristische Abweichungen vom linearen Verlauf zeigen, wenn die angenommene Glei-
chung nicht erfllt ist. Aus der Art der Abweichung kann bereits auf mgliche ande-
re Mechanismen geschlossen werden. Darber hinaus erlauben solche Diagramme
18 1 Multiple Gleichgewichte
die Bestimmung der Konstanten durch einfache Extrapolation auf die Koordinate-
nachsen. Es gibt insgesamt drei einfache Umformungen von Gl. (1.23) in Gerade-
ngleichungen. Jede dieser Darstellungsarten hat wiederum gewisse Nachteile, so da
sich die Auswertung nach mehreren Verfahren empfiehlt, insbesondere bei atypischen
Kurvenverlufen.
Dem doppelt-reziproken Diagramm nach I. Klotz (1946) liegt die reziproke Form
der Gl. (1.23) zugrunde:
1
r
=
1
n

K
d
n[A[
X (1X29)
Bei Auftragung von 1/r gegen 1/[A] wird eine Gerade mit der Steigung K
d
/n erhal-
ten, die die Ordinate bei 1/n und die Abszisse bei 1/ K
d
schneidet (Abb. 1.2D). Die-
ses Diagramm hat seine Entsprechung im Lineweaver-Burk-Diagramm der Enzymki-
netik (vgl. Abschnitt 2.3.1.3). Dort wird auch ausfhrlich auf dessen Nachteile einge-
gangen, die bei Bindungsmessungen noch gravierender sind, da durch die starke
Komprimierung der Werte im hohen Konzentrationsbereich infolge der reziproken
Auftragung eine exakte Bestimmung von n schwierig ist. Zustzlich verursacht die
reziproke Auftragung eine betrchtliche Verzerrung der Fehlergrenzen, so da die
Anwendung einfacher nicht-linearer Regressionsverfahren ohne Bercksichtigung ge-
eigneter Gewichtungsfaktoren unzulssig ist.
Wesentlich gnstiger ist das von G. Scatchard (1949) beschriebene (dem Eadie-
Hofstee-Diagramm der Enzymkinetik entsprechende) Diagramm. Multiplikation von
Gl. (1.29) mit r n/K
d
fhrt zur Beziehung:
r
[A[
=
n
K
d

r
K
d
Y (1X30)
wobei r gegen r/[A] aufgetragen wird (Abb. 1.2C). Bei diesem Diagramm ist n di-
rekt aus dem Abszissenschnittpunkt der Geraden abzulesen. Der Ordinatenschnitt-
punkt hat den Wert n/K
d
, die Steigung ist 1/K
d
. Die Fehlergrenzen weiten sich so-
wohl zu geringeren wie zu hohen Ligandenkonzentrationen auf. Diese relativ symme-
trische Fehlerverzerrung macht die Anwendung einfacher linearer Regressionen unter
Vorbehalt mglich.
Durch Multiplikation von Gl. (1.29) mit [A] erhlt man die in der Enzymkinetik
als Hanes-Diagramm gebruchliche Darstellungsform
[A[
r
=
[A[
n

K
d
n
Y (1X31)
bei der [A] gegen [A]/r aufgetragen wird (Abb. 1.2E). Dieses Diagramm findet bei
Bindungsmessungen wenig Verwendung, da n nur aus der Steigung (1/n) oder zusam-
men mit K
d
aus dem Ordinatenschnittpunkt (K
d
/n) erhalten wird, so da sich ein Feh-
ler in der Bestimmung der einen Konstanten auch auf die andere bertrgt. Die Feh-
lerverzerrung ist in diesem Diagramm allerdings geringer als in den beiden anderen
Diagrammen. Dieses hat zusammen mit dem Scatchard-Diagramm den Nachteil, da
die beiden Variablen durch die Achsen nicht getrennt werden.
A1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 19
1.3.2.2 Auswertung von Bindungskurven
aus optischen Titrationsverfahren
Die bisher besprochenen Auswertungsverfahren gehen davon aus, da die Menge des
freien Liganden [A] im Gleichgewicht bekannt ist. Bei verschiedenen Bindungsmetho-
den, insbesondere bei spektroskopischen Titrationen (vgl. Abschnitt 3.4.1.5), wird [A]
jedoch nicht unmittelbar aus der Messung erhalten. Das gleiche gilt auch fr enzymki-
netische Messungen. Dort wird das Problem durch die Vereinfachung [A]
0
= [A] umgan-
gen, was aufgrund der in der Enzymkinetik generell geltenden Vorbedingung
[E] [A]
0
nherungsweise zulssig ist. Damit wird auch der Anteil an gebundenem
Liganden gering gegenber der Gesamtmenge, [A]
geb
[A]
0
, die Gesamtmenge des
Liganden wird durch die Bindung kaum verndert, der berwiegende Teil des zugege-
benen Liganden verbleibt in freier Form. Bei Bindungsmessungen sind die Verhltnisse
vllig anders. Als gleichberechtigte Partner werden Makromolekle und Ligand in ver-
gleichbarer Menge eingesetzt. Die Gesamtmenge des Liganden wird durch den Anteil
des gebundenen sprbar reduziert, [A]
0
ist nicht mehr mit [A] gleichzusetzen. Dies be-
dingt, da die aus optischen Titrationen erhaltenen Sttigungsfunktionen nicht mehr
dem durch Gl. (1.23) beschriebenen hyperbolen Verlauf folgen (Abb. 1.3A) und daher
auch nicht nach den bisher besprochenen Verfahren ausgewertet werden knnen. Weiter
wird der Anteil an [A]
geb
nur als ein dem Sttigungsgrad des Makromolekls propor-
tionales optisches Mesignal und nicht in molaren Einheiten erhalten.
Zur Auswertung optischer Titrationen wird eine Asymptote an die Kurve im Be-
reich der Sttigung gelegt (Abb. 1.3A). Gegenber einer hyperbolen Sttigungsfunkti-
on nhert sich die Titrationskurve rascher der Sttigung, die Asymptotenbildung ist
daher zuverlssiger. Der Ordinatenschnittpunkt der Asymptote ist xn[E]
0
, x ist ein
vom Mesignal abhngiger Proportionalittsfaktor. Der Sttigungswert xn[E]
0
wird
willkrlich 1 gesetzt und alle Ordinatenwerte darauf bezogen. Sie entsprechen dann
der in Gl. (1.23a) definierten Sttigungsfunktion Y. Durch den Koordinatenursprung
wird eine Tangente an die im Anfangsbereich bei niederer Ligandenkonzentration na-
hezu linear ansteigenden Werte gelegt. Beide Geraden schneiden sich beim Abszis-
20 1 Multiple Gleichgewichte
Abb. 1.3. Auswertung spektroskopischer Titrationen. A) Direkte Auftragung, B) Diagramm nach
Stockell.
senwert [A]
0
=n[E]
0
. Daraus erhlt man n und mit dessen Kenntnis lt sich auch der
Proportionalittsfaktor x bestimmen und damit die Ordinatenwerte in [A]
geb
umrech-
nen. Werden diese von den zugehrigen Abszissenwerten [A]
0
abgezogen, resultieren
die Werte fr [A]. Damit knnen die Daten nun nach den in Abb. 1.2 gezeigten Dia-
grammen ausgewertet werden. [A] ergibt sich aus der Titrationskurve auch graphisch,
wie in Abb. 1.3A gezeigt. Whrend die gesamte Distanz von der Ordinaten zu einem
bestimmten Mepunkt [A]
0
ist, betrgt der Abszissenabschnitt bis zur Ursprungstan-
genten [A]
geb
und von dort zum Mepunkt [A]. Diese Tangente entspricht einem Bin-
dungsverhalten bei unendlich hoher Affinitt (K
d
?0), wobei der Ligand vollstndig
an das Makromolekl bindet ([A]
0
=[A]
geb
), so da kein ungebundener Ligand in der
Lsung verbleibt. Sind jedoch alle Bindungsstellen abgesttigt, dann kann weiter zu-
gesetzter Ligand nur noch in freier Form vorliegen ([A]
0
=[A]), die Bindungskurve
geht in die Sttigungsasymptote ber. In dem Mae wie, bei endlicher Affinitt in
realen Systemen, bereits vor Erreichen der vollen Absttigung freier Ligand auftritt,
weicht die tatschliche Mekurve von der idealen Form ab. Das Abweichen ist ein
direktes Ma des freien Liganden, d. h. die Kurvenform lt bereits die Strke der
Affinitt erkennen. Kurven hoher Affinitten schmiegen sich enger den beiden Asym-
ptoten an als solche geringerer Affinitt. Im letzteren Fall ist die tatschliche Lage
der Geraden schwerer erkennbar und insbesondere die Ursprungstangente wird zu
flach angelegt, was gravierende Abweichungen bei der Auswertung zur Folge hat.
Auch zu geringe Konzentrationen des konstant gehaltenen Makromolekls [E]
0
be-
dingen zu flache Kurvenverlufe.
Eine direkte Linearisierung von Bindungskurven bei optischen Titrationen ist nach
A. Stockell (1959) mglich, wenn in Gl. (1.29) fr r =nY =n[EA]/[E]
0
gesetzt wird
und [A]
geb
=n[EA]:
1
Y
= 1
K
d
[A[
0
n[EA[
= 1
K
d
[A[
0
nY[E[
0
X
Durch Umformung erhlt man ber
[A[
0
Y
[A[
0
= n[E[
0
(1 Y) K
d
die Gleichung:
[A[
0
[E[
0
Y
=
K
d
[E[
0
(1 Y)
n X (1X32)
Diese Gleichung enthlt nur noch bekannte bzw. direkt bestimmbare Gren und er-
gibt bei Auftragung von [A]
0
/[E]
0
Y gegen 1/[E]
0
(1Y) eine Gerade mit der Steigung
K
d
, dem Ordinatenschnittpunkt n und dem Abszissenschnittpunkt n/K
d
(Abb. 1.3B).
Bei dieser Art der Auswertung kann, im Gegensatz zu den Linearisierungsverfahren
von Gl. (1.23), der Sttigungswert nicht durch Extrapolation gewonnen werden, son-
dern ist zur Definition von Y =1 der Asymptoten der Sttigungskurve (Abb. 1.3A) zu
A1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 21
entnehmen. Daher sind die Messungen bis weit in den Sttigungsbereich hinein fort-
zusetzen. Das Stockell-Diagramm reagiert empfindlich auf Abweichungen der Me-
werte vom normalen Kurvenverlauf, so da eine zuverlssige Auswertung nur bei
sehr geringen Fehlerstreuungen mglich ist. Auch ist dieses Diagramm beim Vorlie-
gen anderer Mechanismen schwieriger zu interpretieren als die direkten Linearisie-
rungsverfahren.
Nach dem Auswertungsverfahren fr Bindungskurven von P. Job (1928) wird die
Gesamtkonzentration von Ligand und Makromolekl konstant gehalten und nur das
molare Verhltnis beider Komponenten verndert. X ist die Molfraktion des Makro-
molekls und Y die des Liganden, X+Y=1. Dieses Verhltnis wird gegen einen Para-
meter der Komplexbildung, z. B. [A]
geb
, ein optisches Signal oder die Enzymaktivi-
tt, aufgetragen. Abbildung 1.4 zeigt den Kurvenverlauf. An den Stellen X=0 und
Y=0 werden Tangenten angelegt, deren gemeinsamer Schnittpunkt den Wert
Y
i
X
i
=
K
d
nc
0
K
d
c
0
(1X33)
hat. X
i
und Y
i
sind die Molfraktionen von Enzym und Ligand an der Stelle des
Schnittpunkts, c
0
=[E]
0
+[A]
0
ist die konstant gehaltene Gesamtkonzentration an Ma-
kromolekl und Ligand. Fr c
0
K
d
wird Y
i
/X
i
=n. In diesem Fall ist die Stchio-
metrie der Bindung aus dem Verhltnis der Molfraktionen am Tangentenschnittpunkt
abzulesen. Fr c
0
K
d
wird Y
i
/X
i
=1, der Kurvenverlauf nimmt eine symmetrische
Form an und der Schnittpunkt ergibt, unabhngig von der tatschlichen Zahl der Bin-
dungsstellen, den Wert 1. Es liegt darin eine Schwche des Job-Diagramms, die aber
vermieden wird, solange die Summe von Makromolekl- und Ligandenkonzentration
ber dem Wert der Dissoziationskonstanten liegt. Bei Kenntnis von n lt sich K
d
aus Gl. (1.33) errechnen, wobei hierfr die Bedingung c
0
&K
d
vorteilhaft ist. Auch
kann K
d
aus dem Maximum der Kurve in Abb. 1.4 nach der Beziehung
K
d
=
(an a n)
2
c
0
4an
(1X34)
22 1 Multiple Gleichgewichte
Abb. 1.4. Auswertung von Bindungsdaten nach
P. Job.
erhalten werden, wobei a das Verhltnis des Mewerts beim Maximum M
m
zum St-
tigungswert M
?
ist.
Weitere Verfahren zur Auswertung von Bindungsdaten aus spektroskopischen Ti-
trationen sind in Abschnitt 2.3.1.1 beschrieben.
1.3.3 Bindung verschiedener Liganden, Kompetition
Aufgrund der hohen Bindungsspezifitt von Proteinen und insbesondere von Enzy-
men wird in der Regel nur der von der Natur vorgesehene Ligand, z. B. das Enzym-
substrat, gebunden und alle anderen Verbindungen ausgeschlossen. Diese Selektion
kann jedoch nicht absolut sein und, abhngig von der speziellen Beschaffenheit der
Bindungsstelle und deren Bindungsaffinitt, werden, trotz hoher Spezifitt, struktur-
analoge Verbindungen im Mae ihrer Homologie zum natrlichen Liganden mehr
oder minder gut akzeptiert. Bestimmte Verbindungen sind aufgrund besonderer
Wechselwirkungen mit den Bindungszentren sogar in der Lage, deutlich strker zu
binden als der eigentliche Ligand. Analoge Verbindungen des Liganden entwickeln
manchmal gleichartige Wirkungen wie dieser, meistens sind sie jedoch selbst inaktiv,
blockieren aber die Bindungsstelle fr den eigentlichen Liganden und wirken durch
dessen Verdrngung antagonistisch. Dieser Vorgang der Konkurrenz um eine Bin-
dungsstelle, der Kompetition, kann dazu dienen, die spezifische Bindung von Ligan-
den nachzuweisen, auch beruht auf ihr die Wirkung vieler (antagonistischer) Arznei-
mittel und Drogen (z. B. b-Rezeptor-Blocker). Der Mechanismus der Kompetition
lt sich folgendermaen formulieren:
Die Bindungsaffinitten sind durch die Dissoziationskonstanten
K
A
=
[E[[A[
[EA[
und K
B
=
[E[[B[
[EB[
(1X35 a)
ausgedrckt. Die Gesamtmenge an Makromolekl ist
[E[
0
= [E[ [EA[ [EB[ X
Nach Gl. (1.35a) lassen sich [E] und [EB] durch K
A
und K
B
ersetzen:
[E[
0
=
K
A
[EA[
[A[
1 [B[
K
B
_ _
[EA[ X
A1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 23
Durch Umstellung wird daraus:
[EA[ =
[E[
0
[A[
[A[ K
A
1
[B[
K
B
_ _
X
Fr ein Makromolekl mit n Bindungsstellen ergibt sich, wie fr Gl. (1.23) disku-
tiert, die Beziehung
r =
n[A[
[A[ K
A
1
[B[
K
B
_ _
X (1X36)
Die doppelt-reziproke Form lautet:
1
r
=
1
n

K
A
n[A[
1
[B[
K
B
_ _
(1X37)
und die Scatchard-Gleichung:
r
[A[
=
n
K
A
1
[B[
K
B
_ _

r
K
A
1
[B[
K
B
_ _
X (1X38)
Gegenber der einfachen Bindungsgleichung erscheinen nun zwei variable Konzen-
trationsglieder, doch sind die einfachen Beziehungen weiter anwendbar, solange eine
Komponente, z. B. B, whrend der Variation der anderen als konstant betrachtet wer-
den kann. Damit bleibt auch der Klammerausdruck konstant, K
A
erhht sich schein-
bar um diesen Wert. Es werden aber weiterhin hyperbole Kurven erhalten. Eine zwei-
te Mereihe mit vernderter Konzentration [B]
2
, die aber innerhalb der Mereihe
konstant bleibt, ergibt ebenfalls eine hyperbole Kurve, jedoch mit anderer Steilheit,
da das scheinbare K
A
wieder einen anderen Wert annimmt (Abb. 1.5A). Da Gl.
(1.23) erfllt ist, lassen sich die Kurven auch mit den entsprechenden graphischen
Verfahren linearisieren, nur wird anstelle von K
A
der um den Klammerausdruck ver-
nderte Wert erhalten. Dagegen bleibt der Sttigungswert n unverndert. So besitzen
im doppelt-reziproken Diagramm (Abb. 1.5B) alle Geraden einen gemeinsamen Ordi-
natenschnittpunkt, im Scatchard-Diagramm (Abb. 1.5C) treffen sie sich auf der Ab-
szisse. Solche Geraden-Muster sind charakteristisch fr die Kompetition zweier Li-
ganden um die gleiche Bindungsstelle. Geht [A] ??, so wird B aus allen Bindungs-
stellen verdrngt (und umgekehrt).
Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten fr A und B kann man zunchst,
wie fr die einfache Gl. (1.23) beschrieben, K
A
in Abwesenheit von B bestimmen,
z. B. beim doppelt-reziproken Diagramm aus dem Abszissenschnittpunkt
(Abb. 1.2D). In Anwesenheit von B lt sich auf gleichem Wege K
B
erhalten, wenn
anstelle von K
A
der Ausdruck K
A
(1+[B]/K
B
) gesetzt wird, da [B] bekannt und K
A
be-
24 1 Multiple Gleichgewichte
reits bestimmt ist. Weitere Verfahren zur Auswertung von Kompetitionen sind Ab-
schnitt 2.5.1.3 beschrieben.
Fr den Fall, da B zwar die Bindung von A an das Makromolekl beeinflut,
diesen Liganden aber nicht vollstndig verdrngen kann (z. B. durch Bindung in un-
mittelbarer Nachbarschaft von A oder durch Induktion einer die Bindungsstelle von
A beeinflussenden Konformationsnderung des Makromolekls), gilt folgender Me-
chanismus:
Gegenber dem kompetitiven Mechanismus werden, neben Gl. (1.35a), zwei weitere
Dissoziationskonstanten erhalten:
K
/
A
=
[EB[[A[
[EAB[
und K
/
B
=
[EA[[B[
[EAB[
Y (1X35 a)
A1.3 Makromolekle mit identischen, unabhngigen Bindungsstellen 25
+
Abb. 1.5. Kompetition zweier Liganden um eine Bindungsstelle. Die Konzentration von A wird vari-
iert bei unterschiedlichen, jeweils konstant gehaltenen Mengen von B. A) Direkte Auftragung, B)
doppelt-reziproke Darstellung, C) Diagramm nach Scatchard, D) Diagramm nach Hanes.
die nach Gl. (1.35a) und (1.35b) zusammenhngen:
K
A
K
B
=
K
/
A
K
/
B
X (1X39)
Damit lassen sich aus der Beziehung fr die Gesamtmenge des Makromolekls
[E[
0
= [E[ [EA[ [EB[ [EAB[
die einzelnen Enzymformen durch Konstanten ersetzen:
[E[
0
= [E[
[E[[A[
K
A

[E[[B[
K
B

[E[[A[[B[
K
A
K
/
B
Y
[E[ =
[E[
0
1
[A[
K
A

[B[
K
B

[A[[B[
K
A
K
/
B
X
Der Anteil des gebundenen Liganden [A]
geb
ist
[A[
geb
= [EA[ [EAB[ =
[E[[A[
K
A

[E[[A[[B[
K
A
K
/
B
Y
[A[
geb
=
[E[
0
[A[
K
A
1
[B[
K
/
B
_ _
1
[A[
K
A

[B[
K
B

[A[[B[
K
A
K
/
B
X
Bei Ersatz von [A]
geb
durch r =[A]
geb
/[E]
0
unter Annahme von n Bindungsstellen
und bei Multiplikation mit K
A
ergibt sich Gleichung:
r =
n[A[ 1
[B[
K
/
B
_ _
K
A
1
[B[
K
B
_ _
[A[ 1
[B[
K
/
B
_ _
X (1X40)
Eine gegenseitige Beeinflussung der Bindung der Liganden erfolgt nur fr den Fall
K
A
=K
/
A
, K
B
=K
/
B
, whrend sich Gl. (1.40) fr K
A
=K
/
A
, K
B
=K
/
B
zur normalen Bin-
dungsgleichung 1.23 reduziert. Jeder Ligand bindet dann unabhngig vom anderen.
In den linearisierten Darstellungen werden, gem den Gleichungen fr das doppelt-
reziproke Diagramm
1
r
=
1
n

K
A
1
[B[
K
B
_ _
n[A[ 1
[B[
K
/
B
_ _
/
(1X41)
26 1 Multiple Gleichgewichte
und das Scatchard-Diagramm
r
[A[
= n
1
[B[
K
/
B
_ _
K
A
1
[B[
K
B
_ _
r
1
[B[
K
/
B
_ _
K
A
1
[B[
K
B
_ _
Y (1X42)
Geradenscharen mit gemeinsamen Schnittpunkten erhalten, die ebenso liegen wie im
Falle der Kompetition (Abb. 1.5), so da beide Mechanismen nicht zu unterscheiden
sind. Darin liegt eine Gefahr, Kompetitionsexperimente falsch zu interpretieren. Un-
terschieden werden knnen beide Mechanismen durch die in der Enzymkinetik hu-
fig verwendeten Sekundrauftragungen (Abschnitt 2.5.1.2), wo die Geradensteigun-
gen (beim Scatchard-Diagramm die positiven reziproken Werte der Steigungen) ge-
gen den konstant gehaltenen Liganden B aufgetragen werden. Beim kompetitiven
Mechanismus wird eine Gerade mit dem Abszissenschnittpunkt K
B
erhalten. Im
Falle getrennter Ligandenbindung ergibt das Sekundrdiagramm gekrmmte Kurven.
Die Wechselwirkungen unterschiedlicher Liganden mit dem Makromolekl haben
ihre Entsprechung bei der reversiblen Enzymhemmung (Abschnitt 2.5.1), wobei die
Kompetition der kompetitiven Hemmung, der zuletzt dargestellte Mechanismus dage-
gen einer partiell kompetitiven Hemmung entspricht. Diese Analogie folgt daraus,
da [A]
geb
sich aus [EA] und [EAB] zusammensetzt, wie auch bei der partiell kom-
petitiven Hemmung Enzym-Substrat-Komplex und Enzym-Substrat-Hemmstoff-Kom-
plex als gleich aktiv gelten.
1.4 Makromolekle mit nicht-identischen,
unabhngigen Bindungsstellen
Verschiedene Makromolekle, wie Enzyme oder Membranrezeptoren, besitzen fr
den gleichen Liganden unterschiedliche Bindungszentren. Diese knnen auf der glei-
chen Untereinheit liegen, hufig jedoch sind unterschiedliche Bindungszentren ein
Hinweis fr das Vorliegen nicht-identischer Untereinheiten, wie bei der aus jeweils
zwei Untereinheiten vom a- und b-Typ bestehenden Tryptophan-Synthase aus Esche-
richia coli (a
2
b
2
), die beide das Zwischenprodukt Indol binden knnen. Ein Makro-
molekl kann somit mehrere Bindungsklassen mit jeweils mehreren identischen Bin-
dungsstellen (n
1
, n
2
, n
3
usw.) besitzen.
Es ist offenkundig, da Liganden zunchst die Stelle hchster Affinitt und erst
mit steigender Konzentration die niederaffinen Bindungsstellen besetzen. Bei unab-
hngiger Bindung der Liganden an die verschiedenartigen Zentren gilt fr jedes Zen-
trum die allgemeine Bindungsgleichung 1.23, der Gesamtvorgang ist also eine Sum-
me der Einzelvorgnge:
r =
n
1
[A[
K
d1
[A[

n
2
[A[
K
d2
[A[
F F F
n
m
[A[
K
dm
[A[
X (1X43)
A1.4 Makromolekle mit nicht-identischen, unabhngigen Bindungsstellen 27
K
d1
, K
d2
usw. sind die Dissoziationskonstanten der unterschiedlichen Bindungsklas-
sen. Jeder Vorgang fr sich folgt einer normalen hyperbolen Sttigungsfunktion. Als
Gesamtfunktion resultiert eine berlagerung zweier oder mehrerer Hyperbeln
(Abb. 1.6A). Im niederen Konzentrationsbereich des Liganden erfolgt zunchst ein
steiler Anstieg durch die Besetzung der hochaffinen Stellen. Wo diese Funktion der
Sttigung zustrebt, setzt die Besetzung der niederaffinen Stellen ein und lt die re-
sultierende Kurve weiter ansteigen. Im Vergleich zu einer einfachen hyperbolen
Funktion fllt daher der vordere steile Anstieg und ein langes Auslaufen zur Stti-
gung auf, dessen Ausprgung vom relativen Verhltnis der Bindungskonstanten und
der Anzahl gleichartiger Zentren innerhalb der verschiedenen Bindungsklassen ab-
hngt. Daher ist auch diese Art des Abweichens von einer normalen Hyperbel nicht
leicht erkennbar, wie auch eine Bestimmung der Konstanten aus dieser Kurve nicht
sinnvoll ist. Es erweist sich hier der Vorteil linearisierter Darstellungen, die fr die-
sen Mechanismus ein charakteristisches Abweichen vom linearen Verlauf zeigen. Die
jeweiligen Kurvenformen resultieren aus einer berlagerung zweier oder mehrerer
Geraden, wie in Abb. 1.6BD gezeigt. Im doppelt-reziproken Diagramm (Abb. 1.6B)
und im Diagramm nach Hanes (Abb. 1.6D) weicht die Kurve nach rechts unten vom
linearen Verlauf ab, im Scatchard-Diagramm (Abb. 1.6C) erscheint die Kurve als
bergang von einer steilen zu einer flachen Geraden.
28 1 Multiple Gleichgewichte
Abb. 1.6. Bindung eines Liganden an zwei Bindungsstellen unterschiedlicher Affinitt. Gezeigt sind
die Kurven fr die separate Bindung an die nieder- und hochaffine Bindungsstelle und die aus beiden
Anteilen resultierenden Kurvenverlufe. A) Direkte Darstellung, B) doppelt-reziprokes Diagramm, C)
Scatchard-Diagramm, D) Hanes-Diagramm.
Die Auswertung solcher Kurven gestaltet sich nicht ganz einfach. Die Gesamtzahl
aller Bindungsstellen des Makromolekls fr den Liganden kann durch Extrapolation
der Kurve auf die Ordinate im Falle der doppelt-reziproken Auftragung und auf die
Abszisse beim Scatchard-Diagramm erhalten werden. Nicht direkt bestimmbar sind
die Anzahl der Bindungsklassen, die Zahl identischer Bindungsstellen pro Bindungs-
klasse und die zugehrigen Bindungskonstanten. Liegen, wie in der Mehrzahl der
Flle, nur zwei Bindungsklassen vor, dann kann man davon ausgehen, da in den bei-
den Extrembereichen der Ligandenkonzentration jeweils nur eine Bindungsklasse
vorherrscht. Im niederen Substratbereich werden vorzglich die hochaffinen, im Be-
reich der Sttigung dagegen die niederaffinen Zentren besetzt. Trotzdem wre der
Schlu nicht korrekt, die beiden Kurvenenden reprsentierten die getrennten Bin-
dungsklassen und aus Tangenten an diese lieen sich die Konstanten direkt ermitteln,
wie sich aus Abb. 1.6BD erkennen lt. Nherungsweise kann man beim Scatchard-
Diagramm (Abb. 1.6C) diese Tangenten derart parallel verschieben, da die Summe
ihrer Ordinatenschnittpunkte dem Ordinatenschnittpunkt der experimentellen Kurve
entspricht. Nach einem graphischen Verfahren nach Rosenthal (1967) erhlt man die
resultierende Bindungskurve aus zwei solcher Geraden mit Hilfe von Ursprungsgera-
den. Die Summe der Strecken vom Koordinatenursprung zu jeder der beiden Geraden
entspricht einem Punkt der resultierenden Bindungskurve (Abb. 1.7). Eine rechneri-
sche Analyse solcher Kurvenverlufe gelingt auch mit geeigneten Computerprogram-
men durch numerische Parameteranpassung oder mit Hilfe der Methode der kleinsten
Fehlerquadrate (Weder et al., 1974). Solche Verfahren ermglichen auch die Analyse
von Kurven mit mehr als zwei Bindungsklassen. Trotzdem ist es schwierig, solche
Flle allein anhand von Bindungskurven nachzuweisen, da sich die Kurven fr drei
und mehr Bindungsklassen in ihrer Form nur wenig von denjenigen fr zwei Bin-
dungsklassen unterscheiden. Auch finden sich hnliche Kurvenverlufe bei Isoenzy-
men, bei negativer Kooperativitt und bei Halbseitenreaktivitt (vgl. Abschnitt 1.5.6).
A1.4 Makromolekle mit nicht-identischen, unabhngigen Bindungsstellen 29
Abb. 1.7. Graphisches Verfahren der Analyse
einer Bindungskurve mit zwei Bindungsklassen
nach Rosenthal (1967). 1 und 2 sind die Ge-
raden der separaten Bindungsklassen, die Ur-
sprungsgerade hat die Steigung 1/[A]. Ihr
Schnittpunkt P mit der Mekurve mit seinen
Koordinaten [A]
geb
//[A]
geb
/[A] ist die Summe
der Bindungskoordinaten der Schnittpunkte P
1
und P
2
mit den Geraden der separaten Bin-
dungsklassen.
1.5 Makromolekle mit identischen,
sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativitt
1.5.1 Hill-Gleichung
Seit hundert Jahren ist bekannt, da die Bindung von Sauerstoff an Hmoglobin keiner
einfachen, hyperbolen Funktion gehorcht, sondern einen charakteristischen S-frmigen
oder sigmoiden Verlauf nimmt, whrend die Bindung an das eng verwandte Myoglobin
vllig normal ist (Abb. 1.8). Dieses auffallende Verhalten gab seither den Ansto fr
eine Vielzahl theoretischer und methodischer Studien. Noch greres Interesse gewann
dieses Phnomen, als vergleichbare Sttigungskurven auch bei Enzymen gefunden wur-
den, die Schlsselpositionen im Stoffwechsel innehaben. Damit wurde offenkundig, da
sich hierin ein wichtiges regulatorisches Prinzip der Zelle verbirgt.
Einen ersten Erklrungsversuch unternahm 1910 A. V. Hill, der postulierte, da an
ein Hmoglobinmolekl mehrere (n) Sauerstoffmolekle gleichzeitig binden:
E nA = EA
n
X (1X44)
Das Massenwirkungsgesetz fr dieses Reaktionsgleichgewicht lautet:
K
d
=
[E[[A[
n
[EA
n
[
X (1X45)
Eine Bindungsgleichung kann in analoger Weise, wie fr Gl. (1.23) gezeigt, hergelei-
tet werden, nur da [A] durch [A]
n
zu ersetzen ist:
r =
n[A[
n
K
d
[A[
n
X (1X46)
30 1 Multiple Gleichgewichte
Abb. 1.8. Sauerstoffsttigungskurven fr Myoglobin und Hmoglobin (nach Perutz, M.F. 1978, Scien-
tific American 239, 6, 6886).
Diese Hill-Gleichung beschreibt sigmoide Bindungskurven, wie sie fr das Hmoglo-
bin gefunden wurden. Um n, die Zahl der pro Hmoglobin gebundenen Ligandenmo-
lekle, zu bestimmen, berfhrte Hill Gleichung (1.46) durch Logarithmieren in eine
lineare Form, wobei r durch Y = ran ersetzt wurde:
Y
1 Y
=
[A[
n
K
d
Y
log
Y
1 Y
= n log[A[ log K
d
X (1X47)
Logarithmische Auftragung von Ya(1 Y) gegen die Ligandkonzentration ergibt
eine Gerade mit der Steigung n (Abb. 1.9). Die Zahl der bindenden Sauerstoffmole-
kle wre demnach direkt aus der Steigung abzulesen. Tatschlich lassen sich aber
die von Hmoglobin und verschiedenen Enzymen erhaltenen sigmoiden Bindungskur-
ven in einem solchen Hill-Diagramm weder linearisieren noch ergibt die Steigung
den erwarteten Wert von 4 fr die Zahl der Bindungsstellen. Vielmehr bekommen
alle experimentell erhaltenen sigmoiden Kurven in diesem Diagramm einen charakte-
ristischen dreiphasigen Verlauf. Bei geringen Substratkonzentrationen ist die Kurve
linear mit einer Steigung von 1, die im mittleren Sttigungsbereich auf einen maxi-
malen Wert, beim Hmoglobin um 2,8, ansteigt und im Sttigungsbereich wieder zu
einer Geraden der Steigung 1 zurckkehrt (Abb. 1.9). Hyperbole, der einfachen Bin-
dungsgleichung gehorchenden Kurven, ergeben, unabhngig von der Zahl der Bin-
dungsstellen des Makromolekls, im Hill-Diagramm immer Geraden mit einer Stei-
gung von 1. Dieses Diagramm wre demnach eine weitere Mglichkeit der linearen
Darstellung der allgemeinen Bindungsgleichung, doch bietet es gegenber den bereits
beschriebenen Verfahren keine besonderen Vorteile. Vielmehr sind die Konstanten
umstndlicher zu ermitteln. So entspricht K
d
dem Abszissenwert an der Stelle
Ya(1 Y) = 0 (Halbsttigung).
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Abb. 1.9. Hill-Diagramm fr die Flle
positiver und negativer Kooperativitt.
Die gepunkteten Tangenten an die Kur-
ven im unteren und oberen Liganden-
bereich haben die Steigung 1 und ent-
sprechen einer normalen, hyperbolen
Bindung. Der Hill-Koeffizient ist die
Steigung der gestrichelten Tangenten
an die Bereiche maximaler Ab-
weichung.
1.5.2 Adair-Gleichung
G. S. Adair (1925) erbrachte den Nachweis, da Hmoglobin tatschlich aus vier Un-
tereinheiten besteht und konnte somit zeigen, da weder die Zahl der Bindungsstel-
len der Steigung des Hill-Diagramms zu entnehmen ist noch die Hill-Gleichung die
Bindungsverhltnisse hinreichend beschreibt. Sie bercksichtigt nicht, da mehrere
Bindungsstellen auf einem Makromolekl nacheinander in einer Folge einzelner Re-
aktionsschritte besetzt werden, wie bereits fr die allgemeine Bindungsgleichung in
Abschnitt 1.3.1 formuliert. Tatschlich ist der der Hill-Gleichung zugrunde gelegte
Mechanismus der Reaktionsgleichung (1.44) die Summierung aller Einzelschritte,
wobei die Zwischenformen EA bis EA
n1
eliminiert und daher als nicht vorhanden
angesehen werden. Um einem solchen Mechanismus zu gengen, mten alle Liga-
ndenmolekle gleichzeitig an das Makromolekl binden und dieses in einem einzi-
gen Schritt vllig absttigen. Teilgesttigte Formen drften nicht auftreten. Ein sol-
cher Mechanismus ist schwer vorstellbar, da sich die Liganden nicht gegenseitig ab-
sprechen knnen und ein einzelnes Ligandenmolekl nicht daran gehindert werden
kann, alleine eine freie Bindungsstelle zu besetzen. Nherungsweise finden sich Vor-
gnge solcher Art bei Kristallisationen und Polymerisationen aus bersttigten L-
sungen, wo die Bildung einer Keimzelle der limitierende Proze ist und selbst Tage
und Wochen dauern kann. Findet dieser Schritt jedoch statt, dann setzt die Kristalli-
sation der gesamten Lsung nahezu augenblicklich ein. bertragen auf ein Makromo-
lekl mit einer begrenzten Anzahl von Bindungsstellen wre zu fordern, da diese
nahezu keine Affinitt zum Liganden besitzen. Tritt schlielich doch ein Ligand in
Wechselwirkung mit einer Bindungsstelle, so steigert sich die Affinitt der noch frei-
en Bindungsstellen des Makromolekls derart drastisch, da diese in unmittelbarer
Folge besetzt werden. Der erste Ligand macht den Weg frei und verhilft den nachfol-
genden zur Bindung. Diese Art von Bindung bezeichnet man als Kooperativitt.
Zur Beschreibung der sigmoiden Bindungskurve des Sauerstoffs beim Hmoglobin
entwickelte Adair eine Gleichung unter Einbeziehung der Einzelschritte der Bindung.
Das Vorgehen entspricht prinzipiell demjenigen fr die allgemeine Bindungsglei-
chung, nur werden die Konstanten fr die einzelnen Teilschritte als unterschiedlich
angenommen und sind daher nicht durch eine einzige Konstante zu ersetzen. In der
nach Gl. (1.26) definierten Sttigungsfunktion r werden die verschiedenen Enzymfor-
men durch die makroskopischen Dissoziationskonstanten der Teilschritte ersetzt und
so die bereits in Abschnitt 1.3.1 hergeleitete Adair-Gleichung (1.27) erhalten:
r =
[A[
K
/
1

2[A[
2
K
/
1
K
/
2

3[A[
3
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F F F
n[A[
n
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F F F K
/
n
1
[A[
K
/
1

[A[
2
K
/
1
K
/
2

[A[
3
K
/
1
K
/
2
K
/
3
F F F
[A[
n
K
/
1
K
/
2
K
/
3
(1X27)
Fr die direkte Auswertung experimenteller Daten eignet sich diese Gleichung weni-
ger, da die verschiedenen Konstanten nicht unmittelbar bestimmbar sind. Umgekehrt
lassen sich aber durch willkrliche Vorgabe bestimmter Werte Kurvenverlufe simu-
lieren und experimentell erhaltenen Daten anpassen. Sigmoide Sttigungskurven re-
32 1 Multiple Gleichgewichte
sultieren, wenn die Konstanten vom ersten zum letzten Bindungsschritt abnehmen, al-
so die Affinitt der Bindungsstellen mit dem Besetzungsgrad zunimmt. Diese Kurven
zeigen nun auch im Hill-Diagramm den beobachteten dreiphasigen Verlauf und der
Wert der maximalen Steigung ist geringer als die tatschlich vorliegende Zahl der
Bindungsstellen, wie es bei realen Systemen beobachtet wird. Die Steigung hngt ab
vom relativen Verhltnis der Konstanten zueinander. Sie wird steiler und nhert sich
der Zahl der Bindungsstellen, je mehr die Konstanten der Teilschritte im oben ange-
gebenen Sinne divergieren, d. h. je strker die Kooperativitt ausgeprgt wird. Keines-
falls aber kann der Wert der Steigung die Zahl identischer Bindungsstellen berstei-
gen. Umgekehrt geht die Steigung in dem Mae gegen 1, wie sich die Konstanten
einander annhern. Das Adairsche Modell ist demnach eine Verfeinerung der Vorstel-
lung von Hill: anstatt der simultanen Besetzung aller Bindungsstellen wird eine se-
quenzielle Bindung mit steigender Affinitt angenommen.
Obwohl die Adair-Gleichung, im Gegensatz zur Hill-Gleichung, experimentell er-
haltene Bindungskurven vollstndig beschreiben kann, bleibt sie dennoch unbefriedi-
gend, da ihr kein plausibler Bindungsmechanismus zugrunde liegt. Der Adairsche
Mechanismus unterstellt, da sich nicht die Bindungsstellen des Makromolekls, son-
dern die Bindungsschritte in ihrer Affinitt unterscheiden. Alle Bindungsstellen sind
gleich, aber jeder Bindungsschritt geht mit einer definierten nderung der Affinitten
aller noch unbesetzten Stellen einher. So wrde beim Hmoglobin mit zunchst vier
identischen Bindungsstellen die zuletzt besetzte Stelle viermal ihre Affinitt ndern,
von K
/
1
nach K
/
4
. Es ist ein formaler Mechanismus, der nichts darber aussagt, wie
das Makromolekl die Affinittsnderungen realisiert.
1.5.3 Paulingsches Modell
Die erste plausible Beschreibung kooperativer Phnomene stammt von Linus Pauling
(1935), der ebenfalls davon ausging, da das Makromolekl aus identischen Bin-
dungsstellen mit einheitlichen Bindungskonstanten K
d
besteht. Er machte jedoch die
weitergehende Annahme, da jede mit einem Liganden beladene Untereinheit des
Makromolekls eine stabilisierende Wirkung auf die noch unbesetzten Untereinheiten
ausbt. Diese wird ausgedrckt durch einen Interaktionsfaktor a, der eine Erhhung
der Bindungsaffinitten bewirkt. Unter Bercksichtigung der statistischen Faktoren
aus Gl. (1.24) ergeben sich die Bindungskonstanten fr jeden Teilschritt zu:
K
/
d1
=
K
d
4
Y K
/
d2
=
2K
d
3a
Y K
/
d3
=
3K
d
2a
2
Y K
/
d4
=
4K
d
a
3
X
Werden diese Konstanten in die Adair-Gleichung (1.27) eingesetzt, so ergibt sich fol-
gende Bindungsfunktion:
r =
4[A[
K
d

12a[A[
2
K
2
d

12a
3
[A[
3
K
3
d

4a
6
[A[
4
K
4
d
1
4[A[
K
d

6a[A[
2
K
2
d

4a
3
[A[
3
K
3
d

a
6
[A[
4
K
4
d
X (1X48)
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Auch mit dieser gegenber der Adair-Gleichung vereinfachten Beziehung lassen sich
sigmoide Sttigungskurven befriedigend beschreiben.
1.5.4 Allosterische Enzyme
In der Folgezeit wurde zunehmend offenkundig, da sich das atypische Bindungsver-
halten dieser Klasse von Makromoleklen nicht in der sigmoiden Form der Stti-
gungskurve eines Liganden (homotroper Effekt) erschpft, sondern da zustzliche
Beeinflussung des Bindungsverhaltens in positiver oder negativer Weise durch an-
dersartige Liganden (Aktivatoren bzw. Hemmstoffe) erfolgen kann (heterotrope Effek-
te). Diese Effektoren wirken nicht durch direkte Wechselwirkung mit dem eigentli-
chen Liganden, z. B. durch Verdrngung aus dessen Bindungsstelle (Kompetition),
sondern besitzen einen eigenen, rumlich getrennten Wirkort, ein allosterisches Zen-
trum (griech. akko8 anders; rseqeo8 starr). Dies ermglicht mit hoher Spezifitt die
Regulation der Bindung und damit der Wirkung eines Liganden durch einen zweiten,
vllig andersartigen Metaboliten, wie im Falle der Feedback-Hemmung, wo das End-
produkt einer Stoffwechselkette den ersten katalytischen Schritt derselben steuert.
Die Wirkung heterotroper Effektoren auf die sigmoide Sttigungsfunktion eines Li-
ganden erfolgt bereinstimmend in der Weise, da Aktivatoren die sigmoide Abwei-
chung, d. h. die Strke kooperativer Wechselwirkungen, abschwchen, whrend
Hemmstoffe diese intensivieren. Im Falle von Enzymen wird das sigmoide Stti-
gungsverhalten in der Regel auch bei Messungen der Reaktionsgeschwindigkeit in
Abhngigkeit von der Substratkonzentration sichtbar und die Effektoren verndern
die Enzymaktivitt in der oben geschilderten Weise. Dieser Klasse regulatorischer
Enzyme wurde die Bezeichnung allosterische Enzyme verliehen. Es sei darauf ver-
wiesen, da Kooperativitt, die sich in vernderten Bindungskurven ausdrckt, und
Allosterie, also die Beeinflussung eines Zentrums durch ein zweites, rumlich ge-
trenntes, prinzipiell unabhngige Phnomene darstellen, die auch getrennt fr sich
vorkommen knnen. In der Regel treten sie jedoch gemeinsam auf und entfalten, wie
noch gezeigt wird, nur so ihre volle regulatorische Wirksamkeit. Die Verknpfung al-
losterischer Eigenschaften mit der Kooperativitt wurde von den bisher beschriebe-
nen Modellen nicht bercksichtigt.
1.5.5 Symmetrie-Modell
Jaques Monod, Jeffries Wyman und Jean-Pierre Changeux prsentierten 1965 in dem
Artikel On the Nature of Allosteric Transition: A Plausible Model das erste umfas-
sende Modell zur Beschreibung allosterischer Enzyme. Es wurde richtungsweisend
fr das Verstndnis regulatorischer Mechanismen an Enzymen. Das Modell sttzt
sich auf bestimmte Voraussetzungen (vgl. Abb. 1.10), die bei mehreren allosterischen
Enzymen, wie auch dem Hmoglobin, beobachtet wurden:
1) Ein allosterisches Enzym ist ein, aus einer begrenzten Anzahl n identischer Ein-
heiten (Protomere) gebildetes, Oligomer. Ein Protomer kann selbst eine Unterein-
34 1 Multiple Gleichgewichte
heit (Polypeptidkette) sein oder sich aus mehreren nicht-identischen Untereinhei-
ten zusammensetzen.
2) Protomere besetzen quivalente Positionen im Enzymmolekl, das damit zumin-
dest eine Symmetrieachse besitzt.
3) Das Enzym kann in mindestens zwei Konformationszustnden exisitieren, die als
T-Zustand (von engl. tense, gespannt) und R-Zustand (von engl. relaxed, ent-
spannt) bezeichnet werden und sich in ihrem Energiegehalt unterscheiden. In Ab-
wesenheit des Liganden stehen beide Enzymformen miteinander in einem durch
die Konstante L charakterisierten Gleichgewicht:
L =
[T[
[R[
X (1X49)
4) Beim bergang von der einen in die andere Enzymform bleibt die molekulare
Symmetrie erhalten. Alle Untereinheiten eines Enzymmolekls existieren zur
gleichen Zeit entweder nur im T- oder nur im R-Zustand, Zwischenformen mit
Protomeren in verschiedenen Konformationen sind nicht mglich.
5) Beide Enzymformen unterscheiden sich in ihrer Affinitt zum Liganden. T ist die
weniger affine (bzw. weniger aktive) Form, d. h. das Verhltnis c der Dissoziati-
onskonstanten ist:
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Abb. 1.10. Schematische Darstellung der Konformationszu-
stnde und der fraktionellen Absttigung eines tetrameren
Makromolekls nach dem Symmetrie-Modell.
c =
K
R
K
T
` 1 X (1X50)
6) Die weniger affine Enzymform liegt in Abwesenheit des Liganden gegenber der
affineren Form im groen berschu vor, d. h. L>1.
Fr die Bindung des Liganden an die beiden Enzymformen ergeben sich folgende
Gleichgewichte:
T = R
T A = TA R A = RA
TA A = TA
2
RA A = RA
2
TA
2
A = TA
3
RA
2
A = RA
3
F
F
F
F
F
F
TA
n1
A = TA
n
RA
n1
A = RA
n
X
Unter Annahme gleicher mikroskopischer Bindungskonstanten fr Bindungsstellen an
identischen Untereinheiten knnen die einzelnen Enzymformen durch die Konstanten
ausgedrckt werden:
[TA[ = [T[n
[A[
K
T
[RA[ = [R[n
[A[
K
R
[TA[
2
= [TA[
(n 1)[A[
2K
T
[RA[
2
= [RA[
(n 1)[A[
2K
R
F
F
F
F
F
F
[TA[
n
= [TA
n1
[
[A[
nK
T
[RA[
n
= [RA
n1
[
[A[
nK
R
X
Aus dem Anteil der durch den Liganden besetzten Bindungsstellen
Y =
1
n

([TA[ 2[TA
2
[ F F F n[TA
n
[) ([RA[ 2[RA
2
[ F F F n[RA
n
[)
([TA[ [TA
2
[ F F F [TA
n
[) ([RA[ [RA
2
[ F F F [RA
n
[)
(1X51)
erhlt man unter Ersatz von [A]/K
R
=a die allgemeine Sttigungsfunktion fr das
Symmetrie-Modell:
Y =
Lca(1 ca)
n1
a(1 a)
n1
L(1 ca)
n
(1 a)
n
X (1X52)
Sigmoide Sttigungskurven werden immer dann erhalten, wenn gleichzeitig die drei
Bedingungen L>1, c<1 und n>1 erfllt sind. Ist nur eine dieser Bedingungen nicht
36 1 Multiple Gleichgewichte
erfllt, so da c oder n=1 bzw. L sehr klein wird, reduziert sich Gl. (1.52) auf die
Form der normalen Bindungsgleichung:
Y =
a
1 a
=
[A[
K
R
[A[
X (1X23)
Das Ausma der Krmmung, d. h. die Sigmoiditt bzw. die Strke der Kooperativitt,
ist um so ausgeprgter, je eindeutiger diese Bedingungen erfllt sind, d. h. je grer
L und n und je kleiner c wird. In der direkten, nicht-linearen Darstellung
(Abb. 1.11A) ist dies weniger gut zu erkennen als in den linearen Diagrammen, die
nun charakteristische Abweichungen von der Geraden zeigen, im Falle der doppelt-
reziproken Darstellung (Abb. 1.11B) nach rechts oben, im Hanes-Diagramm
(Abb. 1.11D) nach links oben und im Scatchard-Diagramm (Abb. 1.11C) wird ein
Maximum durchlaufen. Zur Analyse kooperativer Systeme eignet sich besonders das
Hill-Diagramm (Abb. 1.9), aus dem zwei charakteristische Gren ermittelt werden
knnen. Wie bereits erwhnt, verluft die Kurve von einer Geraden der Steigung 1
bei geringen Ligandenkonzentrationen ber einen steileren mittleren Bereich wieder
in eine Gerade der Steigung 1 im Sttigungsbereich. Die beiden Geraden reprsentie-
ren die einfachen Funktionen der Bindung des Liganden an den T-Zustand im unte-
ren und an den R-Zustand im oberen Sttigungsbereich. Hier liegen diese Zustnde
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Abb. 1.11. Bindungskurven kooperativer Systeme nach dem Symmetriemodell in verschiedenen gra-
phischen Darstellungen. Die Konstanten L und c sind fr schwache Kooperativitt 5 bzw. 0,1, fr
starke Kooperativitt 100 bzw. 0,01 und fr nicht-kooperatives Verhalten 1. A) Direkte Darstellung,
B) doppelt-reziprokes Diagramm, C) Scatchard-Diagramm, D) Hanes-Diagramm.
in praktisch reiner Form vor, der Ligand bindet an ein einheitliches System nach den
Regeln der einfachen Bindungsgleichung. Der Abstand zwischen beiden Geraden ist
ein Ma fr die Energiedifferenz zwischen R- und T-Zustand. Im mittleren Bereich
wird der kooperative Effekt wirksam, das System geht vom niederaffinen T-Zustand
zum hochaffinen R-Zustand. Die maximale Steigung wird als Hill-Koeffizient (n
h
) be-
zeichnet und gibt Auskunft ber die Strke der Kooperativitt (s. u.).
Anschaulich kann der kooperative Effekt so verstanden werden, da der erste Li-
gand fr seine Bindung zunchst sehr wenig affine, da im Unterschu befindlichen
Molekle im R-Zustand vorfindet. Durch seine Bindung stabilisiert er jedoch den R-
Zustand und zieht ihn aus dem Gleichgewicht. Zur Aufrechterhaltung des ursprngli-
chen Gleichgewichts mu daher ein Makromolekl aus dem berschssigen T-Zu-
stand nachgeliefert und in den R-Zustand umgewandelt werden. Der folgende Ligand
findet somit sowohl die dem ursprnglichen Gleichgewicht entsprechenden wie die
noch freien Bindungsstellen der aus dem Gleichgewicht entfernten teilbesetzten Form
vor. Die Menge verfgbarer Bindungsstellen nimmt damit rascher zu als die Konzen-
tration des Liganden. Bei 4 Protomeren setzt jeder bindende Ligand neben seiner ei-
genen noch 3 weitere Bindungsstellen frei. Ist schlielich der Vorrat an T-Form er-
schpft und besteht die gesamte Makromoleklpopulation nur noch in der R-Form,
dann folgt die Bindung einer normalen Funktion mit einer Steigung von 1.
Der Hill-Koeffizient bewegt sich in den Grenzen 1n
h
n, wobei seine relative Gr-
e durch L und c bestimmt wird: je deutlicher die Bedingungen L1 und c1 erfllt
sind, um so mehr nhert sich n
h
der Protomerenzahl n. Keinesfalls kann er diese jedoch
bersteigen, wie auch umgekehrt n
h
durch keine Kombination von L und c die Zahl 1
unterschreiten kann. Der Hill-Koeffizient erweist sich damit als ein Ma fr die Strke
der Kooperativitt, je mehr er sich der Protomerenzahl angleicht, um so ausgeprgter ist
die Kooperativitt. Im Extremfall wird n
h
=n, d. h. es gilt der durch die Hill-Gleichung
(1.46) beschriebene Mechanismus. Daran zeigt sich die Bedeutung des Hill-Koeffizien-
ten, er gibt die Reaktionsordnung hinsichtlich des variierten Liganden wieder. Nach der
Reaktionsgleichung 1.44 drfte zwar n nur ganze Zahlenwerte annehmen, aufgrund der
Wechselwirkung der Untereinheiten sind aber auch gebrochene Reaktionsordnungen
mglich. Die hchstmgliche Reaktionsordnung wird bei simultaner Besetzung aller
Bindungsstellen, d. h. maximaler Kooperativitt, erreicht. Damit ist der Hill-Koeffizi-
ent auch kein direktes Ma fr die Zahl der Untereinheiten (bzw. Protomeren), jedoch
ist die tatschliche Protomerenzahl gleich dem Hill-Koeffizient oder grer (soweit
nicht andere Mechanismen fr den sigmoiden Kurvenverlauf verantwortlich sind). Er
ist auch (bei gleichen Werten fr L und c) nicht proportional zu n. Tabelle 1.1 zeigt
am Beispiel verschiedener sauerstoffbindender Proteine, da n
h
viel schwcher an-
steigt als die Protomerenzahl. Whrend diese von 1 bis ber 100 zunimmt, steigt der
Hill-Koeffizient nur bis 6 an. Dies zeigen auch theoretische Berechnungen.
Heterotrope Effektoren beeinflussen im Symmetrie-Modell ber die allosterischen
Bindungszentren das Gleichgewicht zwischen den R- und T-Zustnden. Aktivatoren
verhalten sich wie der kooperative Ligand selbst, sie binden mit hherer Affinitt an
die R-Form und verschieben das Gleichgewicht in deren Richtung. Dadurch verrin-
gert sich L, die Kooperativitt schwcht sich ab, der Hill-Koeffizient wird kleiner.
Der Ligand findet in Gegenwart des Aktivators eine grere Menge des Makromole-
kls bereits im R-Zustand vor, so da sich die Aktivitt insgesamt erhht. Umgekehrt
38 1 Multiple Gleichgewichte
bindet ein Hemmstoff an die T-Form und stabilisiert diese. L und damit n
h
steigen
an, die Kooperativitt wird verstrkt. Es ist nun eine grere Menge des Liganden
notwendig, um die Verschiebung des Gleichgewichts zur T-Form auszugleichen, so
da eine Hemmung resultiert.
Heterotrope Effekte werden in Gl. (1.52) durch Modifizierung der Gleichgewichts-
konstanten L zu L
/
bercksichtigt:
L
/
= L
1 db
1 b
_ _
n

1 ec
1 c
_ _
n
X (1X53)
b und c sind die um ihre Bindungskonstanten an die R-Form (K
Ri
bzw. K
Ra
) reduzier-
ten Hemmstoff- bzw. Aktivatorkonzentrationen; d=K
ri
/K
Ti
>1 und e=K
Ra
/K
Ta
<1 sind
die Verhltnisse der Bindungskonstanten fr R- und T-Zustand des Hemmstoffs und
des Aktivators.
1.5.6 Sequenz-Modell und negative Kooperativitt
Ein Jahr nach der Postulierung des Symmetrie-Modells publizierten D. E. Koshland,
G. Nemethy und D. Filmer (1966) ein weiteres Modell allosterischer Enzyme, das
kooperative Phnomene und heterotrope Effekte vergleichbar gut beschreibt. Auch
dieses Modell setzt den Aufbau des Makromolekls aus mehreren identischen Unte-
reinheiten und das Vorliegen von zumindest zwei Konformationen unterschiedlicher
Affinitt voraus. Der wenig affine bzw. inaktive T-Zustand (zur Einheitlichkeit wer-
den die Bezeichnungen aus dem Symmetrie-Modell bernommen) herrscht in Abwe-
senheit, der affine bzw. aktive R-Zustand in Gegenwart des Liganden vor. K
t
ist die
Gleichgewichtskonstante beider Enzymformen in Abwesenheit des Liganden:
K
t
=
[T[
[R[
1 X (1X54)
Gegenber dem Symmetrie-Modell sind zwei wesentliche Unterschiede hervorzuhe-
ben. Bereits vor der Postulierung des Sequenz-Modells entwickelte Koshland die in-
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Tab. 1.1. Beziehung zwischen Protomerenzahl n und Hill-Koeffizient n
h
bei Hmproteinen verschie-
dener Organismen (nach Wyman, 1967).
Protein Herkunft n n
h
Myoglobin Sugetiere 1 1
Myoglobin Mollusken 2 1,5
Hmoglobin Sugetiere 4 2,8
Hmocyanin Hummer 24 4
Chlorocruorin Spirographis
(Rhrenwurm)
~80 5
Erythrocruorin Arenicola
(Pierwurm)
>100 6
duced-fit-Hypothese, die, im Gegensatz zu Emil Fischers Schlo-Schlssel-Theorie,
annimmt, da die Substratspezifitt eines Enzyms nicht auf vorgebildeten, starren
Bindungsregionen beruht, in die sich nur das eigentliche Substratmolekl gleich ei-
nem Schlssel einfgen kann, sondern sich die passende Bindungsstelle interaktiv
zwischen Enzym und Substrat ausbildet. Nur das richtige Substrat kann diese Anpas-
sung induzieren. Diese Hypothese ist auch Grundlage des Sequenz-Modells. Anders
als beim Symmetrie-Modell, wo der Ligand sich selbst nicht aktiv an der Umwand-
lung von T- und R-Zustand beteiligt, sondern nur die affinere Form herausgreift, in-
duziert im Sequenzmodell der Ligand durch seine Bindung den Konformationsber-
gang. Als zweiter Unterschied zum Symmetrie-Modell erfolgt dieser bergang se-
quentiell, nur Untereinheiten, an die der Ligand bindet, nehmen die R-Form an, alle
brigen verbleiben im T-Zustand. Die Konformationsumwandlung geschieht somit
schrittweise mit der Absttigung des Enzyms (Abb. 1.12).
Kooperativitt wird durch Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten verur-
sacht. Die Strke dieser gegenseitigen Beeinflussung hngt vom Konformationszu-
stand der unmittelbar benachbarten Untereinheiten ab und wird durch Interaktions-
konstanten definiert. Diese geben das Verhltnis der miteinander interagierenden
(z. B. TT) zu nicht interagierenden Untereinheiten (T, T) an. Da es sich um relative
Gren handelt, dient die Konstante K
TT
fr T T-Wechselwirkungen als Bezugswert
und wird gleich 1 gesetzt:
K
TT
=
[T[[T[[TT[
[TT[[T[[T[
= 1 (1X55)
K
RT
=
[T[[R[[TT[
[RT[[T[[T[
=
[R[[TT[
[RT[[T[
(1X56)
K
RR
=
[R[[R[[TT[
[RR[[T[[T[
X (1X57)
Wechselwirkungen der Untereinheiten beim bergang vom T- zum R-Zustand knnen
somit stabilisierend (K
RT
und K
RR
<1) oder destabilisierend (K
RT
und K
RR
>1) wirken.
Die Sttigungsfunktion fr das Sequenzmodell leitet sich von der hier in allgemei-
ner Form dargestellten Adair-Gleichung (1.23) ab:
Y =
1
n

[A[
H
1

2[A[
2
H
2

3[A[
3
H
3
F F F
n[A[
n
H
n
H
0

[A[
H
1

[A[
2
H
2

[A[
3
H
3
F F F
[A[
n
H
n
X (1X58)
40 1 Multiple Gleichgewichte
Abb. 1.12. Schematische Darstellung der Konformationszustnde und der fraktionellen Absttigung
eines tetrameren Makromolekls nach dem Sequenz-Modell.
Die Terme H
0
, H
1
usw. setzen sich aus allen fr den jeweiligen Bindungsschritt rele-
vanten Konstanten zusammen. Die Bindungskonstante K
R
des Liganden fr den R-
Zustand (die Bindung an den wenig affinen T-Zustand wird vernachlssigt) und die
Gleichgewichtskonstanten K
t
der beiden Makromoleklformen gehen, wie auch die
Substratkonzentration [A], mit der Potenz des jeweiligen Bindungsschrittes i ein, die
Interaktionskonstanten dagegen gem dem Vorliegen der entsprechenden Wechsel-
wirkungen. Tabelle 1.2 zeigt die Bedeutung der Terme H am Beispiel eines Makro-
molekls aus drei linear angeordneten Untereinheiten. Durch Einsetzen der H-Glie-
der in Gl. (1.58) ergibt sich die Beziehung:
Y =
1
3

[A[
(K
2
RT
2K
RT
)K
R
K
t

2[A[
2
(K
2
RT
2K
RT
K
RR
)K
2
R
K
2
t

3[A[
3
2K
2
RR
K
3
R
K
3
t
1
[A[
(K
2
RT
2K
RT
)K
R
K
t

[A[
2
(K
2
RT
2K
RT
K
RR
)K
2
R
K
2
t

[A[
3
2K
2
RR
K
3
R
K
3
t
X
(1X59)
Diese Gleichung ist nur fr die Enzymform gltig, fr die sie abgeleitet wurde. Die
wenig wahrscheinliche lineare Anordnung des Trimers wurde gewhlt, da sie die ein-
fachste oligomere Struktur darstellt, die die verschiedenen Kombinationen der Inter-
aktionskonstanten gut sichtbar werden lt. Schon fr ein im Dreieck angeordnetes
Trimer (Abb. 1.13) mte eine eigene Beziehung hergeleitet werden. Fr ein Tetra-
mer sind drei Anordnungen denkbar, linear, quadratisch und tetraedrisch. Fr hhere
Oligomere gibt es noch mehr Anordnungsmglichkeiten. Fr die Ableitung einer
Gleichung nach diesem Modell ist damit nicht nur die Kenntnis der Zahl der Unte-
reinheiten, sondern auch deren jeweilige Anordnung erforderlich. Weiterhin sind hier
nur gleichartige Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten angenommen, was das
Vorliegen gleichartiger Kontaktstellen zwischen den Untereinheiten voraussetzt. Ins-
besondere bei hheren Aggregaten knnen gleiche Untereinheiten durch verschieden-
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Tab. 1.2. Konformationszustnde und Definition der H-Werte fr ein trimeres lineares Makromolekl
nach dem Sequenzmodell.
Enzymkonformation Interaktionskonstante H-Werte
Unbesetztes Enzym
TTT K
TT
K
TT
=1 H
0
=1
1. Bindungsschritt
TRT K
RT
K
RT
= K
RT
2
H
1
=(K
RT
2
+ 2K
RT
)K
R
K
t
TTR+RTT K
TT
K
RT
+ K
RT
K
TT
= 2K
RT
2. Bindungsschritt
RTR K
RT
K
RT
= K
RT
2
H
2
=(K
RT
2
+2K
RT
K
RR
)
.
K
R
2
K
t
2
RRT+TRR K
RT
K
RR
+K
RR
K
RT
= 2K
RT
K
RR
3. Bindungsschritt
RRR K
RR
K
RR
=2K
RR
2
H
3
=K
RR
2
K
R
3
K
t
3
artige Kontaktflchen verbunden sein, wie Abb. 1.13 am Beispiel eines aus zwei
bereinanderliegenden Trimeren bestehenden Hexamers zeigt. Die Untereinheiten in-
nerhalb der Trimere sind durch einen Typ von Kontaktflchen verbunden, whrend
ein zweiter Typ den Zusammenhalt der beiden Trimere vermittelt. Fr jeden Typ von
Kontaktstellen sind eigene Interaktionskonstanten zu definieren.
Diese Komplikationen lassen das Modell fr reale Systeme als schwierig erschei-
nen, da die relative Anordnung der Untereinheiten nur durch Strukturuntersuchungen
zu erhalten ist. Es kann aber davon ausgegangen werden, da bestimmte Anordnun-
gen bevorzugt sind, wie eine tetraedrische Anordnung fr vier Untereinheiten. Wei-
terhin sind die Interaktionskonstanten experimentell nicht bestimmbar. Die Bedeu-
tung dieses Modells, wie auch des Symmetriemodells, liegt nicht in der Bestimmung
von Konstanten, sondern im Verstndnis eines Regulationsmechanismus, fr den bei-
de Modelle eine anschauliche Grundlage bieten. Genauere Aussagen ber das Vorlie-
gen eines bestimmten Modells erfordern eingehende Struktur- und Konformationsstu-
dien des Makromolekls, die bisher nur fr einzelne Beispiele vorliegen. Einen Hin-
weis kann die relative Lage des kooperativen Bereichs, d. h. die maximale Steigung
im Hill-Diagramm, geben. Beim Sequenzmodell fllt dieser genau mit der Halbstti-
gung zusammen, whrend er beim Symmetrie-Modell von der Anzahl der Protome-
ren abhngt. Mit zunehmender Protomerenzahl wandert der kooperative Bereich in
den unteren Sttigungsbereich. Bei mehr als zehn Protomeren ist die Verschiebung
derart ausgeprgt, da sie ohne weiteres erkannt werden kann.
Heterotrope Effekte werden im Sequenz-Modell hnlich erklrt wie im Symmetrie-
Modell. Aktivatoren untersttzen die Wirkung des kooperativen Liganden, indem sie
ebenfalls den bergang vom inaktiven in den aktiven Zustand induzieren, whrend al-
losterische Hemmstoffe den T-Zustand stabilisieren und den bergang erschweren.
Es wurde bereits darauf hingewiesen, da die Wechselwirkungen auch destabilisie-
rend wirken knnen, falls K
TR
und K
RR
grer werden als K
TT
. Die Abweichung von
der normalen, hyperbolen Sttigungsfunktion kehrt sich um, anstatt sigmoider Kur-
ven erhlt man einen Verlauf, der dem in Abschnitt 1.4 beschriebenen Fall nicht-
42 1 Multiple Gleichgewichte
Abb. 1.13. Anordnungsmg-
lichkeiten der Untereinheiten
verschieden aggregierter Ma-
kromolekle. Fr das Hexamer
sind rechts unten die unter-
schiedlichen Kontakte der Un-
tereinheiten in horizontaler und
vertikaler Richtung angedeutet.
identischer, unabhngiger Bindungszentren hnlich ist. Auch die Abweichungen in
den linearisierten Darstellungen entsprechen diesem Mechanismus (vgl. Abb. 1.6). Im
Hill-Diagramm (Abb. 1.9) fllt nunmehr die Steigung unter 1. Dieses, der eigentli-
chen Kooperativitt (auch positive Kooperativitt genannt) entgegengesetzte, anti-ko-
operative Verhalten wird als negative Kooperativitt bezeichnet. Es findet sich relativ
hufig bei Enzymen und die diesem Mechanismus gehorchende Bindung von NAD
an die Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase galt als erster Nachweis des Se-
quenz-Modells (Convay & Koshland, 1968).
Eine Einschrnkung erfhrt die negative Kooperativitt durch die nicht selten zu
beobachtende Halbseitenreaktivitt. Hier behindert ein bereits gebundener Ligand die
Besetzung der zweiten, identischen Bindungsstelle durch sterische oder elektrostati-
sche Effekte oder durch kovalente Reaktionen (Phosphorylierung). Dadurch wird zu-
nchst nur die Hlfte der ursprnglich vorhandenen Bindungsstellen abgesttigt, die
andere Hlfte dagegen berhaupt nicht oder erst bei sehr hohen Ligandenkonzentra-
tionen. Es handelt sich nicht im eigentlichen Sinne um eine durch Wechselwirkung
von Untereinheiten vermittelte negative Kooperativitt, obwohl Bindungsverhalten
und damit die Kurvenverlufe in den Diagrammen sehr hnlich sind. Halbseitenreak-
tivitt wurde u.a. gefunden bei der Alkohol-Dehydrogenase, der Malat-Dehydroge-
nase und der alkalischen Phosphatase (Levitzki & Koshland, 1976).
Der Umstand, da verschiedene Mechanismen, wie die negative Kooperativitt,
die Halbseitenreaktivitt, nicht-identische und asymmetrische Bindungszentren oder
unterschiedliche Enzymformen bzw. Isoenzyme hnliche Bindungsmuster ergeben,
erschwert den eindeutigen Nachweis eines bestimmten Mechanismus, wie der negati-
ven Kooperativitt. Strukturuntersuchungen sind sehr hilfreich, da negative Koopera-
tivitt und Halbseitenreaktivitt identische Untereinheiten voraussetzen. Nicht-identi-
sche Bindungsstellen sind dagegen zumeist auf nicht-identischen Untereinheiten loka-
lisiert. Viele Enzyme, wie die Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase, die CTP-
Synthetase und die Desoxythymidin-Kinase, aber auch Rezeptoren und selbst die
tRNA-Bindung an Ribosomen zeigen einen negativ-kooperativen Mechanismus. Der
physiologische Vorteil der negativen Kooperativitt knnte in einer greren Unemp-
findlichkeit gegenber Vernderungen in der Metaboliten-Konzentration (Substrate, Ef-
fektoren) liegen. Aufgrund der hohen Affinitt des ersten Bindungsschrittes sind diese
Systeme bei geringen Substratmengen sehr aktiv und immer in der Lage, einen Grun-
dumsatz aufrechtzuerhalten. Bei hohen Konzentrationen ist die weitere Aktivittszu-
nahme zwar gering, jedoch kann das System einem Substratanstieg ber einen sehr brei-
ten Bereich, wenn auch abgeschwcht, folgen, ohne sich frhzeitig abzusttigen.
1.5.7 Physiologische Aspekte der Kooperativitt
Eine groe Zahl biologischer Regulationsprozesse bedient sich der Kooperativitt.
Neben dem Hmoglobin tritt sie bei vielen Schlsselenzymen von Stoffwechselwe-
gen, aber auch bei membrangebundenen Enzymen auf, wo sie durch die Membran-
fluiditt beeinflut wird, bei Transportsystemen und ATPasen, bei Ligandenbindung
an Rezeptoren, wie dem strogenrezeptor, bei der an der synaptischen bertragung
beteiligten Acetylcholinesterase und bei der Thrombinaktivitt. Der Vorteil kooperati-
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
ven Sttigungsverhaltens liegt einerseits in der berproportionalen Reaktion des Sy-
stems auf Vernderungen in der Ligandenkonzentration selbst, andererseits in der da-
mit hufig verknpften allosterischen Regulation. Allosterische Beeinflussung durch
Konformationsnderung mittels eines vom Wirkungszentrum des Makromolekls
rumlich getrennten regulatorischen Zentrums wre zwar auch fr ein normales Bin-
dungsverhalten vorstellbar, doch liegt der Vorteil der Kooperativitt in der Steilheit
der sigmoiden Sttigungskurven besonders im mittleren Sttigungsbereich, der in der
Regel dem physiologischen Schwankungsbereich des Liganden entspricht
(Abb. 1.14). Eine geringfgige Konzentrationsschwankung bewirkt ein Mehrfaches an
Aktivittsvernderung. Das System reagiert viel empfindlicher auf Konzentrationsn-
derungen als bei normalem Sttigungsverhalten. Effektoren wirken nicht nur aktivie-
rend oder hemmend, sie nehmen dem System auch die Sensitivitt gegenber
Schwankungen in der Substratkonzentration. Der Aktivator hebt das System auf volle
Aktivitt, der Hemmstoff drckt es auf ein minimales Niveau.
Auch wenn seither viele Beispiele allosterischer Enzyme nachgewiesen werden
konnten, verbleibt die Frage nach der Relevanz der hier vorgestellten Modelle. Die
folgenden Beispiele gut untersuchter allosterischer Enzyme sollen zeigen, da we-
sentliche Voraussagen dieser Modelle zutreffen, so der Aufbau aus identischen Unte-
reinheiten, die Existenz unterschiedlich aktiver Konformationen und vom aktiven
Zentrum rumlich getrennter regulatorischer Zentren fr die Wirkung von Effektoren.
Teilweise werden auch Eigenschaften beider Modelle im gleichen System gefunden,
wie beim Hmoglobin, wo die Sauerstoffbindung eine Konformationsnderung indu-
ziert, die Konformationsbergnge der Untereinheiten aber konzertiert erfolgen.
Wie Abb. 1.15 zeigt, nehmen beide Modelle unter allen denkbaren Kombinationen
von Konformationsbergngen und Ligandenbindung extreme Positionen ein. Das
Symmetrie-Modell lt nur die in den ueren Balken eingefaten einheitlichen Kon-
formationen zu, das Sequenzmodell nur die diagonalen Formen der direkten Ver-
knpfung zwischen Ligandenbindung und Konformationsbergang. Die durch beide
Modelle nicht erfaten Zustnde knnten ebenfalls eine Rolle spielen und durch an-
dere Modelle einbezogen werden. Allerdings ist offensichtlich, da starke Kooperati-
44 1 Multiple Gleichgewichte
Abb. 1.14. Regulatorische Bedeu-
tung allosterischer Enzyme. Der
physiologische Ligandenbereich ist
hervorgehoben. 1) Negative Koope-
rativitt; 2) normale Bindung. Posi-
tive Kooperativitt 3) mit Aktivator,
4) ohne Effektor und 5) mit Hemm-
stoff.
vitt nur durch die extremen Positionen zu erzielen ist, so da alle mglichen Modelle,
die alleine auf der Kombination zwischen Ligandenbindung und Konformationsber-
gngen beruhen, durch die beiden beschriebenen Modelle hinreichend erfat sind. An-
dere Modelle mten weitergehend sein und zustzliche Aspekte einbeziehen.
Ein wichtiges Kriterium fr ihre Gltigkeit ist der von beiden Modellen postulierte
Aufbau aus identischen Untereinheiten. Kooperative Effekte bei monomeren Makro-
moleklen knnen diese Modelle nicht erklren und es ist eine deutliche Bestti-
gung, da monomeres Myoglobin trotz weitgehender Homologie zu Hmoglobin eine
normale Sauerstoffbindung zeigt. Kooperatives Verhalten ist dann noch mit den Mo-
dellen in Einklang zu bringen, wenn der bergang vom T- in den R-Zustand mit ei-
ner Aggregation des Monomers zum Oligomer einhergeht. Mit der Ribonuclease
wurde ein ausschlielich monomeres Enzym mit sigmoidem Sttigungsverhalten ge-
funden, dessen Kooperativitt nicht durch Wechselwirkung von Untereinheiten verur-
sacht sein kann. Dieser Mechanismus wird als kinetische Kooperativitt bezeichnet,
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Abb. 1.15. Mgliche Konformations- und Bindungszustnde eines tetrameren Makromolekls. Die in-
aktiven T-Formen sind quadratisch, die aktiven R-Formen als Kreise dargestellt. Die beiden senkrech-
ten Balken schlieen die im Symmetrie-Modell erlaubten Zustnde, der diagonale Balken die mgli-
chen Zustnde im Sequenz-Modell ein.
da er die Kombination eines schnellen katalytischen Umsatzes mit einem langsamen
Konformationsbergang zwischen einer inaktiven und einer aktiven Enzymform er-
fordert (Slow-Transition-Modell, Abschnitt 2.8.2), also auf zeitabhngigen Vorgngen
basiert, whrend die bisher beschriebenen Modelle auf (zeitunabhngigen) Gleichge-
wichten beruhen. Die kinetische Kooperativitt lt sich relativ einfach dadurch er-
kennen, da sigmoides Sttigungsverhalten nur beim Substratumsatz, nicht aber bei
der Bindung beobachtet werden kann.
1.5.8 Nachweis der Kooperativitt
Kooperative Effekte werden zunchst am atypischen Sttigungsverhalten des Ligan-
den erkannt. Da die wesentlichen Mechanismen auf Gleichgewichtsannahmen basie-
ren, ist es vorteilhaft, dieses Verhalten durch direkte Bindungsmessungen zu bestim-
men, obwohl bei Enzymen die Enzymaktivitt einfacher nachweisbar ist und in der
Regel auch sigmoide Abhngigkeiten erkennen lt, da sich Beeinflussungen der Af-
finitt des Substrats ber den K
m
-Wert auf die Enzymreaktion bertragen (K-Sy-
steme). Andererseits knnen sich die beiden Enzymkonformationen anstatt in ihrer
Affinitt zum Liganden in ihrer katalytischen Aktivitt unterscheiden (V-Systeme),
wie auch die Wirkung von Effektoren oft unmittelbar auf die Umsatzgeschwindigkeit
zielt. Zur Analyse sigmoider Kurven sind linearisierte Diagramme der direkten
(nicht-linearen) Auftragung vorzuziehen, da Abweichungen vom linearen Verlauf
deutlicher erkennbar sind. Fr die Dokumentation solcher Mechanismen ist eine gr-
ere Zahl von Mewerten als bei normalem Verhalten ntig, auch mu ein breiterer
Konzentrationsbereich des Liganden abgedeckt werden.
Abweichungen vom normalen Verhalten knnen auch andere, gegebenenfalls auch
artifizielle Ursachen haben. Sigmoide Sttigungskurven werden beobachtet bei Mehr-
substratreaktionen, bei hohen Enzymkonzentrationen (da hier nicht mehr, wie in der
Enzymkinetik allgemein angenommen, [A]
0
=[A] gilt), bei Instabilitt des Enzyms in
verdnnter Lsung, oder bei fehlerhafter Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit
(vgl. Abschnitt 2.3.2).
Als Strke der Kooperativitt kann, wie bereits erwhnt, das Verhltnis des Hill-
Koeffizienten zur Zahl der Bindungsstellen dienen, bei positiver Kooperativitt liegt
n
h
zwischen 1 und n, bei negativer Kooperativitt unter 1. Die Asymptoten an die
Sttigungskurve im Hill-Diagramm im niederen und hohen Ligandenbereich mit der
Steigung 1 knnen als reprsentativ fr die beiden Enzymzustnde betrachtet und die
zugehrigen Dissoziationskonstanten aus deren Ordinatenwerten bei log [A] =0 erhal-
ten werden. Der mit RT

2
_
multiplizierte Abstand beider Asymptoten ergibt die Dif-
ferenz zwischen den freien Energien fr die Wechselwirkungen der Bindung des er-
sten und des letzten Liganden (Abb. 1.9).
Ein weiteres Ma der Kooperativitt ist der R
s
-Wert. Er ist definiert als das Ver-
hltnis der Ligandenkonzentrationen bei 90% und 10% Sttigung und hat fr eine
normale hyperbole Sttigungskurve immer den Wert 81. Bei positiver Kooperativitt
nimmt die Steilheit der Kurve zu, der R
s
-Wert nimmt mit der Strke der Kooperativi-
tt ab, bei negativer Kooperativitt steigt er an (Tabelle 1.3). Hill-Koeffizient und R
s
-
46 1 Multiple Gleichgewichte
Wert stehen in keiner direkten Relation. Whrend der Hill-Koeffizient die Kooperati-
vitt an einer bestimmten Stelle, der maximalen Abweichung, erfat, bercksichtigt
der R
s
-Wert einen breiteren Bereich, es geht aber der Bezug zur Protomerenzahl ver-
loren. Die Bestimmung des R
s
-Werts ist in Abb. 1.16, einem halblogarithmischen
Diagramm, gezeigt. Dieses Diagramm eignet sich besonders zur Darstellung weiter
Ligandenbereiche bei kooperativen Systemen. Allerdings erhalten hier auch normale
Bindungskurven eine sigmoide Form, so da eine Unterscheidung nur anhand der
Steilheit der Kurve mglich ist. Bei Halbsttigung zeigt die Kurve einen Wende-
punkt, dessen Abszissenwert bei normalem Bindungsverhalten dem K
d
-Wert ent-
spricht. Bei kooperativen Systemen hat ein solcher bei Halbsttigung definierter K
d
-
Wert keine theoretische Bedeutung. Da aber auch hier die Ligandenkonzentration bei
Halbsttigung fr ein gegebenes System spezifisch und konstant ist, wird ein S
0.5
-
Wert als charakteristische Gre fr das Makromolekl definiert, der aber nicht die
Bedeutung einer echten Bindungskonstante hat.
Wie in Abb. 1.11 gezeigt, geben allosterische Enzyme charakteristische Abwei-
chungen in linearen Diagrammen. Doch lassen sich diese Kurven wieder linearisie-
ren, wenn [A]
n
anstatt [A] aufgetragen wird, wobei hier, gem der Hill-Gleichung,
n die Reaktionsordnung hinsichtlich [A] bedeutet und damit dem Hillkoeffizient n
h
und nicht der Zahl der Bindungsstellen entspricht.
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
Tab. 1.3. Vergleich zwischen dem Hill-Koeffizienten n
h
und dem R
s
-Wert (nach Taketa und Pogell,
1965).
n
h
R
s
0,5 6570
1,0 81
2,0 9
4,0 3
Abb. 1.16. Halblogarithmische
Darstellung von Sttigungskur-
ven zur Bestimmung des R
s
-
Werts aus dem Verhltnis der Li-
gandenkonzentrationen bei 90%
und 10% Sttigung fr 1) nega-
tiv kooperatives, 2) normales
und 3) positiv kooperatives Ver-
halten. Der S
0,5
-Wert, die Liga-
ndenkonzentration bei Halbstti-
gung, ist als 1 angenommen.
1.5.9 Beispiele allosterischer Enzyme
1.5.9.1 Hmoglobin
Obwohl selbst kein Enzym, gab das Hmoglobin wesentliche Impulse fr zahlreiche
theoretische Studien, wie der kooperativen Modelle. Auch inspirierte es die Entwick-
lung so wichtiger Methoden, wie der Rntgenstrukturanalyse und schneller kineti-
scher Apparaturen. Der Vergleich der sigmoiden Bindungscharakteristik des Sauer-
stoffs beim tetrameren Hmoglobin mit dem einfachen Sttigungsverhalten des eng
verwandten monomeren Myoglobins demonstriert augenfllig die Bedeutung der
Wechselwirkung von Untereinheiten fr die Kooperativitt. Hinsichtlich der Postulate
der allosterischen Modelle zeigt Hmoglobin einen scheinbaren Widerspruch durch
seinen Aufbau aus zwei Paaren nicht-identischer Untereinheiten, d. h. 2 Protomeren.
Demgem drfte es einen Hill-Koeffizient von 2 nicht berschreiten, tatschlich
aber liegt dieser nahe 3. Die a- und b-Untereinheiten sind jedoch in ihren Affinitten
fr den Liganden vergleichbar und daher als identisch zu werten. Detaillierte rntgen-
kristallographische Untersuchungen von Max Perutz (1970, 1990) erlauben einen ge-
nauen Einblick in das allosterische Geschehen des Hmoglobins. In Abwesenheit von
Sauerstoff (Desoxy-Hmoglobin) existiert das Hmoglobin in einem niederaffinen T-
Zustand, der gegenber dem hochaffinen R-Zustand des mit Sauerstoff besetzten
Oxy-Hmoglobins durch acht zustzliche Ionenbindungen zwischen den Untereinhei-
ten stabilisiert ist. Im Desoxy-Hmoglobin liegt das Eisenion in einem High-Spin-Zu-
stand vor und ragt um 0,06 nm aus der Ebene des Porphyrin-Rings heraus, wo es
von einem Histidinrest ber seine fnfte Koordinationsstelle gehalten wird. Die ande-
ren vier Koordinationsstellen sind durch Porphyrin-Stickstoffatome besetzt. Durch die
Bindung eines Sauerstoffmolekls an die sechste Koordinationsstelle des Eisens geht
dieses in den Low-Spin-Zustand ber und wandert in die Ringebene des Porphyrins.
Es zieht das Histidin mit sich und lst damit die Konformationsnderung zum R-Zu-
stand unter Spaltung der acht ionischen Bindungen zwischen den Untereinheiten aus.
Der R-Zustand wird durch das gebundene Sauerstoffmolekl stabilisiert.
Die Bedeutung des sigmoiden Sttigungsverhaltens fr die Regulation der Sauer-
stoffbindung wird durch deren Abhngigkeit von der Protonenkonzentration (Bohr-
Effekt) deutlich. Die in den Blutkapillaren aus Hydrogencarbonat freigesetzten Proto-
nen binden an die endstndigen Aminosuren des Hmoglobins und stabilisieren den
T-Zustand. Die Sigmoiditt der Sttigungsfunktion wird ausgeprgter, die Bindungs-
kapazitt sinkt und Sauerstoff wird an das Gewebe abgegeben. Umgekehrt setzt die
durch den hohen Sauerstoffdruck in der Lunge bedingte verstrkte Sauerstoffbindung
Protonen aus dem Hmoglobin frei, der pH-Wert sinkt und die Sigmoiditt schwcht
sich infolge der Stabilisierung des R-Zustandes ab. Der geringere pH-Wert verursacht
wiederum die Freisetzung von CO
2
aus Hydrogencarbonat in der Lunge. Eine Stabili-
sierung des T-Zustandes durch Verknpfung der b-Untereinheiten und infolgedessen
eine Abnahme der Sauerstoffbindungskapazitt bewirkt auch 2,3-Bisphosphoglycerat,
das ebenfalls an der Regulation der Sauerstoffbindung teilnimmt.
48 1 Multiple Gleichgewichte
1.5.9.2 Aspartat-Transcarbamylase
Dieses aus Escherichia coli gewonnene und eingehend untersuchte Enzym demon-
striert augenfllig die rumliche Trennung von katalytischen und regulatorischen
Zentren auf separaten Polypeptidketten. Das native Enzymmolekl besteht aus sechs
katalytischen Untereinheiten (C, M
r
=33000), die zu zwei Trimeren zusammengefat
sind und aus sechs regulatorischen Untereinheiten (R, M
r
=17000), die drei Dimere
bilden, so da sich eine (C
3
)
2
(R
2
)
3
-Struktur ergibt. Katalytische und regulatorische
Zentren sind 6 nm voneinander entfernt. Der allosterische Aktivator ATP und der In-
hibitor CTP binden beide an die gleiche Region der R-Untereinheit. CTP stabilisiert
den T-Zustand und erhht den sigmoiden Charakter der Substratsttigungsfunktion,
ATP bindet bevorzugt an die R-Form und stabilisiert diese unter Abschwchung der
Kooperativitt des Substrats Aspartat. Letzteres bindet ebenfalls bevorzugt an die R-
Form. Beim bergang vom T- in den R-Zustand rcken die beiden katalytischen Tri-
mere um 1,1 nm auseinander und rotieren um 128 relativ zueinander, whrend sich
die regulatorischen Dimere um 158 um die zweizhlige Moleklachse drehen. Durch
diesen bergang bewegen sich mehrere fr die Bindung von Aspartat wichtige Ami-
nosurereste in Richtung des aktiven Zentrums und erhhen die Affinitt fr das Sub-
strat. Die Abtrennung der regulatorischen Untereinheit fhrt zum Verlust der Regula-
tion durch ATP und CTP und der Kooperativitt, die katalytische Aktivitt bleibt je-
doch erhalten. Am Beispiel dieses Enzyms war es auch mglich, einen konzertierten
bergang vom T- zum R-Zustand gem dem Symmetrie-Modell nachzuweisen. Es
gengt die Besetzung der Hlfte aller Bindungsstellen durch eine analoge Verbin-
dung des bergangszustandes (PALA, N-Phosphonacetyl-L-aspartat), um das ge-
samte Enzymmolekl in den R-Zustand zu berfhren.
Die Aspartat-Transcarbamylase ist ein gutes Beispiel fr eine Endprodukt-Hem-
mung. Das Enzym steht am Beginn der Synthesekette der Pyrimidin-Nucleotide und
wird durch deren Endprodukt, CTP, gehemmt. Der Aktivator ATP ist Endprodukt der
Purinbiosynthesekette. Da fr die Nucleinsure-Biosynthese beide Nucleotide im
gleichen Verhltnis gebraucht werden, stimuliert ein berschu der Purin-Nucleotide
die Pyrimidinsynthese, die wiederum durch einen berschu an Pyrimidin-Nucleoti-
den gehemmt wird (Kantrowitz & Lipscomp, 1990).
1.5.9.3 Aspartokinase
Die Aspartokinase I: Homoserin-Dehydrogenase I aus Escherichia coli katalysiert
den ersten und den dritten Schritt der Threonin-Biosynthese-Kette. Von diesem Weg
zweigt die durch eine Aspartokinase II: Homoserin-Dehydrogenase II kontrollierte
Methionin-Biosynthese und der durch eine Aspartokinase III regulierte Biosynthese-
weg fr Lysin ab. Die Aspartokinase I: Homoserin-Dehydrogenase I besteht aus vier
identischen Untereinheiten (M
r
=86000), wobei jede Untereinheit katalytische Zen-
tren fr die beiden Enzymaktivitten auf zwei getrennten Domnen besitzt (multi-
funktionelles Enzym). Durch partielle Proteolyse bzw. durch Mutationen konnten die
getrennten Domnen mit ihren zugehrigen Enzymaktivitten erhalten werden, wobei
die Aspartokinase ihre tetramere Struktur behlt, whrend die Homoserin-Dehydroge-
A1.5 Makromolekle mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen, Kooperativi-
nase in Dimere zerfllt. Im nativen Enzym unterliegen beide Aktivitten der Endpro-
dukthemmung durch Threonin, das ein sigmoides Sttigungsverhalten zeigt, welches
fr die Aspartokinase-Aktivitt ausgeprgter ist (n
h
=4) als fr die Homoserin-Dehy-
drogenase-Aktivitt (n
h
=3). Die getrennte Aspartokinase-Domne zeigt noch volle
Hemmbarkeit durch Threonin, nicht aber die Homoserin-Dehydrogenase-Domne,
d. h. das native Enzym besitzt nur eine regulatorische Bindungsstelle auf der Asparto-
kinase-Domne, die fr beide Enzymaktivitten wirksam ist. Das konnte auch durch
eine Ein-Schritt-Mutation gezeigt werden, bei der die Kooperativitt fr beide Aktivi-
tten um einen vergleichbaren Betrag reduziert wurde, nmlich auf n
h
=1,65 fr die
Aspartokinase und n
h
=1,45 fr die Homoserin-Dehydrogenase. Es ist daraus zu
schlieen, da das native Enzym durch die Fusion der Gene zweier ursprnglich ge-
trennter Enzyme entstanden ist, einer allosterischen, durch Threonin hemmbaren
Aspartokinase und einer ursprnglich nicht regulierten Homoserin-Dehydrogenase,
der die allosterischen Eigenschaften durch die Fusion aufgezwungen wurden.
1.5.9.4 Andere Beispiele
Die Phosphofructokinase ist das wichtigste regulatorische Enzym der Glykolyse. Der
entsprechende Reaktionsschritt in der umgekehrten Richtung, der Gluconeogenese,
wird durch ein anderes Enzym, die Fructose-1,6-Bisphosphatase, katalysiert. Hier ist
eine enge regulatorische Kopplung notwendig, um einen ATP-Abbau durch Leerlauf
(Futile Cycle) der beiden gegenlufigen Reaktionen zu verhindern, da die Hinreakti-
on ein ATP verbraucht, das in der Rckreaktion nicht zurckgewonnen wird. AMP
ist Aktivator der Phosphofruktokinase und Hemmstoff der Fructose-1,6-Bisphospha-
tase. Die Phosphofructokinase, ein tetrameres Enzym, wird durch Phosphoenolpyru-
vat gehemmt, das den T-Zustand stabilisiert. Das Substrat Fructose-6-phosphat zeigt
einen kooperativen Effekt, wobei der bergang vom T- in den R-Zustand durch eine
Drehung um 78 jeweils zweier Dimeren gegeneinander bewirkt wird. Eine Umorientie-
rung zweier Dimeren um 198 verursacht die Bindung des Hemmstoffes AMP bei der
ebenfalls tetrameren Fructose-1,6-Bisphosphatase. In Sugetieren werden beide En-
zyme zustzlich durch Fructose-2,6-bisphosphat reguliert, die Phosphofructokinase
wird allosterisch aktiviert und die Fructose-1,6-Bisphosphatase in negativ kooperativer
Weise gehemmt. Beide Enzyme unterliegen somit einem entgegengerichteten Regula-
tionsprinzip, was verhindert, da beide Reaktionen simultan nebeneinander ablaufen.
Einer allosterischen Regulation gehorchen auch die beiden fr Auf- und Abbau
des Glycogens verantwortlichen Enzyme. Hier wird die allosterische Regulation zu-
stzlich durch kovalente Modifikation berlagert, einer ber einen zyklischen Kaska-
denmechanismus gesteuerten Phosphorylierung. Die Glycogen-Synthase wird durch
Glucose-6-phosphat aktiviert und durch AMP gehemmt, whrend die Glycogen-Phos-
phorylase durch AMP aktiviert und durch Glucose-6-phosphat und ATP gehemmt
wird. Der bergang vom T- in den R-Zustand ist bei der Glycogen-Phosphorylase
begleitet von einer Rotation der Untereinheiten relativ zueinander um 108. Es ndert
sich die Quartrstruktur des Enzyms in Richtung einer gnstigeren Packung, wobei
das katalytische Zentrum in die Nhe der allosterischen AMP-Bindungsstelle und der
Phosphorylierungsstelle gerckt wird. Dieser enzymatisch aktive R-Zustand wird ei-
50 1 Multiple Gleichgewichte
nerseits durch AMP, andererseits durch kovalent gebundene Phosphatreste an der
Phosphorylierungsstelle stabilisiert.
1.6 Nicht-identische,
sich beeinflussende Bindungsstellen
Der Beschreibung des Bindungsverhaltens von Liganden an identische, an nicht-iden-
tische, unabhngige und an identische, sich beeinflussende Bindungsstellen mte
nunmehr die Bindung von Liganden an nicht-identische, sich beeinflussende Bin-
dungsstellen folgen. Allerdings konnten solche Flle bisher nicht berzeugend nach-
gewiesen werden. Hmoglobin wre zwar ein solches Beispiel, doch wird es auf-
grund vergleichbarer Bindungskonstanten dem Fall identischer Untereinheiten zuge-
rechnet. Unterschiedliche, unabhngige Bindungsstellen verursachen, wie in Ab-
schnitt 1.4 gezeigt, ein Abweichen vom normalen Bindungsverhalten (Abb. 1.6), das
demjenigen identischer, sich beeinflussender Bindungsstellen (fr den Fall positiver
Kooperativitt) entgegengesetzt ist (Abb. 1.9). Dies ist deutlich im doppelt-reziproken
Diagramm zu erkennen (Abb. 1.6B und 1.11B). Die Kurve fr positive Kooperativi-
tt weicht nach rechts oben, die fr unterschiedliche Bindungszentren dagegen nach
rechts unten ab. Bei vergleichbarer Ausprgung kompensieren sich beide Effekte und
eine lineare Abhngigkeit wie fr normales Bindungsverhalten resultiert. Auch bei
unterschiedlicher Strke beider Effekte erfolgt eine teilweise Kompensation und nur
der berwiegende Mechanismus kann sich in abgeschwchter Form manifestieren.
Gleiches gilt fr gleichzeitiges Vorliegen positiver und negativer Kooperativitt, da
letztere eine hnliche Kurvenform ergibt wie die Bindung an nicht-identische Bin-
dungsstellen. Es lt sich zwar ber die Bedeutung solcher berlagerungen im Sinne
einer Gegenregulation oder Feinabstimmung diskutieren, auch knnten solche ber-
lagerungen Ursache manchmal beobachteter Inhomogenitten in Kurvenverlufen
sein. Aufgrund des Fehlens berzeugender Beispiele bleibt aber offen, inwieweit ge-
genstzliche Mechanismen im gleichen System tatschlich verwirklicht sind.
Eine Verstrkung zweier gleichgerichteter Effekte htte dagegen die Verknpfung
von negativer Kooperativitt mit Wechselwirkungen nicht-identischer Untereinheiten
zur Folge, doch auch hier fehlt es an berzeugenden Beispielen.
1.7 Literatur
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52 1 Multiple Gleichgewichte
2 Enzymkinetik
Gegenber den als zeitunabhngig anzusehenden multiplen Gleichgewichten befat
sich die Enzymkinetik mit den zeitabhngigen Reaktionen von Enzymen, mit deren
Hilfe Mechanismen enzymatischer Katalyse und Regulation aufgeklrt werden sollen.
Beide Gebiete ergnzen sich, da, wie aus dem vorigen Kapitel ersichtlich, durch
Gleichgewichtsbetrachtungen bereits Teilbereiche der Enzymkinetik, wie die Sub-
stratbindung oder kooperative Phnomene, vorweggenommen sind, die hier nicht
mehr behandelt werden mssen. Whrend die Gesetzmigkeiten der multiplen
Gleichgewichte auf alle Bindungsvorgnge anwendbar sind, beschrnkt sich die En-
zymkinetik, mit wenigen Ausnahmen, wie Transportsysteme, auf Enzyme. Der wich-
tigste und daher bevorzugt behandelte Ligand ist nunmehr das Substrat, das durch
das Enzym zum Produkt umgesetzt wird. Diese Umsetzung wird gegebenenfalls
durch andere Liganden, wie Cofaktoren, Hemmstoffe oder Aktivatoren beeinflut.
Als Voraussetzung zur Behandlung der enzymkinetischen Gesetze wird zunchst auf
die chemische Reaktionsordnung eingegangen.
2.1 Reaktionsordnung
Die Ordnung einer chemischen Reaktion bezglich der einzelnen Komponenten ist
definiert als die Potenz, mit der die Konzentration der Komponente in die Geschwin-
digkeitsgleichung eingeht. Die gesamte Ordnung der Reaktion ist die Summe der
Ordnungen aller Komponenten. Eine Reaktion:
2A B =P
ist insgesamt dritter Ordnung in der Hinreaktion, jedoch zweiter Ordnung bezglich
des Reaktanten A und erster Ordnung sowohl bezglich B, wie auch insgesamt in
der Rckreaktion.
2.1.1 Reaktionen erster Ordnung
Die einfachste chemische Reaktion ist die spontane Umwandlung eines Stoffes A in
einen Stoff P wie beim radioaktiven Zerfall:
A
k
1
PX
Die Geschwindigkeit der Reaktion v ist mebar durch die zeitliche Abnahme von A
oder die Zunahme von P und sie ist direkt abhngig von der Menge an A:
Enzymkinetik: Theorie und Methoden, 3. Auflage. Hans Bisswanger
Copyright 2000 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim
ISBN: 3-527-30096-1
v =
d[A[
dt
=
d[P[
dt
= k
1
[A[ Y (2X1)
k
1
, die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung, hat die Dimension s
1
, sie ist kon-
zentrationsunabhngig. Integration der Gl. (2.1) von 0 bis zur Zeit t ergibt:

A
1
A
0
d[A[
[A[
=

t
t
0
k
1
dt X
ln[A[ = ln[A[
0
k
1
t Y (2X2)
[A[ = [A
0
[e
k
1
t
X (2X3)
Substratabnahme bzw. Produktzunahme verlaufen exponentiell mit der Zeit
(Abb. 2.1A). Nach Gl. (2.2) lassen sich solche Kurven durch halblogarithmische Auf-
tragung der Substrat- bzw. Produktkonzentration nach der Zeit linearisieren. Die Ge-
schwindigkeitskonstante kann aus der Steigung (Abb. 2.1B) oder der Halbwertszeit
t
1/2
, bei der das Substrat zur Hlfte umgesetzt ist, erhalten werden. [A] ist dann [A]
0
/
2 und ln ([A]
0
/[A]) =ln 2:
k
1
=
ln 2
t
1a2
=
0Y69
t
1a2
X (2X4)
54 2 Enzymkinetik
Abb. 2.1. Zeit-Umsatz-Kurven nullter und erster Ordnung fr Produktbildung und Substratverbrauch
in der direkten (A) und der halblogarithmischen (B) Darstellung. Die Ermittlung der Umsatzge-
schwindigkeit durch Tangenten an die Kurven ist in A gezeigt.
2.1.2 Reaktionen zweiter Ordnung
A B
k
1
P X
Die Umsatzgeschwindigkeit ist bei dieser Reaktion proportional der Abnahme an A
und an B, sowie der Zunahme an P:
v =
d[A[
dt
=
d[B[
dt
=
d[P[
dt
= k
1
[A[[B[ X (2X5)
In die Dimension der Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung k
1
(s
1
M
1
) geht
nun auch die Konzentration ein. Integration von Gl. (2.5) fhrt zu:
k
1
t =
1
[A[
0
[B[
0
ln
[B[
0
[A[
[A[
0
[B[
; (2X6)
t ist nun abhngig von zwei Variablen, A und B, die Gleichung lt sich in der halb-
logarithmischen Darstellung nicht mehr linearisieren. Sie ist nur zu lsen, wenn eine
der Variablen als konstant angesehen werden kann, was dann zutrifft, wenn ein Reak-
tionspartner gegenber dem anderen in sehr groem berschu vorliegt, so da sich
dessen Konzentration whrend des Reaktionsverlaufs nur unwesentlich ndert. Die
Reaktion wird dadurch pseudoerster Ordnung:
v = k
1
[A[[B[
0
= k
/
1
[A[ X (2X7)
Die als konstant angesehene Konzentration [B]
0
wird in die Geschwindigkeitskon-
stante pseudoerster Ordnung einbezogen: k
1
/
=k
1
[B]
0
. Bei Gltigkeit dieser Vorausset-
zung lt sich diese Reaktion wie eine Reaktion erster Ordnung behandeln und in ei-
nem halblogarithmischen Diagramm wie in Abb. 2.1B linearisieren. Die Steigung, ge-
teilt durch die Konzentration des konstant gehaltenen Reaktionspartners, ergibt die
Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung. Eine Unterscheidung der pseudoersten
Ordnung von der ersten Ordnung ist in diesem Diagramm durch Vernderung der
Ausgangskonzentration des konstanten Reaktionspartners mglich, da sich die Stei-
gung in diesem Sinne ndert, whrend sie im Falle der ersten Ordnung von der Kon-
zentration unabhngig ist. Auf solche Weise lt sich z. B. unterscheiden, ob die
Konformationsvernderung eines Enzyms spontan abluft oder durch Ligandenbin-
dung induziert wird.
Sind Bedingungen pseudoerster Ordnung, d. h. sehr hohe Konzentrationen eines
Reaktionspartners, nicht zu erreichen, lt sich Gl. (2.5) dadurch vereinfachen, da
beide Reaktanten in der gleichen Konzentration eingesetzt werden, [A]
0
=[B]
0
:
v =
d[A[
dt
= k
1
[A[
2
X (2X8)
A2.1 Reaktionsordnung 55
Durch Integration nach t

A
1
A
0
d[A[
[A[
2
=

t
t
0
k
1
dt
erhlt man die Beziehung:
1
[A[
=
1
[A[
0
k
1
t Y (2X9)
die in einem Diagramm 1/[A] gegen t eine lineare Funktion mit der Steigung k
1
er-
gibt. Auch in diesem Falle lt sich k
1
auch ber die Halbwertszeit berechnen:
k
1
=
1
t
1a2
[A[
0
X (2X10)
2.1.3 Reaktionen nullter Ordnung
Reaktionen nullter Ordnung sind von den Konzentrationen der Reaktanten unabhn-
gig:
v =
d[A[
dt
=
d[P[
dt
= k X (2X11)
Integration nach der Zeit ergibt eine lineare Abhngigkeit:
[A[ = [A[
0
kt X (2X12)
Reaktionen, die dieser Ordnung gehorchen, sind daran zu erkennen, da die Abnah-
me des Substrat bzw. die Zunahme des Produkts linear mit der Zeit verluft
(Abb. 2.1A). Nullter Ordnung sind Reaktionen mit Beteiligung eines Katalysators,
wenn dieser gegenber den Reaktionspartnern in sehr geringer Konzentration vorliegt
und damit dessen Konzentration allein die Umsatzgeschwindigkeit bestimmt. Dies
gilt jedoch nur, wenn die Menge des Katalysators als konstant betrachtet werden
kann. Es ist dann auch unerheblich, wie viele Reaktanten an der Reaktion beteiligt
sind und welcher Ordnung die Reaktion in Abwesenheit des Katalysators gehorchen
wrde.
56 2 Enzymkinetik
2.2 Steady-State-Kinetik
und Michaelis-Menten-Gleichung
2.2.1 Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung
Der einfachste Fall einer enzymatischen Katalyse ist eine Reaktion, bei der ein Sub-
strat umgesetzt wird, wie bei Isomerisierungen oder Spaltungsreaktionen (Peptidasen,
Proteasen, Nucleasen etc.), auch wird ein irreversibler Reaktionsverlauf angenom-
men. Damit ist es auch gleichgltig, ob ein einziges Produkt entsteht oder mehrere
Spaltstcke freigesetzt werden:
A E
k
1
B EA
k
2
E P X
k
1
A
Fr die zeitliche nderung der einzelnen Reaktionspartner ergeben sich folgende Dif-
ferentialgleichungen:
d[A[
dt
= k
1
[A[[E[ k
1
[EA[ (2X13)
d[E[
dt
= k
1
[A[[E[ (k
1
k
2
)[EA[ Y (2X14)
d[EA[
dt
= k
1
[A[[E[ (k
1
k
2
)[EA[ Y (2X15)
d[P[
dt
= k
2
[EA[ = v X (2X16)
Als Umsatzgeschwindigkeit v wird die Produktzunahme definiert, die nach Gl. (2.16)
der Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes EA direkt proportional ist. Diese
hngt wiederum von der Menge der Reaktionspartner ab. Zur Lsung der Differen-
tialgleichungen wre die Kenntnis der zeitlichen Konzentrationsvernderungen der
Reaktionspartner erforderlich, was vor allem fr [E] und [EA] experimentell kaum
mglich ist. In Abb. 2.2 sind solche Vernderungen aller beteiligten Reaktionspartner
unter Vorgabe bestimmter Konstanten berechnet. Drei Phasen sind deutlich zu unter-
scheiden: 1. Eine kurze Anfangsphase der Bildung von Enzym-Substrat-Komplex bei
gleichzeitiger Abnahme des freien Enzyms. In diesem Bereich ist die Umsatzge-
schwindigkeit noch gering. 2. Eine mittlere Phase, in der sich die Konzentration des
Enzym-Substrat-Komplexes nur wenig ndert, die Umsatzgeschwindigkeit erreicht
hier ihren maximalen Wert. 3. Die letzte Phase ist geprgt durch den Zerfall des En-
zym-Substrat-Komplexes infolge der Erschpfung des Substratberschusses, die Um-
satzgeschwindigkeit nimmt wieder ab.
Durch Variation der Geschwindigkeitskonstanten ndern sich die relativen Berei-
che der drei Phasen. Sind alle drei Konstanten vergleichbar gro, dann ist die Dauer
der mittleren Phase relativ kurz, die Konzentration von [EA] erreicht zu keinem Zeit-
A2.2 Steady-State-Kinetik und Michaelis-Menten-Gleichung 57
punkt einen konstanten Wert. Stellt sich dagegen das vorgeschaltete Gleichgewicht
im Vergleich zur Enzymkatalyse rasch ein (eine durchaus plausible Annahme), also
k
1
&k
1
>k
2
, dann verlngert sich die mittlere Phase auffallend. Die Konzentration
des Enzym-Substrat-Komplexes bleibt fr eine beachtliche Zeitdauer nahezu unvern-
dert. In diesem Bereich halten sich Bildung und Zerfall des Enzym-Substrat-Komple-
xes gerade die Waage, es herrscht ein gleichgewichtshnlicher Zustand, der aber nur
fr eine begrenzte Zeit stabil ist. Zum Unterschied von einem echten Gleichgewicht
(engl. equilibrium) wird dieser Zustand mit dem englischen Begriff Steady-State
(Fliegleichgewicht) bezeichnet. In diesem Bereich beobachtet man, als Folge der
Konstanz des Enzym-Substrat-Komplexes, eine lineare Substratabnahme bzw. Pro-
duktbildung, die Reaktion wird nullter Ordnung hinsichtlich des Substrats. Da die
zeitliche nderung von Enzym-Substrat-Komplex und freiem Enzym d[EA]/dt =d[E]/
dt =0 gesetzt werden kann, vereinfachen sich die Gl. (2.14) und (2.15)
k
1
[A[[E[ = (k
1
k
2
)[EA[ X
und unter Ersatz von [E] nach dem Prinzip der Massenerhaltung [E]
0
=[E]+[EA] er-
gibt sich fr [EA] der Ausdruck
[EA[ =
k
1
[A[[E[
0
k
1
[A[ k
1
k
2
Y
der in Gl. (2.16) eingesetzt wird, um eine Beziehung zwischen Umsatzgeschwindig-
keit und Substratmenge zu erhalten:
v =
d[P[
dt
= k
2
[EA[ =
k
2
[E[
0
[A[
k
1
k
2
k
1
[A[
X (2X17)
58 2 Enzymkinetik
Abb. 2.2. Zeitliche Vernderung
der Reaktionspartner einer en-
zymkatalysierten Reaktion.
1) Pre-Steady-State-Phase,
2) Steady-State-Phase,
3) Substraterschpfung.
(k
1
+k
2
)/k
1
wird zu einer gemeinsamen Konstanten K
m
zusammengefat. k
2
[E]
0
=V
ist die Maximalgeschwindigkeit, da hier die gesamte eingesetzte Enzymmenge an der
Reaktion teilnimmt. Damit wird Gl. (2.17) zu:
v =
V[A[
K
m
[A[
X (2X18)
Diese von Briggs und Haldane 1925 entwickelte Gleichung besitzt zentrale Bedeu-
tung fr die Enzymkinetik. Sie ist zwar nur fr den einfachen Fall einer irreversiblen
Einsubstratreaktion abgeleitet, doch bleibt sie unter bestimmten Bedingungen und
mit Modifikationen auch fr komplexere Mechanismen gltig. hnliche Beziehungen
fr die Beschreibung der Invertase-Reaktion wurden bereits 1902 von Adrian J.
Brown in Birmingham und von Victor Henri in Paris formuliert. Zusammen mit der
Kanadierin Maud Menten hat Leonor Michaelis die Gltigkeit der Henrischen Glei-
chung ebenfalls am Enzym Invertase 1913 in Berlin untersucht. Deren Verdienst be-
stand vor allem in der Erkenntnis, da zur Dokumentation von Enzymreaktionen ge-
nau standardisierte Bedingungen hinsichtlich Temperatur, pH-Wert und Ionenstrke
eingehalten werden mssen. Im Unterschied zur Steady-State-Annahme gingen diese
frhen Studien von einer Gleichgewichtsbetrachtung aus. Die Einstellung des Gleich-
gewichts zwischen freiem Enzym und Substrat einerseits und dem Enzym-Substrat-
Komplex (Michaelis-Komplex) andererseits erfolge so rasch gegenber dem katalyti-
schen Umsatz, da die Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes alleine von k
1
und k
1
, nicht aber von k
2
abhinge. Nach Gl. (2.16) ist v ein direktes Ma fr [EA]
bzw. [A]
geb
bei Bindungsgleichgewichten. Damit knnte die Geschwindigkeitsglei-
chung analog der Bindungsgleichung (1.23) abgeleitet werden (vgl. Abschnitt 1.3.1)
und erhielte dann die Form:
v =
V[A[
K
d
[A[
=
V[A[
k
1
k
1
[A[
Y (2X19)
bei der anstelle von K
m
die Dissoziationskonstante K
d
steht. Gleichung (2.19) ent-
spricht den realen Verhltnissen weniger als Gl. (2.18), da die katalytische Konstante
k
2
gegenber der Gleichgewichtseinstellung hufig nicht zu vernachlssigen ist und
die Menge von EA tatschlich von Gleichgewichtseinstellung und katalytischem Um-
satz bestimmt wird. Entsprechend weicht auch die durch kinetische Messungen be-
stimmte Konstante K
m
vielfach von der aus Bindungsmessungen erhaltenen Dissozia-
tionskonstanten K
d
ab. Die Steady-State-Annahme ist damit weitergehender und all-
gemeiner gefat. Trotzdem hat sich fr die von Briggs und Haldane entwickelte Be-
ziehung die Bezeichnung Michaelis-Menten-Gleichung erhalten, wie auch K
m
als Mi-
chaelis-Konstante bezeichnet wird.
Aufgrund der weitgehenden Analogie der Michaelis-Menten-Gleichung mit der
allgemeinen Bindungsgleichung (1.23) gelten auch die dort besprochenen Regeln zur
Ermittlung der Konstanten sinngem. Die Sttigungsfunktion [A]
geb
bzw. r ent-
spricht der Reaktionsgeschwindigkeit v, Sttigung ist dort bei n[E]
0
bzw. n, hier bei
A2.2 Steady-State-Kinetik und Michaelis-Menten-Gleichung 59
V erreicht, K
d
wird durch die Michaelis-Konstante K
m
ersetzt. Ein prinzipieller Unter-
schied besteht allerdings im praktischen Vorgehen. Whrend bei Bindungsmessungen
die Konzentration des freien Liganden [A] ermittelt werden mu, wird bei kineti-
schen Messungen an dessen Stelle die Konzentration des zugefgten Substrats
[A]
0
=[A]+[EA] gesetzt, was zwar nicht vllig korrekt ist, da aber fr kinetische
Messungen nur katalytische, d. h. uerst geringe Enzymmengen ntig sind, kann
aufgrund der Vorbedingung [E]
0
[A] die Menge an enzymgebundenem Substrat
vernachlssigt werden.
Die Michaelis-Menten-Gleichung ist durch zwei Konstanten charakterisiert: die
Michaelis-Konstante steht in Bezug zur Dissoziationskonstanten und gibt somit Hin-
weise auf die Affinitt des Substrats, geringe Werte dieser Konstanten sprechen fr
eine hohe Affinitt. Die katalytische Konstante k
cat
gibt die Umsatzgeschwindigkeit
des Enzyms an. Im Gegensatz zur K
m
wird k
cat
nicht unmittelbar, sondern nur als
V=k
cat
/[E]
0
erhalten, d. h. es ist die Kenntnis der molaren Menge des eingesetzten
Enzyms erforderlich. Das Verhltnis k
cat
/K
m
=k
cat
k
1
/(k
1
+k
2
) wird als katalytische Ef-
fizienz bezeichnet. Es hat die Dimension einer Geschwindigkeitskonstanten zweiter
Ordnung (vgl. Gl. (1.17)). Es gilt als Ma der Substratspezifitt, hohe Werte sind ein
Hinweis fr hohe Substratspezifitten.
Aufgrund der zentralen Bedeutung der Michaelis-Menten-Gleichung fr die En-
zymkinetik sind Auswertung und Art der Darstellung der Daten sehr wichtig und
eine umfangreiche Literatur befat sich mit diesem Thema. Hier seien nur die ge-
bruchlichsten Verfahren besprochen.
2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten
2.3.1 Graphische Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung
2.3.1.1 Nicht-lineare Darstellungen
Wie die allgemeine Bindungsgleichung (1.23) hat auch die Michaelis-Menten-Glei-
chung in der direkten Auftragung von v gegen [A] die Form einer rechtwinkligen Hy-
perbel (Abb. 2.4A). Da die Beziehung dieser Gleichung zur Hyperbelfunktion nicht
augenfllig ist, sei sie hier erlutert (vgl. Abb. 2.3). Die allgemeine Hyperbelglei-
chung lautet:
X
2
A
2

Y
2
B
2
= 1 X (2X20)
Fr eine rechtwinklige Hyperbel ist A=B (Abb. 2.3A):
X
2
Y
2
= A
2
X (2X21)
Drehungder Koordinaten umdenWinkel 458: X=X
/
cos aY
/
sina, Y=X
/
sina+Y
/
cos a,
ergibt, unter Bercksichtigung von sin 458 =cos 458 =0,7071 (Abb. 2.3B):
60 2 Enzymkinetik
(X
/
Y
/
)
2
(X
/
Y
/
)
2
= 2 A
2
Y
2X
/
Y
/
= A
2
X
Verschiebung des Achsenkreuzes um die Inkremente a und b: X
/
=X
//
+a; Y
/
=Y
//
b
(Abb. 2.3C):
2(X
//
a)(Y
//
b) = A
2
Y
//
=
A
2
a2 ab bX
//
X
//
a
Y
Wird ab=A
2
/2 gewhlt, dann vereinfacht sich die Gleichung zu
Y
//
=
bX
//
a X
//
X (2X22)
aus der die Analogie zur Michaelis-Menten-Gleichung ersichtlich wird, wenn Y
//
&v,
X
//
&[A], a&K
m
, b&V.
Fr sehr groe bzw. unendliche Substratkonzentrationen (K
m
[A]) kann K
m
in
Gl. (2.18) vernachlssigt werden, sie vereinfacht sich zu v =V, eine Asymptote an die
Kurve fr [A]?? hat den Ordinatenwert V. An der Stelle V/2 ist die Substratkon-
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 61
Abb. 2.3. Transformation einer rechtwinkligen
Hyperbel in die Form der Michaelis-Menten-
Kurve. A) Rechtwinklige Hyperbel, B) Drehung
des Achsenkreuzes um 458, C) Verschiebung
des Achsenkreuzes um die Inkremente a und b.
Die Entsprechung der kinetischen Konstanten ist
angegeben.
zentration zahlenmig gleich der Michaelis-Konstanten, [A] =K
m
(Abb. 2.4A). Auf
diese Weise lassen sich die kinetischen Konstanten aus dem Diagramm gewinnen.
Diese Vorgehensweise ist jedoch nicht ganz unproblematisch. Die Bedingung
[A]?? ist experimentell auch nicht nherungsweise zu erreichen, da das Substrat in
sehr hohen Konzentrationen, wenn berhaupt lslich, vielfach einen negativen Ein-
flu auf die Enzymaktivitt hat (selbst wenn keine spezifische Substrathemmung vor-
liegt). Andererseits verfhrt ein mehrfacher berschu der Substratkonzentration ge-
genber dem K
m
-Wert leicht zur Annahme, Sttigung sei praktisch schon erreicht.
Tabelle 2.1 zeigt, in welcher Weise eine zu niedrig angenommene Sttigung zu Feh-
lern fhren kann und wie sich diese auf die K
m
-Bestimmung bertragen.
Ein weiteres Problem liegt in der Angleichung der Kurve an die Mewerte, die
zwangslufig einer Fehlerstreuung unterliegen. So kann es fr einen gegebenen Da-
tensatz durchaus mehrere scheinbar gleichwertige Mglichkeiten geben, eine hyper-
bole Kurve anzupassen (Abb. 2.5). Dies gilt ganz besonders, wenn zu wenig Mewer-
te vorhanden sind bzw. wenn nicht ber den gesamten Sttigungsbereich gemessen
wurde. Wurden nur geringe Substratkonzentrationen erfat, so wird die Bestimmung
von V (und damit auch zwangslufig von K
m
) unzuverlssig, liegen die Werte dage-
gen im Sttigungsbereich, so wird die K
m
-Bestimmung ungenau. Um die Kurve opti-
mal abzudecken, ist eine gleichmige Verteilung der Substratmengen in einem Be-
62 2 Enzymkinetik
Abb. 2.4. Nicht-lineare und lineare Darstellungsformen der Michaelis-Menten-Gleichung. A) Direkte
Darstellung, B) halblogarithmische Darstellung, C) Eadie-Hofstee-Diagramm, D) doppel-reziproke
Darstellung nach Lineweaver-Burk, E) Hanes-Diagramm. Die Arten der Bestimmung von K
m
und V
sind angegeben.
reich um jeweils eine Zehnerpotenz unter und ber dem K
m
-Wert zu empfehlen, wo-
bei fr eine Kurve zumindest 10 Konzentrationswerte (mglichst durch Mehrfachbe-
stimmung abgesichert) gewhlt werden sollten.
Nicht-lineare Darstellungen haben auch den Nachteil, da Abweichungen vom hy-
perbolen Verlauf, bedingt durch andere Mechanismen, artifizielle Einflsse oder sy-
stematische Fehler, schwer zu erkennen und zu beurteilen sind. Kurvenverlufe, wie
sie bei negativer Kooperativitt oder bei Vorliegen verschiedenartiger Zentren gefun-
den werden, sind einem hyperbolen Kurvenverlauf sehr hnlich. Aber auch andere
Abweichungen, wie sigmoide Verlufe, sind bei schwacher Ausprgung und groer
Fehlerstreuung leicht zu bersehen.
Die Anwendung nicht-linearer Regressionsverfahren schtzt zumindest teilweise
vor den geschilderten Fehlermglichkeiten. Ein einfaches Verfahren zur Anpassung
der Michaelis-Menten-Kurve nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate wurde
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 63
Tab. 2.1. Umsatzgeschwindigkeiten eines Enzyms, ausgedrckt in % der tatschlichen Maximalge-
schwindigkeit V bei x-fachem Substratberschu gegenber K
m
(als 1 angenommen). Die rechte
Spalte zeigt die bei V/2 ermittelten scheinbaren K
m
-Werte, wenn als V anstatt der wahren Maximalge-
schwindigkeit die beim jeweiligen Substratberschu bestimmte Umsatzgeschwindigkeit genommen
wird.
Substratberschu x-fach K
m
Umsatzgeschwindigkeit (% V) K
m
aus Umsatzgeschwindigkeit
2
5
10
20
30
40
50
100
?
66,7
83,3
90,9
95,2
96,8
97,6
98,0
99,0
100
0,50
0,71
0,83
0,91
0,94
0,95
0,96
0,98
1
Abb. 2.5. Unsicherheiten in der Bestimmung der kinetischen Konstanten der Michaelis-Menten-Be-
ziehung bei unzureichender Abdeckung des Mebereichs und starker Fehlerstreuung. In A) ist der
Sttigungsbereich, in B) der niedere Konzentrationsbereich nicht bercksichtigt. Es sind jeweils drei
innerhalb der Fehlerschwankungen liegende Kurven eingezeichnet.
von Cornish-Bowden (1984) beschrieben. Allerdings bedrfen auch diese Verfahren
der kritischen Beurteilung, insbesondere bei der Feststellung von Abweichungen vom
hyperbolen Verlauf. Die Zuverlssigkeit der Anpassung und damit die der berechne-
ten Konstanten bertrifft vielfach die von Linearisierungsverfahren. Die Methode der
direkten Auftragung hat gegenber anderen Darstellungsformen weiterhin den Vor-
teil, da die Mewerte ohne rechnerische Verzerrung dargestellt werden. Insbesonde-
re wird die Fehlerstreuung unverndert wiedergegeben und erlaubt die Einschtzung
der Zuverlssigkeit der Werte.
Eine Variante der direkten Auftragung ist das halblogarithmische Diagramm. Die
logarithmische Auftragung der Substratkonzentrationen auf der Abszisse ermglicht
es, auch bei einem breiteren Konzentrationsumfang alle Werte in einem einzigen Dia-
gramm unterzubringen und dabei den niederen und den hohen Sttigungsbereich glei-
chermaen sichtbar zu machen (Abb. 2.4B). Die hyperbole Kurve bekommt hier eine
S-frmige (sigmoide) Gestalt, hnlich der, die allosterische Enzyme bereits in der di-
rekten Auftragung zeigen. Dies erschwert das Erkennen derartiger Abweichungen.
Ein von Dixon (1965) vorgeschlagenes Verfahren zur Bestimmung der Michaelis-
Konstanten bercksichtigt den in der Enzymkinetik meist vernachlssigten Umstand,
da die angegebene Substratkonzentration tatschlich die Gesamtmenge [A]
0
=
[A]+[EA] und nicht die in der Michaelis-Menten-Gleichung geforderte Konzentration
des freien Substrats [A] ist, von der sie bei hherer Enzymkonzentration bzw. bei
starker Bindung merklich abweichen kann. Dieses Verfahren eignet sich daher auch
zur Auswertung von Bindungsmessungen durch spektroskopische Titrationen (Ab-
schnitt 1.3.2.2), erfordert allerdings die Kenntnis des Sttigungswertes (V), der aus
anderen Verfahren bestimmt werden mu. Durch den Koordinatenursprung wird eine
Tangente an die Sttigungskurve gelegt (Abb. 2.6A). Eine weitere Gerade verbindet
den Koordinatenursprung mit dem Punkt der Kurve an der Stelle v =V/2. Die Schnitt-
punkte beider Geraden mit der Asymptoten V entsprechen den Substratkonzentratio-
nen [A]
0
/
und [A]
0
//
, deren Differenz ergibt K
m
(bzw. K
d
). Trgt man diese Differenz
noch einmal auf der Asymptoten nach links ab, so entspricht der verbleibende Ab-
stand von diesem Punkt zur Ordinate der eingesetzten Enzymmenge [E]
0
. Mit Hilfe
einer Verbindungslinie zwischen diesem Punkt der Asymptoten und dem Koordina-
64 2 Enzymkinetik
Abb. 2.6. Bestimmung der kinetischen Konstanten nach den Verfahren von A) Dixon (1965); B) Kil-
roe-Smith (1966); C) Dixon (1972).
tenursprung ist es mglich, die Verteilung der Komponenten in der Lsung an jedem
Punkt der Sttigungskurve zu ermitteln. Denkt man sich eine horizontale Linie durch
einen beliebigen Punkt der Sttigungskurve, so entspricht die Strecke auf dieser Li-
nie von der Ordinate zu der genannten Verbindungslinie der Menge an EA-Komplex
bei diesem Sttigungsgrad. Der Abstand von hier bis zur Sttigungskurve entspricht
dem freien Substrat [A], whrend der Abstand vom gleichen Punkt bis zum Lot auf
[E]
0
das freie Enzym [E] angibt (vgl. Abb. 2.6A).
Um Unsicherheiten in der Tangentenbildung zu umgehen, hat Kilroe-Smith (1966)
dieses Verfahren modifiziert (Abb. 2.6B). Es werden Verbindungslinien zwischen
dem Koordinatenursprung und den Punkten V/2 bzw. 3V/4 der Sttigungskurve gezo-
gen. K
m
ergibt sich nun aus der Distanz der Schnittpunkte einer Horizontalen fr V/2
mit diesen beiden Verbindungslinien. Verlngert man beide Verbindungslinien bis zur
Asymptoten V, so betrgt die Distanz 2K
m
und eine dritte Verbindungslinie zwischen
den beiden, die durch v =2V/3 geht, teilt diese Distanz in zwei gleiche Abschnitte
von jeweils K
m
. Darauf grndet wiederum das weiter modifizierte Verfahren von Di-
xon (1972). Ursprungsgeraden werden durch die Punkte v =(n1)V/n (fr n=0, 1, 2,
3 usw.) gezeichnet, also V/2, 2V/3, 3V/4, 4V/5, usw., die die Asymptote V in Distan-
zen zu jeweils K
m
schneiden (Abb. 2.6 C). Die Linie fr n=1 ist die im ursprngli-
chen Verfahren bereits verwendete Tangente an den Anfang der Sttigungskurve
(Abb. 2.6A). Wird von hier nach links der Abschnitt fr K
m
noch einmal abgetragen,
so erhlt man die Verbindungslinie fr n=0, von der die Strecke zur Ordinate, wie
bereits oben erwhnt, [E]
0
angibt. Dieses Verfahren eignet sich auch zur Bestimmung
von Hemmkonstanten (s. Abschnitt 2.5.1.2).
Zur Berechnung dieses Verfahrens werden die Konzentrationen von freiem Sub-
strat bzw. Ligand [A] und Enzym [E] ersetzt durch Gesamtmengen abzglich des als
Enzymkomplex gebundenen Anteils. Fr die Dissoziationskonstante K
d
erhlt man
den Ausdruck:
K
d
=
[A[[E[
[EA[
=
([A[
0
[EA[)([E)
0
[EA[)
[EA[
(2X23)
K
d
=
[A[
0
[EA[
1

([E[
0
[EA[) X
Fr die Gleichung der Tangente an die Kurve im Koordinatenursprung kann man da-
von ausgehen, da [A]
0
klein und [EA] gegenber [E]
0
zu vernachlssigen ist:
K
d
=
[A[
0
[EA[
[E[
0
[E[
0
X
Damit ergibt sich fr die Gleichung der Tangente fr enzymkinetische Verhltnisse
unter Bercksichtigung von v =k
cat
[EA] und V=k
cat
[E]
0
, wobei unter Annahme eines
schnellen Gleichgewichts nherungsweise K
m
*K
d
gesetzt wird:
[A[
0
v
=
K
m
V

1
k
cat
X (2X24)
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 65
Die Tangente schneidet die Sttigungsasymptote bei v =V, die Substratkonzentration
an dieser Stelle hat den Wert [A]
0
' =K
m
+V/k
cat
. Bei Halbsttigung v =V/2 ist
[EA] =[E]
0
/2 bzw. [E]
0
[EA] =[E]
0
/2. Gem Gl. (2.23) ergibt sich fr die Substrat-
konzentration [A]
0
//
an dieser Stelle:
K
m
= [A[
//
0

V
2k
cat
= [A[
/
0

V
k
cat
(2X25)
V
k
cat
= 2([A[
/
0
[A[
//
0
)
K
m
= [A[
/
0
2([A[
/
0
[A[
//
0
) = 2[A[
//
0
[A[
/
0
X
Aus Gl. (2.25) folgt weiter:
K
m
[A[
/
0
[E[
0
[E[
0
= [A[
/
0
K
m
X
Aus dieser Beziehung kann schlielich auch k
cat
=V/[E]
0
bzw. der Absorptionskoeffi-
zient fr den EA-Komplex bei spektroskopischen Titrationen ermittelt werden.
Fr die Modifikation nach Kilroe-Smith (1966) wird an der Stelle v =3V/4 die
Konzentration [EA]
#
=v/k=3V/4k eingesetzt:
[E[
0
[EA[
#
=
V
k

3V
4k
=
V
4k
X
Einsetzen dieser Beziehung in Gl. (2.23) unter Bercksichtigung der Substratkonzen-
tration [A]
0
#
an der Stelle v =3V/4 ergibt:
K
m
= [A[
#
0
4k
3V
1

V
4k
=
[A[
#
0
3

V
4k
X
Durch Einsetzen von Gl. (2.25) erhlt man schlielich:
K
m
=
2[A[
#
0
3
[A[
//
0
X
2.3.1.2 Direkt-lineare Diagramme
Eine vllig andere Art der Darstellung von Medaten ist das direkt-lineare Dia-
gramm von Cornish-Bowden und Eisenthal (1974). Durch Umformung wird die Mi-
chaelis-Menten-Gleichung in eine Geradengleichung mit den (gedachten) Variablen V
als Ordinate und K
m
als Abszisse berfhrt:
66 2 Enzymkinetik
V = K
m
v
[A[
v X (2X26)
Die zugehrige Gerade schneidet die Ordinate an der Stelle v und die Abszisse bei
[A]. Trgt man umgekehrt die Werte fr [A] auf der Abszisse (mit negativem Vorzei-
chen), die zugehrigen Werte fr v auf der Ordinate ab und verbindet jedes Wertepaar
mit einer Geraden, dann erhlt man fr mehrere Wertepaare eine Geradenschar mit ei-
nem gemeinsamen Schnittpunkt rechts der Ordinate mit den X- bzw. Y-Koordinaten K
m
und V (Abb. 2.7A). Aufgrund der Fehlerstreuung wird man tatschlich keinen gemein-
samen Schnittpunkt erhalten, vielmehr ergibt sich eine Wolke verschiedener Gerade-
nschnittpunkte. Die Konstanten erhlt man dann aus dem Mittelwert (Median, vgl. Ab-
schnitt 2.11) aller X- bzw. Y-Koordinaten der Einzelschnittpunkte (Abb. 2.7B).
Ein Nachteil besteht darin, da die Schnittpunkte auerhalb des eigentlichen Dia-
gramms liegen und einzelne dieser Schnittpunkte ganz aus dem vorgegebenen Rah-
men ausbrechen knnen, so da ein Diagramm ggf. in mehreren Dimensionen darge-
stellt werden mu. Dies lt sich durch Umwandlung von Gl. (2.26) in die reziproke
Form umgehen (Cornish-Bowden und Eisenthal, 1978):
1
V
=
1
v

K
m
V[A[
Y (2X27)
wobei 1/v auf der Ordinate und [A]/v auf der Abszisse aufgetragen werden
(Abb. 2.7C). Der gemeinsame Geradenschnittpunkt, der nun innerhalb des Dia-
gramms liegt, hat die X- und Y-Koordinaten K
m
/V und 1/V.
Eine dritte Art der Umformung fhrt zur Gleichung:
1
K
m
=
V
K
m
v

1
[A[
X (2X28)
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 67
Abb. 2.7. Direkt-lineares Diagramm. In A) werden die Substratkonzentrationen auf dem negativen
Ast der Abszisse und die Werte von v auf der Ordinate abgetragen und durch Geraden verbunden. In
C) wird [A]/v auf der Abszisse und 1/v auf der Ordinate abgetragen. B) zeigt das gleiche Diagramm
wie A) bei starker Fehlerstreuung.
Durch Auftragung von 1/[A] gegen v/[A] ergibt sich ein gemeinsamer Schnittpunkt mit
den Koordinaten 1/K
m
und V/K
m
(Abb. 2.7D). Allerdings hat dieses, wie auch das vor-
hergehende Diagramm, den Nachteil reziproker Auftragung mit einer Skalenverzerrung.
Die direkt-linearen Darstellungen bentigen zwar keine Regressionsverfahren, las-
sen jedoch Abweichungen vom normalen Verhalten kaum erkennen. Es ergibt sich in
solchen Fllen eine mehr oder minder charakteristische Verzerrung der Schnittpunkts-
wolke. Dies gilt auch fr Analysen von Enzymhemmungen und Mehrsubstrat-Reak-
tionen, die fr den jeweiligen Mechanismus charakteristische Versetzungen der ge-
meinsamen Schnittpunkte bewirken. Doch erschwert auch hier die Vielzahl der durch
die Fehlerstreuung verursachten Einzelschnittpunkte eine genaue Beurteilung (vgl.
Abschnitt 2.5.1.2).
2.3.1.3 Linearisierungsverfahren
Die bei den nicht-linearen Diagrammen angesprochenen Nachteile knnen weitge-
hend durch Linearisierungsverfahren ausgerumt werden. Die Konstanten lassen sich
einfach aus Achsenschnittpunkten bzw. Geradensteigungen ermitteln. Abweichungen
der Mewerte von der Gesetzmigkeit der Michaelis-Menten-Beziehung geben sich
durch charakteristische Abweichungen vom linearen Verlauf zu erkennen und geben
Hinweise fr andere Mechanismen (z. B. Kooperativitt) oder artifizielle Einflsse.
Ein weiterer wichtiger Vorteil von Linearisierungsverfahren ist die Analyse enzymki-
netischer Daten bei Variation von zwei und mehr Liganden z. B. bei Enzymhemmun-
gen oder Mehrsubstrat-Reaktionen, wo aus dem resultierenden Geradenmuster der
vorliegende Mechanismus erkennbar wird. Grundstzlich gilt jedoch, da Auswertungs-
verfahren nur die Informationen aus Daten wiedergeben, die in diesen enthalten sind.
Das sei am Beispiel der Katalase demonstriert, bei der es mit einfachen Memethoden
nicht mglich war, den K
m
-Wert des Substrats H
2
O
2
zu bestimmen, da hohe Substrat-
konzentrationen das Enzym schdigen. In der direkten Auftragung war daher die Stti-
gung nicht zu erreichen und damit auch die Substratkonzentration bei Halbsttigung
nicht bestimmbar. In dem noch zu besprechenden doppelt-reziproken Diagramm lt
sich die Kurve linearisieren und K
m
durch einfache Extrapolation auf die Abszisse er-
halten, das Erreichen des Sttigungsbereiches wre dafr nicht ntig. Tatschlich befin-
den sich die Mewerte jedoch so weit im rechten Bereich des Diagramms, da die er-
haltenen Geraden praktisch auf den Koordinatenursprung extrapolieren und ein eindeu-
tiger Ordinaten- bzw. Abszissenschnittpunkt nicht angegeben werden kann.
Es sind drei einfache Umformungen der Michaelis-Menten-Gleichung in eine Ge-
raden-Gleichung mglich. Diese wurden zuerst von Woolf vorgeschlagen und sind in
dem Buch Allgemeine Chemie der Enzyme von Haldane und Stern (1932) er-
whnt, ohne jedoch besondere Beachtung zu finden. Spter beschrieben andere Autoren
die einzelnen Linearisierungen in ausfhrlichen Publikationen. Entgegen der allgemein
akzeptierten Regel, wonach die Namensgebung dem Erstautor gebhrt, werden diese
Verfahren zumeist nach spteren Autoren benannt. Dies ist zwar nicht zurecht, aber inso-
weit praktikabel, als andernfalls alle drei Darstellungsarten Woolf-Diagramm heien
mssten und eine Unterscheidung nicht mglich wre. Die Situation wird dadurch noch
verwickelter, als gleiche Diagramme unabhngig von mehreren Autoren beschrieben
68 2 Enzymkinetik
wurden, so da fr einzelne Diagramme ganz verschiedene Namenskombinationen exi-
stieren, die teilweise die Urheberschaft von Woolf bercksichtigen (z. B. Scatchard-,
Eadie-, Eadie-Scatchard-, Eadie-Hofstee-, Woolf-Hofstee-Diagramm). Da aber die Um-
formung der Michaelis-Menten- in eine Geradengleichung nicht als besondere mathe-
matische Leistung anzusehen ist, seien hier der Verstndlichkeit wegen die gebruch-
lichsten Bezeichnungen gewhlt. Woolfs Verdienst sei durch diese Anmerkung gewr-
digt.
Das doppel-reziproke bzw. Lineweaver-Burk-Diagramm beruht, wie der Name zum
Ausdruck bringt, auf der reziproken Form der Michaelis-Menten-Gleichung:
1
v
=
1
V

K
m
V

1
[A[
X (2X29)
Die Auftragung der reziproken Umsatzgeschwindigkeit 1/v gegen die reziproke Sub-
stratkonzentration 1/[A] ergibt bei Gltigkeit der Beziehung eine Gerade, die die Or-
dinate bei 1/V, die Abszisse bei 1/K
m
schneidet (Abb. 2.4D). Obwohl das gebruch-
lichste Linearisierungsverfahren der Michaelis-Menten-Gleichung, gilt es als das un-
geeignetste (vgl. Markus et al., 1976). Der wesentliche Nachteil ist die Ungleichver-
teilung der Daten. Die reziproke Auftragung verursacht bei quidistanten Substrat-
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 69
Abb. 2.8. Fehlergrenzen in verschiedenen Darstellungsarten der Michaelis-Menten-Beziehung unter
Annahme eines konstanten absoluten Fehlers. A) Direkte Auftragung, B) doppelt-reziprokes Dia-
gramm, C) Eadie-Hofstee-Diagramm, D) Hanes-Diagramm.
konzentrationen (vgl. Abb. 2.8B) eine Stauchung in Richtung der Koordinaten bzw.
eine Spreizung von diesen weg. Werden die Konzentrationen dagegen so gewhlt,
da sie in diesem Diagramm gleiche Abstnde ergeben, dann decken sie die Stti-
gungskurve nicht optimal ab. Noch gravierender ist, da sich diese Ungleichvertei-
lung ebenso auf die abhngige Variable v und damit auch auf deren Fehlergrenzen
auswirkt. Unter Annahme eines gleichen absoluten Fehlers ber den gesamten Me-
bereich werden die Fehlergrenzen in der doppelt-reziproken Darstellung zur Ordinate
hin komprimiert, nach rechts dagegen stark aufgeweitet. Ein lineares Regressionsver-
fahren erkennt diese Verzerrung nicht und gewichtet die stark streuenden Werte im
rechten Teil des Diagramms ebenso wie die komprimierten Werte nahe der Ordinate.
Bereits eine geringfgige Fehlerabweichung bei geringen Substratkonzentrationen
kann den Verlauf einer einfachen Regressionsgeraden ganz erheblich beeintrchtigen.
Nur durch Einfhrung geeigneter Gewichtungsfaktoren lt sich diese Ungleichver-
teilung ausgleichen (Wilkinson, 1961). Allerdings trgt gerade diese Ungleichvertei-
lung nicht unwesentlich zur hufigen Anwendung dieses Diagramms bei. Die Kom-
primierung der Fehlergrenzen bei hohen Substratkonzentrationen vermittelt den Ein-
druck sehr geringer Fehlerstreuung und lt die Daten hier vertrauensvoller erschei-
nen. Ein tatschlicher Vorteil dieses Diagramms gegenber den anderen Linearisie-
rungsverfahren liegt darin, da die beiden Variablen v und [A] durch die Koordinaten
getrennt dargestellt werden. Auch sind Abweichungen von der Michaelis-Menten-
Gleichung gut zu erkennen und Hemm- und Mehrsubstrat-Mechanismen lassen sich
gut beurteilen.
Die Gleichung fr das Hanes-Diagramms ergibt sich durch Multiplikation der rezi-
proken Michaelis-Menten-Gleichung (2.29) mit [A]:
[A[
v
=
[A[
V

K
m
V
Y (2X30)
bei dem [A]/v gegen [A] aufgetragen wird (Abb. 2.4E und 2.8D). Die Gerade hat die
Steigung 1/V, sie schneidet die Abszisse bei 1/K
m
und die Ordinate bei K
m
/V. Die
Fehlergrenzen werden hier nur unwesentlich verzerrt, so da eine einfache lineare
Regression anwendbar ist. Es erfolgt jedoch keine Trennung der Variablen, die Sub-
stratkonzentration geht in beide Achsen ein.
Multiplikation der Gl. (2.29) mit vV und Umstellung ergibt die dem Eadie-Hof-
stee-Diagramm zugrundeliegende Gleichung:
v = V K
m

v
[A[
X (2X31)
Bei Auftragung von v gegen v/[A] wird V aus dem Ordinatenschnittpunkt und K
m
aus der Steigung erhalten (Abb. 2.4C und 2.8C). Gegenber dem bei Bindungsmes-
sungen gebruchlichen Scatchard-Diagramm sind lediglich die Achsen vertauscht
(s. Abschnitt 1.3.2.1). Neben dem Nachteil fehlender Variablentrennung beobachtet
man auch hier eine Verzerrung der Fehlergrenzen, die jedoch nicht so drastisch wie
beim doppelt-reziproken Diagramm ist. Die Fehlergrenzen weiten sich von der Mitte
des Diagramms her zu niederen und zu hohen Substratkonzentrationen auf.
70 2 Enzymkinetik
2.3.1.4 Graphische Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven
Die bisher beschriebenen Auswertungsverfahren gehen davon aus, da die Umsatzge-
schwindigkeiten v in getrennten Anstzen bei unterschiedlichen Substratkonzentratio-
nen gemessen und die Daten in die Diagramme bertragen werden. Tatschlich aber
werden schon im Verlaufe einer einzigen Enzymreaktion vom Anfangswert [A]
0
bis
zum Ende bzw. Gleichgewicht der Reaktion [A]
?
alle Substratkonzentrationen konti-
nuierlich durchlaufen. Die Registrierung eines solchen Zeitverlauf (z. B. im photome-
trischen Enzymtest) ergibt eine Zeit-Umsatz-Kurve, deren Ordinatenwerte (z. B. ber
die Absorption) die aktuellen Substrat- bzw. Produktkonzentrationen und deren Stei-
gungen die zugehrigen Reaktionsgeschwingigkeiten v =d[P]/dt anzeigen (Abb. 2.1).
Eine einzige Zeit-Umsatz-Kurve enthlt damit die gesamte Information der Michae-
lis-Menten-Kinetik und man mte nur [A]
0
gro genug whlen, um den gesamten
Sttigungsbereich zu durchlaufen. Aus einer einzigen Zeit-Umsatz-Kurve knnen an
beliebig vielen Punkten die [A]- und v-Werte erhalten und in die verschiedenen Dia-
gramme bertragen werden. Neben der unsicheren Tangentenbildung hat diese einfa-
che Methode allerdings den Nachteil, da strende Einflsse, wie die Hemmung des
Enzyms durch das entstehende Produkt und dessen Rckreaktion zum Substrat nicht
leicht erkannt werden und zu falschen Ergebnissen fhren. Balcom und Fitch (1945)
haben dieses Verfahren mittels eines Computerprogrammes so modifiziert, da auch
kompliziertere Mechanismen, wie Produkthemmung, einbezogen werden knnen. Die
Zeit-Umsatz-Kurven werden dabei in gleiche Zeitabschnitte (z. B. 12 s) eingeteilt, an
denen jeweils die Substratkonzentration (z. B. ber Absorption) errechnet wird. Die
zugehrige Geschwindigkeit ergibt sich aus der Steigung einer Verbindungslinie der
beiden benachbarten Punkte.
2.3.1.5 Integrierte Michaelis-Menten-Gleichung
Wie fr die Auswertung hyperboler Sttigungskurven kann auch fr Zeit-Umsatz-Kur-
ven eine Verbesserung durch Linearisierung erreicht werden. Man kann dazu, nach dem
folgenden Verfahren, eine gegebene Mekurve, z. B. den Schreiberausdruck eines Pho-
tometers, punktweise umrechnen und in einem entsprechenden Diagramm darstellen.
Der eigentliche Gewinn der direkten Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven liegt jedoch
in der Mglichkeit der Speicherung der Daten des Megerts durch einen Computer
(online), der nach jeder Messung die Daten unmittelbar auswertet.
Die Michaelis-Menten-Gleichung
v =
d[A[
dt
=
V[A[
K
m
[A[
(2X18)
wird nach Umformung

K
m
[A[
[A[
d[A[ =
K
m
[A[
d[A[ d[A[ = Vdt
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 71
integriert von [A]
0
zur Zeit t =0 bis [A] zur Zeit t:
K
m

[A[
[A[
0
d[A[
[A[

[A[
[A[
0
d[A[ = V

t
0
dt X
Die integrierte Michaelis-Menten-Gleichung lautet dann:
K
m
ln
[A[
0
[A[
[A[
0
[A[ =Vt X (2X33)
In dieser Form wurde sie zuerst von Victor Henri (1902) abgeleitet. Durch weitere
Umformung erhlt man eine Geradengleichung (Walker & Schmidt, 1944; Jennings
& Niemann, 1953):
[A[
0
[A[
t
= V K
m
ln
[A[
0
[A[
t
X (2X34a)
bzw. im Zehnerlogarithmus:
[A[
0
[A[
t
= V K
m
2Y3 log
[A[
0
[A[
t
(2X34b)
Wird anstatt des Substratverbrauchs die Produktbildung gemessen, so kann, unter An-
nahme einer irreversiblen Reaktion, [P] =[A]
0
[A] gesetzt werden. [P]
?
ist die Pro-
duktkonzentration nach Ablauf der Reaktion:
[P[
t
= V K
m
ln
[P[

[P[

[P[
t
Y (2X35a)
[P[
t
= V K
m
2Y3 log
[P[

[P[

[P[
t
X (2X35b)
([A]
0
[A])/t gegen ln([A]
0
/[A])/t bzw. [P]/t gegen ln ([P]
?
/([P]
?
[P]))/t (als ln oder
log) aufgetragen ergibt eine Gerade mit der Steigung K
m
und dem Ordinatenschnitt-
punkt V (Abb. 2.9A). Dies ist die hufigste Art der Darstellung der integrierten Mi-
chaelis-Menten-Gleichung. Daneben gibt es noch zwei weitere Linearisierungsverfah-
ren. 1/K
m
aus dem Abszissenabschnitt und 1/V aus dem Ordinatenschnittpunkt er-
hlt man aus einem Diagramm, dem die Gleichung
72 2 Enzymkinetik
t
[P[
=
2Y3 log
[P[

[P[

[P[
[P[

K
m
V

1
V
(2X36)
zugrundeliegt (Abb. 2.9B). Eine dritte Mglichkeit der Linearisierung basiert auf der
Formel:
t
2Y3 log
[P[

[P[

[P[
=
[P[
V 2Y3 log
[P[

[P[

[P[

K
m
V
(2X37)
mit 1/V als Steigung, K
m
/V als Ordinaten- und K
m
als Abszissenschnittpunkte (Abb.
2.9C).
Wie fr die Auswertungsverfahren der einfachen Michaelis-Menten-Gleichung las-
sen sich auch fr die Darstellungen ihrer integrierten Form komplexere Mechanismen
wie Enzymhemmung und Mehrsubstrat-Reaktionen aus dem Geradenmuster oder aus
Abweichungen vom linearen Verlauf erkennen.
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 73
Abb. 2.9. Lineare Darstellungen der integrierten
Michaelis-Menten-Gleichung (vgl. Text).
2.3.2 Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit
2.3.2.1 Experimentelle Bestimmung
Die oben besprochenen Auswertungsverfahren setzen die Kenntnis der Reaktionsge-
schwindigkeit voraus. Da die Enzymkinetik weitgehend auf dieser Methodik beruht,
seien hier einige prinzipielle Punkte diskutiert. Wie Abb. 2.2 zeigt, lt sich der zeit-
liche Verlauf enzymkatalysierter Reaktionen in drei Bereiche einteilen, eine durch
schnelle kinetische Methoden erfabare Pre-Steady-State-Phase, die Steady-State-
Phase und schlielich der Bereich zunehmender Substraterschpfung. Fr die auf der
Gltigkeit der Steady-State-Beziehung beruhenden enzymkinetischen Messungen ist,
mit Ausnahme der oben geschilderten direkten Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven,
nur der mittlere lineare Bereich von Bedeutung.
Die Erfassung des Steady-State-Bereichs setzt voraus, da Zeit-Umsatz-Kurven
z. B. durch optische Messungen kontinuierlich registriert werden. Bei vielen Enzym-
reaktionen knnen jedoch Substrat- oder Produktvernderung nicht durch ein direktes
Mesignal whrend der Reaktion erfat werden, der Umsatz mu nach dem Abstop-
pen der Enzymreaktion durch nachgeschaltete Messungen, wie Farbreaktionen, Auf-
trennung durch die HPLC-Methode oder radioaktive Markierung bestimmt werden
(gestoppter Test). Durch Abstoppen des Tests zu unterschiedlichen Zeiten lassen sich
zwar Zeit-Umsatz-Kurven punktweise aufnehmen, dies ist aber mhsam, auch ist der
lineare Anfangsbereich bei einer begrenzten Zahl von Zeitwerten nicht immer ein-
deutig auszumachen. Zur Vereinfachung solcher Tests begngt man sich hufig da-
mit, nur jeweils einen einzigen Wert nach einer festgelegten Inkubationszeit zu be-
stimmen (Einpunkt-Messung). Fr enzymkinetische Untersuchungen ist ein solches
Vorgehen vllig unzureichend. Ebenfalls problematisch ist die Kopplung einer schwer
nachweisbaren Enzymreaktion mit einer kontinuierlich mebaren Indikatorreaktion
(gekoppelter Test), z. B. ber eine NADH-abhngige Dehydrogenase, fr die das Pro-
dukt der zu untersuchenden Enzymreaktion als Substrat dient. Allerdings darf die Indi-
katorreaktion selbst niemals geschwindigkeitsbestimmend werden, was bei den groen
Variationsbreiten enzymkinetischer Untersuchungen nicht immer gewhrleistet ist.
Fr enzymkinetische Untersuchungen ist der lineare Steady-State-Bereich aus-
schlaggebend, da die Michaelis-Menten-Gleichung fr d[EA]/dt =0 abgeleitet wurde
und somit nur in diesem Bereich gilt. Je besser die Bedingung [E]
0
[A]
0
erfllt ist,
umso deutlicher wird der lineare Bereich. Umgekehrt ist bei Variation des Substrats
unterhalb des K
m
-Werts der Steady-State-Bereich kurz und oft kaum zu erkennen
(Abb. 2.10A). Da dieser aber sofort beim Start der Reaktion einsetzten sollte, behilft
man sich in solchen Fllen damit, durch Anlegen einer Tangente an die Kurve bei
t =0 die Anfangsgeschwindigkeit zu ermitteln (Tangenten-Verfahren). Dies hat auch
den Vorteil, da Einflsse des Produktes, wie Produkthemmung und Rckreaktion,
zu vernachlssigen sind. Zustzlich zu der Unsicherheit, ob bei nicht-linearem An-
fangsbereich die Steady-State-Beziehung berhaupt gltig ist, ergibt sich auch das
Problem, da zwischen dem Reaktionsstart beim Mischen der Reaktionspartner und
dem Beginn der Registrierung die Reaktion bereits fortgeschritten ist und gar keine
Anfangsgeschwindigkeit mehr vorliegt. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird unter-
schtzt, und zwar umso mehr, je kleiner die anfngliche Substratkonzentration ist.
74 2 Enzymkinetik
Bei der Auswertung solcher Daten knnen statt hyperboler sigmoide Kurvenverlufe
resultieren (Abb. 2.10B).
Es ist in solchen Fllen zu empfehlen, die Enzymmenge zu reduzieren. Dies ver-
bessert einerseits die Steady-State-Bedingungen, andererseits wird der zeitliche Ab-
lauf und damit auch der lineare Bereich gestreckt. Das erfordert, die Empfindlichkeit
der Memethode soweit wie mglich zu steigern. Sind aber alle methodischen Mg-
lichkeiten ausgereizt, dann stehen graphische Verfahren zur Bestimmung der wahren
Anfangsgeschwindigkeit zur Verfgung. Bevor auf diese eingegangen wird, sei noch
auf einen scheinbaren Widerspruch hingewiesen. Die Ableitung der Michaelis-Men-
ten-Gleichung erfolgte ausschlielich unter der Steady-State-Bedingung d[EA]/dt =0,
jedoch unabhngig von der Substratkonzentration, solange [E]
0
[A]
0
gilt. Dies wird
leicht dahingehend miverstanden, da das Enzym aufgrund des groen Substratber-
schusses gesttigt und damit Linearitt auch nur bei Substratsttigung zu erwarten
sei. Es wird dabei bersehen, da Substratberschu nicht zwangslufig Enzymstti-
gung bedeutet, vielmehr ist diese alleine abhngig von der Gleichgewichtskonstanten.
Das sei an einem Zahlenbeispiel demonstriert. Setzt man eine Substratkonzentration
von einem Zehntel des K
m
-Werts ein, z. B. 10
6
M bei K
m
=10
5
M, und eine Enzym-
konzentration von [E]
0
=10
9
M, so betrgt nach K
d
=[A][E]/[EA] die Menge des En-
zym-Substrat-Komplexes [EA] =10
10
M. Trotz eines tausendfachen Substratber-
schusses ist das Enzym nur zu 10% gesttigt.
2.3.2.2 Graphische Verfahren
Eine Verbesserung des Tangenten-Verfahrens wurde von Lee & Wilson (1971) be-
schrieben. Zwei beliebige Punkte der Zeit-Umsatz-Kurve (z. B. 0 und 30% Reaktions-
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 75
Abb. 2.10. Ermittlung der Anfangsgeschwindigkeiten durch die Tangentenmethode. A) Die Kurven
zeigen gemessene Zeit-Umsatz-Kurven (1, 2, 3, . . .), die durchgezogenen Geraden die tatschliche An-
fangsgeschwindigkeit (1', 2', 3' . . .). Der schattierte Bereich ist die Zeit zwischen Mischen (0) und
Start der Reaktion. Die gestrichelten Linien entsprechen den Tangenten an die Zeit-Umsatz-Kurven
am Startpunkt (1'', 2'', 3'' . . .). B) Direkte Auftragung der wahren Anfangsgeschwindigkeiten und den
aus der Tangentenmethode erhaltenen Werte gegen die Substratkonzentration.
umsatz) werden durch eine Gerade verbunden. Deren Steigung entspricht der Reakti-
onsgeschwindigkeit bei der Substratkonzentration des Mittelwerts beider Punkte (hier
15%). Eine Verbesserung stellt das Sekanten-Verfahren von Waley (1981) dar. Auch
hier wird eine Verbindungslinie zwischen zwei Punkten, [A]
1
, t
1
und [A]
2
, t
2
, einer
Zeit-Umsatz-Kurve gezogen (Abb. 2.11A). Deren Steigung ([A]
1
[A]
2
)/(t
1
t
2
) ent-
spricht der Steigung einer Tangente an die Kurve und damit der Geschwindigkeit fr
eine dritte Substratkonzentration [A]
3
mit dem Wert
[A[
3
=
[A[
1
[A[
2
ln
[A[
1
[A[
2
(2X38a)
bzw.
[P[
3
= [A[
0

[P[
2
[P[
1
ln
[A[
0
[P[
1
[A[
0
[P[
2
Y (2X38b)
76 2 Enzymkinetik
Abb. 2.11. Methoden der Bestimmung der wahren Anfangsgeschwindigkeit. A) Sekanten-Verfahren
nach Waley (1981), B) direkt-lineares Diagramm nach Cornish-Bowden (1975), C) Verfahren nach
Boeker (1982), D) Verfahren nach Alberty & Koerber (1957).
wenn die Produktbildung erfat wird. Bei photometrischen Messungen kann die Kon-
zentration an [A]
3
aus den Absorptionswerten A bei den entsprechenden Zeiten be-
stimmt werden, wobei A
0
und A
?
die Absorptionswerte zu Beginn und Ende der Re-
aktion sind:
[A[
3
=
[A[
0
A
0
A

A
1
A
2
ln
A
1
A

A
2
A

X (2X38c)
Mit dem Sekanten-Verfahren kann v auch bei Ein-Punkt-Messungen bestimmt werden,
wobei die Steigung der Verbindungslinie zwischen dem Startpunkt und dem Mepunkt
der Reaktion ermittelt wird. Die Methode setzt die Abwesenheit von Produkthemmung
voraus, doch auch in deren Gegenwart lt sich v durch einfache Modifikation erhalten,
solange diese Hemmung kompetitiv ist, was in der Regel auch zutrifft. In diesem Fall
werden zwei Sekanten gezogen, die eine z. B. von 020%, die andere von 040%. Die
beiden Steigungen entsprechen zwei Geschwindigkeiten v
1
und v
2
, denen, wie oben
dargestellt, zwei Substratkonzentrationen [A]
1
und [A]
2
zugeordnet werden. Die wahre
Anfangsgeschwindigkeit ergibt sich dann aus der Beziehung:
v =
[A[
0
([A[
1
[A[
2
)
[A[
1
[A[
2
1
v
2

1
v
2

[A[
0
[A[
1
v
1

[A[
2
v
2

X (2X39)
Umgekehrt kann aus dem Vergleich der Steigungen beider Sekanten auf eine Pro-
dukthemmung geschlossen werden. Das Verhltnis v/v
/
liegt fr eine ungehemmte
Reaktion zwischen 1 und 1.145, bei einer Produkthemmung liegt es darber (bis ma-
ximal 2,2).
Whrend die bisher beschriebenen Verfahren lediglich die Bestimmung der Um-
satzgeschwindigkeit durch Tangentenbildung objektiver gestalten, ermglicht die auf
der integrierten Michaelis-Menten-Gleichung beruhende Methode von Cornish-Bow-
den (1975) die Ermittlung der wahren Anfangsgeschwindigkeit v
0
bei t =0. Die in
der integrierten Michaelis-Menten-Gleichung (2.33) enthaltenen Konstanten K
m
und
V stimmen mit denen der einfachen Michaelis-Menten-Gleichung (2.18) nur dann
berein, wenn diese ber den gesamten Verlauf der Zeit-Umsatz-Kurve gltig ist,
was nur fr eine irreversibel verlaufende Einsubstratreaktion zutrifft. Bei komplizier-
teren Mechanismen, wie Produkthemmung, Irreversibilitt der Reaktion oder die Be-
teiligung mehrerer Substrate bleiben diese Gren nicht konstant und werden als ap-
parente Konstanten (K
m
app
, V
app
) bezeichnet. Gleichung (2.33) lautet dann unter Be-
trachtung des Produkts:
V
app
=
[P[
t

K
app
m
t
ln
[P[

[P[

[P[
Y (2X40)
wobei [P] die Produktkonzentration zu einer bestimmten Zeit t und [P]
?
diejenige
beim Gleichgewicht der Reaktion ist. In einem Diagramm von V
app
gegen K
m
app
er-
A2.3 Auswertung enzymkinetischer Daten 77
gben sich Geraden mit Ordinaten-Schnittpunkten [P]/t und Abszissen-Schnittpunk-
ten [P]/ln[P]
?
/([P]
?
[P]). Tatschlich wird in umgekehrter Weise vorgegangen. Die
Werte der Achsenschnittpunkte werden aus den Zeit-Umsatz-Kurven ermittelt und
auf den zugehrigen Achsen abgetragen. Dabei kann ohne wesentlichen Verlust an
Genauigkeit der Abszissenwert durch Reihenentwicklung auf [P]
?
+1/2[P] verein-
facht werden. Die einander zugehrigen Achsenabschnitte werden in Form eines di-
rekt-linearen Diagramms durch Geraden verbunden und treffen sich in einem Punkt
rechts der Ordinate (Abb. 2.11B). Die Verbindungsgerade dieses Punktes mit dem
Abszissenwert [P]
?
schneidet die Ordinate bei V
app
[P]
?
/(K
m
app
+[P]
?
), das v
0
der Re-
aktion. Da sich die Steigungen der aus einer Zeit-Umsatz-Kurve entnommenen Ge-
raden meist nicht stark voneinander unterscheiden, ist der gemeinsame Schnittpunkt
oft schwer erkennbar. Er erscheint jedoch deutlicher, wenn die Ordinate zur Abzisse
hin auf einen Winkel zwischen 208 und 308 geneigt wird, was das Ergebnis nicht be-
einflut. Fr eine v
0
-Bestimmung gengen fnf Geraden. Da unter experimentellen
Bedingungen anstatt des erwarteten gemeinsamen Schnittpunkts vielfach eine
Schnittpunktwolke resultiert, kann die Verbindungsgerade mit ausreichender Genauig-
keit durch deren Mitte gelegt werden. Exakt mte eine Verbindungsgerade mit je-
dem Einzelschnittpunkt gezeichnet und der Mittelwert aller Ordinatenschnittpunkte
dieser Linien errechnet werden.
Ebenfalls auf der integrierten Michaelis-Menten-Gleichung beruht das Verfahren
von Boeker (1982), bei dem D[P]/t gegen D[P] aufgetragen wird. D[P] =[P][P]
0
ist
das whrend der Reaktion gebildete Produkt ([P]
0
ist nicht notwendigerweise null).
Das Diagramm ergibt eine lineare Abhngigkeit, wobei v
0
durch Extrapolation auf
D[P] =0 erhalten wird (Abb. 2.11C). Die Kenntnis von [P]
?
ist nicht erforderlich.
Bei dem hnlichen Verfahren von Alberty und Koerber (1957) wird D[P]/t gegen t
aufgetragen und v
0
durch Extrapolation auf t =0 erhalten (Abb. 2.11D).
Auf das generelle Problem der Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven mit der inte-
grierten Michaelis-Menten-Gleichung bei Produkthemmung wird in Abschnitt 2.4.3
eingegangen.
2.4 Reversible Enzymreaktionen
2.4.1 Geschwindigkeitsgleichung fr reversible Enzymreaktionen
Der Ableitung der Michaelis-Menten-Gleichung wurde eine irreversibel verlaufende
Enzymreaktion zugrundegelegt, was auch fr verschiedene Reaktionen, wie Phospha-
tasen, Peptidasen, nherungsweise zutrifft. Die meisten Enzymreaktionen, z. B. Iso-
merasen, Dehydrogenasen oder Transaminasen, streben dagegen einem Gleichge-
wicht zu und knnen sowohl durch Substrat wie Produkt gestartet werden:
A E
k
1
B EA
k
2
B E P X (2X41)
k
1
A
k
2
A
In den Differentialgleichungen fr E und EA ist die Rckreaktion zu bercksichti-
gen, auch ndert sich die Reaktionsgeschwindigkeit v:
78 2 Enzymkinetik
d[E[
dt
= (k
1
k
2
)[EA[ (k
1
[A[k
2
[P[)[E[ Y (2X42)
d[EA[
dt
= (k
1
k
2
)[EA[ (k
1
[A[k
2
[P[)[E[ Y (2X43)
d[P[
dt
= k
2
[EA[ k
2
[E[[P[ = v X (2X44)
Mit Hilfe der Beziehung fr die Gesamtmenge des Enzyms [E]
0
=[E]+[EA] lassen
sich [E] und [EA] aus den Gl. (2.42) und (2.43) berechnen:
[E[ =
(k
1
k
2
)[E[
0
k
1
[A[k
2
[P[(k
1
k
2
)
Y (2X45)
[EA[ =
(k
1
[A[ k
2
[P[)[E[
0
k
1
[A[k
2
[P[(k
1
k
2
)
(2X46)
und in Gl. (2.44) einsetzen. Man erhlt damit die Geschwindigkeitsgleichung in der
Form der Geschwindigkeitskonstanten:
v =
(k
1
k
2
[A[ k
1
k
2
[P[)[E[
0
k
1
[A[k
2
[P[ (k
1
k
2
)
X (2X47)
Da die Geschwindigkeitskonstanten nicht direkt bestimmbar sind, wird Gl. (2.47) in die
Form der kinetischen Konstanten berfhrt. Dazu werden Zhler und Nenner mit (k
1
+k
2
)/k
1
k
2
multipliziert, wobei K
mA
und V
1
Michaelis-Konstante und Maximalgeschwin-
digkeit fr die Hinreaktion, K
mP
und V
2
die Konstanten fr die Rckreaktion sind:
K
mA
=
k
1
k
2
k
1
Y K
mP
=
k
1
k
2
k
2
Y
V
1
= k
2
[E[
0
; V
2
= k
1
[E[
0
;
v = v
1
v
2
=
K
mP
V
1
[A[ K
mA
V
2
[P[
K
mA
K
mP
K
mP
[A[K
mA
[P[
(2X48)
Gleichung (2.48) setzt sich zusammen aus Anteilen der Michaelis-Menten-Gleichung
fr Hin- und Rckreaktion. Fr [P] oder [A] =0 erhlt man die Ausdrcke fr die ge-
trennten Reaktionen:
v
1
=
V
1
[A[
K
mA
[A[
Y v
2
=
V
2
[P[
K
mP
[P[
X (2X18)
Es folgt daraus, da selbst bei Vorliegen einer Rckreaktion die einfache Michaelis-
Menten-Gleichung als gltig angesehen werden kann, solange das Produkt zu vernach-
A2.4 Reversible Enzymreaktionen 79
lssigen ist. Nimmt jedoch whrend der Reaktion die Produktkonzentration sprbar zu,
dann beeinflut die einsetzende Rckreaktion in zunehmendem Mae die Reaktionsge-
schwindigkeit und im Vergleich zur einfachen Michaelis-Menten-Gleichung werden zu
geringe Werte erhalten. Hier zeigt sich einerseits die Universalitt der Michaelis-Men-
ten-Gleichung, die auch fr den Fall einer reversiblen Enzymreaktion anwendbar ist,
andererseits wird ihr Gltigkeitsbereich zeitlich eingeschrnkt. Beim Vorliegen einer
Rckreaktion gilt sie nur im Anfangsbereich der Zeit-Umsatz-Kurve zur Zeit t
0
, womit
die Notwendigkeit unterstrichen wird, Anfangsgeschwindigkeiten zu bestimmen.
Eine weitere Konsequenz von Gl. (2.48) ist, da die Reaktion sowohl von der Sub-
strat- wie der Produktseite her mittels der einfachen Michaelis-Menten-Gleichung
analysiert werden kann. Damit werden alle vier kinetischen Konstanten, K
mA
, K
mP
,
V
1
und V
2
, bestimmbar. Bei deren Kenntnis lassen sich die vier Geschwindigkeits-
konstanten der Reaktion errechnen:
k
1
=
V
1
V
2
K
mA
[E[
0
Y k
1
=
V
2
[E[
0
Y k
2
=
V
1
[E[
0
Y k
2
=
V
1
V
2
K
mP
[E[
0
X
Somit kann ber die Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten von Hin- und Rck-
reaktion eine groe Zahl von Informationen erhalten werden. Ein Problem bei der
Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven ist die sich der anfnglichen Reaktion zuneh-
mend berlagernde Rckreaktion. Die aus der integrierten Michaelis-Menten-Glei-
chung abgeleiteten Linearisierungsverfahren (Gl. (2.34)(2.36)) ergeben keine Ge-
raden mehr. Wird die Integration von Gl. (2.48) jedoch unter Einbeziehung der Rck-
reaktion vorgenommen, so erhlt man wieder eine lineare Beziehung:
[A[
0
[A[
t
=
K
mP
V
1
K
mA
V
2
K
mP
K
mA

K
m
K
mP
K
mP
K
mA
1
(V
1
V
2
)[A[
0
K
mP
V
1
K
mA
V
2

ln

1
[A[
0
[A[
[P[
g

t
(2X49)
([A]
0
[A])/t wird gegen ln(1([A]
0
[A])/[P]
g
)/t aufgetragen, wobei [P]
g
die Produkt-
konzentration beim Erreichen des Gleichgewichts der Reaktion ist. Falls [P]
g
und V
2
nicht bekannt sind, lassen sich K
mA
und V
1
durch Auftragung von ([A]
0
[A])/t gegen
ln([A]
0
/[A])/t nach der Methode von Foster und Niemann (Abschnitt 2.4.3) bei ver-
schiedenen [A]
0
-Werten aus dem Anfangsbereich ([P] =0) erhalten, wie K
mP
und V
2
aus der Rckreaktion. Allerdings unterscheidet sich dann das Verfahren nicht mehr
prinzipiell von der Methode der Bestimmung von Anfangsgeschwindigkeiten bei un-
terschiedlichen Substratkonzentrationen.
2.4.2 Haldane-Beziehung
Bei reversiblen Enzymreaktionen wird, im Gegensatz zu irreversiblen, das Substrat
nur soweit verbraucht, bis ein Gleichgewichtszustand erreicht ist, bei dem sich die
80 2 Enzymkinetik
Umsatzgeschwindigkeiten beider Richtungen kompensieren. Die Geschwindigkeit der
Gesamtreaktion ist v =0. Gleichung (2.47) und (2.48) lassen sich vereinfachen zu:
k
1
k
2
[A[
g
= k
1
k
2
[P[
g
(2X50)
K
mP
V
1
[A[
g
= K
mA
V
2
[P[
g
(2X51)
wobei [A]
g
und [P]
g
die Konzentrationen im Gleichgewicht sind. Die Gleichge-
wichtskonstante der gesamten Reaktion ist:
K
g
=
[E[
g
[P[
g
[E[
g
[A[
g
=
[P[
g
[A[
g
=
k
1
k
2
k
1
k
2
=
K
mP
V
1
K
mA
V
2
=
K
p
K
a
X (2X52)
K
g
ist das Verhltnis der Dissoziationskonstanten des Enzym-Produkt-Komplexes
K
p
=k
2
/k
2
zu der des Enzym-Substrat-Komplexes K
a
=k
1
/k
1
. Diese von J.B.S. Hal-
dane beschriebene Beziehung zwischen den kinetischen Konstanten und den thermo-
dynamischen Gleichgewichtskonstanten zeigt, da Michaelis-Konstanten und Maxi-
malgeschwindigkeiten von Hin- und Rckreaktion nicht unabhngig voneinander
sind. Um eine Reaktion vorzglich in die Richtung des Produkts zu lenken (K
g
1),
mu V
1
V
2
bzw. K
mA
K
mP
sein.
2.4.3 Produkthemmung
Eine weitere Konsequenz der Reversibilitt in Gl. (2.48) ist die Hemmung des En-
zyms durch sein eigenes Produkt. Whrend bei der ursprnglichen Ableitung der Mi-
chaelis-Menten-Gleichung am Beispiel einer irreversiblen Reaktion ein reversibles
Bindungsgleichgewicht nur fr das Substrat angenommen wurde, mu nach dem Re-
aktionsschema (2.41) auch ein solches fr das Produkt bercksichtigt werden. Dies
gilt auch fr den Fall, da die Rckreaktion zu vernachlssigen ist. Somit ist eine
Produkthemmung fr jedes Enzym zu erwarten, allerdings ist sie (bei schwacher Bin-
dung des Produkts) nicht immer deutlich zu erkennen. Im Verlauf einer Reaktion
nimmt die Hemmwirkung durch die Produktbildung kontinuierlich zu. Um die hem-
mende Wirkung des Produkts direkt zu untersuchen, wird dieses beim Start der Reak-
tion in einer bestimmten Konzentration [P] zugegeben. Vernachlssigt man die Rck-
reaktion (V
2
=0), kann Gl. (2.48) vereinfacht werden, wobei aus dem gleichem Grund
die Michaelis-Konstante des Produkts durch dessen Dissoziationskonstante K
P
=k
2
/k
2
ersetzt wird:
v =
K
p
V
1
[A[
K
mA
K
P
[A[K
P
[P[K
mA
=
V
1
[A[
K
mA

1
[P[
K
P

[A[
X (2X53)
In der doppelt-reziproken Form lautet die Gleichung:
A2.4 Reversible Enzymreaktionen 81
1
v
=
1
V
1

K
mA

1
[P[
K
P

V
1
[A[
X (2X54)
Es handelt sich hierbei um eine kompetitive Produkthemmung, d. h. das Produkt kon-
kurriert um die Bindungsstelle des Substrats am aktiven Zentrum des Enzyms. Das in
ein Produkt umgewandelte Substrat verbleibt zunchst an seiner ursprnglichen Bin-
dungsstelle und verhindert dadurch die Anheftung eines neuen Substratmolekls. In
der doppelt-reziproken Darstellung (Abb. 2.12) erhlt man fr verschiedene Produkt-
konzentrationen eine Geradenschar mit einem gemeinsamen Ordinatenschnittpunkt an
der Stelle 1/V und dem Abszissenschnittpunkt 1/K
mA
(1+[P]/K
P
). Bei Kenntnis von
K
mA
(bestimmt in Abwesenheit des Produkts) lt sich K
P
berechnen.
Die hufigste Art der Produkthemmung ist kompetitiv, doch sind andere Arten der
Einwirkung des Produkts auf die Enzymreaktion auch mglich. So kann bei Reaktio-
nen mit mehreren Substraten das aus einem Substrat entstehende Produkt zwar dieses
verdrngen und somit die Reaktion blockieren, es verdrngt aber nicht zwangslufig
auch das Cosubstrat. Bezglich des Cosubstrats ist die Hemmung nicht-kompetitiv. In
seltenen Fllen tritt eine unkompetitive Produkthemmung auf (Abschnitt 2.5.1.8). Die
gleichen Hemmtypen beobachtet man auch mit spezifischen Hemmstoffen des En-
zyms. Sie werden in Abschnitt 2.5.1 ausfhrlich behandelt. Die dort abgeleiteten
Gleichungen und Auswertungsverfahren gelten sinngem, wenn die Hemmstoffkon-
zentration [I] durch [P] und die Hemmkonstante K
i
durch K
P
ersetzt werden. Dies
gilt jedoch nur, solange die Produktkonzentration [P] im Mebereich als konstant an-
gesehen werden kann, obwohl diese genau genommen im Reaktionsverlauf stetig zu-
nimmt. Hierin liegt ein wesentlicher Unterschied zu Hemmstoffen, die whrend der
gesamten Reaktion als konstant angesehen werden knnen. Das macht sich dann be-
sonders bemerkbar, wenn anstelle von Anfangsgeschwindigkeiten mit Hilfe der inte-
grierten Michaelis-Menten-Gleichung vollstndige Zeit-Umsatz-Kurven ausgewertet
werden. Deren Verlauf wird nachhaltig durch die Produkthemmung beeinflut.
82 2 Enzymkinetik
Abb. 2.12. Kompetitive Produkthemmung in der
doppelt-reziproken Darstellung mit Angabe der
Bestimmung der kinetischen Konstanten.
Nach Foster und Niemann (1953) kann die Produkthemmung in der integrierten
Michaelis-Menten-Gleichung bercksichtigt werden:
[A[
0
[A[
t
=
VK
P
K
p
K
A

K
mA
(K
P
[A[
0
)
K
P
K
mA

ln
[A[
0
[A[
t
X (2X55)
In einem Diagramm von ([A]
0
[A])/t gegen ln ([A]
0
/[A])/t werden fr K
mA
<K
P
Ge-
raden mit negativer Steigung erhalten (Abb. 2.13), fr K
mA
>K
P
mit positiver Stei-
gung. Bei K
mA
=K
P
steht die Gerade senkrecht zur Abszisse. Fr verschiedene An-
fangskonzentrationen von [A]
0
ergibt sich in diesem Diagramm eine Geradenschar
mit einem gemeinsamen Ordinatenschnittpunkt an der Stelle V/(1K
mA
/K
P
). Schnitt-
punkte dieser Geraden mit Ursprungsgeraden der Steigung [A]
0
haben die y-Koordi-
nate v
0
, der wahren Anfangsgeschwindigkeit bei t =0. Die Schnittpunkte mehrerer li-
nearisierter Zeit-Umsatz-Kurven mit ihren zugehrigen Ursprungsgeraden liegen ih-
rerseits auf einer Geraden, die einer idealen Zeit-Umsatz-Kurve in Abwesenheit der
Produkthemmung entspricht. Deren Steigung hat den Wert K
m
, der Ordinatenschnitt-
punkt ist V und der Abszissenschnittpunkt V/K
m
. Mit Hilfe dieser Konstanten kann
man aus den Steigungen der einzelnen Zeit-Umsatz-Kurven, die nach Gl. (2.55) den
Wert K
m
(K
P
+[A]
0
)/(K
P
K
m
) haben, K
P
errechnen. Einfacher wird K
P
als Abszissen-
schnittpunkt eines Sekundrdiagramms dieser Steigungen gegen [A]
0
erhalten.
Nicht zu verwechseln ist die Produkt-Hemmung mit der Endprodukt-Hemmung
(engl.: feedback inhibition), einem allgemeinen Regulationsprinzip bei mehrstufigen
Stoffwechselwegen. Das Endprodukt der Kette hemmt die Aktivitt des ersten En-
zyms und schaltet damit die gesamte Reaktionssequenz ab, so da sich Zwischenpro-
dukte nicht anhufen knnen. Durch die zahlreichen Reaktionsschritte der Kette ist
das Endprodukt strukturell so sehr vom Substrat bzw. Produkt des ersten Enzyms
verschieden, da es von dessen aktiven Zentrum nicht mehr erkannt wird. Es wirkt
vielmehr durch die Bindung an ein rumlich getrenntes allosterisches Regulations-
zentren auf das katalytische Zentrum (Abschnitt 1.5.4). Kinetisch ist die Endprodukt-
A2.4 Reversible Enzymreaktionen 83
Abb. 2.13. Auswertungsverfahren der inte-
grierten Michaelis-Menten-Gleichung unter
Bercksichtigung der Produkthemmung nach
Foster und Niemann (1953).
Hemmung wie eine nicht-kompetitive Enzymhemmung (Abschnitt 2.5.1.2) zu behan-
deln. Allerdings ist bei allosterischen Enzymen das sigmoide Sttigungsverhalten zu
bercksichtigen.
2.5 Enzymhemmung
Unter Enzymhemmung versteht man die negative Beeinflussung der Enzymaktivitt
durch spezifisch an definierte (katalytische oder regulatorische) Zentren bindende Li-
ganden Hemmstoffe oder Inhibitoren. Eine Verminderung der Reaktionsgeschwin-
digkeit kann aber auch durch andere Faktoren, wie Temperatur, pH-Wert, Ionenstrke
oder Polaritt des Lsungsmittels, verursacht sein. Solche Beeinflussungen erfolgen
unspezifisch durch Vernderungen der Enzymstruktur ber Oberflcheneffekte,
Wechselwirkungen mit geladenen Gruppen oder Strungen der Hydrathlle, ohne in
gezielter Weise auf das aktive Zentrum einzuwirken. Es zhlen dazu auch Wechsel-
wirkungen mit hydrophoben Verbindungen, Detergentien oder chaotropen Stoffen,
wie Ammoniumsulfat. Einflsse solcher Art fallen nicht unter den Begriff der En-
zymhemmung und sind als Ursache der beobachteten Hemmung auszuschlieen. Das
ist nicht immer offenkundig, da in beiden Fllen die gleiche Wirkung, die Abnahme
der Umsatzgeschwindigkeit, beobachtet wird. Die Zugabe einer vorgekhlten Lsung
eines vermeintlichen Hemmstoffes zum Enzymtest senkt die Temperatur und vermin-
dert damit die Umsatzrate. hnliches gilt fr pH-Verschiebungen bei Zugabe saurer
oder basischer Substanzen, fr Verunreinigungen oder hohe Salzkonzentrationen in
der Lsung des Hemmstoffes. Die Effekte nehmen mit der Menge der zugesetzten
Lsung zu und tuschen somit eine Konzentrationsabhngigkeit vor.
Auch die Art der Bindung eines spezifischen Hemmstoffes ist fr die Behandlung
der Enzymhemmung von Bedeutung. Zumeist bindet der Hemmstoff reversibel und
kann wieder vom Enzym abgelst bzw. verdrngt werden (reversible Hemmung). Be-
stimmte Hemmstoffe binden jedoch derart stark, da sie vom Enzym nicht mehr ab-
zulsen sind (irreversible Hemmung). Dies ist entweder durch kovalente Bindung
verursacht, wie bei Suizid-Substraten, die zunchst den katalytischen Proze nach-
vollziehen, dabei aber mit einer funktionellen Gruppe eine kovalente Bindung einge-
hen und das Enzym blockieren, oder durch extrem starke nicht-kovalente Bindung,
wie bei bergangsanalogen des aktivierten Zustandes oder bei Komplexbindungen.
Reversible und irreversible Enzymhemmungen ergeben verschiedenartige Abhngig-
keiten und werden daher getrennt betrachtet.
2.5.1 Reversible Enzymhemmung
2.5.1.1 Allgemeine Geschwindigkeitsgleichung
Ein Hemmstoff (Inhibitor) I bindet an ein Enzym und beeinflut dessen Reaktionsge-
schwindigkeit. Die Geschwindigkeitskonstante k
2
fr die ungehemmte Reaktion ver-
ndert sich durch die Bindung des Hemmstoffs an den ESI-Komplex zu k
6
:
84 2 Enzymkinetik
(2.56)
Dieser Reaktionsmechanismus enthlt je zwei Dissoziationskonstanten fr das Sub-
strat A und fr den Hemmstoff I:
K
A
=
k
1
k
1
=
[E[[A[
[EA[
Y K
Ai
=
k
5
k
5
=
[EI[[A[
[EAI[
Y
K
ic
=
k
3
k
3
=
[E[[I[
[EI[
Y K
iu
=
k
4
k
4
=
[EA[[I[
[EAI[
X
Aus diesen Ausdrcken erhlt man den Zusammenhang
K
A
K
Ai
=
K
ic
K
iu
Y (2X57)
so da bei Kenntnis von drei Konstanten die vierte berechnet werden kann.
Die Differentialgleichungen fr das freie Enzyme und den Enzym-Substrat-Kom-
plex, unter Annahme der Steady-State-Bedingung, sowie fr die Reaktionsgeschwin-
digkeit v lauten:
d[E[
dt
= (k
1
k
2
)[EA[ (k
1
[A[ k
3
[I[)[E[ k
3
[EI[ = 0 Y (2X58)
d[EA[
dt
= (k
1
k
2
k
4
)[EA[ k
1
[A[[E[ k
4
[EAI[ = 0 Y (2X59)
d[P[
dt
= k
2
[EA[ k
6
[EAI[ = v X (2X60)
Die Ausdrcke fr die Enzym-Hemmstoff-Komplexe werden in der Beziehung fr
die Gesamtmenge des Enzyms durch die Hemmkonstanten ersetzt:
[E[
0
= [E[ [EA[ [EI[ [EAI[ = [E[ [EA[
[E[[I[
K
ic

[EA[[I[
K
iu
X (2X61)
A2.5 Enzymhemmung 85
Damit ergibt sich
[E[ =
[E[
0
[EA[

1
[I[
K
iu

1
[I[
K
ic
X (2X62)
Mit K
ic
=k
3
/k
3
wird in Gl. (2.58) [EI] durch K
ic
ersetzt:
(k
1
[A[ k
3
[I[)[E[(k
1
k
2
)[EA[ k
3
[E[[I[ = 0
k
1
[A[[E[(k
1
k
2
)[EA[ = 0 X
Damit wird aus Gl. (2.62) [E] eliminiert:
(k
1
k
2
)[EA[
k
1
[A[
=
[E[
0
[EA[

1
[I[
K
iu

1
[I[
K
ic
X
Daraus lt sich [EA] ausdrcken, wobei K
m
=(k
1
+k
2
)/k
1
gesetzt wird:
[EA[ =
[E[
0
K
m
[A[

1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu
X
Setzt man diesen Ausdruck in die Geschwindigkeitsgleichung (2.60) ein unter Ver-
wendung von V
1
=k
2
[E]
0
, V
2
=k
6
[E]
0
und ersetzt [EAI] durch K
iu
, so folgt:
v = k
2

k
6
[I[
K
iu

[EA[ X
v =

V
1

V
2
[I[
K
iu

[A[
K
m

1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu

[A[
X (2X63)
Der in der Reaktionsgleichung (2.56) dargestellte und durch die Beziehung (2.63)
formulierte Mechanismus entspricht einer partiell nicht-kompetitiven Hemmung. Ob-
wohl kein sehr hufiger Hemmtyp, wurde seine Gleichung stellvertretend fr die fol-
genden Mechanismen abgeleitet. Die Gleichung reprsentiert den allgemeinen Me-
chanismus einer reversiblen Enzymhemmung. Aus ihr knnen alle Gleichungen fr
spezifische Mechanismen durch Vereinfachungen abgeleitet werden.
Abb. 2.14 gibt einen berblick ber alle wichtigen reversiblen Hemmtypen. Sie
werden in zwei Hauptgruppen unterteilt. Bei partiellen Hemmungen, wie der partiell
86 2 Enzymkinetik
nicht-kompetitiven Hemmung, behlt das Enzym auch nach Bindung des Hemmstof-
fes seine katalytische Aktivitt, allerdings kann diese durch den Hemmstoff beein-
flut sein. Bei den vollstndigen Hemmungen dagegen bildet das Enzym mit dem
Hemmstoff einen inaktiven Dead-End-Komplex, der an der Reaktion nicht mehr teil-
nehmen kann.
2.5.1.2 Nicht-kompetitive Hemmung,
graphische Darstellung von Hemmdaten
Eine vollstndige Hemmung liegt vor, wenn der EAI-Komplex inaktiv ist, damit wird
k
6
bzw. V
2
=0:
(2.64)
A2.5 Enzymhemmung 87
Abb. 2.14. berblick ber die wichtigsten reversiblen Hemm-Mechanismen.
Gl. (2.63) vereinfacht sich zu (V
1
=V):
v =
V[A[
K
m

1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu

[A[
X (2X65)
Die reziproke Form fr das Lineweaver-Burk-Diagramm lautet:
1
v
=
1
[I[
K
iu
V

K
m

1
[I[
K
ic

V[A[
X (2X66)
Umformung der Gleichung fr die Darstellung nach Hanes:
[A[
v
=
[A[

1
[I[
K
iu

V

K
m

1
[I[
K
ic

V
(2X67)
und nach Eadie-Hofstee:
v =
V
1
[I[
K
iu

K
m

1
[I[
K
ic

K
m

1
[I[
K
iu

v
[A[
X (2X68)
Diese allgemeine Form einer vollstndigen Hemmung wird als nicht-kompetitive
Hemmung bezeichnet (bzgl. der Bezeichnungen vgl. Abschnitt 2.5.1.7). Durch den
Einflu des Hemmstoffes wird sowohl die scheinbare Michaelis-Konstante wie die
Maximalgeschwindigkeit verndert. Zur Charakterisierung dieses Hemmtyps werden
Umsatzgeschwindigkeiten mehrerer Mereihen mit variierenden Substratkonzentratio-
nen bestimmt, wobei jede Mereihe eine konstante Menge an Hemmstoff enthlt.
Eine Mereihe wird als Kontrolle und zur K
m
- und V-Bestimmung ohne Hemmstoff
getestet. Substrat- und Hemmstoffkonzentrationen werden im Bereich ihrer Michae-
lis- bzw. Hemmkonstante variiert (jeweils um eine Zehnerpotenz darunter und dar-
ber). Die direkte Auftragung (Abb. 2.15A) ergibt auch in Gegenwart des Hemmstof-
fes hyperbole Kurven, die mit steigender Hemmstoff-Konzentration abflachen und
geringeren Sttigungswerten zustreben. Ein Kriterium dieses Hemmtyps ist, da die
ursprngliche Maximalgeschwindigkeit nicht mehr erreicht wird, allerdings ist das in
der nicht-linearen Auftragung nicht immer eindeutig zuerkennen. Hierin erweisen
sich die linearisierten Darstellungen als berlegen, die auch in Gegenwart des
Hemmstoffes ihre Linearitt behalten. Die verschiedenen Geraden jeder Mereihe
ordnen sich zu Mustern an, die fr Hemmtyp und Linearisierungsverfahren charakte-
ristisch sind. Im doppelt-reziproken Diagramm treffen sich alle Geraden in einem ge-
meinsamen Schnittpunkt links der Ordinate, d. h. sie unterscheiden sich in Steigung
und Ordinatenschnittpunkt entsprechend der Vernderung von scheinbarer Michaelis-
88 2 Enzymkinetik
Konstante und Maximalgeschwindigkeit durch den Hemmstoff (Abb. 2.15B). Aus der
Lage des Schnittpunktes kann das Verhltnis der beiden Hemmkonstanten zueinander
abgelesen werden. Er liegt ber der Abszisse fr K
ic
<K
iu
. In diesem hufig vorkom-
menden Fall behindert das Substrat die Bindung des Hemmstoffes. Damit gilt nach
Gl. (2.57) zwangslufig K
A
<K
Ai
, der Hemmstoff strt auch die Substratbindung. Be-
gnstigen sich dagegen Hemmstoff und Substrat in ihrer Bindung an das Enzym,
A2.5 Enzymhemmung 89
Abb. 2.15. Nicht-kompetitive Hemmung in unterschiedlichen Darstellungsarten. A) Direkte Darstel-
lung, B) doppelt-reziprokes Diagramm, C) Eadie-Hofstee-Diagramm, D) Hanes-Diagramm, E) direkt-
lineares Diagramm, F) Hemm-Diagramm nach Dixon (1953). Die Mglichkeiten der Bestimmung der
kinetischen Konstanten sind angegeben.
d. h. K
ic
>K
iu
und K
A
>K
Ai
, dann liegt der gemeinsame Geradenschnittpunkt unter-
halb der Abszisse. Fr K
ic
=K
iu
und K
A
=K
Ai
findet keinerlei gegenseitige Beeinflus-
sung statt, Bindung von Substrat und Hemmstoff erfolgen vllig unabhngig vonein-
ander. Der Schnittpunkt liegt nun auf der Abszisse. Dieser Sonderfall, bei dem sich
K
m
nicht ndert, wird oft als die eigentliche nicht-kompetitive Hemmung bezeichnet,
im Unterschied zu einer sog. gemischten Hemmung (engl. mixed inhibition). Dabei
wird davon ausgegangen, da bei der Verschiebung des Schnittpunktes von der Ab-
szisse weg nach oben bzw. unten der Hemmtyp zunehmend in eine kompetitive bzw.
unkompetitive Hemmung bergeht. Dieser Begriff ist nicht sehr glcklich, da bezg-
lich des Mechanismus (Gl. (2.64)) zwischen nicht-kompetitiver und ,gemischter
Hemmung kein prinzipieller Unterschied besteht, wohl aber zwischen dieser und der
kompetitiven bzw. unkompetitiven Hemmung (vgl. Abschnitt 2.5.1.3 und 2.5.1.4).
Im Hanes-Diagramm (Abb. 2.15D) entspricht das Geradenmuster dem der dop-
pelt-reziproken Darstellung, nur kehrt sich die Lage der Schnittpunkte ober- bzw. un-
terhalb der Abszisse um. In der Eadie-Hofstee-Darstellung (Abb. 2.15C) liegt der Ge-
radenschnittpunkt fr K
ic
<K
iu
im zweiten, fr K
ic
>K
iu
im vierten Quadranten,
K
ic
=K
iu
ergibt Parallelen.
Die Abweichungen der Geraden bei Anwesenheit eines Hemmstoffes vom Verlauf
der ungehemmten Reaktion dienen nach den Gl. (2.66)(2.68) auch zur Bestimmung
der Hemmkonstanten K
ic
und K
iu
. So geht, wie in Abb. 2.15 dargestellt, im doppelt-
reziproken Diagramm K
ic
in die Steigung und K
iu
in den Ordinatenschnittpunkt ein,
whrend der Abszissenschnittpunkt beide Konstanten enthlt und sich somit weniger
fr die Bestimmung eignet. Da dieses Verfahren zur Berechnung der Konstanten et-
was umstndlich ist, sind Sekundrdiagramme zu empfehlen, die den Vorteil einer
zustzlichen Kontrolle des Hemmtyps aufweisen. Hierbei werden Parameter, die sich
infolge der Hemmung im Primrdiagramm ndern, wie Steigungen und Ordinaten-
schnittpunkte, gegen die zugehrigen Hemmstoffkonzentrationen aufgetragen. Voll-
stndige Hemmungen mit inaktiven Dead-End-Komplexen ergeben lineare Sekundr-
diagramme, partielle Hemmungen dagegen nicht-lineare Abhngigkeiten, so da da-
mit beide Hauptgruppen der reversiblen Hemmung unterschieden werden knnen.
Aus allen drei Linearisierungsverfahren lassen sich Sekundrdiagramme herleiten.
Dies sei hier am Beispiel des doppelt-reziproken Diagramms gezeigt. Die Steigung
St der Geraden ist gem Gl. (2.66)
St =
K
m
V

[I[K
m
K
ic
V
Y (2X69)
der Ordinatenschnittpunkt Or:
Or =
1
V

[I[
K
iu
V
X (2X70)
Bei Auftragung der Steigungen bzw. der Ordinatenschnittpunkte gegen die Hemm-
stoffkonzentration werden Geraden mit den Abszissenschnittpunkten K
ic
bzw. K
iu
erhalten (Abb. 2.16).
90 2 Enzymkinetik
Das direkt-lineare Diagramm ergibt bereits fr die Variation des Substrats eine Ge-
radenschar mit einem gemeinsamen Schnittpunkt. Fr jede Mereihe in Gegenwart
des Hemmstoffes wird eine weitere Geradenschar mit einem gemeinsamen Schnitt-
punkt erhalten, der sich in einer fr den Hemmtyp charakteristischen Weise ver-
schiebt, so bei der nicht-kompetitiven Hemmung schrg nach unten (Abb. 2.15E).
Speziell fr die Darstellung von Hemmdaten hat Dixon (1953) ein Diagramm vor-
geschlagen, bei dem K
ic
direkt aus der x-Koordinate des gemeinsamen Gerade-
nschnittpunkts abgelesen werden kann, gem der Umformung von Gl. (2.66):
1
v
=
1
V
1
K
m
[A[

[I[
V
1
K
iu

K
m
K
ic
[A[

Y (2X71)
woraus eine lineare Abhngigkeit 1/v von [I] resultiert. Das experimentelle Vorgehen
ist umgekehrt wie fr die anderen Diagramme. Innerhalb einer Mereihe wird, bei je-
weils konstant gehaltener Substratkonzentration, die Hemmstoffmenge verndert. Die
gemeinsamen Geradenschnittpunkte liegen, wie im Lineweaver-Burk-Diagramm nach
dem Verhltnis der Hemmkonstanten im 2. oder 3. Quadranten bzw. auf der Abszisse
(Abb. 2.15F). Im Gegensatz zu den anderen Diagrammen wird hier direkt die Abhn-
gigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom Hemmstoff dargestellt. Wie bereits bei
den Sekundrdiagrammen ergibt sich Linearitt nur fr vollstndige reversible
Hemmtypen, partielle Mechanismen zeigen gekrmmte Kurven. Das Diagramm hat
jedoch den Nachteil, da nicht-kompetitive (hier nur Fall K
ic
<K
iu
) und kompetitive
Hemmung bereinstimmend einen Geradenschnittpunkt im zweiten Quadranten ha-
ben und somit diese hufigsten Hemmtypen hier nicht zu unterscheiden sind.
Ein weiteres, ebenfalls von Dixon (1972) entwickeltes, auch zur K
m
-Bestimmung
geeignetes, Verfahren bentigt nur die Abhngigkeit der Umsatzgeschwindigkeit des
Enzyms von der Hemmstoffkonzentration bei einer einzigen (sttigenden) Substratmen-
ge. Allerdings wird hier die Kenntnis des vorliegenden Hemmtyps vorausgesetzt. V
/
sei
die Umsatzgeschwindigkeit der ungehemmten Reaktion bei [I] =0 (nicht identisch mit
der Maximalgeschwindigkeit V bei unendlicher Substratkonzentration), die in Gegen-
A2.5 Enzymhemmung 91
Abb. 2.16. Sekundrauftragungen der Steigungen (A) und Ordinatenschnittpunkte (B) aus einem dop-
pelt-reziproken Diagramm fr eine nicht-kompetitive Hemmung.
wart des Hemmstoffes hyperbol abfllt und (unter Voraussetzung vollstndiger Hem-
mung) gegen die Basislinie luft (Abb. 2.17A). Es werden nun Verbindungslinien zwi-
schen V
/
und den Kurvenpunkten v
/
=V
/
(n1)/n (fr n=0, 1, 2, 3 usw., d. h. V
/
/2, 2V
/
/3,
3V
/
/4, 4V
/
/5 usw.) gezogen. Diese schneiden die Basislinie in gleichen Abstnden, die
bei nicht-kompetitiver Hemmung den Wert K
ic
(bezogen auf den Konzentrationsma-
stab der Abszisse) haben. Die Linie fr n=1 entspricht der Ursprungstangente an die
Kurve. Wird von deren Schnittpunkt nach links noch einmal die Distanz fr K
ic
abge-
tragen, so erhlt man die Linie fr n=0. Die Strecke von hier zur Ordinate ([I] =0) ent-
spricht schlielich der eingesetzten Enzymkonzentration. Bei der kompetitiven Hem-
mung sind die Abstnde der Schnittpunkte der Verbindungslinien mit der Basislinie ab-
hngig von der Substratkonzentration. In diesem Falle ist der Versuch bei verschiedenen
Substratkonzentrationen durchzufhren. In einer Auftragung der Distanzen gegen die
Substratmengen ergibt sich eine Gerade, die die Ordinate ([A] =0) an der Stelle K
ic
und die Abszisse bei K
m
schneidet (Abb. 2.17B).
Die Mechanismen der Enzymhemmung lassen sich auch mit Hilfe der integrierten
Michaelis-Menten-Gleichung analysieren. Fr die nicht-kompetitive Hemmung ergibt
die Integration der Gl. (2.65)
K
m

1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu
ln
[A[
0
[A[
[A[
0
[A[ =
Vt
1
[I[
K
iu
Y (2X72)
die in die drei linearen Formen von Abschnitt 2.3.1.5 berfhrt werden kann. Hier
sei nur eine Form dargestellt:
[A[
0
[A[
t
=
V
1
[I[
K
iu

K
m

1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu

ln
[A[
0
[A[
t
X (2X73)
92 2 Enzymkinetik
Abb. 2.17. Graphisches Verfahren (A) zur Bestimmung von Hemm- und Michaelis-Konstanten nach
Dixon (1972). B) Sekundrauftragung der apparenten Konstanten K' gegen die Substratkonzentration.
Unterschiedliche Hemmstoffkonzentrationen ergeben Geradenscharen mit einem ge-
meinsamen Schnittpunkt, aus dessen Lage auch hier das Verhltnis der Hemmkonstan-
ten abgelesen werden kann: im zweiten Quadranten fr K
ic
<K
iu
(Abb. 2.18A), im vier-
ten Quatranten fr K
ic
>K
iu
(Abb. 2.18C) und Parallelen fr K
ic
=K
iu
(Abb. 2.18B). Wie
bei den anderen Linearisierungsverfahren knnen die Hemmkonstanten zweckmig
ber Sekundrauftragungen erhalten werden (Abb. 2.18D und E).
Die nicht-kompetitive Hemmung ist fr die Regulation des Zellstoffwechsels der
wichtigste Hemmtyp, da hier die Beeinflussung der Aktivitt durch Metaboliten ohne
direkte Substratanalogie mglich ist, wie bei der Endprodukt-Hemmung und bei allo-
sterischen Enzymen (Abschnitt 1.5.4). Bei diesen Enzymen zeigen sich oft aufgrund
von berlagerungen mit kooperativen Effekten nicht-hyperbole Sttigungskurven, die
sich durch einfache Verfahren linearisieren lassen. In diesen Fllen kann der nicht-
kompetitive Mechanismus durch Extrapolation auf unendliche Substratkonzentration
erkannt werden, wo fr unterschiedliche Hemmstoffmengen verminderte Maximalge-
schwindigkeiten erscheinen. Hufig tritt nicht-kompetitive Hemmung auch in Form
einer Produkthemmung bei Mehrsubstratreaktionen auf, wenn im Laufe des Substra-
tumsatzes Produkte mit zunehmender Konzentration am aktiven Zentrum gebunden
bleiben und dieses blockieren. Das Produkt verhindert einerseits die Anheftung desje-
nigen Substrats, aus dem es entstanden ist (kompetitive Produkthemmung, Abschnitt
2.4.3), andererseits verhindert es damit auch die Wirksamkeit des Cosubstrats, ob-
A2.5 Enzymhemmung 93
Abb. 2.18. Nicht-kompetitive Hemmung in linearisierten Darstellungen der integrierten Michaelis-
Menten-Gleichung. A) K
ic
<K
iu
, B) K
ic
= K
iu
, C) K
ic
>K
iu
. D) Sekundrauftragung der reziproken Or-
dinatenschnittpunkte und E) der reziproken Abszissenschnittpunkte gegen die Hemmstoffkonzentration.
wohl es dieses selbst nicht verdrngt. Bezglich des Cosubstrats verhlt sich das Pro-
dukt zumeist, aber nicht zwangslufig, als nicht-kompetitiver Hemmstoff. Entspre-
chend fungieren auch inaktive Verbindungen des einen Substrats als nicht-kompetiti-
ve Hemmstoffe fr das Cosubstrat.
2.5.1.3 Kompetitive Hemmung
Bei diesem bereits mehrfach erwhnten Hemmtyp konkurriert der Hemmstoff, zumeist
aufgrund enger Strukturanalogie, mit dem Enzymsubstrat um dessen Bindungsstelle am
aktiven Zentrum des Enzyms (Kompetition). Es kann entweder nur Substrat oder
Hemmstoff gebunden werden, eine gleichzeitige Bindung beider ist ausgeschlossen:
(2.74)
Die Geschwindigkeitsgleichung (2.65) der nicht-kompetitiven Hemmung vereinfacht
sich durch den Wegfall von K
iu
(d. h. K
iu
??[I]/K
iu
?0), es ist nur noch eine
Hemmkonstante zu bercksichtigen:
v =
V[A[
K
m

1
[I[
K
ic

[A[
X (2X75)
Linearisierung nach Lineweaver-Burk:
1
v
=
1
V

K
m

1
[I[
K
ic

V[A[
Y (2X76)
nach Hanes:
[A[
v
=
[A[
V

K
m

1
[I[
K
ic

V
Y (2X77)
nach Eadie-Hofstee:
v = V K
m
1
[I[
K
ic

v
[A[
(2X78)
94 2 Enzymkinetik
und nach Dixon:
1
v
=
1
V
1
K
m
[A[

[I[K
m
VK
ic
[A[
X (2X79)
V wird bei dieser Hemmung nicht verndert, da das Substrat bei sehr groem ber-
schu ([A] ??) den Hemmstoff vollstndig verdrngt (wie umgekehrt auch groe
Hemmstoffmengen das Substrat verdrngen). Diese Eigenschaft ist indikativ fr die-
sen Hemmtyp und zeigt sich in der doppelt-reziproken Darstellung an einem gemein-
samen Ordinatenschnittpunkt aller Geraden bei 1/V (Abb. 2.19B). Entsprechend stre-
ben in der direkten Auftragung die Hyperbeln einem gemeinsamen Sttigungsniveau
zu. Durch die Hemmung wird lediglich die scheinbare Michaelis-Konstante beein-
flut, daher ndern sich in den linearisierten Darstellungen nur die Parameter, die K
m
enthalten, wie die Steigungen im Lineweaver-Burk-Diagramm. So erhlt man auch
nur ein Sekundrdiagramm zur Bestimmung von K
ic
. Diese fr die kompetitive Hem-
mung charakteristische Bindungskonstante wird auch als kompetitive Hemmkonstante
bezeichnet. In der Dixon-Darstellung schneiden sich die Geraden, wie bei der nicht-
kompetitiven Hemmung, in einem gemeinsamen Punkt im zweiten Quadraten mit
K
ic
als x-Koordinate (Abb. 2.19F). Im direkt-linearen Diagramm bewegt sich der ge-
meinsame Geradenschnittpunkt parallel zur Abszisse nach rechts (Abb. 2.19E).
Die integrierte Michaelis-Menten-Gleichung fr den Fall einer kompetitiven Hem-
mung ergibt sich aus Gl. (2.72) fr die nicht-kompetitive Hemmung unter Vernach-
lssigung der Glieder von K
iu
:
K
m
1
[I[
K
ic

ln
[A[
0
[A[
[A[
0
[A[ = Vt Y (2X80)
in Form einer Geradengleichung:
[A[
0
[A[
t
= V K
m
1
[I[
K
ic

ln
[A[
0
[A[
t
X (2X81)
Die Geraden besitzen einen gemeinsamen Ordinatenschnittpunkt bei V. Ein Sekundr-
diagramm der Steigung bzw. der reziproken Abszissenschnittpunkte gegen die
Hemmstoffkonzentration ergibt K
ic
aus dem Abszissenschnittpunkt.
Die kompetitive Hemmung ist besonders fr Untersuchungen zur Enzymspezifitt
durch Substratanaloga von Bedeutung. Kompetitive Hemmstoffe (Antagonisten) dienen
unter anderem auch in der Therapie der gezielten Blockierung bestimmter Enzymreak-
tionen. Als natrliches Regulationsprinzip erscheint dieser Hemmtyp zumeist in Form
der Produkthemmung (Abschnitt 2.4.3). Produktanhufung im Verlauf einer Reaktion
verursacht zunehmende Hemmung des Enzyms, so da auch bei Substratberschu Pro-
dukt nur in begrenzten Mengen entsteht und sich in der Zelle nicht akkumuliert.
Obwohl bei kompetitiver Hemmung in der Regel von einer Strukturanalogie zwi-
schen Substrat und Hemmstoff ausgegangen wird, findet man diesen Hemmtyp auch
bei sehr verschiedenartigen Verbindungen. So konkurrieren Cibacron-Farbstoffe um
A2.5 Enzymhemmung 95
die NAD-Bindungsstelle bei Dehydrogenasen, worauf das Prinzip der Affinittschro-
matographie mit diesen Farbstoffen beruht. Umgekehrt ist auch ein kompetitives
Hemmmuster in Diagrammen kein zwingender Beweis einer Kompetition. So wird
bei der Alkoholdehydrogenase fr o-Phenanthrolin eine kompetitive Hemmung be-
zglich NAD gefunden, tatschlich beruht die Hemmwirkung aber auf der Komple-
xierung von aktiven Zinkionen (Boiwe and Branden, 1977). Auch die auf einem
ganz anderen Mechanismus beruhende partiell-kompetitive Hemmung zeigt ein hnli-
ches Geradenmuster (Abschnitt 2.5.1.7).
96 2 Enzymkinetik
Abb. 2.19. Kompetitive Hemmung in unterschiedlichen Darstellungsarten. A) direkte Darstellung, B)
doppelt-reziprokes Diagramm, C) Eadie-Hofstee-Diagramm, D) Hanes-Diagramm, E) direkt-lineares
Diagramm, F) Hemm-Diagramm nach Dixon (1953). Die Bestimmung der kinetischen Konstanten
aus diesen Diagrammen ist angegeben.
2.5.1.4 Unkompetitive Hemmung
Bei diesem seltenen Hemmtyp bindet der Hemmstoff ausschlielich an den Enzym-
Substrat-Komplex. Ein solcher Mechanismus liegt dann vor, wenn die Bindungsstelle
fr den Hemmstoff erst in Wechselwirkung mit dem Substrat gebildet wird:
(2.82)
Die Gleichungen folgen aus denjenigen fr die nicht-kompetitive Hemmung (Gl.
(2.65)) unter Vernachlssigung von K
ic
:
v =
V[A[
K
m
1
[I[
K
iu

[A[
X (2X83)
Gleichung nach Lineweaver-Burk:
1
v
=
1
[I[
K
iu
V

K
m
V[A[
Y (2X84)
Gleichung nach Hanes:
[A[
v
=
[A[ 1
[I[
K
iu

V

K
m
V
Y (2X85)
Gleichung nach Eadie-Hofstee:
v =
V
1
[I[
K
iu

K
m
1
[I[
K
iu

v
[A[
(2X86)
und nach Dixon:
1
v
=
1
V
1
K
m
[A[

[I[
VK
iu
X (2X87)
Bei dieser Hemmung ndert sich die scheinbare Maximalgeschwindigkeit, K
m
bleibt
unverndert. In der direkten Darstellung ist die Steilheit des Anstiegs der Hyperbeln
A2.5 Enzymhemmung 97
bei geringen Substratkonzentrationen in Abwesenheit und in Gegenwart des Hemm-
stoffes gleich, bei hheren Konzentrationen streben die Kurven jedoch zu unter-
schiedlichen Sttigungswerten. Doppelt-reziprokes Diagramm und Dixondarstellung
ergeben Parallelen (Abb. 2.20B und F). Die unkompetitive Hemmkonstante K
iu
wird
aus dem Sekundrdiagramm der Ordinatenabschnitte erhalten. Im direkt-linearen Dia-
gramm streben die Schnittpunkte senkrecht nach unten (Abb. 2.20E). Die integrierte
Michaelis-Menten-Gleichung fr diese Hemmung lautet:
98 2 Enzymkinetik
Abb. 2.20. Unkompetitive Hemmung in unterschiedlichen Darstellungsarten. A) Direkte Darstellung,
B) doppelt-reziprokes Diagramm, C) Eadie-Hofstee-Diagramm, D) Hanes-Diagramm, E) direkt-linea-
res Diagramm, F) Hemm-Diagramm nach Dixon (1953). Die Bestimmung der kinetischen Konstanten
aus diesen Diagrammen ist angegeben.
K
m
1
[I[
K
iu

ln
[A[
0
[A[
[A[
0
[A[ =
Vt
1
[I[
K
iu

(2X88)
und in der Linearisierung:
[A[
0
[A[
t
=
V
1
[I[
K
iu

K
m
ln
[A[
0
[A[
1
[I[
K
iu

t
X (2X89)
Es wird ein gemeinsamer Abszissenschnittpunkt erhalten. Ein Sekundrdiagramm der
reziproken Ordinatenabschnitte gegen die Hemmstoffkonzentrationen ergibt K
iu
als
Abszissenabschnitt.
2.5.1.5 Partielle Hemm-Mechanismen,
partiell nicht-kompetitive Hemmung
Reaktionsschema 2.56 und Geschwindigkeitsgleichung 2.63 fr diesen Hemmtyp
wurden bereits stellvertretend fr alle reversiblen Enzymhemmungen gezeigt (Ab-
schnitt 2.5.1.1). Die doppelt-reziproke Form lautet:
1
v
=
K
m
1
[I[
K
ic

V
1

V
2
[I[
K
iu

[A[

1
[I[
K
iu
V
1

V
2
[I[
K
iu
Y (2X90)
nach Hanes:
[A[
v
=
K
m
1
[I[
K
ic

V
1

V
2
[I[
K
iu

1
[I[
K
iu

[A[
V
1

V
2
[I[
K
iu
Y (2X91)
nach Eadie-Hofstee:
v =
V
1

V
2
[I[
K
iu
1
[I[
K
iu

K
m
1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu


v
[A[
X (2X92)
Auch die partiellen Hemmungen zeigen in allen drei Darstellungsarten lineare Ab-
hngigkeiten und die relative Lage der Geraden gleicht vielfach der der entsprechen-
A2.5 Enzymhemmung 99
den vollstndigen Hemmtypen. Allerdings sind durch die zustzliche Umsatzrate k
6
fr den EAI-Komplex vielfltigere Variationsmglichkeiten und damit weitere Kur-
venmuster mglich, was die Erkennung und Beurteilung dieses Hemmtyps erschwert.
Abbildung 2.21 zeigt einige Kombinationen. Auffallend ist auch die mgliche Lage
des gemeinsamen Schnittpunkts im doppelt-reziproken Diagramm innerhalb des er-
sten Quadranten (Abb. 2.21B). Charakteristisch fr partielle Hemmungen ist, da alle
Auftragungen in Abhngigkeit von der Hemmstoffkonzentration, also Sekundr- und
100 2 Enzymkinetik
Abb. 2.21. Partiell nicht-kompetitive Hemmung in der doppelt-reziproken Darstellung (AD) und im
Dixon-Diagramm (E, F) in verschiedenen Kombinationen von Hemmkonstanten und Maximalge-
schwindigkeiten. Die Einfgungen zeigen Sekundrdiagramme von Steigungen und Ordinatenschnitt-
punkten gegen die Hemmstoffkonzentrationen.
Dixon-Diagramme, keine Geraden ergeben (Abb. 2.21E, F und Einfgungen in AD).
Eine weitere Eigenheit partieller Hemm-Mechanismen besteht darin, da sie auch Ak-
tivierungen beschreiben knnen und zwar auf zwei verschiedenartige Weisen. Fr
k
6
>k
2
ist der EAI-Komplex enzymatisch aktiver als der EA-Komplex. Fr
K
ic
>K
iu
&K
A
>K
Ai
verlagert sich das Gleichgewicht von den inaktiven E- und EI-
Formen zu den aktiven EA- und EAI-Komplexen.
2.5.1.6 Partiell unkompetitive Hemmung
Dieser Hemmtyp liegt vor, wenn bei der unkompetitiven Hemmung der ternre EAI-
Komplex noch aktiv ist:
(2.93)
Die Geschwindigkeitsgleichung fr diesen Hemmtyp lautet:
v =
V
1

V
2
[I[
K
iu

[A[
K
m

1 [I[
K
iu

[A[
Y (2X94)
in doppelt-reziproker Form:
1
v
=
K
m
V
1

V
2
[I[
K
iu

[A[

1
[I[
K
iu
V
1

V
2
[I[
K
iu
Y (2X95)
nach Hanes:
[A[
v
=
K
m
V
1

V
2
[I[
K
iu

1
[I[
K
iu

[A[
V
1

V
2
[I[
K
iu
Y (2X96)
A2.5 Enzymhemmung 101
nach Eadie-Hofstee:
v =
V
1

V
2
[I[
K
iu
1
[I[
K
iu

K
m
1
[I[
K
iu

v
[A[
X (2X97)
Die graphischen Darstellungen entsprechen denen der vollstndig unkompetitiven
Hemmung, jedoch mit nicht-linearen Dixon- und Sekundr-Diagrammen
(Abb. 2.22A, C) und der Mglichkeit einer Enzymaktivierung durch den Hemmstoff
(Abb. 2.22B, D).
2.5.1.7 Partiell kompetitive Hemmung
Whrend unkompetitive und nicht-kompetitive Hemmungen als vollstndige und par-
tiellen Hemmtypen auftreten knnen, sollte das fr die kompetitive Hemmung nicht
102 2 Enzymkinetik
Abb. 2.22. Partiell unkompetitive Hemmung in der doppelt-reziproken Darstellung (A, B) und im Di-
xon-Diagramm (C, D) in verschiedenen Kombinationen von Maximalgeschwindigkeiten. Die Einf-
gungen zeigen Sekundrdiagramme von Steigungen und Ordinatenschnittpunkten gegen die Hemm-
stoffkonzentrationen.
gelten, da ein aktiver EAI-Komplex ausgeschlossen ist. Die Entsprechung liegt hier
nicht jedoch im Mechanismus, sondern in vergleichbaren Kurvenmustern in den ver-
schiedenen Diagrammen mit der kompetitiven Hemmung. Dixon- und Sekundrdia-
gramme sind jedoch wie bei den anderen partiellen Hemmungen gekrmmt
(Abb. 2.23), woran dieser Mechanismus einfach von einer echten kompetitiven Hem-
mung zu unterscheiden ist. Es handelt sich bei diesem Hemmtyp um einen Sonder-
fall der partiell nicht-kompetitiven Hemmung, bei dem der Hemmstoff die Umsatzra-
te des Enzyms nicht beeinflut, d. h. k
2
=k
6
:
(2.98)
A2.5 Enzymhemmung 103
Abb. 2.23. Partiell kompetitive Hemmung in der doppelt-reziproken Darstellung (A, B) und im Di-
xon-Diagramm (C, D) in verschiedenen Kombinationen von Hemmkonstanten. Die Einfgungen zei-
gen Sekundrdiagramme von Steigungen gegen die Hemmstoffkonzentrationen.
Die Geschwindigkeitsgleichung fr diesen Hemmtyp lautet:
v =
V[A[
K
m

1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu

[A[
Y (2X99)
nach Lineweaver-Burk:
1
v
=
1
V

K
m
1
[I[
K
ic

V 1
[I[
K
iu


1
[A[
Y (2X100)
nach Hanes:
[A[
v
=
[A[
V

K
m
1
[I[
K
ic

V 1
[I[
K
iu

Y (2X101)
und nach Eadie-Hofstee:
v = V
K
m
1
[I[
K
ic

1
[I[
K
iu


v
[A[
X (2X102)
Es ist auffallend, da alle bisher besprochenen Hemmtypen den Begriff kompetitiv
enthalten, obwohl er nur fr eine einzige dieser Hemmungen zutrifft. Ursprnglich
wurden die Hemmtypen nach den Geradenmustern in den linearisierten Darstellun-
gen, z. B. dem doppelt-reziproken Diagramm, eingeteilt. Demnach wird zwischen ei-
ner kompetitiven (bzw. partiell kompetitiven) Hemmung mit Geradenschnittpunkt auf
der Ordinate und einer nicht-kompetitiven Hemmung mit Geradenschnittpunkt auf
der Abszisse unterschieden. Liegt der Schnittpunkt dazwischen, sei die Hemmung
gemischt (engl.: mixed inhibition), verlaufen die Geraden parallel, sei sie unkompe-
titiv. Wie wenig sich diese Bezeichnungen am vorliegenden Mechanismus orientie-
ren, wird daran ersichtlich, da gemischte Hemmung kein einheitlicher Begriff ist.
Fr den Fall K
ic
<K
iu
lge eine Mischung zwischen kompetitiver und nicht-kompetiti-
ver, fr K
ic
>K
iu
eine solche zwischen unkompetitiver und nicht-kompetitiver Hem-
mung vor. Auch ist die partiell kompetitive Hemmung keinesfalls kompetitiv.
104 2 Enzymkinetik
2.5.1.8 Nicht- und unkompetitive Produkthemmung
In Abschnitt 2.4.3 wurde bereits die aus der Reversibilitt einer Enzymreaktion resul-
tierende Produkthemmung behandelt, die einem kompetitiven Mechanismus gehorcht.
Vor allem bei Mehrsubstratreaktionen kann ein Produkt auch als nicht- oder unkom-
petitiver Hemmstoff wirken. In den Geschwindigkeitsgleichungen der entsprechenden
Hemmungen sind die Ausdrcke fr [I] durch [P] zu ersetzen, wobei eine Rckreak-
tion auszuschlieen ist. Es werden dem Typ der Hemmung entsprechende Gerade-
nmuster erhalten. Die Hemmkonstanten haben die Bedeutung von Produktbindungs-
konstanten.
Integration von Gl. (2.65) fr den Fall einer nicht-kompetitiven Produkthemmung
ergibt folgenden Ausdruck, wobei [P] =[A]
0
[A] gesetzt wird:
K
m
1
[A[
0
K
ic
_ _
ln
[A[
0
[A[
1
K
m
K
ic
_ _
[P[
[P[
2
2K
iu
= Vt X (2X103)
Dieser Ausdruck lt sich aufgrund des quadratischen Gliedes in den Linearisie-
rungsverfahren der integrierten Michaelis-Menten-Gleichung nicht in eine Gerade-
ngleichung berfhren, wie fr die Auftragung von ([A]
0
[A])/t gegen ln ([A]
0
/[A])/t
ersichtlich wird:
[A[
0
[A[
t
=
V
1
[A[
0
[A[
2K
iu

K
m
K
ic

K
m
1
[A[
0
K
ic
_ _
1
[A[
0
[A[
2K
iu

K
m
K
ic

ln
[A[
0
[A[
t
X
(2X104)
Bei Zugabe einer konstanten Produktmenge [P]
0
bereits zu Beginn der Reaktion wird
aus Gl. ( 2.104)
[A[
0
[A[
t
=
V
1
[P[
0
K
iu

[A[
0
[A[
2K
iu

K
m
K
ic

K
m
1
[A[
0
K
ic
_ _
1
[P[
0
K
iu

[A[
0
[A[
2K
iu

K
m
K
ic

ln
[A[
0
[A[
t
X (2X105)
Da die nicht-kompetitive auch die kompetitive und unkompetitive Hemmung ein-
schliet, lassen sich deren Gleichungen durch Vereinfachung der Gl. (2.103)(2.105)
erhalten, indem K
iu
=? fr die kompetitive und K
ic
=? fr die unkompetitive Pro-
dukthemmung gesetzt werden. Eine Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven zur Be-
stimmung des Hemmtyps ist nach der in Abschnitt 2.4.3 beschriebenen Methode von
Foster und Niemann mglich.
A2.5 Enzymhemmung 105
2.5.1.9 Substrathemmung
Dieser auch Substratberschuhemmung genannte, hufig zu beobachtende Hemmtyp
gibt sich dadurch zu erkennen, da die Reaktionsgeschwindigkeit bei hohen Substrat-
konzentrationen anstatt einer Maximalgeschwindigkeit zuzustreben, wieder absinkt.
Dies ist damit zu erklren, da neben dem umzusetzenden noch ein weiteres Sub-
stratmolekl an das Enzym bindet und die Reaktion hemmt. Geht man davon aus,
da das erste bindende Substratmolekl grundstzlich an der Katalyse teilnimmt (da
sich ansonsten das Enzym an seinem eigenen Substrat vergiften wrde), dann wirkt
das zweite Substratmolekl als unkompetitiver, nur an den Enzym-Substrat-Komplex
bindender Hemmstoff:
(2.106)
Daher gelten Gl. (2.83)(2.87) fr die unkompetitive Hemmung sinngem, wenn [I]
durch [A] ersetzt wird:
v =
V[A[
K
m
1
[A[
K
iu
_ _
[A[
Y (2X107)
Lineweaver-Burk-Gleichung:
1
v
=
1
[A[
K
iu
V

K
m
V[A[
Y (2X108)
Gleichung nach Hanes:
[A[
v
=
[A[ 1
[A[
K
iu
_ _
V

K
m
V
Y (2X109)
Gleichung nach Eadie-Hofstee:
v =
V
1
[A[
K
iu

K
m
1
[A[
K
iu
_ _

v
[A[
(2X110)
106 2 Enzymkinetik
und nach Dixon:
1
v
=
1
V
1
K
m
[A[
_ _

[A[
VK
iu
X (2X111)
Da hier die gleiche Verbindung sowohl als Substrat wie als Hemmstoff auftritt, las-
sen sich die beiden gegenlufigen Wirkungen nicht getrennt aufzeigen, die lineari-
sierten Darstellungsformen ergeben keine Geraden. Aus der Art der Abweichung,
z. B. der Umkehrung des Kurvenverlaufs zur Ordinate im doppelt-reziproken Dia-
gramm (Abb. 2.24A), ist zwar die Substrathemmung erkennbar, schwieriger gestaltet
sich aber die Bestimmung der Konstanten, da selbst die Michaelis-Konstante nicht in
Abwesenheit des Hemmstoffes ermittelt werden kann. Nherungsweise kann davon
ausgegangen werden, da bei sehr geringen Substratkonzentrationen der hemmende
Einflu zu vernachlssigen ist. Aus einer Asymptoten an den Kurvenverlauf in die-
sem Bereich lassen sich K
m
und V abschtzen (Abb. 2.24A). Auf hnliche Weise er-
hlt man K
iu
aus dem Abszissenschnittpunkt einer Asymptoten des Dixon-Dia-
gramms an die Mewerte bei hohen Substratkonzentrationen, wo die Hemmwirkung
dominiert (Abb. 2.24B).
Auch Zeit-Umsatz-Kurven sind durch Integration von Gl. (2.107) nicht zu lineari-
sieren:
[A[
0
[A[
t
= V
[A[
2
0
[A[
2
2K
iu
t
K
m
ln
[A[
0
[A[
t
X (2X112)
A2.5 Enzymhemmung 107
Abb. 2.24. Substrathemmung. A) Doppelt-reziprokes Diagramm, B) Dixon-Diagramm.
2.5.2 Irreversible Enzymhemmung
2.5.2.1 Unterscheidung reversibler und irreversibler Hemmstoffe
Da reversible und irreversible Hemmungen getrennt zu behandeln sind, ist es vorweg
erforderlich, die Art der Hemmung zu charakterisieren. Zumeist ist die Unterschei-
dung offenkundig, wenn eine kovalente Reaktion des Liganden mit dem Enzym che-
misch entweder auszuschlieen oder aufgrund reaktiver Gruppierungen zu erwarten
ist. Besonders im letzteren Fall ist jedoch nicht immer vorherzusehen, ob eine kova-
lente Bindung tatschlich geknpft wird oder ob Bindung nur aufgrund reversibler
Assoziation erfolgt. So knnten die als Suizid-Substrate verwendeten Substratanalo-
gen nur aufgrund ihrer Substratanalogie binden, ohne da eine kovalente Reaktion
zustandekommt. Umgekehrt fhren auch nicht-kovalente Bindungen dann zu (quasi-
)irreversiblen Hemmungen, wenn diese auerordentlich fest sind (K
d
<10
10
M), wie
dies bei bergangsanalogen hufig beobachtet wird. Eine Unterscheidung zwischen
diesen beiden Arten der Hemmung ist zwar durch Abtrennung des Hemmstoffes mit-
tels Dialyse, Gelfiltration, Ultrafiltration usw. mglich. Bei reversibler Bindung sollte
die volle Enzymaktivitt wiedergewonnen werden, whrend fr irreversible Bindung
keine Reaktivierung zu erwarten ist. Allerdings werden nicht immer eindeutige Er-
gebnisse erhalten, da das Enzym allein durch die Prozedur der Abtrennung Aktivi-
ttsverluste erleiden kann und es dann schwierig wird, dies von einer Inaktivierung
durch den Hemmstoff zu unterscheiden.
Ein einfaches, aber ebenfalls nicht immer eindeutiges Verfahren ist die Messung
der Enzymaktivitt einer Enzym-Hemmstoff-Mischung vor und nach einer definierten
Verdnnung. Wird eine Enzymlsung z. B. um den Faktor 10 verdnnt, dann redu-
ziert sich ihre Aktivitt um den gleichen Faktor. Inaktiviert zuvor ein Hemmstoff ei-
nen Teil des Enzyms durch kovalente Bindung, dann wird die verbleibende Aktivitt
durch Verdnnung gleichermaen reduziert. Ein reversibler Hemmstoff dissoziiert da-
gegen bei Verdnnung ab, es resultiert ein schwcherer Aktivittsverlust, als dem
Verdnnungseffekt entspricht.
Ein zuverlssiger und rascher Test irreversibler Hemmung ist die Bestimmung der
Zeitabhngigkeit der Hemmwirkung. Der reversible Hemmstoff bewirkt eine augen-
blickliche Verminderung der Enzymaktivitt auf einen bestimmten Wert, der sich zeit-
abhngig nicht weiter ndert (Abb. 2.25A). Bei einer irreversiblen Hemmung nimmt
dagegen die Enzymaktivitt exponentiell (Reaktion pseudo-erster Ordnung) ab. Die Ur-
sache dieses Effekts liegt in der Konzentrationsabhngigkeit der (tatschlich vorliegen-
den) zweiten Reaktionsordnung, die es ermglicht, die Hemmstoffmenge soweit zu re-
duzieren, bis der Verlauf der Reaktion zeitlich verfolgt werden kann. Dabei kann an-
fnglich die Hemmwirkung noch nicht erkennbar sein. Liegt der Hemmstoff (bei stch-
iometrischer Bindung an das Enzym) in zumindest gleicher Menge vor wie das Enzym,
so wird dieser schlielich smtliche Enzymmolekle inaktivieren.
Aus der Abhngigkeit der Enzyminaktivierung von der Hemmstoffkonzentration
kann die Stchiometrie der Bindung bestimmt werden. Bei starker Bindung nimmt
im Anfangsbereich die Enzymaktivitt nahezu linear ab. Durch Extrapolation auf die
Abszisse bekommt man den Anteil des pro eingesetzten Enzyms gebundenen Hemm-
stoffes (Abb. 2.25B).
108 2 Enzymkinetik
2.5.2.2 Charakterisierung irreversibler Hemmungen
Fr die irreversible Bindung des Hemmstoffes an das Enzym kann folgendes Reakti-
onsschema zugrundegelegt werden:
E I
k
1
B EI
k
2
EI
i
k
1
A
wobei angenommen ist, da der Hemmstoff zunchst mit dem Enzym einen reversi-
blen Assoziationskomplex EI bildet, der, in einem irreversiblen Proze in die inakti-
ve EI
i
-Form bergeht. Die Gesamtmenge des eingesetzten Enzyms [E]
0
verteilt sich
damit auf die Enzymformen:
[E[
0
= [E[ [EI[ [EI[
i
= [E[
a
[EI[
i
X (2X114)
[E] und [EI] ist der Anteil an aktivem Enzym [E]
a
, da bei Substratberschu im Enzym-
test der Hemmstoff auch aus [EI] verdrngt wird. In Analogie zur Michaelis-Menten-
Gleichung ist, unter der Voraussetzung [I] [E]
0
, die zeitliche Bildung der inaktiven
Enzymform [EI]
i
der Konzentration des reversiblen [EI]-Komplexes direkt proportional:
d[EI[
i
dt
=
d([E[
0
[E[
a
)
dt
= k
2
[EI[ X
Die Gesamtmenge des Enzyms [E]
0
bleibt konstant, d. h. d[E]
0
/dt =0:

d[E[
a
dt
= k
2
[EI[ X (2X115)
[EI] lt sich aus Gl. (2.114) unter Bercksichtigung der Hemmkonstanten fr die re-
versible Bindung des Hemmstoffs K
i
=[E][I]/[EI] ersetzen:
[E[
a
= [EI[ [E[ = [EI[
[EI[K
i
[I[
A2.5 Enzymhemmung 109
Abb. 2.25. Zeitverlauf ei-
ner irreversiblen und einer
reversiblen Hemmung (A)
und Bestimmung des An-
teils an irreversibel gebun-
denem Hemmstoff (B).
und damit [EI] aus Gl. (2.115) eliminieren:
d[E[
a
dt
=
k
2
[E[
a
1
K
i
[I[
X
Integration von [E]
0
zur Zeit t =0 nach [E]
a
zur Zeit t

_
[E[
a
[E[
0
d[E[
a
[E[
a
=
_
t
t=0
k
2
dt
1
K
i
[I[
ergibt:
ln
[E[
a
[E[
0
=
k
2
t
1
K
i
[I[
(2X116 a)
bzw. im Zehnerlogarithmus
log
[E[
a
[E[
0
=
k
2
t
2Y3 1
K
i
[I[
_ _
X (2X116 b)
Ein Diagramm der Restaktivitten des Enzyms log ([E]
a
/[E]
0
) gegen die Inkubations-
zeit t ergibt fr unterschiedliche Hemmstoffkonzentrationen Geraden (Abb. 2.26A),
deren Steigungen St den Wert
St =
k
2
1
K
i
[I[
(2X117)
annehmen. Die reziproken Werte der Steigungen gegen die reziproke Hemmstoffkon-
zentration aufgetragen ergeben eine lineare Funktion:
1
St
=
1
k
2

K
i
k
2
[I[
(2X118)
mit 1/k
2
und 1/K
i
als Ordinaten- bzw. Abszissenschnittpunkte (Abb. 2.26B).
Konkurriert ein zweiter Ligand A (z. B. das Substrat) um die Bindungsstelle des
Hemmstoffes, dann ist Gl. (2.116) um den Ausdruck 1+[A]/K
A
im Nenner zu erweitern:
ln
[E[
a
[E[
0
=
k
2
t
1
K
i
[I[
_ _
1
[A[
K
A
_ _
X (2X119)
110 2 Enzymkinetik
Entsprechend ist auch die Beziehung fr die Steigung zu erweitern:
1
St
=
1
k
2

K
i
1
[A[
K
A
_ _
k
2
[I[
X (2X120)
Bei verschiedenen Konzentrationen von A erhlt man unterschiedliche Geraden und
K
A
kann, wie in Abb. 2.26B gezeigt, aus deren Schnittpunkt mit der Abszisse errech-
net oder aber aus einem Sekundrdiagramm der Steigungen dieses Diagramms gegen
[A] entnommen werden.
2.5.3 Enzymreaktionen mit zwei konkurrierenden Substraten
Aufgrund ihrer engen Spezifitt reagieren Enzyme bevorzugt mit einem bestimmten
Substrat A
1
, doch werden teilweise auch homologe Verbindungen des Substrats A
2
akzeptiert:
A
1
k
1
B EA
1
k
2
E P
1
k
1
A
E

(2X121)
A
2
k
3
B EA
1
k
4
E P
2
X
k
3
A
Dabei ist eines der Substrate, in der Regel das natrliche, wirksamer als das andere.
Sind beide Substrate gleichzeitig zugegen, so wird das schlechtere Substrat das bessere
behindern, die gesamte Umsatzgeschwindigkeit wird sich verringern. Die Verhltnisse
werden dadurch komplexer, als die Wirksamkeit beider Substrate hinsichtlich Bindung
und Katalyse unterschiedlich, teilweise sogar entgegengesetzt sein kann. Ein Substrat
kann mit hherer Affinitt gebunden, aber langsamer als ein zweites umgesetzt werden.
A2.5 Enzymhemmung 111
Abb. 2.26. Darstellung einer irreversiblen Hemmung. A) Halblogarithmische Auftragung fr unter-
schiedliche Hemmstoffkonzentrationen. B) Sekundr-Auftragung der Steigungen aus Diagramm A)
fr mehrere Substratkonzentrationen.
Nach der Steady-State-Annahme ist
d[EA
1
[
dt
= k
1
[E[[A
1
[ (k
1
k
2
)[EA
1
[ = 0 Y (1X122)
d[EA
2
[
dt
= k
3
[E[[A
2
[ (k
3
k
4
)[EA
2
[ = 0 Y (2X123)
v = k
2
[EA
1
[ k
4
[EA
2
[ Y (2X124)
[E[
0
= [E[ [EA
1
[ [EA
2
[ X (2X125)
Durch Ersatz von [E] aus Gl. (2.125) in Gl. (2.122) und Gl. (2.123) wird:
[EA
2
[ = [E[
0
[EA
1
[ 1
k
1
k
2
k
1
[A
1
[
_ _
(2X126)
[EA
1
[ = [E[
0
[EA
2
[ 1
k
3
k
4
k
3
[A
2
[
_ _
(2X127)
und durch Einsetzen von 2.126 in 2.127 unter Bercksichtigung von K
m1
=(k
1
+k
2
)/k
1
und K
m2
=(k
3
+k
4
)/k
3
:
[EA
1
[ =
K
m2
[E[
0
[A
1
[
K
m2
[A
1
[ K
m1
[A
2
[ K
m1
K
m2
Y (2X128 a)
[EA
2
[ =
K
m1
[E[
0
[A
2
[
K
m2
[A
1
[ K
m1
[A
2
[ K
m1
K
m2
X (2X128 b)
Einsetzen der Gl. (2.128a) und (2.128b) in Gl. (2.124) ergibt die Geschwindigkeits-
gleichung fr eine Reaktion mit zwei alternativen Substraten, wobei V
1
=k
2
[E]
0
und
V
2
=k
4
[E]
0
ist:
v =
V
1
K
m2
[A
1
[ V
2
K
m1
[A
2
[
K
m2
[A
1
[ K
m1
[A
2
[ K
m1
K
m2
X (2X129)
Abbildung 2.27 zeigt ein Beispiel fr einen solchen Mechanismus in der doppelt-re-
ziproken Darstellung bei Variation des aktiveren Substrats und Konstanz des weniger
aktiven. Auffallend sind Abweichungen von der Linearitt und berkreuzungen der
Kurven im ersten Quadranten.
112 2 Enzymkinetik
2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen
2.6.1 Nomenklatur
Fr die bisher betrachteten Enzymreaktionen wurde die Teilnahme nur eines einzigen
Substratmolekls am katalytischen Umsatz angenommen. Tatschlich sind aber an
der berwiegenden Zahl aller Enzymreaktionen zwei, manchmal sogar drei Substrate
beteiligt. Das knnte die Bedeutung der bisherigen Betrachtungen wesentlich ein-
schrnken. Doch erweist sich die Michaelis-Menten-Beziehung auch fr diese Erwei-
terung als prinzipiell gltig, solange die Abhngigkeit jeweils nur eines Substrats un-
tersucht wird und die anderen Substrate und Cofaktoren in groem berschu, also
praktisch sttigend, vorliegen. Man erhlt so zwar die kinetischen Konstanten des va-
riierten Substrats, jedoch keinerlei Information ber den vorliegenden Mehrsubstrat-
Mechanismus. Eine umfassende Analyse solcher komplexer Reaktionen erfordert die
gegenseitige Variation aller beteiligten Substrate. R. A. Alberty (1959), K. Dalziel
(1957) und insbesondere W. Wallace Cleland (1963) haben Mehrsubstrat-Reaktionen
eingehend beschrieben. Die folgende Darstellung hlt sich im wesentlichen an die
von Cleland eingefhrte bersichtliche Nomenklatur.
Substrate werden in der Reihenfolge ihrer Bindung an das Enzym mit A, B, C,
Produkte in der Reihenfolge ihrer Ablsung mit P, Q, R bezeichnet. Tritt das Enzym
in mehreren Formen auf, werden diese mit E, F, G benannt. Das Enzym bildet mit
Substraten bzw. Produkten bergangskomplexe (engl. transitory complexes) EA, EP
usw., die in unimolekularen Schritten unter Substrat- bzw. Produktfreisetzung zerfal-
len knnen. Die katalytische Reaktion erfolgt an zentralen Komplexen (engl. central
complexes). Sie werden zur Unterscheidung von bergangskomplexen in Klammern
geschrieben, z. B. (EAB). Zentrale Komplexe knnen nicht weiter Substrate oder Pro-
dukte binden, da bereits alle Stellen besetzt sind, vielmehr nur Substrat bzw. Produkt
in unimolekularen Schritten abgeben. Da die Steady-State-Kinetik selbst keine Infor-
mation zum bergang von Substraten in Produkte (und umgekehrt) auf dem Enzym-
molekl liefert, wird nur ein zentraler Komplex fr beide Zustnde vor und nach der
Katalyse (EAB-EPQ) definiert. Die Zahl der Substrate, die insgesamt an der Hinreak-
tion und die der Produkte, die an der Rckreaktion teilnehmen, wird in den Benen-
A2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 113
Abb. 2.27. Reaktion mit zwei alternativen Substraten in
doppelt-reziproker Auftragung. Die Maximalgeschwin-
digkeit V
1
des variierten Substrats ist hher als die des
konstant gehaltenen Substrats V
2
. Im umgekehrten Falle
weichen die Kurven nach unten ab und streben dem dann
tiefer liegenden Wert 1/ V
2
zu. Die Michaelis-Konstanten
beider Substrate sind als gleich angenommen.
nungen Uni, Bi, Ter dem Namen des Reaktionsmechanismus hintangestellt. Vereini-
gen sich beispielsweise zwei Substrate zu einem Produkt, so handelt es sich um ei-
nen Bi Uni-Mechanismus. Sequentielle Mechanismen sind solche, bei denen erst alle
Substrate gebunden sein mssen, ehe Produkt freigesetzt wird, wobei die Bindung
der unterschiedlichen Substrate in zuflliger Reihenfolge (engl. random) oder geord-
net (engl. ordered) erfolgen kann. Bei Ping-Pong-Mechanismen wird Produkt bereits
freigesetzt, bevor alle Substrate gebunden haben. Das Enzym tritt dabei in zwei oder
mehr, durch Gruppen des Substrats modifizierte Enzymformen auf. Bei Iso-Mecha-
nismen isomerisiert das Enzym in zwei oder mehr stabile Konformationen. Da die
englischen Ausdrcke fr Mehrsubstrat-Reaktionen auch im deutschen Schrifttum ge-
bruchlich sind, werden diese hier bevorzugt.
Die Reaktionsgleichungen werden schematisch dargestellt. Das Fortschreiten der
Reaktion symbolisiert eine horizontale Grundlinie, unter der die verschiedenen En-
zymzustnde angegeben sind. Bindung von Substraten wird durch vertikale Pfeile auf
die Grundlinie, Dissoziation von Produkten durch vertikale Pfeile von der Grundlinie
gekennzeichnet. Die Geschwindigkeitskonstanten stehen an diesen Pfeilen, links fr
die Hinreaktion, rechts fr die Rckreaktion. Das Reaktionsschema fr einen Orde-
red Bi Bi-Mechanismus in der konventionellen Schreibweise
E A
k
1
B EA
k
1
A
EA B
k
2
B EAB-EPQ
k
3
B EQ P
k
2
A A
k
3
EQ
k
4
B E Q
k
4
A
bekommt damit folgende Form:
Zunchst werden die wichtigsten Mehrsubstrat-Mechanismen vorgestellt und im wei-
teren verschiedene Methoden der Ableitung komplexer Geschwindigkeitsgleichungen
behandelt.
2.6.2 Random-Mechanismus (Zufalls-Mechanismus)
Bei diesem allgemeinsten Mehrsubstrat-Mechanismus, der unter anderem bei Kinasen
oder der Phosphorylase B gefunden wird, binden Substrate und Produkte in zuflli-
ger Reihenfolge. Im einfachsten Fall ist die Bindung vllig unabhngig, es erfolgt
114 2 Enzymkinetik
(2.130)
keine gegenseitige Beeinflussung. Das Reaktionsschema fr einen Random Bi Bi-Me-
chanismus mit Beteiligung von zwei Substraten und zwei Produkten lautet:
(2.131)
Gegenber einem reversiblen Einsubstratmechanismus mit jeweils zwei Maximalge-
schwindigkeiten (V
1
fr Hin- und V
2
fr Rckreaktion) und zwei Michaelis-Konstan-
ten (K
mA
fr Substrat und K
mP
fr Produkt) ergibt sich eine Vielzahl neuer Konstan-
ten. Zum einen hat jedes Substrat und jedes Produkt seine eigene Michaelis-Kon-
stante (K
mA
, K
mP
usw.) fr die Wechselwirkung mit dem zentralen Komplex. Weiter-
hin besitzt jeder dieser Liganden eine zustzliche Konstante fr seine Bindung an das
freie Enzym unter Bildung der nicht katalytisch aktiven bergangskomplexe. Es han-
delt sich um Bindungskonstanten, sie werden als Hemmkonstanten K
i
bezeichnet, da
sie in der Rckreaktion mit den Konstanten fr die Produkthemmung (vgl. Abschnitt
2.5.1.8) identisch sind. Fr den Random Bi Bi-Mechanismus existieren somit zehn ki-
netische Konstanten, zwei Maximalgeschwindigkeiten und jeweils vier Hemm- und
Michaelis-Konstanten fr Substrate und Produkte. Diese Konstanten sind durch einfa-
che kinetische Analyse, wie bisher dargestellt, nicht zu erhalten. Es gilt aber in Ana-
logie zur nicht-kompetitiven Hemmung (Abschnitt 2.5.1.2), zu der der Random Bi
Bi-Mechanismus einige Parallelen aufweist, da Hemm- und Michaelis-Konstanten
fr die Substrate bzw. die Produkte miteinander in Beziehung stehen: K
iA
/K
iB
=K
mA
/
K
mB
und K
iP
/K
iQ
=K
mP
/K
mQ
. Weiterhin sind Hemm- und Michaelis-Konstanten fr
das gleiche Substrat bzw. Produkt einander gleich, wenn ihre Bindung durch das Co-
substrat bzw. Coprodukt nicht beeinflut wird, z. B. K
iA
=K
mA
und K
iB
=K
mB
.
In seiner allgemeinen Form ergibt der Random-Mechanismus aufgrund seiner al-
ternativen Reaktionswege eine komplexe Geschwindigkeitsgleichung und, solange
das Substrat nicht sttigend vorliegt, keine hyperbolen bzw. einfach zu linearisieren-
den Abhngigkeiten von der Substratmenge. Eine wesentliche Vereinfachung wird er-
reicht durch die Annahme schneller Gleichgewichte gegenber einer relativ langsa-
men Umwandlung der zentralen ternren Komplexe (EAB) und (EPQ) (Rapid-Equili-
brium-Random-Mechanismus). Fr den Random Bi Bi-Mechanismus lautet dann die
Geschwindigkeitsgleichung:
A2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 115
v =
V
1
V
2
[A[[B[
[P[[Q[
K
g
_ _
K
iA
K
mB
V
2
K
mB
V
2
[A[K
mA
V
2
[B[
K
mQ
V
1
[P[
K
g

K
mP
V
1
[Q[
K
g
V
2
[A[[B[
V
1
[P[[Q[
K
g
X
(2X132)
K
g
ist die Gleichgewichtskonstante der Gesamtreaktion. Bei Bestimmung von An-
fangsgeschwindigkeiten in der Hinreaktion, d. h. [P] =[Q] =0, vereinfacht sich Gl.
(2.132) zu:
v =
V
1
[A[[B[
K
iA
K
mB
K
mB
[A[ K
mA
[B[ [A[[B[
X (2X133)
Es ist zu erkennen, da bei Konstanthaltung eines der beiden Substrate prinzipiell die
ursprngliche Form der Michaelis-Menten-Gleichung erhalten wird und somit hyper-
bole Abhngigkeiten zu erwarten sind. Linearisierungsverfahren wie das Lineweaver-
Burk-Diagramm sind damit hier anwendbar:
1
v
=
K
iA
K
mB
V
1
[A[[B[

K
mA
V
1
[A[

K
mB
V
1
[B[

1
V
1
X (2X134)
Wird in mehreren Mereihen jeweils ein Substrat, z. B. [A], variiert, whrend [B] inner-
halb der gleichen Mereihe konstant bleibt, sich jedoch zur jeweils nchsten ndert,
dann ergeben sich in der doppelt-reziproken Darstellung Geraden mit einem gemeinsa-
men Schnittpunkt links der Ordinate (Abb. 2.28B). Wiederum in Analogie zur nicht-
kompetitiven Hemmung ist die Lage des Schnittpunkts vom Verhltnis der Konstanten
und damit auch von der gegenseitigen Beeinflussung der beiden Substrate abhngig.
Ohne Beeinflussung, d. h. fr K
iA
=K
mA
und K
iB
=K
mB
liegt der Schnittpunkt direkt
auf der Abszisse und hat den Wert 1/K
mA
, bei Variation des Cosubstrats 1/K
mB
.
Bei reversiblen Reaktionen lassen sich in entsprechender Weise die Michaelis-Konstan-
ten fr die Rckreaktion bestimmen, so da fr diesen einfachen Fall alle kinetischen
Konstanten leicht zu ermitteln sind. Fr K
iA
<K
mA
, K
iB
<K
mB
liegt der gemeinsame
Schnittpunkt oberhalb und fr K
iA
>K
mA
, K
iB
>K
mB
unterhalb der Abszisse und hat
die in Abb. 2.28B angegebenen Koordinaten. Gleichgltig, ob [A] oder [B] die Variable
innerhalb einer Mereihe ist, wird ein gleichartiges Geradenmuster erhalten. Zur Ermitt-
lung der Hemm- und Michaelis-Konstanten kann man sich des bereits bei der Hemm-
kinetik besprochenen Verfahrens der Sekundrauftragung bedienen, wobei auch hier die
Linearitt ein zustzlicher Test fr den angenommenen Mechanismus ist (Tabelle 2.1).
Die Steigung St
A
der Geraden in der primren Auftragung ist nach Gl. (2.134):
St
A
=
K
iA
K
mB
V
1
[B[

K
mA
V
1
Y (2X135)
d. h. diese gegen 1/[B] aufgetragen ergibt eine Gerade mit dem Abszissenschnittpunkt
K
mA
/K
iA
K
mB
(bzw. 1/K
mB
fr K
mA
=K
iA
). Die Ordinatenschnittpunkte Or
A
der
Primrauftragung:
116 2 Enzymkinetik
Or
A
=
K
mB
V
1
[B[

1
V
1
Y (2X136)
ebenfalls gegen 1/[B] aufgetragen, ergeben eine Gerade mit dem Abszissenschnitt-
punkt 1/K
mB
. Bei Variation von [B] in der primren Darstellung schneidet die Ge-
rade eines Sekundrdiagramms aus Steigungen St
B
gegen 1/[A]:
St
B
=
K
iA
K
mB
V
1
[A[

K
mB
V
1
(2X137)
die Abszisse bei 1/K
iA
. Ein Abszissenschnittpunkt von 1/K
mA
wird bei Auftragung
der Ordinatenschnittpunkte Or
B
gegen 1/[A] erhalten:
Or
B
=
K
mA
V
1
[A[

1
V
1
X (2X138)
Die Auftragung von [A]/v gegen [A] bzw. [B]/v gegen [B] nach Hanes:
[A[
v
=
1
V
1
K
mA

K
iA
K
mB
[B[
_ _

[A[
V
1
1 K
mB
[B[
_ _
(2X139)
[B[
v
=
K
mB
V
1
1
K
iA
[A[
_ _

[B[
V
1
1
K
mA
[A[
_ _
(2X140)
ergibt ebenfalls einen gemeinsamen Geradenschnittpunkt links der Ordinate
(Abb. 2.28B) und auch hier knnen die kinetischen Konstanten in Sekundrdarstel-
lungen der Steigungen bzw. der Ordinatenschnittpunkte gegen die reziproke Cosub-
stratkonzentration ermittelt werden (Tabelle 2.1).
Die Gleichungen fr die Auftragung von v/[A] bzw. v/[B] gegen v nach Eadie-
Hofstee lauten:
v =
V
1
1
K
mB
[B[

v
[A[

K
mA

K
iA
K
mB
[B[
1
K
mB
[B[
(2X141)
v =
V
1
1
K
mA
[A[

v
[B[

K
mB
1
K
iA
[A[
_ _
1
K
mA
[A[
X (2X142)
Der gemeinsame Geradenschnittpunkt liegt fr K
iA
>K
mA
links der Ordinate
(Abb. 2.28A) und fr K
iA
<K
mA
rechts unterhalb der Abszisse, fr K
iA
=K
mA
werden
Parallelen erhalten. Fr die Sekundrdiagramme werden hier die reziproken Abszis-
sen- bzw. Ordinatenschnittpunkte gegen die zugehrige Cosubstratkonzentration auf-
getragen (Tabelle 2.2).
A2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 117
2.6.3 Ordered-Mechanismus (geordneter Mechanismus)
Bei diesem bereits im Reaktionsschema 2.130 dargestellten Mechanismus ist eine
strikte Reihenfolge der Bindung der Substrate vorgegeben. Die ausfhrliche Ge-
schwindigkeitsgleichung eines Ordered Bi Bi-Mechanismus wird im folgenden Ab-
schnitt abgeleitet (Gl. (2.168)). Deren Vereinfachung fr die Hinreaktion ergibt die
bereits fr den Rapid-Equilibrium Random Bi Bi-Mechanismus vorgestellte Gl.
(2.133), wodurch sich der Ordered-Mechanismus als eine Sonderform des allgemei-
neren Random-Mechanismus mit maximaler gegenseitiger Beeinflussung der Substrate
zu erkennen gibt. Insofern gelten auch die dort besprochenen Darstellungsformen. Auf
diese Weise ist eine Unterscheidung beider Mechanismen nur mglich gegenber einem
reinen Random-Mechanismus ohne jede Beeinflussung der Substratbindung mit iden-
tischen Hemm- und Michaelis-Konstanten. Wie bereits erwhnt ergibt dieser Fall im
doppelt-reziproken Diagramm einen gemeinsamen Abszissenschnittpunkt.
Eine Unterscheidung beider Mechanismen ist ber die Analyse der Produkthem-
mungen mglich. Die Reaktion wird in Gegenwart eines Produkts gehemmt. Vor-
118 2 Enzymkinetik
Abb. 2.28. Random-Mechanismus in der
Auftragung nach A) Eadie-Hofstee, B) Li-
neweaver-Burk und C) Hanes unter Angabe
der Bestimmung der kinetischen Konstan-
ten.
zugsweise wird ein Produkt die Reaktion in Abhngigkeit desjenigen Substrats, aus
dem es entstanden ist (z. B. Acetaldehyd aus Ethanol im Falle der Alkohol-Dehydro-
genase), kompetitiv hemmen, gegenber dem Cosubstrat (z. B. NAD) aber wird es
nicht-kompetitiv wirken, da es letzteres zwar nicht verdrngen, aber doch den Reakti-
onsumsatz verhindern kann. Die tatschlichen Verhltnisse bei Mehrsubstrat-Reaktio-
nen sind allerdings etwas komplexer und hngen vom Mechanismus und der Stti-
gung mit dem Cosubstrat ab. Dies macht man sich zunutze, indem fr einen aufzu-
klrenden Mechanismus die Arten der Produkthemmung bezglich beider Substrate
und Produkte ermittelt und mit den zu erwartenden Hemmmustern fr die verschie-
denen Mehrsubstrat-Mechanismen verglichen werden (Tabelle 2.3). Eine solche Ana-
lyse untersttzt die graphischen Auswertungen.
Ordered-Mechanismen werden besonders bei Dehydrogenasen beobachtet. Speziell
bei der Alkohol-Dehydrogenase findet sich ein Sonderfall, der Theorell-Chance-Me-
chanismus, bei dem der zentrale Komplex derart rasch zerfllt, da seine stationre
Konzentration nur geringfgig und in der Geschwindigkeitsgleichung zu vernachlssi-
gen ist:
A2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 119
Tab. 2.2. Abszissen- und Ordinatenschnittpunkte der Sekundrdarstellungen fr Bisubstratreaktionen.
St
A
, St
B
sind die Steigungen, Or
A
, Or
B
die Ordinatenschnittpunkte und Ab
A
, Ab
B
die Abszissen-
schnittpunkte aus den Primrdiagrammen bei Variation von [A] bzw. [B].
Primrdiagramm Sekundrdiagramm
Achsenbezeichnung Achsenbezeichnung Schnittpunkte
Y X Y X Random/Ordered-Mechanismus Ping-Pong-Mechanismus
Ordinate Abszisse Ordinate Abszisse
1/v 1/[A] St
A
Ab
A
Or
A
1/[B]
1/[B]
1/[B]
K
mA
/V
1/V
K
mA
/K
iA
K
mB
1/K
mB
1/K
mA
1/V
1/K
mB
1/K
mB
1/v 1/[B] St
B
Ab
B
Or
B
1/[A]
1/[A]
1/[A]
K
mB
/V
1/V
1/K
iA
1/K
mA
1/K
mB
1/V
1/K
mA
1/K
mA
[A]/v [A] St
A
1/Ab
A
Or
A
1/[B]
1/[B]
1/[B]
1/V
K
mA
/V
1/K
mB
K
mA
/K
iA
K
mB
1/V
K
mA
1/K
mB
1/K
mB
[B]/v [B] St
B
1/Ab
B
Or
B
1/[A]
1/[A]
1/[A]
1/V
K
mB
/V
1/K
mA
1/K
iA
1/V
K
mB
1/K
mA
1/K
mA
v/[A] v St
A
1/Ab
A
Or
A
1/[B]
1/[B]
1/[B]
1/V
K
mA
/V
1/K
mB
K
mA
/K
iA
K
mB
1/K
mA
1/V
1/K
mB
1/K
mB
v/[B] v St
B
1/Ab
B
Or
B
1/[A]
1/[A]
1/[A]
1/V
K
mB
/V
1/K
mA
1/K
iA
1/K
mB
1/V
1/K
mA
1/K
mA
(2.143)
Allerdings ist die vereinfachte Geschwindigkeitsgleichung 2.133 der Hinreaktion mit
derjenigen des normalen Ordered-Mechanismus identisch, so da auf graphischem
Wege keine Unterscheidung getroffen werden kann. Aufgrund der Abwesenheit des
zentralen Komplexes wird jedoch eine vernderte Produkthemmung gefunden (Ta-
belle 2.3).
Isomerisiert das Enzym im zentralen Komplex von EAB nach FPQ:
(2.144)
so erhlt man einen Iso-Ordered-Mechanismus, der sich in zustzlichen Gliedern der
Geschwindigkeitsgleichung ausdrckt, die zwar die Produkthemmung beeinflussen
120 2 Enzymkinetik
Tab. 2.3. Muster der Produkthemmungen bei Bisubstrat-Mechanismen (nach Cleland, 1963). K, kom-
petitiv; NK, nicht-kompetitiv; UK, unkompetitiv; kH, keine Hemmung.
Mechanismus Hemmendes Variables Substrat
Produkt
A B
nicht gesttigt gesttigt mit B nicht gesttigt gesttigt mit A
Ordered Bi Bi P
Q
NK
K
UK
K
NK
NK
NK
kH
Theorell-Chance P
Q
NK
K
kH
K
K
NK
K
kH
Iso-Ordered Bi Bi P
Q
NK
NK
UK
NK
NK
NK
NK
UK
Random Bi Bi
Rapid equilibrium
P oder Q K kH K kH
Ping-Pong Bi Bi P
Q
NK
K
kH
K
K
NK
K
kH
Iso-Ping-Pong Bi Bi
(Isomerisierung v. E)
P
Q
NK
NK
kH
NK
K
NK
K
NK
(Tabelle 2.3), aber fr die Hinreaktion bedeutungslos sind, so da auch in diesem
Falle Gl. (2.133) als gltig angesehen werden kann.
2.6.4 Ping-Pong-Mechanismus
Der Name beschreibt das fr diesen Mechanismus charakteristische alternierende
Binden der Substrate und Freisetzen der Produkte:
(2.145)
Nach der Ablsung des ersten Produkts verbleibt das Enzym in einer intermediren
Form in der Regel durch bernahme einer reaktiven Gruppe des ersten Substrats, die
dann auf das zweite Substrat unter Bildung eines zweiten Produkts bertragen wird.
Ein charakteristisches Beispiel ist die Reaktion der Aminotransferasen, bei denen
eine Aminosure, z. B. Aspartat, ihre Aminogruppe auf das Pyridoxalphosphat des
Enzyms bertrgt und selbst als a-Ketosure (Oxalacetat) freigesetzt wird. Eine zwei-
te a-Ketosure (a-Ketoglutarat) bernimmt die Aminogruppe unter Bildung von Glut-
amat. Ein Multisite-Ping-Pong-Mechanismus findet sich bei der Fettsure-Synthase.
Das Substrat wird durch die am zentralen Pantetheinrest gebundene wachsende Fett-
surekette ber sieben katalytische Zentren weitergereicht.
Die allgemeine Geschwindigkeitsgleichung fr den Ping-Pong Bi Bi-Mechanismus
wird in Abschnitt 2.7.3 abgeleitet. Die vereinfachte Gleichung der Hinreaktion lautet:
v =
V
1
[A[[B[
K
mB
[A[ K
mA
[B[ [A[[B[
X (2X146)
Im Unterschied zu den anderen Bisubstrattypen zeigt dieser Mechanismus in der dop-
pelt-reziproken Darstellung Parallelen (Abb. 2.29B):
1
v
=
K
mA
V
1
[A[

K
mB
V
1
[B[

1
V
1
X (2X147)
Sekundrdiagramme der Ordinaten- und Abszissenschnittpunkte gegen die reziproke
Cosubstratkonzentration sind mglich (Tabelle 2.2).
Im Diagramm nach Hanes:
[A[
v
=
K
mA
V
1

[A[
V
1
1
K
mB
[B[
_ _
(2X148)
A2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 121
[B[
v
=
K
mB
V
1

[B[
V
1
1
K
mA
[A[
_ _
(2X149)
besitzen die Geraden einen gemeinsamen Ordinatenschnittpunkt an den Stellen K
mA
/
V
1
bzw. K
mB
/V
1
(Abb. 2.29C). Sekundrdiagramme sind durch Auftragung der Stei-
gungen bzw. der reziproken Abszissenschnittpunkte gegen die reziproke Cosubstrat-
menge zu erhalten (Tabelle 2.2)
Ein gemeinsamer Geradenschnittpunkt auf der Abszisse ergibt sich auch im Eadie-
Hofstee-Diagramm (Abb. 2.29A):
v =
V
1
1
K
mB
[B[

v
[A[

K
mA
1
K
mB
[B[
(2X150)
v =
V
1
1
K
mA
[A[

v
[B[

K
mB
1
K
mA
[A[
X (2X151)
Die Sekundrdiagramme sind hier aus Steigungen und reziproken Abszissenabschnit-
ten mglich (Tabelle 2.2).
122 2 Enzymkinetik
Abb. 2.29. Ping-Pong-Mechanismus in der Auf-
tragung nach A) Eadie-Hofstee, B) Lineweaver-
Burk und C) Hanes. Die Bestimmung kineti-
scher Konstanten ist angezeigt.
Bei einem Iso-Ping-Pong-Mechanismus isomerisiert die Enzymform F weiter zur
Form G:
(2.152)
Dieser Mechanismus ist aus dem Muster der Produkthemmung erkennbar (Tabelle 2.3).
2.6.5 Haldane-Beziehungen bei Mehrsubstrat-Reaktionen
Wie bereits fr eine reversible Einsubstrat-Reaktion gezeigt (Abschnitt 2.4.2), lassen
sich auch fr andere kinetische Mechanismen eine oder mehrere Haldane-Beziehun-
gen herleiten, bei denen die Gleichgewichtskonstante K
g
der gesamten Reaktion in
Beziehung zu den kinetischen Konstanten steht. Allgemein knnen Haldane-Bezie-
hungen in der Weise formuliert werden:
K
g
=
V
1
V
2
_ _
n
K
P
K
Q
K
R
K
A
K
B
K
C
X (2X153)
Der Zhler enthlt die Maximalgeschwindigkeit der Hinreaktion und Konstanten der
Produkte, der Nenner die Maximalgeschwindigkeit der Rckreaktion und Konstanten
der Substrate. Bei den Konstanten handelt es sich je nach Mechanismus um Michae-
lis- oder Hemmkonstanten. Der Exponent n hat zumeist die Werte 0, 1 oder 2, es exi-
stiert aber immer zumindest eine Haldane-Beziehung fr n=1, mit deren Hilfe K
g
aus der Geschwindigkeitsgleichung eliminiert werden kann. Diese lt sich zumeist
aus dem konstanten Glied im Nenner der Geschwindigkeitsgleichung (z. B.
K
iA
K
mB
V
2
in Gl. (2.132)) ableiten. Dazu mu die Gleichung in die Form der Ge-
schwindigkeitskonstanten berfhrt werden, wozu ein Vorgriff auf die in Abschnitt
2.7.1 behandelte Ableitung von Geschwindigkeitsgleichungen ntig ist. Zhler und
Nenner der Gl. (2.132) werden mit K
g
/V
1
erweitert, das konstante Glied lautet dann
K
iA
K
mB
V
2
K
g
/V
1
. Formuliert man nun, wie fr Gl. (2.166) gezeigt, in Form der Koef-
fizienten unter Zusammenfassung der Geschwindigkeitskonstanten, so lautet dieses
Glied:
K
iA
K
mB
V
2
K
g
1
V
1
_ _
=
Ko
KoA

KoA
KoAB

Z
2
KoPQ

Z
1
Z
2

KoAB
Z
1
X
Nach Krzen und Erweitern mit KoQ lassen sich die verbleibenden Koeffizienten in
kinetische Konstanten zurck verwandeln:
A2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 123
K
iA
K
mB
V
2
K
g
V
1
=
Ko
KoQ

KoQ
KoPQ
= K
iQ
K
mP
X
Damit ergibt sich die Haldane-Beziehung:
K
g
=
V
1
K
iQ
K
mP
V
2
K
iA
K
mB
X (2X154)
Andere Haldane-Beziehungen knnen ber die Koeffizientenform der Geschwindig-
keitsgleichungen aus Nennergliedern mit K
g
auf hnliche Weise erhalten werden.
2.6.6 Mechanismen mit mehr als zwei Substraten
Grundstzlich lassen sich alle Mehrsubstratreaktionen auch bei drei oder vier Subst-
raten auf die hier besprochenen drei Haupttypen zurckfhren. Es treten aber auch
Kombinationen verschiedener Mechanismen auf, wie hybride Ping-Pong-Ordered-
und Ping-Pong-Random-Mechanismen. Ein Ordered Ter Ter-Mechanismus:
(2.155)
gehorcht in der Hinreaktion der Gleichung:
v =
V
1
[A[[B[[C[
K
iA
K
iB
K
mC
K
iB
K
mC
[A[ K
iA
K
mB
[C[ K
mC
[A[[B[ K
mB
[A[[C[
V
1
[A[[B[[C[
K
mA
[B[[C[ [A[[B[[C[
(2X156)
Die Vorgehensweise entspricht der von Bisubstratreaktionen. Es wird jeweils ein Sub-
strat variiert bei verschiedenen festen Konzentrationen eines Cosubstrats. Das dritte
Substrat bleibt whrend der gesamten Prozedur konstant. In der doppelt-reziproken
Darstellung werden, wie beim Ordered Bi Bi-Mechanismus, Schnittpunkte links der
Ordinate erhalten und es lassen sich in analoger Weise aus Gl. (2.156) Sekundrdia-
gramme ableiten.
Insgesamt sind fnf Ping-Pong-Mechanismen unter Beteiligung von drei Substra-
ten und drei Produkten mglich. Beim Hexa-Uni-Ping-Pong binden alle Substrate
und Produkte alternierend und es treten drei zentrale Komplexe auf:
124 2 Enzymkinetik
(2.157)
Die Geschwindigkeitsgleichung in der Hinreaktion lautet:
v =
V
1
[A[[B[[C[
K
mC
[A[[B[ K
mB
[A[[C[ K
mA
[B[[C[ [A[[B[[C[
X (2X158)
Man erhlt Parallelen in der doppelt-reziproken Darstellung bei Variation jedes der
drei Substrate gegen jeweils ein Cosubstrat.
Vier Ping-Pong-Mechanismen mit je zwei zentralen Komplexen knnen auftreten,
wobei jeweils zwei Liganden in geordneter Reihenfolge binden bzw. sich ablsen,
nmlich der Bi Uni Uni Bi-Ping-Pong-Mechanismus:
(2.159)
der Uni Bi Bi Uni-, der Bi Bi Uni Uni- und der Uni Uni Bi Bi-Mechanismus. Die
beiden letzteren entsprechen sich in der Rckreaktion. Alle vier Mechanismen besit-
zen die gleichen Geschwindigkeitsgleichungen fr die Hinreaktion:
v =
V
1
[A[[B[[C[
K
iA
K
mB
[C[ K
mC
[A[[B[ K
mB
[A[[C[ K
mA
[B[[C[ [A[[B[[C[
(2X160)
und lassen sich daher graphisch nicht unterscheiden, wohl aber ber die Produkthem-
mungen. Im doppelt-reziproken Diagramm werden Parallelen erhalten. Nur bei Varia-
tion von [A] gegenber verschiedenen konstanten Mengen von [B] bzw. umgekehrt
bei Variation von [B] gegenber mehreren Konzentrationen von [A] schneiden sich
alle Geraden in einem Punkt links der Ordinate.
Vereinzelt treten auch Quad-Mechanismen unter Beteiligung von vier Substraten
auf, so bei der Carbamoylphosphat-Synthetase.
A2.6 Mehrsubstrat-Reaktionen 125
2.6.7 Andere Schreibweisen fr Mehrsubstratreaktionen
Zwar wird berwiegend die von Cleland eingefhrte Nomenklatur fr Mehrsubstra-
treaktionen verwendet, daneben finden sich aber noch Schreibweisen anderer Auto-
ren, wovon diejenige von Dalziel (1957) besonders abweicht, da dort V in andere ki-
netische Konstanten einbezogen wird. Die Geschwindigkeitsgleichungen lassen sich
in die Schreibweise von Dalziel berfhren, indem Zhler und Nenner mit der rezi-
proken katalytischen Konstanten U
0
=1/k
cat
multipliziert werden. Gl. (2.133) be-
kommt dann die folgende Form, wobei die Substrate mit S
1
, S
2
usw. bezeichnet wer-
den:
v =
[E[
0
[S
1
[[S
2
[
U
12
U
2
[S
1
[ U
1
[S
2
[ U
0
[S
1
[[S
2
[
X
Die Dalziel-Koeffizienten haben demnach die Bedeutung U
1
=K
mA
/k
cat
und
U
2
=K
mB
/k
cat
. U
12
/U
2
entspricht K
iA
. Die Schreibweise von Alberty (1953) deckt
sich weitgehend mit der Clelandschen Nomenklatur (K
A
=K
mA
usw.), jedoch wird fr
das Produkt K
iA
K
mB
in Gl. (2.133) eine gemeinsame Konstante K
AB
gesetzt und
K
iA
=K
AB
/K
mB
.
2.7 Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen
komplexer Enzymmechanismen
2.7.1 King-Altman-Verfahren
Wie man sich leicht selbst berzeugen kann, fhrt die bisherige Herleitung von Ge-
schwindigkeitsgleichungen nach den Regeln der Steady-State-Kinetik ber Differen-
tialgleichungen bei komplexeren Enzymmechanismen zu unbersichtlichen und
schwer zu lsenden Anstzen. Um auch fr diese Flle Gleichungen ohne besonde-
ren mathematischen Aufwand zu erhalten, wurden verschiedene Vereinfachungen vor-
geschlagen, von denen die Methode von E. L. King und C. Altman (1956) die breite-
ste Akzeptanz gefunden hat. Sie wird hier am Beispiel eines Ordered Bi Bi-Mecha-
nismus beschrieben.
1. Schritt: Zunchst wird ein Polygon skizziert, dessen Ecken die im Mechanis-
mus auftretenden Enzymformen bilden. Diese werden mit Doppelpfeilen verbunden,
auf denen die zugehrigen Geschwindigkeitskonstanten, gegebenenfalls multipliziert
mit eintretenden Liganden (Substrate bzw. Produkte) geschrieben werden. Eine Frei-
setzung von Liganden wird dagegen nicht vermerkt. Es mssen immer geschlossene
Reaktionsschemata entstehen, auch sind alle mglichen Wege zu bercksichtigen.
Fr den Ordered-Mechanismus ergibt sich folgendes Schema, wobei die zentralen
Komplexe von Substraten und Produkten auch hier zusammengefat werden:
126 2 Enzymkinetik
(2.161)
Fr einen Random Bi Uni-Mechnismus (zwei Substrate ergeben ein Produkt) sieht
das Schema folgendermaen aus:
(2.162)
2. Schritt: Es werden nun alle mglichen Figuren gezeichnet, mit denen alle Enzym-
formen durch Linien direkt miteinander verbunden werden knnen, ohne da ge-
schlossene Figuren entstehen. Fr den Random Bi Uni-Mechanismus ergeben sich
acht solcher Figuren:
fr den Ordered-Mechanismus dagegen nur vier:
Die Zahl der mglichen Kombinationen ist m!/(n1)!(mn+1)! fr einfache Mecha-
nismen mit nur einem Reaktionszyklus; n ist die Zahl der verschiedenen Enzymfor-
men und m die Zahl der Verknpfungen zwischen den Enzymformen im ursprngli-
chen Reaktionsschema. Bei mehreren Zyklen sind fr jeden Zyklus diejenigen Kom-
binationen, die geschlossene Figuren ergeben, abzuziehen. Diese sind fr jeden Zy-
klus zu errechnen nach (mr)!/(nr1)!(mn+1)!, wobei r die Zahl der Verknpfun-
gen im geschlossenen Zyklus sind. Fr den Random Bi Uni-Mechanismus ergben
sich demnach zunchst 5!/(41)!(54+1)! =10 Figuren, fr die beiden Zyklen mit je
drei Verknpfungen sind jedoch zweimal (53)!/(431)!(54+1)! =1 abzuziehen, so
da acht offene Figuren resultieren.
A2.7 Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen komplexer Enzymmechanismen 127
3. Schritt: Es werden nun nacheinander die Positionen jeder einzelnen Enzymform
in smtlichen Figuren markiert und diejenigen Pfeile eingezeichnet, die zur jeweili-
gen Enzymform hinfhren. Aus dem ursprnglichen Reaktionsschema werden die zu
den Pfeilen gehrigen Beschriftungen aus Geschwindigkeitskonstanten und Konzen-
trationsgliedern bernommen. Diese Vorgehensweise ist hier fr das freie Enzym ge-
zeigt, die anderen Formen sind entsprechend zu behandeln. Die Geschwindigkeitskon-
stanten und Konzentrationsglieder jeder Figur werden als Produkt zusammengefat:
Die relative Menge der jeweiligen Enzymform wird gebildet aus einem speziellen
Zhlerterm Z und einem allen Enzymformen gemeinsamen Nennerterm N. Der Zh-
ler ist die Summe der aus den Figuren fr jede Enzymform ermittelten Produkte:
[E[
[E[
0
=
Z
E
N
=
k
1
k
2
k
3
[P[ k
2
k
3
k
4
[B[ k
1
k
3
k
4
k
1
k
2
k
4
N
Y
[EA[
[E[
0
=
Z
EA
N
=
k
1
k
2
k
3
[A[[P[ k
2
k
3
k
4
[P[[Q[ k
1
k
3
k
4
[A[ k
1
k
2
k
4
[A[
N
Y
[EAB[
[E[
0
=
Z
EAB
N
=
k
1
k
2
k
3
[A[[B[[P[k
2
k
3
k
4
[B[[P[[Q[k
1
k
3
k
4
[P[[Q[k
1
k
2
k
4
[A[[B[
N
Y
[EQ[
[E[
0
=
Z
EQ
N
=
k
1
k
2
k
3
[A[[B[ k
2
k
3
k
4
[B[[Q[ k
1
k
3
k
4
[Q[ k
1
k
2
k
4
[Q[
N
X
Der Nenner ist die Summe aller Zhlerterme:
N = Z
E
Z
EA
Z
EAB
Z
EQ
(2X163)
= k
1
k
2
k
3
[P[ k
2
k
3
k
4
[B[ k
1
k
3
k
4
k
1
k
2
k
4
k
1
k
2
k
3
[A[[P[ k
2
k
3
k
4
[P[[Q[
k
1
k
3
k
4
[A[ k
1
k
2
k
4
[A[ k
1
k
2
k
3
[A[[B[[P[ k
2
k
3
k
4
[B[[P[[Q[ k
1
k
3
k
4
[P[[Q[
k
1
k
2
k
4
[A[[B[ k
1
k
2
k
3
[A[[B[ k
2
k
3
k
4
[B[[Q[ k
1
k
3
k
4
[Q[ k
1
k
2
k
4
[Q[ X
Die Geschwindigkeitsgleichung der Reaktion in der allgemeinen Form hat als Nen-
ner ebenfalls N. Ihr Zhler ist die Differenz zwischen dem Produkt aller Substratkon-
zentrationen und einem Zhlerkoeffizienten Z
1
einerseits und dem Produkt aller Pro-
duktkonzentrationen und einem Zhlerkoeffizienten Z
2
andererseits. Z
1
=[E]
0
k
1
k
2
k
3
. . .
ist das Produkt aller Geschwindigkeitskonstanten der Hinreaktion mit der Enzymkon-
128 2 Enzymkinetik
zentration Z
2
=[E]
0
k
1
k
2
k
3
. . . das Produkt aller Geschwindigkeitskonstanten der
Rckreaktion mit der Enzymkonzentration:
v =
(Z
1
[A[[B[[C[ F F F Z
2
[P[[Q[[R[ F F F)
N
X (2X164)
4. Schritt: Der Nenner wird nun in die Koeffizientenform umgeschrieben. Dazu wer-
den alle Geschwindigkeitskonstanten nach ihren Konzentrationsgliedern geordnet
N = k
1
k
4
(k
2
k
3
) k
1
k
4
(k
2
k
3
)[A[ k
2
k
3
k
4
[B[ k
1
k
2
k
3
[P[k
1
k
4
(k
2
k
3
)[Q[
k
1
k
2
(k
3
k
4
)[A[[B[ k
1
k
2
k
3
[A[[P[ k
2
k
3
k
4
[B[[Q[ k
3
k
4
(k
1
k
2
)[P[[Q[
k
1
k
2
k
3
[A[[B[[P[ k
2
k
3
k
4
[B[[P[[Q[ (2X165)
und die unter demselben Konzentrationsglied stehenden Geschwindigkeitskonstanten
ausgedrckt als Koeffizient Ko der betreffenden Konzentrationsglieder, z. B. Ko-
AB=k
1
k
2
(k
3
+k
4
). Der gesamte Nennerausdruck in der Koeffizientenform lautet dann:
N = Ko KoA[A[ KoB[B[ KoP[P[ KoQ[Q[ KoAB[A[[B[ KoAP[A[[P[
KoBQ[B[[Q[ KoPQ[P[[Q[ KoABP[A[[B[[P[ KoBPQ[B[[P[[Q[ X (2X166)
Mit Hilfe der Koeffizienten werden die kinetischen Konstanten definiert. Die Maxi-
malgeschwindigkeit der Hinreaktion V
1
ist der Quotient aus dem Zhlerkoeffizienten
Z
1
und dem Koeffizienten aller Substrate. Die Maximalgeschwindigkeit der Rckre-
aktion V
2
ist der Quotient aus Z
2
und dem Koeffizienten aller Produkte:
V
1
=
Z
1
KoABC F F F
Y V
2
=
Z
2
KoPQRF F F
X
Die Michaelis-Konstanten sind die Verhltnisse der Koeffizienten aller Substrate bzw.
Produkte abzglich des variablen Substrats bzw. Produkts zu den Koeffizienten smt-
licher Substrate bzw. Produkte:
K
mA
=
KoBC F F F
KoABC F F F
Y K
mB
=
KoAC F F F
KoABC F F F
Y
K
mP
=
KoQRF F F
KoPQRF F F
Y K
mQ
=
KoPRF F F
KoPQRF F F
X
K
g
, die Gleichgewichtskonstante der Reaktion, ergibt sich aus dem Verhltnis der
Zhlerkoeffizienten bzw. der Produkte der Geschwindigkeitskonstanten der Hinreakti-
on zu denen der Rckreaktion:
K
g
=
Z
1
Z
2
=
k
1
k
2
k
3
F F F
k
1
k
2
k
3
F F F
X
A2.7 Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen komplexer Enzymmechanismen 129
Fr den Ordered Bi Bi-Mechanismus erhlt man demnach folgende Konstanten:
V
1
=
k
1
k
2
k
3
k
4
[E[
0
k
1
k
2
(k
3
k
4
)
=
k
3
k
4
[E[
0
k
3
k
4
V
2
=
k
1
k
2
k
3
k
4
[E[
0
k
3
k
4
(k
1
k
2
)
=
k
1
k
2
[E[
0
k
1
k
2
K
mA
=
k
2
k
3
k
4
k
1
k
2
(k
3
k
4
)
=
k
3
k
4
k
1
(k
3
k
4
)
K
mB
=
k
1
k
4
(k
2
k
3
)
k
1
k
2
(k
3
k
4
)
=
k
4
(k
2
k
3
)
k
2
(k
3
k
4
)
K
mP
==
k
1
k
4
(k
2
k
3
)
k
3
k
4
(k
1
k
2
)
=
k
1
(k
2
k
3
)
k
3
(k
1
k
2
)
K
mQ
=
k
1
k
2
k
3
k
3
k
4
(k
1
k
2
)
=
k
1
k
2
k
4
(k
1
k
2
)
K
g
=
k
1
k
2
k
3
k
4
k
1
k
2
k
3
k
4
X
5. Schritt: Zhler und Nenner der in die Koeffizientenform berfhrten Geschwindig-
keitsgleichung werden mit dem Faktor Z
2
/(KoABCF F FKoPQRF F F) multipliziert. Der
Zhler erhlt dann die allgemeine Form:
V
1
V
2
[A[[B[[C[ F F F
[P[[Q[[R[ F F F
K
g
_ _
X (2X167)
Beim Nenner werden die Glieder der Reihe nach mit dem konstanten Faktor multipli-
ziert und es wird versucht, smtliche Koeffizienten durch kinetische Konstanten gem
den obigen Definitionen zu ersetzen. Dies zeigt die Tabelle 2.4. So ergeben sich im
zweiten Nennerglied die Ausdrcke fr K
mB
=KoA/KoAB und V
2
=Z
2
/KoPQ, im dritten
kann man K
mA
und V
2
einsetzen. In anderen Fllen, wie im vierten oder fnften Glied,
wird dies erst durch eine geeignete Erweiterung des Ausdrucks erreicht, die in der zwei-
ten Spalte von Tabelle 2.4 vermerkt ist. Wieder andere Glieder, wie das erste, lassen
sich auch nicht durch Erweiterungen auflsen. In diesen nicht aufzulsenden Ausdrk-
ken verbergen sich die Hemmkonstanten fr die Bindung an das freie Enzym. Diese
wurden bisher nicht definiert, da sie sich in kein einheitliches Schema fgen. Sie erge-
ben sich aus dem konkreten Fall. Auch hier gilt, da der variable Ligand nicht im Zh-
lerterm erscheinen darf, whrend den Nenner der Koeffizient aller im Zhler benannten
zuzglich des variablen Liganden bildet. So steht der Ausdruck Ko/KoA im ersten Glied
offensichtlich fr K
iA
. Da diese Annahme zutreffend ist, wird offenkundig beim Ersatz
der Koeffizienten durch ihre Geschwindigkeitskonstanten, die mit k
1
/k
1
tatschlich die
betreffende Dissoziationskonstante ausdrcken. In Glied sieben wird die gleiche Kon-
stante K
iA
durch andere Koeffizienten, nmlich KoP/KoAP, ausgedrckt. Aber auch
hier verbleibt nach Einsetzen der Geschwindigkeitskonstanten k
1
/k
1
, woraus ersicht-
lich ist, da fr eine Konstante auch mehrere Definitionen mglich sind.
130 2 Enzymkinetik
Fr den Ordered Bi Bi-Mechanismus ergibt sich daraus die Geschwindigkeitsglei-
chung in der Form der kinetischen Konstanten:
v =
V
1
V
2
[A[[B[
[P[[Q[
K
g
_ _
K
iA
K
mB
V
2
K
mB
V
2
[A[ K
mA
V
2
[B[
K
mQ
V
1
[P[
K
g

K
mP
V
1
[Q[
K
g
V
2
[A[[B[
K
mQ
V
1
[A[[P[
K
iA
K
g

K
mA
V
2
[B[[Q[
K
iQ

V
1
[P[[Q[
K
g

V
2
[A[[B[[P[
K
iP

V
1
[B[[P[[Q[
K
iB
K
g
X (2X168)
Diese immer noch sehr komplizierte Gleichung vereinfacht sich bei Steady-State-
Messungen der Anfangsgeschwindigkeit zu der bereits bekannten Gl. (2.133) fr die
Hinreaktion unter der Annahme [P] =[Q] =0:
v =
V
1
[A[[B[
K
iA
K
mB
K
mB
[A[ K
mA
[B[ [A[[B[
(2X133 a)
und fr die Rckreaktion fr [A] =[B] =0:
v =
V
2
[P[[Q[
K
iA
K
mB
K
mQ
[P[ K
mP
[Q[ [P[[Q[
X (2X133 b)
A2.7 Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen komplexer Enzymmechanismen 131
Tab. 2.4. Umformung des Nenners aus Gl. (2.166) von der Form der Koeffizienten in die der kineti-
schen Konstanten. Der konstante Faktor, mit dem smtliche Nennerglieder multipliziert wurden, ist in
der ersten Spalte hervorgehoben.
Nennerterme in
Koeffizientenform
Erweiterung Nennerterme in
Konstantenform
Definition der
Hemmkonstanten
Z
2
uo
KoABKoPQ
KoA K
iA
K
mB
V
2
u
ie
=
uo
uoe
=
k
I
k
I
Z
2
uoe[e[
KoABKoPQ
K
mB
V
2
[A]
Z
2
uof[f[
KoABKoPQ
K
mA
V
2
[B]
Z
2
uo[[
KoABKoPQ
Z
1
u
m

I
[[
u
g
Z
2
uo[[
KoABKoPQ
Z
1
u
m

I
[[
u
g
Z
2
uoef[e[[f[
KoABKoPQ
V
2
[A][B]
Z
2
uoe[e[[[
KoABKoPQ
KoP Z
1
u
m

I
[e[[[
u
ie
u
g
u
ie
=
uo
uoe
=
k
I
k
I
Z
2
uof[f[[[
KoABKoPQ
KoB
u
me

P
[f[[[
u
i
u
i
=
uof
uof
=
k
R
k
R
Z
2
uo[[[[
KoABKoPQ
Z
1

I
[[[[
u
g
Z
2
uoef[e[[f[[[
KoABKoPQ

P
[e[[f[[[
u
i
u
i
=
uoef
uoef
=
k
Q
k
R
k
Q
Z
2
uof[f[[[[[
KoABKoPQ
Z
1

I
[f[[[[[
u
if
u
g
u
if
=
uo
uof
=
k
I
k
P
k
P
2.7.2 Vereinfachtes Verfahren nach der Graphentheorie
Auch wenn das King-Altman-Verfahren eine deutliche Vereinfachung gegenber der
Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen nach den Steady-State-Regeln bringt,
erhlt man auch hier bei umfangreichen Mechanismen beraus komplizierte Anstze.
Volkenstein und Goldstein (1966) konnten das King-Altman-Verfahren mit Hilfe der
fr elektronische Signale entwickelten Graphentheorie vereinfachen. Eine noch wei-
tergehende Vereinfachung, fr die nur noch ein rudimentres Verstndnis von Alge-
bra notwendig sei, wurde von Fromm (1970) entwickelt.
Wie beim King-Altman-Verfahren werden geschlossene Reaktionsschemata fr
den jeweiligen Mechanismus erstellt. Die einzelnen Enzymformen gelten als Knoten-
punkte und werden fortlaufend nummeriert:
(2.169)
Die Determinante fr einen Knotenpunkt, z. B. fr 1 (&[E]), setzt sich zusammen
aus zwei Anteilen. Zunchst werden die Konstanten bzw. Ausdrcke der krzesten
Ein-Schritt-Wege, die zu diesem Knoten fhren, genommen, also 2?1&k
1
und
4?1&k
4
im vorliegenden Beispiel. An diese werden die Nummern der Knoten-
punkte geschrieben, die nicht durch den jeweiligen Ein-Schritt-Weg berhrt werden,
d. h.
[E[ = (2 1)(3)(4) (4 1)(2)(3) Y
und jede dieser Nummern wird ersetzt durch die Summe von Ausdrcken derjenigen
Pfeile, die von diesen wegfhren:
[E[ = k
1
(k
2
k
3
)(k
3
[P[ k
4
) k
4
(k
1
k
2
[B[)(k
3
k
2
) X
Durch Ausmultiplizieren ergibt sich:
[E[ =k
1
k
2
k
3
[P[ k
1
k
3
k
3
[P[ k
1
k
2
k
4
k
1
k
3
k
4
k
1
k
3
k
4
k
2
k
3
k
4
[B[
k
1
k
2
k
4
k
2
k
2
k
4
[B[ X
Eliminiert werden verbotene Glieder, die Geschwindigkeitskonstanten fr Hin- und
Rckreaktion desselben Schritts enthalten, also k
1
k
3
k
3
[P] und k
2
k
2
k
4
[B]. Bei red-
undanten Ausdrcken (k
1
k
2
k
4
, k
1
k
3
k
4
) bleibt nur jeweils ein Glied stehen, so da
schlielich fr [E] die gleiche Beziehung resultiert wie beim King-Altman-Verfahren:
132 2 Enzymkinetik
[E[ = k
1
k
2
k
3
[P[ k
1
k
2
k
4
k
1
k
3
k
4
k
2
k
3
k
4
[B[ X
Diese Prozedur wird fr alle Enzymformen durchgefhrt und dann analog dem King-
Altman-Verfahren die Geschwindigkeitsgleichung erhalten.
2.7.3 Kombination von Gleichgewichts- und Steady-State-Annahmen
Eine noch weitergehende Vereinfachung beruht auf der ursprnglichen auch von Mi-
chaelis und Menten getroffenen Annahme schneller Gleichgewichte, die sich unver-
hltnismig rascher einstellen als der katalytische Umsatz (Cha, 1968). Komplexere
Mechanismen werden unterteilt in verschiedene Segmente, innerhalb derer die einzel-
nen Reaktionsschritte im schnellen Gleichgewicht zueinander stehen. Diese Segmente
sind durch langsame Reaktionsschritte getrennt. Ein fraktioneller Konzentrationsfak-
tor f
i
gibt das Verhltnis der Konzentration einer speziellen Enzymform (E
i
) zur Sum-
me der Konzentrationen aller Enzymformen des jeweiligen schnellen Gleichgewichts-
segments an:
f
i
=
[E
i
[

n
i=1
[E
i
[
Das Vorgehen nach diesem Verfahren sei am Beispiel eines Ping-Pong Bi Bi-Mecha-
nismus unter der Annahme langsamer katalytischer Gleichgewichte gegenber
schnellen Bindungsschritten demonstriert:
(2.170)
Die Enzymformen der beiden Segmente X
1
=[E]+[EA]+[EQ] und X
2
=[E
/
] + [E
/
B] +
[E
/
P] stehen untereinander in einem schnellen Gleichgewicht. Die Geschwindigkeits-
gleichung gem der allgemeinen King-Altman-Form lautet:
v =
(k
2
k
5
f
2
f
5
k
2
k
5
f
2
f
5
)[E[
0
k
2
f
2
k
2
f
2
k
5
f
5
k
5
f
5
X (2X171)
A2.7 Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen komplexer Enzymmechanismen 133
Die fraktionellen Konzentrationsfaktoren fr die betreffenden Enzymformen werden
so definiert, da zunchst eine Enzymform, z. B. E bzw. E
/
, als Referenz genommen
und eins gesetzt wird. Die anderen Enzymformen werden durch die Konzentrations-
variablen der zugehrigen Liganden und die Geschwindigkeits- bzw. Dissoziations-
konstanten ersetzt. Dabei steht die Konzentrationsvariable auf dem Bruchstrich und
die Dissoziationskonstante unter diesem, falls der Ligand an die betreffende Enzym-
form bindet. Dissoziiert er dagegen ab, kehrt sich der Bruch um (im folgenden ste-
hen anstelle der Dissoziations- die Geschwindigkeitskonstanten):
f
EA
=
[EA[
X
1
=
k
1
[A[
k
1
1
k
1
[A[
k
1

k
6
[Q[
k
6
=
k
1
k
6
[A[
k
1
k
6
k
1
k
6
[A[ k
1
k
6
[Q[
Y
f
E
/
P
=
[E
/
P[
X
2
=
k
3
[P[
k
3
1
k
4
[B[
k
4

k
3
[P[
k
3
=
k
3
k
4
[P[
k
3
k
4
k
3
k
4
[A[ k
3
k
4
[P[
Y
f
E
/
B
=
[E
/
B[
X
2
=
k
4
[B[
k
4
1
k
4
[B[
k
4

k
3
[P[
k
3
=
k
3
k
4
[B[
k
3
k
4
k
3
k
4
[A[ k
3
k
4
[P[
Y
f
EQ
=
[EQ[
X
1
=
k
6
[Q[
k
6
1
k
1
[A[
k
1

k
6
[Q[
k
6
=
k
1
k
6
[Q[
k
1
k
6
k
1
k
6
[A[ k
1
k
6
[Q[
X
Wird anstatt E EQ als Referenz verwendet und 1 gesetzt, dann lautet der fraktionelle
Konzentrationsfaktor f
EA
:
f
EA
=
[EA[
X
1
=
k
1
[A[k
6
k
1
k
6
[Q[
k
6
k
6
[Q[

k
1
[A[k
6
k
1
k
6
[Q[
=
k
1
k
6
[A[
k
1
k
6
k
1
k
6
[A[ k
1
k
6
[Q[
Y
es resultiert der gleiche Ausdruck. Werden nun die fraktionellen Konzentrationsfakto-
ren in Gl. (2.171) ersetzt, so erhlt man die Geschwindigkeitsgleichung fr den Ping-
Pong-Mechanismus in Form der Geschwindigkeitskonstanten, die sich von einer
durch den King-Altman-Mechanismus hergeleiteten Gleichung dadurch unterscheidet,
da die Konstanten k
2
, k
2
, k
5
und k
5
fr die langsamen Schritte teilweise vernach-
lssigt sind:
134 2 Enzymkinetik
v =
(k
1
k
2
k
3
k
4
k
5
k
6
[A[[B[ k
1
k
2
k
3
k
4
k
5
k
6
[P[[Q[)[E[
0
k
1
k
2
k
3
k
4
k
6
[A[ k
1
k
3
k
4
k
5
k
6
[B[ k
1
k
3
k
4
k
6
(k
2
k
5
)[A[[B[ k
1
k
2
k
3
k
4
k
6
[P[
k
1
k
3
k
4
k
5
k
5
k
6
[Q[ k
1
k
3
k
4
k
6
(k
2
k
5
)[P[[Q[
k
1
k
3
k
4
k
6
(k
2
k
2
)[A[[P[ k
1
k
3
k
4
k
6
(k
5
k
5
)[B[[Q[
X
2.8 Kinetische Behandlung allosterischer Enzyme
Allosterische Enzyme, die als Stoffwechselregulatoren eine zentrale Rolle spielen,
wurden, zusammen mit den wichtigsten Modellvorstellungen, dem Symmetrie- und
dem Sequenz-Modell, bereits im Kapitel Multiple Gleichgewichte behandelt, denn
die Kooperativitt, die den allosterischen Mechanismen zugrundeliegt, lt sich auf
Gleichgewichtsvorgnge zurckfhren. Trotzdem werden allosterische Enzyme auf-
grund des einfacheren Nachweises oft mit kinetischen Methoden charakterisiert. Es
werden vergleichbare (zumeist sigmoide) Abweichungen vom Michaelis-Menten-Ver-
halten des Substrates wie auch Beeinflussungen durch allosterische Effektoren beob-
achtet, wie sie fr die Ligandenbindung beschrieben wurden. Entsprechend sind auch
die dort behandelten Auswertungsverfahren anwendbar, wobei anstelle der Stti-
gungsfunktionen r bzw. Y nunmehr v tritt. So lautet die Ordinatenbezeichnung im
Hill-Diagramm anstatt log (Ya(1 Y)) hier log (v/(Vv)). Eine weitere Besprechung
dieser Enzymklasse erbrigt sich daher. Hier soll nur das spezielle Phnomen der ki-
netischen Kooperativitt behandelt werden.
2.8.1 Hysteretische Enzyme
Bei zahlreichen Enzymreaktionen, wie der Phosphofructokinase und den thiamindi-
phosphathaltigen a-Oxosure-Dehydrogenase-Multienzymkomplexen (z. B. Pyruvat-
Dehydrogenase-Komplex) werden Reaktionsverlufe beobachtet, die durch die Stea-
dy-State-Theorie nicht zu erklren sind. Die Reaktion startet bei diesen Enzymen
nicht mit einer linearen Anfangsgeschwindigkeit nullter Ordnung, vielmehr beobach-
tet man nach Substratzugabe zunchst keinerlei Umsatz. Erst nach einer Verzge-
rungszeit, die einige Sekunden bis zu mehreren Minuten andauern kann, setzt die Re-
aktion ein und steigert sich zum linearen Steady-State-Bereich. Danach klingt die Re-
aktion, wie bei normalen Enzymen, durch Substraterschpfung ab (Abb. 2.30A). In
Anlehnung an die beim Magnetismus beobachtete Retardierung prgte C. Frieden fr
diese Art von Enzymen den Begriff hysteretische Enzyme. Ursachen des verzgerten
Reaktionsbeginns knnen unterschiedlicher Natur sein, offensichtlich geht das Enzym
in Wechselwirkung mit dem Substrat in einem langsamen Proze, zumeist einer Kon-
formationsnderung, von einer inaktiven in eine aktive Form ber. Da diese Enzyme
nicht unmittelbar, sondern auf zeitlich zurckliegende Vorgnge reagieren, also eine
Art Erinnerungsvermgen besitzen, wird auch von einem Enzymgedchtnis (mnemo-
nische Enzyme) gesprochen. Die Hysterese hat physiologisch eine dmpfende Wir-
A2.8 Kinetische Behandlung allosterischer Enzyme 135
kung. Das System reagiert nicht sofort auf metabolische nderungen, kurzzeitige,
nicht anhaltende Impulse werden ignoriert, Schwankungen werden ausgeglichen.
Die Dauer der Verzgerungsphase s (engl.: lag phase) wird, wie in Abb. 2.30A
gezeigt, durch Extrapolation des linearen Steady-State-Bereich auf die Abszisse oder
Ordinate bestimmt. Zuverlssiger ergibt sie sich aus der Steigung einer halblogarith-
mischen Darstellung der um die Steady-State-Geschwindigkeit v
ss
reduzierten Um-
satzgeschwindigkeit v (durch Tangenten an die Zeit-Umsatz-Kurve zu erhalten) ge-
gen die Zeit im Bereich der Verzgerungsphase (Abb. 2.30B). Eine lineare Abhn-
gigkeit in diesem Diagramm ist gleichzeitig eine Kontrolle fr einen Vorgang pseu-
do-erster Ordnung der Verzgerungsphase. Vielfach wird der Steady-State-Bereich
nicht zuverlssig erhalten, wenn sich direkt an die Verzgerungsphase bereits der
nicht-lineare Abfall der Reaktionsgeschwindigkeit anschliet. Die Zeit-Umsatz-Kurve
durchluft dann einen Wendepunkt, dessen Umgebung einen linearen Steady-State-
Verlauf vortuschen kann. In diesen Fllen kann s aus der Steigung eines Guggen-
heim-Diagrammes erhalten werden (Abb. 2.30C). Hier wird jeweils die Differenz
zweier durch ein konstantes Zeitintervall Dt voneinander getrennten Substratkonzen-
trationen [A]
i
und [A]
1+D
logarithmisch gegen die Zeit aufgetragen, wobei die Stei-
gung den Wert 1/s annimmt. Die dem Diagramm zugrundeliegende Beziehung leitet
sich aus Gl. (2.3) fr eine Reaktion erster Ordnung her:
[A[
i
[A[
iD
= [A[
0
e
tas
(1 e
Dtas
) Y (2X173)
wobei e
Dt/s
konstant ist.
136 2 Enzymkinetik
Abb. 2.30. Zeitverlauf einer hysteretischen Reaktion im Vergleich zu einem normalen Reaktionsver-
lauf nullter Ordnung. A) Zeit-Umsatz-Kurve, die Bestimmung der Geschwindigkeiten in der Anfangs-
(v
i
) und der Steady-State-Phase (v
ss
) sowie die Dauer der Verzgerungsphase s sind angegeben; B)
halblogarithmische Auftragung, C) Guggenheim-Diagramm.
2.8.2 Kinetische Kooperativitt, Slow-Transition-Modell
Langsame Aktivierungsprozesse bei enzymatischen Reaktionen knnen Abweichungen
von der Michaelis-Kinetik in der Art positiver oder negativer Kooperativitt verursa-
chen, ohne da dafr Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten notwendig sind (ki-
netische Kooperativitt). Im Slow-Transition-Modell (Abb. 2.31) wird eine gegenber
Substratbindung und Umsatzgeschwindigkeit langsame Umwandlung einer wenig akti-
ven (E) in eine aktive Enzymform (E
/
) angenommen. Sigmoides Sttigungsverhalten
des Substrats wird dann bei Messung der Umsatzgeschwindigkeit beobachtet, wobei
Voraussetzung ist, da beide Enzymzustnde Substrat binden und katalytisch aktiv
sind, wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz. In Abwesenheit des Substrats liegt
das Enzym in der inaktiven Form vor. Ist nur eine Enzymform aktiv und erfolgt die
langsame Konformationsumwandlung des Enzyms vor der Ligandenbindung, so wird
zwar eine Verzgerungsphase, nicht aber sigmoides Sttigungsverhalten beobachtet.
Der Hill-Koeffizient kann bei der kinetischen Kooperativitt maximal 2 erreichen, da
die Reaktion hinsichtlich des Substrats zweiter Ordnung ist und das Substrat an zwei
verschiedenen Stellen (EA und E
/
A) reagiert. Zur Unterscheidung von der Kooperativi-
tt werden bei diesem Mechanismus sigmoide Sttigungskurven nur bei Messungen der
Umsatzgeschwindigkeit, nicht aber der Substratbindung erhalten. Substratbindungskur-
ven zeigen einen normalen hyperbolen Verlauf. Der Mechanismus ist in der Weise vor-
stellbar, da das Enzym nach Bindung des Substrats in den aktiven Zustand bergeht.
Bei geringen Substratmengen kann das Enzym nach jedem Substratumsatz wieder in
den weniger aktiven Zustand zurckkehren, ehe das nchste Substratmolekl bindet.
Bei zunehmender Substratkonzentration reicht fr eine steigende Zahl von Enzymmo-
leklen die Zeit bis zur Bindung des nchsten Substratmolekls nicht mehr zur Rck-
kehr in den ursprnglichen Zustand aus. Bei hohen Substratkonzentrationen verbleiben
alle Enzymmolekle in der aktiven Form, das Enzym arbeitet mit hchster Effizienz.
Im Unterschied zu den auf Gleichgewichten beruhenden allosterischen Modellen,
dem Symmetrie- und dem Sequenz-Modell, ist kinetische Kooperativitt auch fr
A2.8 Kinetische Behandlung allosterischer Enzyme 137
Abb. 2.31. Schema des
Slow-Transition-Modells fr
ein monomeres Enzym.
monomere Systeme mglich. Sie wurde zuerst bei der monomeren Ribonuclease
nachgewiesen. Spter fanden sich weitere Beispiele, wie die Hexokinase und die Glu-
cokinase. Allerdings mu kinetische Kooperativitt nicht auf monomere Enzyme be-
grenzt sein. So wurde auch fr den aus 24 Protomeren aufgebauten bakteriellen Pyru-
vat-Dehydrogenase-Komplex, dem grten lslichen Enzymaggregat dieser Zellen,
ein solcher Mechanismus ohne Beteiligung von Wechselwirkungen zwischen Unte-
reinheiten nachgewiesen (Bisswanger, 1984).
2.9 Spezielle Enzym-Mechanismen
2.9.1 Kinetik immobilisierter Enzyme
Immobilisierten Enzymen kommt bei biotechnologischen Verfahren in Enzymreakto-
ren oder bei Biosensoren, aber auch in der Medizin, steigende Bedeutung zu. In der
Zelle knnen membrangebundene Enzyme als immobilisierte Systeme betrachtet wer-
den.
Die kinetische Behandlung eines immobilisierten Enzymsystems hngt von dessen
spezieller Struktur ab, allgemeinverbindliche Regeln knnen kaum aufgestellt wer-
den. Die Immobilisierung von Enzymen erfolgt hufig ber kovalente Bindung an fe-
ste Oberflchen, eine Matrix, wie Dextrane, Agarose, knstliche Polymere, Glas oder
Keramik. Solange eine Wirkung des Trgers auf die Reaktionspartner, insbesondere
die Diffusionsfhigkeit des Substrats bzw. Produkts ausgeschlossen werden kann,
sind diese Systeme in kinetischer Hinsicht wie lsliche Enzyme zu behandeln. Der
Trger kann jedoch auf Substrate und Produkte abstoend oder anziehend wirken
und damit die Konzentrationsverhltnisse in der Umgebung des immobilisierten En-
zyms in negativer oder positiver Weise beeinflussen. Oft wirkt die (z. B. hydrophobe)
Oberflche des Trgers wie eine Grenzschicht, die den Durchtritt des Substrats zum
katalytischen Zentrum erschwert. Ein solcher Fall liegt auch bei Enzymen vor, die in
Organellenmembranen eingebettet sind. Ein anderes Prinzip der Fixierung ist der Ein-
schlu des Enzyms in eine fr das Substrat durchlssige Matrix, wie Agarose, Poly-
acrylamid oder Nylonkugeln. Das Enzym wird dabei nicht durch kovalente Fixierung
modifiziert und kann seine native Struktur weitgehend erhalten. Auch hier sind die
Regeln fr Enzyme in Lsung anwendbar, solange die Konzentrationsverhltnisse im
Partikel mit der umgebenden Lsung ausgeglichen sind. Dies erfordert eine freie Dif-
fusionsfhigkeit aller beteiligten Komponenten, wie Substrate, Produkte oder Ionen
(pH-Vernderung!). Ist das nicht gewhrleistet, so beobachtet man Abweichungen des
Verhaltens des immobilisierten Enzyms gegenber dem in Lsung. Setzt das Enzym
das Substrat rascher um, als dieses durch die Matrix diffundieren kann, so kommt es
in der Umgebung des Enzyms zu einer Substratverarmung, deren Ausma von der
Substratkonzentration im umgebenden Medium abhngt. Bei geringen Substratkon-
zentrationen, wo das Enzym am effizientesten arbeitet, ist die Substratverarmung
strker ausgeprgt, whrend sie im Bereich der Substratsttigung vergleichsweise ge-
ring wird. Umgekehrt verhlt es sich mit dem Produkt, das sich bei Diffusionsbe-
schrnkung anhuft und an der Abdissoziation gehindert wird.
138 2 Enzymkinetik
Die kinetischen Modelle, die aus solchen Betrachtungen entwickelt werden, be-
rcksichtigen nur die Wechselwirkung zwischen dem Enzym und seiner unmittelba-
ren Umgebung an der Matrix, insbesondere mit dem Substrat. Besondere Effekte auf
individuelle Enzyme knnen nicht bercksichtigt werden. So kann die Immobilisie-
rung eines Enzyms durch kovalente Modifizierung mittelbar oder unmittelbar am ka-
talytischen Mechanismus beteiligter funktioneller Gruppen den Reaktionsmechanis-
mus beeinflussen. Teilweise werden Konformationsnderungen zum aktiven Zustand
oder regulatorische Einflsse durch Trgerfixierung erschwert oder ganz unterdrckt.
Die enge Bindung an den Trger verursacht unter Umstnden eine Abschirmung des
aktiven Zentrums.
Durch Diffusionsbehinderung des Substrats kann sich die experimentell bestimmte
Umsatzgeschwindigkeit des immobilisierten Enzyms v
/
von der des nativen Enzyms
in Lsung v
kin
um den Effizienzfaktor g
e
unterscheiden:
v
/
= g
e
v
kin
= g
e
V[A[
K
m
[A[
X (2X174)
g
e
ist selbst eine Funktion der Substratkonzentration, fr g
e
=1 ist die Reaktion kine-
tisch kontrolliert, die Reaktion des immobilisierten Enzyms entspricht der des freien,
und es gehorcht der Michaelis-Menten-Gleichung. Bei niedrigeren Werten von g
e
wird die Reaktion zunehmend diffusionskontrolliert, die Michaelis-Menten-Gleichung
bleibt nicht mehr gltig, so da die blichen Linearisierungsverfahren keine Geraden
mehr liefern. Gleichung (2.174), wie auch die nachfolgenden Betrachtungen, gehen
von einer Einsubstratreaktion aus. Solange alle brigen Substrate und Cofaktoren in
sttigenden Mengen vorliegen, ist dies auch auf Mehrsubstratreaktionen bertragbar.
Grundstzlich wird zwischen zwei Arten der Diffusionslimitierung unterschieden
(Abb. 2.32). Die externe Diffusionslimitierung wird verursacht durch eine Grenz-
schicht zwischen der Matrix, in die das Enzym eingebettet ist, und der umgebenden
Lsung, die vom Substrat berwunden werden mu. Bei der internen Diffusionslimi-
tierung beeinflut die Matrix die Diffusion des Substrats.
A2.9 Spezielle Enzym-Mechanismen 139
Abb. 2.32. Schematische Darstel-
lung externer (A) und interner (B)
Diffusionslimitierung; *Substrat;
n Produkt.
2.9.1.1 Externe Diffusionslimitierung
Das Substrat mu eine Grenzschicht passieren, um zum katalytischen Zentrum eines
Enzyms zu gelangen, das beispielsweise an einer flssigkeitsundurchdringlichen festen
Oberflche fixiert ist. Die Prozesse von Transport und Katalyse erfolgen nacheinander.
Der Flu J
s
des Substrats aus der umgebenden Lsung mit der Substratkonzentration
[A]
0
zum aktiven Zentrum an der Oberflche mit der Substratkonzentration [A] ist:
J
s
= h
s
([A[
0
[A[) =
D
s
([A[
0
[A[)
d
X (2X175)
h
s
=D
s
/d ist der Transportkoeffizient und D
s
der Diffusionskoeffizient des Substrats, d
ist die effektive Grenzschichtdicke. D
s
und h
s
knnen durch verschiedene Methoden,
wie radioaktive Tracertechnik oder Diffusionszellen (Rovito et al. 1973) bestimmt
bzw. der Literatur (Bird et al. 1960) entnommen werden. Der Substratflu zum akti-
ven Zentrum und der, normalerweise der Michaelis-Menten-Beziehung gehorchende,
enzymatische Substratumsatz erfolgen nacheinander. Im Steady-State-Zustand laufen
beide Prozesse mit gleicher Geschwindigkeit ab:
h
s
([A[
0
[A[) =
V[A[
K
m
[A[
X (2X176)
Fr die Substratkonzentration wird die dimensionslose Gre a=[A]/K
m
eingesetzt:
a
0
a =
Va
h
s
K
m
(1 a)
= l
a
1 a
X (2X177)
l=V/h
s
K
m
ist ein dimensionsloses Substratmodul, es gibt das Verhltnis der Ge-
schwindigkeiten der Reaktion und des Transports des Systems an. Fr den Grenzfall
K
m
[A], d. h. bei sehr geringer Substratkonzentration, wird Gl. (2.177) zu:
h
s
([A[
0
[A[) =
V[A[
K
m
X (2X178)
Die Gesamtreaktion verluft nach einer Kinetik erster Ordnung. Die effektive Sub-
stratkonzentration im Bereich um das aktive Zentrum betrgt dann:
[A[ =
h
s
[A[
0
h
s

V
K
m
X (2X179)
Die tatschlich gemessene Umsatzgeschwindigkeit v
/
ist:
v
/
=
V[A[
K
m
=
V
K
m
h
s
[A[
0
h
s

V
K
m
=
[A[
0
1
h
s

K
m
V
X (2X180)
140 2 Enzymkinetik
Fr h
s
V/K
m
ist der Transport schneller als die enzymatische Reaktion, die Reak-
tion ist kinetisch kontrolliert:
v
/
= v
kin
=
V[A[
0
K
m
X (2X181)
Umgekehrt wird die Reaktion bei sehr langsamem Transport durch die Matrix, h
s

V/K
m
, diffusionskontrolliert:
v
/
= v
diff
= h
s
[A[
0
X (2X182)
Fr den Grenzfall K
m
[A], d. h. bei sttigender Substratkonzentration, dem Bereich
der Reaktion nullter Ordnung, strebt v
/
in jedem Fall dem Sttigungswert V zu (Gl.
(2.176), Abb. 2.33A). Im mittleren Substratbereich ([A]*K
m
) tragen, entsprechend
ihrer Gre, v
kin
oder v
diff
den greren Anteil zur Gesamtreaktion bei. Es resultiert
eine Sttigungsfunktion, die sich aus Anteilen des Transportprozesses und der kineti-
schen Reaktion zusammensetzt und die, im Mae der Diffusionslimitierung, einen
gegenber dem wahren K
m
-Wert der Enzymreaktion erhhten scheinbaren (d. h. bei
Halbsttigung ermittelten) K
m
-Wert aufweist. Mit zunehmender Diffusionslimitierung
weicht die Kurve in den graphischen Linearisierungsverfahren (z. B. doppelt-rezipro-
kes Diagramm) immer mehr vom linearen Verlauf der kinetisch kontrollierten Reak-
tion ab. Eine Eigenschaft der externen Diffusionslimitierung ist, da sie sich vielfach
durch Rhren beeinflussen lt, wodurch der Diffusionsausgleich zwischen Lsung
und immobilisiertem Enzym beschleunigt wird.
Bei Kenntnis des Transportkoeffizienten h
s
lassen sich die Geschwindigkeit der ki-
netisch kontrollierten Enzymreaktion v
kin
und die zugehrige Substratkonzentration
[A]
kin
am aktiven Zentrum auf der Membranoberflche aus der Abhngigkeit der ge-
messenen Geschwindigkeit v
/
von der Substratkonzentration der umgebenden Lsung
auf graphischem Wege ermitteln (Abb. 2.33B). Durch einen beliebigen Abszissen-
A2.9 Spezielle Enzym-Mechanismen 141
Abb. 2.33. Reaktion immobilisierter Enzyme. A) Vergleich der gemessenen (v') zur diffusionskontrol-
lierten (v
diff
) und kinetisch kontrollierten (v
kin
) Umsatzgeschwindigkeit. B) Bestimmung von Reakti-
onsgeschwindigkeit v
kin
und Substratkonzentration [A]
kin
am aktiven Zentrum eines immobilisierten
Enzyms.
punkt entsprechend einer bestimmten ueren Substratkonzentration [A]
1
wird eine
Gerade mit der Steigung h
s
gezeichnet. Ein Schnittpunkt dieser Geraden mit einer
Parallelen zur Abszisse an der Stelle der zugehrigen gemessenen Geschwindigkeit
v
/
1
hat die Koordinaten [A]
kin1
und v
kin1
. Auf diese Weise erhlt man punktweise die
Charakteristik der kinetischen Reaktion und mittels der blichen graphischen Verfah-
ren die Konstanten.
2.9.1.2 Interne Diffusionslimitierung
Im Gegensatz zur externen Diffusion verluft die interne Diffusion parallel mit der
enzymkatalysierten Reaktion. Infolge Substratverarmung nimmt die Geschwindigkeit
der Reaktion mit steigendem Abstand des immobilisierten Enzyms von der Mem-
branoberflche ab, whrend die Produktbildung zu lokalen Akkumulationen unter
Ausbildung eines Produktgradienten fhrt. Die simultan verlaufenden Prozesse der
Diffusion durch die Membran und der kinetischen Reaktion verhalten sich additiv:
d[A[
dt
=
d[A[
dt
_ _
diff

d[A[
dt
_ _
kin
Y (2X183)
wobei fr die Diffusion das 2. Ficksche Diffusionsgesetz, fr die kinetische Reaktion
die Michaelis-Menten-Beziehung eingesetzt wird. V
///
ist die intrinsische Maximalge-
schwindigkeit pro Volumeneinheit des porsen Mediums bzw. der Membran:
d[P[
dt
= D
s
d
2
[A[
dx
2
_ _

V
///
[A[
K
m
[A[
X (2X184)
Im stationren Zustand ist d[A]/dt =0:
D
s
d
2
[A[
dx
2
_ _
=
V
///
[A[
K
m
[A[
X (2X185)
Die Differentialgleichung (2.185) lt sich durch numerische Berechnung lsen. Es
werden dimensionslose Gren fr die Substratkonzentration a=[A]/K
m
und fr den
Abstand x von der Oberflche, l =x/L eingefhrt, wobei L die Dicke der Membran
(fr eine Kugel mit dem Partikelradius r wird L durch r/3 ersetzt) und l die Position
in der Membran ist:
d
2
a
dl
2
=
L
2
V
///
K
m
D
s
a
1 a
_ _
= U
2
s
a
1 a
_ _
X (2X186)
U
s
ist das Substrat- oder Thiele-Modul:
U
s
= L

V
///
K
m
D
s
X
_
(2X187)
142 2 Enzymkinetik
Das Thiele-Modul enthlt drei Faktoren, die das Substratprofil in der Membran be-
stimmen, Membrandicke, Diffusionsfhigkeit des Substrats und Enzymaktivitt. Mit
Zunahme von U
s
sinkt die effektive Substratkonzentration in der Membran, die Steil-
heit des Substratgradienten in der Membran nimmt dafr zu. Die Membran verarmt
an Substrat und die Enzymreaktion wird verlangsamt, es ergeben sich Abweichungen
in den linearisierten Darstellungsformen. Wie auch bei der externen Diffusionslimi-
tierung liegt in Gegenwart der internen Diffusionslimitierung die bei Halbsttigung
ermittelte Substratkonzentration ber dem K
m
-Wert des freien Enzyms. Fr kleine
Werte (U
s
1) ist die Reaktion im wesentlichen kinetisch kontrolliert, sie gehorcht
der Michaelis-Menten-Kinetik.
Fr die Bestimmung der kinetischen Konstanten bei immobilisierten Enzymen ist
es wichtig, in einem weiten Konzentrationsbereich des Substrats zu messen, da bei
nicht-linearen Abhngigkeiten innerhalb enger Konzentrationsgrenzen lineare Berei-
che auftreten, die zu falschen Resultaten fhren. Nicht-lineare Kurven knnen nach
einem der gebruchlichen graphischen Verfahren ausgewertet werden, wobei jeweils
davon ausgegangen wird, da bei sehr geringen Substratkonzentrationen die Diffusi-
onslimitierung, bei hohen dagegen die Enzymkatalyse dominiert. Aus Tangenten an
die Extrembereiche knnen, wie in Abb. 2.34 gezeigt, die Konstanten erhalten wer-
den. Diesen Diagrammen liegt die Umformung der Gl. (2.174) fr das doppelt-rezi-
proke Diagramm zugrunde:
1
v
///
=
1
g
e
V
///

K
m
g
e
V
///
[A[
s
Y (1X188)
wobei [A]
s
die effektive Substratkonzentration an der Oberflche ist. Abb. 2.34 zeigt
auch die Art der durch Diffusionslimitierung bedingten Abweichungen vom normalen
linearen Verlauf. Fr sehr kleine Konzentrationen an [A]
s
nhert sich g
e
dem Effizienz-
faktor g
e1
fr eine Reaktion 1. Ordnung. Die scheinbare Michaelis-Konstante in diesem
Bereich ist K=K
m
/g
e1
. Fr hohe Werte von U
s
wird g
e1
=1/U
s
.
A2.9 Spezielle Enzym-Mechanismen 143
Abb. 2.34. Graphisches Verfahren der Bestimmung
kinetischer Konstanten immobilisierter Enzyme bei
interner Diffusionslimitierung (nach Engasser &
Horvath, 1973).
2.9.1.3 Hemmung immobilisierter Enzyme
Alle Einflsse auf das immobilisierte Enzym, die seine Reaktionsgeschwindigkeit
verlangsamen, wirken der Substratverarmung um das Enzym entgegen, Enzymhem-
mung und Diffusionslimitierung wirken antagonistisch. Liegen beide Effekte gleich-
zeitig vor, so schwchen sie sich gegenseitig ab, sie sind insgesamt schwcher als die
Summe der getrennten Effekte erwarten lt. Die Hemmung eines immobilisierten
Enzyms erscheint daher relativ schwcher als die des nativen Enzyms. Die durch Dif-
fusionslimitierung verursachte Nicht-Linearitt der Kurven in graphischen Linearisie-
rungsverfahren wird abgeschwcht, aber auch im Falle einer Nicht-Linearitt bleibt
der Charakter der Hemmung erkennbar: kompetitive Hemmung verndert nur den
scheinbaren K
m
-Wert, nicht die Maximalgeschwindigkeit. Letztere wird auch durch
Diffusionslimitierung nicht berhrt. Nicht-kompetitive Hemmung verndert beide Pa-
rameter, was auch bei einer Diffusionslimitierung erkennbar ist. Fr den Fall einer
einfachen nicht-kompetitiven Hemmung (K
ic
=K
iu
:K
i
, vgl. Gl. (2.65), Abschnitt
2.5.1.2) bei externer Diffusionslimitierung wrde Gl. (2.176) erweitert zu:
h
s
([A[
0
[A[) =
V[A[
(1 [I[aK
i
)(K
m
[A[)
X (2X189)
Ein besonderer Fall ist die Produkthemmung, da sich bei Diffusionslimitierung Pro-
dukt im Bereich des immobilisierten Enzyms anhuft und damit die Hemmung zu-
stzlich verstrkt. Dadurch reduziert sich aber auch die Diffusionslimitierung. Insge-
samt reagiert das immobilisierte Enzym damit schwcher gegenber nderungen der
Produktmenge in seiner Umgebung.
Der Diffusionslimitierung entgegen wirken auch alle anderen, die Enzymaktivitt
beeinflussenden, Faktoren, so eine durch die Immobilisierungsprozedur des Enzyms
verursachte partielle Inaktivierung. Auch hier wird aufgrund verminderter Diffusions-
limitierung das Ausma der Inaktivierung geringer gemessen, als es den tatschli-
chen Verhltnissen entspricht und somit eine grere Effizienz der Immobilisierung
vorgetuscht. Dadurch entsteht auch der Eindruck einer scheinbar verbesserten Lang-
zeitstabilitt infolge der Immobilisierung.
2.9.1.4 pH- und Temperaturverhalten immobilisierter Enzyme
Immobilisierte Enzyme zeigen eine vernderte Abhngigkeit von pH und Ionenstr-
ke. Dies gilt insbesondere, wenn diese Parameter durch die Enzymreaktion selbst ver-
ndert werden, wie bei Verbrauch bzw. Bildung von Suren (z. B. Proteasen) oder
Basen (z. B. Urease) als Substrate oder Produkte der Enzymreaktion. Durch Anhu-
fung solcher Reaktionsprodukte infolge von Diffusionslimitierung kann sich das
scheinbare pH-Optimum des Enzyms um 12 pH-Werte gegenber dem freiem En-
zym verschieben. hnliche Verschiebungen der pH-Optimumskurve treten ein, wenn
das Enzym an eine positiv oder negativ geladene Matrix gekoppelt wird.
Immobilisierte Enzyme zeigen in der Arrhenius-Darstellung (vgl. Abschnitt
2.10.4) hufig Inhomogenitten, d. h. bergnge zwischen lineraren Bereichen unter-
144 2 Enzymkinetik
schiedlicher Steigungen. Das ist dadurch zu erklren, da im unteren Temperaturbe-
reich wegen der sehr langsamen Enzymreaktion der gesamte Vorgang chemisch kon-
trolliert ist. Die Diffusionslimitierung kommt nicht zum Ausdruck (Abb. 2.35). Mit
steigender Umsatzrate bei hheren Temperaturen tritt schlielich Substratverarmung
ein, die Gesamtreaktion zeigt die Charakteristik der Diffusionslimitierung mit einer
geringeren Steigung im Arrhenius-Diagramm. Bei sehr geringen Substratkonzentra-
tionen erstreckt sich dagegen die Diffusionskontrolle ber den gesamten Mebereich,
es wird nur eine Gerade erhalten.
2.9.2 Polymere Substrate
Enzyme, die mit polymeren Substraten mit vielen gleichartigen Bindungen, wie Str-
ke, Cellulose oder Chitin, reagieren, gehorchen nicht der einfachen Michaelis-Men-
ten-Beziehung. Vielmehr steigt K
m
mit sinkendem Polymerisationsgrad bzw. abneh-
mender Moleklmasse an, whrend V abnimmt, d. h. die kinetischen Konstanten ver-
ndern sich im Mae des Fortschreitens der enzymatischen Spaltungsreaktion. Unter
der Annahme, da alle reaktiven Bindungen einander gleich sind, gilt nach Chetka-
rov & Kolev (1984) folgende Beziehung:
v =
k
/
2
M
A
M
A
N
A
m
1
1
M
A
M
E
_ _
[E[[A[
k
/
1
k
/
2
k
/
1

a
(C
a
b
)
a

M
A
N
A
[A[
X (2X190)
K
/
m
und k
/
2
sind die kinetischen Konstanten fr die reaktiven Bindungen, M
A
und
M
A?
die Moleklmassen des Substrats vor und nach unendlich langer Enzymreakti-
on. M
E
ist die Moleklmasse des Enzyms, m
1
die der monomeren Einheit des Poly-
mers (z. B. Glucose), N
A
die Avogadro-Konstante; a ist die Zahl der aktiven Zentren
pro Enzymmolekl, b die Zahl der reaktiven Bindungen pro Substratmolekl und b
?
die Anzahl nicht gespaltener Bindungen nach der Enzymreaktion. (C
b
a
)
a
steht fr die
A2.9 Spezielle Enzym-Mechanismen 145
Abb. 2.35. Temperaturabhngigkeit immobilisierter
Enzyme.
effektive Zahl mglicher Kombinationen zwischen den aktiven Zentren des Enzyms
und den reaktiven Bindungen des Substrats, wobei fr die meisten Enzyme gilt: a=1
und C
b
1
=b; a=r
A
/r
E
ist das Verhltnis des effektiven Querschnitts der reaktiven Sub-
stratbindung r
A
zu dem des aktiven Zentrums r
E
. Gl. (2.190) steht in Analogie zur
Michaelis-Menten-Beziehung, wobei, unter Annahme von M
A
M
E
:
V = k
2
[E[ = k
/
2
M
A
M
A
N
A
m
1
[E[[A[ = k
/
2
(b b

)[E[[A[ (2X191)
und
K
m
(M) =
K
m
M
A
=
k
/
1
k
/
2
k
/
1
N
A
b
a
=
K
/
m
(M)
b
a
(2X192)
gelten. Die entsprechenden Konstanten lassen sich gem Gl. (2.191) und (2.192)
aus Diagrammen gewinnen, wo, wie in Abb. 2.36 dargestellt, die tatschlich gemes-
sene Michaelis-Konstante bzw. Maximalgeschwindigkeit gegen die Zahl der reakti-
ven Zentren des Substratmolekls aufgetragen ist.
2.10 pH- und Temperaturverhalten von Enzymen
2.10.1 pH-Optimumskurve und Bestimmung von pK-Werten
Die Aktivitt von Enzymen zeigt eine deutliche Abhngigkeit vom pH-Wert des Me-
diums. Mit zunehmendem pH-Wert steigt die Aktivitt auf ein Maximum (pH-Opti-
mum) an und fllt im alkalischen Bereich wieder auf Null ab. Es wird eine glocken-
frmige Optimumskurve durchlaufen (Abb. 2.37A). Zwei Effekte bestimmen, je nach
Enzymtyp in unterschiedlichem Mae, die Form der Kurve: direkte Mitwirkung ioni-
scher Gruppen am katalytischen Mechanismus und Beteiligung geladener Gruppen
an der Stabilisierung der Proteinstruktur.
An der enzymatischen Katalyse, wie der Sure-Basen-Katalyse, sind hufig ioni-
sche Gruppen beteiligt, deren Protonierungszustand fr die Reaktion essentiell ist. So
146 2 Enzymkinetik
Abb. 2.36. Bestimmung der
Konstanten K
/
m
und k
/
2
fr die re-
aktive Bindung eines polymeren
Substrats bei Auftragung A) der
tatschlich gemessenen Michae-
liskonstanten K
m
und B) der
Maximalgeschwindigkeit k
2
ge-
gen die Zahl b der reaktiven
Zentren des Substratmolekls.
bildet das aktive Zentrum von Chymotrypsin eine katalytische Triade mit der Hydro-
xylgruppe von Serin, der Imidazolgruppe von Histidin und der Carboxylgruppe von
Aspartat. Abweichungen vom optimalen pH-Wert verndern den Protonierungszu-
stand der beteiligten Gruppen und entziehen diese dem katalytischen Mechanismus.
Im Falle eines einfachen diprotischen Systems wird das pH-Optimum gebildet aus ei-
ner ansteigenden Titrationskurve fr einen im protonierten Zustand aktiven Rest und
einer abfallenden Titrationskurve fr die mit der Protonierung verbundene Inaktivie-
rung eines zweiten Rests. Die pK-Werte der entsprechenden Gruppen im Enzym-Sub-
strat-Komplex (pK
EA
) liegen jeweils bei der halben Hhe der Optimumskurve. Der
Punkt hchster Aktivitt entspricht dem pH-Optimum des Enzyms (Abb. 2.37A). Die
Bestimmung der Enzymaktivitt mu immer unter sttigenden Bedingungen bezg-
lich aller Substrate und Cofaktoren, also bei der apparenten Maximalgeschwindigkeit
(V
app
, im Unterschied zu der auf [A] ?? extrapolierten Maximalgeschwindigkeit V)
erfolgen.
Nach einem Verfahren von M. Dixon und E.C. Webb (1974) wird zur Ermittlung
der pK-Werte der Logarithmus von V
app
gegen den pH-Wert aufgetragen
(Abb. 2.37B). Bei idealem Titrationsverhalten steigt die Kurve an beiden Seiten zu-
nchst mit der Steigung 1 bzw. 1 an. Die beiden Steigungen extrapolieren auf eine
durch das Maximum der Kurve gezogene Horizontale, die sie an den Stellen der
pK
EA
-Werte scheiden. Wird die Protonierung der Gruppen im aktiven Zentrum durch
die Substratbindung verndert, so sind deren pK
E
-Werte im freien Enzym verschie-
den von den pK
EA
-Werten des Enzym-Substrat-Komplexes. In diesem Fall ist auch
A2.10 pH- und Temperaturverhalten von Enzymen 147
Abb. 2.37. pH-Verhalten von Enzymen. A) Direkte Auftragung der apparenten Maximalgeschwindig-
keit gegen den pH-Wert. Die innere Kurve zeigt eine ideale pH-Optimumskurve mit zwei titrierbaren
Gruppen, die uere eine pH-Stabilittskurve. B) Verfahren zur Bestimmung der pK-Werte des En-
zym-Substrat-Komplexes, sowie C) und D) des freien Enzyms (nach Dixon & Webb, 1973).
die apparente Bindungskonstante des Substrats K
A
abhngig vom Protonierungszu-
stand der Gruppen und folglich auch vom pH-Wert. Die pK
E
-Werte des freien En-
zyms werden analog wie die pK
EA
-Werte bestimmt durch Auftragen von V
app
/K
A
(oder V
app
/K
m
) bzw. log V
app
/K
A
gegen den pH-Wert (Abb. 2.37C und D).
Ionisierungskonstanten knnen auch aus den Sekundrauftragungen des Linewea-
ver-Burk-Diagramms gewonnen werden. Die Abhngigkeit der Umsatzgeschwindig-
keit v von der Substratkonzentration wird bei unterschiedlichen pH-Werten gemes-
sen. Bei Auftragung von 1/v gegen 1/[A] erhlt man eine Geradenschar mit einem
gemeinsamen Schnittpunkt links der Ordinate. Werden die Steigungen dieser Ge-
raden gegen die reziproke Protonenkonzentration 1/[H
+
] aufgetragen, so ergibt sich
eine Gerade, die die Abszisse bei 1/K
E
schneidet. Ein Sekundrdiagramm der Ordi-
natenschnittpunkte gegen 1/[H
+
] hat einen Abszissenschnittpunkt von 1/K
EA
.
Eine zuverlssige Bestimmung der pK-Werte aus diesem Diagramm ist nur mg-
lich bei einer Differenz zwischen pK
1
- und pK
2
-Werten von ber 3,5 pH-Einheiten.
Bei Beteiligung einer anderen Zahl ionischer Gruppen als zwei, wie auch bei anders-
artigem Aktivierungsverhalten, bekommt man abweichende Kurvenformen. Ist nur
eine einzige protonierbare Gruppe beteiligt (bzw. spielt der Protonierungsproze nur
in einem bestimmten pH-Bereich, sauer oder alkalisch, eine Rolle fr die Enzymakti-
vitt), so wird nur eine Flanke der Optimumskurve erhalten. Bei mehr als zwei ioni-
schen Gruppen ergeben sich berlagerungen, die nur bei greren pH-Differenzen
der pK-Werte z. B. durch Stufen an den Flanken der Optimumskurve erkennbar sind.
Die pK-Werte der Titrationskurven erlauben Rckschlsse auf die an der Katalyse
beteiligten Gruppen. Allerdings unterscheiden sich die pK-Werte ionischer Gruppen
isolierter Aminosuren oft drastisch von denen im aktiven Zentrum. Die Einbindung
in das Proteinmolekl kann Verschiebungen um einige pH-Einheiten bewirken.
2.10.2 pH-Stabilitt von Enzymen
Aufgrund der polyionischen Proteinnatur von Enzymen wird deren pH-Verhalten
auch durch geladene Gruppen mitbestimmt, die nicht unmittelbar an der Katalyse be-
teiligt sind. Das gilt besonders fr solche Gruppen, denen wichtige Funktionen in der
Aufrechterhaltung der nativen Enzymstruktur zukommt. Whrend es sich bei den
Protonierungen im aktiven Zentrum allgemein um reversible Prozesse handelt, kn-
nen Ladungsvernderungen an strukturerhaltenden Resten irreversible Schdigungen
der nativen Struktur verursachen. Zur Unterscheidung zwischen reversiblen und irre-
versiblen pH-abhngigen Vorgngen dienen pH-Stabilittskurven. Das betreffende
Enzym wird beim jeweiligen pH-Wert fr eine bestimmte Zeit vorinkubiert und da-
nach die Aktivitt beim optimalen pH-Wert gemessen. Reversible Vorgnge drfen
dabei keine Aktivittsvernderungen zeigen, die pH-Stabilittskurve zeigt in diesem
Bereich ein Plateau, das nach beiden Seiten infolge irreversibler Inaktivierungen ab-
fllt. Somit ist diese Kurve breiter als die pH-Optimumskurve (Abb. 2.37A).
Irreversible Denaturierungen knnen auch durch zeitabhngige Aktivittsbestim-
mungen des bei bestimmten pH-Werten inkubierten Enzyms erkannt werden. Wh-
rend bei reversiblen Prozessen die Aktivitt stabil bleibt, bewirken irreversible Vor-
gnge Aktivittsabflle, zumeist exponentiell nach einer Reaktion erster Ordnung.
148 2 Enzymkinetik
Bei Untersuchungen des pH-Verhaltens von Enzymen ist zu bercksichtigen, da
auch Substrate, Coenzyme (z. B. NAD) oder im Testsystem enthaltene Indikato-
renzyme in bestimmten pH-Bereichen instabil sind und damit die Lage des pH-Opti-
mums beeinflussen knnen. Zur Kontrolle sind Vorinkubationen mit den Testkompo-
nenten in Abwesenheit des Enzyms bei unterschiedlichen pH-Werten durchzufhren.
2.10.3 Thermische Stabilitt von Enzymen
Wie bei spontanen chemischen Reaktionen steigt die Geschwindigkeit auch bei en-
zymkatalysierten Reaktionen mit der Temperatur um den Faktor 23 pro 108C. Bei
hheren Temperaturen verzgert sich jedoch der Anstieg, durchluft ein Maximum,
jenseits dessen die Umsatzgeschwindigkeit wieder abnimmt (Abb. 2.38). Dieser Vor-
gang hat seine Ursache in der Destabilisierung und irreversiblen Inaktivierung des
Katalysators infolge seiner thermosensitiven Proteinnatur. Die Lage des Temperatur-
maximums spiegelt somit die Temperaturstabilitt des untersuchten Enzyms wieder.
Bei den meisten Enzymen liegt es zwischen 408C und 508C, also etwas ber der
Krpertemperatur. Es gibt auch temperatursensitive Enzyme, wie die bereits ab 308C
instabile Alkoholdehydrogenase. Enzyme thermophiler Mikroorganismen aus heien
vulkanischen Quellen bleiben teilweise bis ber den Siedepunkt des Wassers aktiv,
ohne da sich deren Struktur wesentlich von der anderer Proteine unterscheidet. Die
grere Temperatursensitivitt der meisten Enzyme ist damit weniger eine zwangs-
lufige Eigenschaft der Proteinnatur, vielmehr erbrigte sich im Laufe der Evolution
mit der Anpassung an moderate Lebensverhltnisse und eine konstante Krpertempe-
ratur die Notwendigkeit einer hohen Temperaturresistenz.
Das Temperaturmaximum zeigt nur bedingt die Temperaturstabilitt eines Enzyms
an. Die Lage des Maximums wird bestimmt durch eine zeitabhngige irreversible Inak-
tivierung und hngt damit von der Zeitdauer ab, mit der das Enzym der erhhten Tem-
peratur ausgesetzt ist. Wird die Aktivitt des Enzyms unmittelbar nach einer Tempera-
turerhhung bestimmt, so liegt das Maximum hher als wenn es vor dem Test bereits
A2.10 pH- und Temperaturverhalten von Enzymen 149
Abb. 2.38. Temperaturverhalten von Enzymen. A) Direkte Auftragung der apparenten Maximalge-
schwindigkeit gegen die Temperatur, B) Arrhenius-Darstellung, C) Auftragung zur Bestimmung der
Reaktionsenthalpie DH
=
des bergangszustandes.
fr lngere Zeit bei dieser Temperatur vorinkubierte. Daraus wird ersichtlich, da es
sich nicht um ein dem pH-Optimum vergleichbares Temperaturoptimum handelt,
da sich hier das Enzym gerade nicht unter optimalen Bedingungen befindet. Daher
ist dieser Begriff zu vermeiden und auch die Enzymaktivitt sollte unterhalb des Tem-
peraturmaximums getestet werden. Beim Maximum und jenseits desselben knnen De-
naturierungsprozesse studiert werden, die Rckschlsse auf die Enzymstruktur zulas-
sen. Das Enzym wird bei konstanter Temperatur vorinkubiert. Durch Probenentnahmen
zu bestimmten Zeiten wird die nderung der Enzymaktivitt unter normalen Testbedin-
gungen verfolgt. Bei Temperaturen im Bereich der thermischen Inaktivierung des En-
zyms erhlt man eine zumeist exponentielle Aktivittsabnahme gem einer Denaturie-
rungskinetik erster Ordnung (Abb. 2.39A). Obwohl die Denaturierung ber viele
Schritte abluft, ist ein bestimmter Schritt verantwortlich fr den Verlust der enzymati-
schen Aktivitt. In halblogarithmischer Darstellung von k
cat
bzw. v gegen die Zeit wer-
den Geraden erhalten, deren Steigungen die Geschwindigkeitskonstanten der Denaturie-
rung ergeben (Abb. 2.39B). Denaturierungsvorgnge lassen sich auch mit anderen Me-
thoden, wie Absorptions-, Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie oder Kalorimetrie unter-
suchen. In seltenen Fllen wird auch das Phnomen der Klteinaktivierung beobachtet.
2.10.4 Temperaturabhngigkeit enzymatischer Reaktionen
Der Bereich unterhalb des Temperaturmaximums, d. h. auerhalb des Bereichs der
thermischen Denaturierung, ergibt beim Auftragen von ln k
cat
bzw. ln v gegen die re-
ziproke absolute Temperatur (K
1
, 08C=273,15 K) fr die meisten Enzymreaktionen
eine lineare Abhngigkeit. Dieser Darstellung liegt die empirische Gleichung von
S. Arrhenius (1889) zugrunde:
k = A e
E
a
aRT
Y (2X193)
150 2 Enzymkinetik
Abb. 2.39. Temperaturstabilitt von Enzymen in
A) direkter und B) halblogarithmischer Auftra-
gung. Das Enzym ist bei je einer Temperatur
unterhalb (T
1
), im Bereich (T
2
) und jenseits (T
3
)
des Temperaturmaximums vorinkubiert.
die durch Logarithmieren in die Geradengleichung
ln k = ln A
E
a
RT
bzwX log k = log A
E
a
2Y3RT
(2X194)
zu berfhren ist. E
a
ist die Aktivierungsenergie des bergangszustandes der Enzym-
katalyse, die nach dieser Gleichung aus der Steigung des Arrhenius-Diagramms
(Abb. 2.38B) zu erhalten ist. Die Konstante A reprsentiert die Wahrscheinlichkeit
des Zustandekommens der Reaktion und enthlt Komponenten fr die Kollisionshu-
figkeit und die Orientierung der Teilchen beim Zusammentreffen, R ist die Gaskon-
stante. Durch bestimmte Integration von Gl. (2.193) ergibt sich die Beziehung:
log
k
2
k
1
=
E
a
2Y3R
T
2
T
1
T
1
T
2
_ _
Y (2X195)
nach der E
a
aus den Umsatzgeschwindigkeiten bei zwei verschiedenen Temperaturen
errechnet werden kann. Fr die Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion k kann
auch die Maximalgeschwindigkeit V=k [E]
0
eingesetzt werden. Aufgrund der
Temperaturabhngigkeit von Dissoziations- und Michaelis-Konstanten ist das Tempera-
turverhalten bei Substratsttigung zu bestimmen, wobei genau genommen die V-Werte
fr jede Temperatur durch Extrapolation auf [A] ?? ermittelt werden mssten. Die
aus dem Arrhenius-Diagramm zu bestimmende Aktivierungsenergie liegt zumeist im
Bereich von 4050 KJmol
1
. Sie ist eine komplexe, aus verschiedenen Teilprozessen
zusammengesetzte Gre. Jeder dieser Prozesse besitzt eine eigene Temperaturkorrela-
tion, so da bei stetiger Temperaturvernderung der geschwindigkeitsbestimmende
Schritt wechseln kann, was sich im Arrhenius-Diagramm in zwei oder mehr Bereichen
unterschiedlicher Steigung ausdrckt. Mehrphasiges Verhalten kann aber auch andere
Ursachen haben, wie Konformationsbergnge des Enzyms oder auch der Membran
bei membrangebundenen Enzymen, oder von Isoenzymen. Besonders die ber einen
breiten Temperaturbereich aktiven thermostabilen Enzyme zeigen hufig mehrphasiges
Temperaturverhalten als Ausdruck unterschiedlich stabiler Zustnde.
Das Prinzip der enzymatischen Katalyse beruht nach einer von H. Eyring 1953 for-
mulierten Theorie auf der Verringerung der Aktivierungsenergie durch Stabilisierung
des bergangszustandes. Zur Umwandlung in Produkt mu das Substrat die Energiebar-
riere des bergangszustandes berwinden. Nur Substratmolekle, die ber ausreichend
Energie verfgen, werden umgewandelt. Im Mae der Erniedrigung der Barriere erhht
sich der Anteil der Molekle, die an der Reaktion teilzunehmen vermgen. Abb. 2.40
zeigt das Energieprofil einer enzymkatalysierten Reaktion, wobei bergangszustnde
sowohl fr die Bindung der Reaktionspartner von beiden Richtungen wie auch fr
den eigentlichen Umwandlungsproze angenommen werden. Fr bestimmte Enzymre-
aktionen konnten Substanzen synthetisiert werden, die den bergangszustand nachah-
men (bergangsanaloga, engl. transition state analogs). Diese zeigen gegenber dem
Substrat eine um mehrere Zehnerpotenzen erhhte Bindungsaffinitt.
Arrhenius entwickelte die Gleichung in Analogie zur vant Hoffschen Reaktions-
isobaren, die die Abhngigkeit der Dissoziationskonstanten K
d
von der Temperatur
im Reaktionsgleichgewicht beschreibt:
A2.10 pH- und Temperaturverhalten von Enzymen 151
d ln K
d
dT
_ _
P
=
DH
0
RT
2
X (2X196)
Fr kleine Bereiche kann die Standard-Reaktionsenthalpie DH
0
als temperaturunab-
hngig angesehen werden, so da durch Integration
ln K
a
=
DH
0
RT
C (2X197)
eine lineare Abhngigkeit des Logarithmus der Dissoziationskonstanten von der rezi-
proken absoluten Temperatur resultiert, aus deren Steigung DH
0
zu errechnen ist. Die
Integrationskonstante C enthlt die Reaktionsentropie DS
0
:
ln K
a
=
DH
0
RT

DS
0
R
Y (2X198)
die aus dem Ordinatenschnittpunkt berechnet werden kann. Gleichung (2.196) folgt
aus der Beziehung fr die Gibbssche freie Standardenergie DG
0
=DH
0
+TDS
0
, die
mit der Dissoziationskonstanten zusammenhngt: DG
0
=RT ln K
d
. Fr die freie
Energie des bergangszustandes DG
=[
gilt entsprechend:
DG
=[
= RT ln K
=[
= DH
=[
TDS
=[
X (2X199)
Nach der Quantenmechanik hngt die Geschwindigkeitskonstante k fr die Bildung
des bergangszustandes mit der Gleichgewichtskonstanten K
=[
des bergangszustan-
des nach k=K
=[
(RT/N
A
h) zusammen, wobei N
A
die Avogadro-Konstante und h das
Plancksche Wirkungsquantum ist. Damit erhlt man aus Gl. (2.199) folgende Bezie-
hung fr den bergangszustand:
log
k
T
=
DH
=[
2Y3RT

DS
=[
2Y3R
log
R
N
A
h
Y (2X200)
152 2 Enzymkinetik
Abb. 2.40. Energieprofil einer
enzymkatalysierten Reaktion.
durch die sich DH
=[
, bei einer linearen Abhngigkeit von log k/T gegen 1/T, aus der
Steigung errechnen lt (Abb. 2.38C). Im Unterschied zur Arrhenius-Darstellung sind
hier fr k absolute Werte einzusetzen. Die Arrheniussche Aktivierungsenergie ist mit
der Enthalpie des bergangszustandes durch die Beziehung E
a
=DH
=[
+RT verbunden.
Bei der praktischen Durchfhrung gilt, wie bereits bei der pH-Abhngigkeit er-
whnt, da auch Komponenten des Enzymtests und Hilfsenzyme temperatursensitiv
sind und die Temperaturkurve des zu untersuchenden Enzyms beeinflussen knnen.
Daher ist es ratsam, die Testmischung ohne Enzym fr bestimmte Zeiten bei ver-
schiedenen Temperaturen vorzuinkubieren und anschlieend die Enzymreaktion bei
konstanter Temperatur zu messen. Bei Stabilitt aller brigen Komponenten mu
eine konstante Umsatzgeschwindigkeit erhalten werden.
2.11 Isotopenaustausch
Isotopen sind ein wertvolles Hilfsmittel zur Untersuchung von Enzymreaktionen.
Zwei hufige Anwendungen sollen hier erwhnt werden, die Isotopenaustauschkine-
tik, die besonders fr die Analyse von Mehrsubstratreaktionen wertvolle Informatio-
nen liefert, und der kinetische Isotopeneffekt, der Aufschlu ber bestimmte Mecha-
nismen der Enzymkatalyse gibt.
2.11.1 Isotopenaustauschkinetik
Die Isotopenaustauschkinetik lt sich von zwei Aspekten her betrachten: das Sy-
stem, bestehend aus Substraten, Produkten und Enzym, kann sich im oder auerhalb
des Gleichgewichts befinden. Einfachere und eindeutigere Interpretationen sind ber
Gleichgewichtssysteme mglich, auf die sich auch diese Beschreibung beschrnkt.
Weitergehende Analysen finden sich u.a. in Fromm (1975), Huang (1979) und Purich
& Allison (1980).
Man lt das System, zusammen mit dem Enzym, zum Gleichgewicht kommen,
wobei Substrate und Produkte zur Beschleunigung der Einstellung gem der Gleich-
gewichtskonstanten K
g
=[P][Q] . . . /[A][B] . . . bereits in ihren Gleichgewichtskonzen-
trationen zugegeben werden. Die Gleichgewichtskonstante lt sich, wie in Abb. 2.41
gezeigt, durch Vorgabe eines bestimmten P/A-Verhltnisses ermitteln. Nach Zugabe
des Enzyms werden Gre und Richtung der Verschiebungen D[A] bzw. D[P] be-
stimmt. Der Schnittpunkt der resultierenden Kurve bei D[A] bzw. D[P] =0 entspricht
der Gleichgewichtsposition. Ein bestimmtes Substrat/Produkt-Paar, z. B. B/P bei einer
Bisubstratreaktion, wird nun in mehreren Konzentrationsstufen variiert, wobei die
Vernderung im Verhltnis der Gleichgewichtskonzentrationen erfolgen mu. Das an-
dere Paar (A/Q) bleibt konstant. Es wird eine geringe, das Gleichgewicht nicht st-
rende Menge einer Komponente, z. B. A
+
als radioaktives Isotop, zugesetzt und zeit-
abhngig der AQ-Austausch als Folge der Vernderung des B/P-Paares gemessen.
Die Ableitung fr die Geschwindigkeitsgleichungen der Austauschreaktion R bei
unterschiedlichen Mehrsubstratreaktionen ist komplex (vgl. Huang, 1979; Purich &
A2.11 Isotopenaustausch 153
Allison, 1980) und nicht besonders informativ, da es kaum mglich ist, aus dem Iso-
topenaustausch selbst kinetische Konstanten zu erhalten. Vielmehr sind die Profile
der Austauschgeschwindigkeit indikativ fr bestimmte Reaktionstypen, wobei unter-
schieden wird zwischen hyperbol (H), hyperbol mit vollstndiger (HCD) und mit par-
tieller Depression (HPD), sigmoid (S) und sigmoid mit vollstndiger (SCD) und par-
tieller Depression (SPD). Unter Depression wird ein abnehmender Kurvenverlauf bei
hheren Konzentrationen des variierten Substrat/Produkt-Paares verstanden
(Abb. 2.42, Tabelle 2.5). Sigmoide Kurvenverlufe knnen auch Hinweise fr koope-
rative Effekte sein.
Besonders die AQ-Austauschgeschwindigkeit ist diagnostisch fr einen obliga-
torischen Ordered Bi Bi-Mechanismus, wo A der Bindung von B vorangeht und P
154 2 Enzymkinetik
Abb. 2.41. Bestimmung der Gleichgewichts-
konstanten einer Reaktion durch Annherung
des Substrat-Produkt-Verhltnisses P/A. Einer
vorgegebenen Mischung an A und P wird En-
zym zugesetzt und die Richtung der Vernde-
rung verfolgt. Die Gleichgewichtslage ist bei
DA bzw. DP=0 erreicht (nach Purich und Al-
lison, 1980).
Abb. 2.42. Profile des Isotopenaustauschs fr
verschiedene Mechanismen von Enzymreaktio-
nen. H, hyperbol; HCD, hyperbol mit vollstn-
diger Depression; HPD, hyperbol mit partieller
Depression; S, sigmoid; SCD, sigmoid mit
vollstndiger Depression; SPD, sigmoid mit
partieller Depression (nach Purich und Alli-
son, 1980).
vor Q freigesetzt wird (Schema 2.130). Fr den AQ-Austausch ist es erforderlich,
da eine Enzymform vorliegt, an die die markierte Verbindung, also A
+
, binden
kann, was bei mittlerer Konzentration des B/P-Paares gegeben ist, die AQ-Aus-
tauschgeschwindigkeit nimmt zunchst zu. Bei hoher B/P-Menge jedoch verarmt die
fr A
+
zugngliche Enzymspezies und die AQ-Austauschgeschwindigkeit nimmt
ab (Abb. 2.42 HCD). Ein normales hyperboles Austauschprofil wird dagegen erhalten
fr den BP-Austausch bei Erhhung des Paares A/Q, da damit die fr die Kombi-
nation mit B
+
und P
+
erforderlichen Spezies EA und EQ vorherrschen.
Wegen der alternativen Wege beim Random Bi Bi-Mechanismus, wo A
+
sowohl
an E wie auch an EB binden kann, verursacht hier ein Anstieg des B/P-Paares keine
Abnahme der AQ-Austauschgeschwindigkeit. Diese Aussage gilt aufgrund der
Symmetrie bei diesem Mechanismus fr alle mglichen Austausche. Ist beim Ran-
dom-Mechanismus die Umwandlung der ternren Komplexe ineinander geschwindig-
keitsbestimmend, dann ist fr jeden Austausch die Geschwindigkeit gleich, andern-
falls sind die Austauschraten unterschiedlich.
Eine Besonderheit des Ping-Pong-Mechanismus ist, da ein Austausch bereits mit
der halben Reaktion mglich ist, z. B. ein AP-Austausch in Abwesenheit des B/Q-
Paares (und umgekehrt):
E A
k
1
B EA
k
2
B E
/
PY (2X201 a)
k
1
A
k
2
A
E
/
B
k
3
B E
/
B
k
4
B E QX (2X201 b)
k
3
A
k
4
A
Nach den Steady-State-Regeln gilt fr die Austauschgeschwindigkeit der Teilreaktion
(2.201a) (A
+
ist die markierte Verbindung, es wird nur die Anfangsreaktion verfolgt,
die Rckreaktion von P
+
zu EA
+
wird vernachlssigt):
A2.11 Isotopenaustausch 155
Tab. 2.5. Profile des Isotopenaustausches bei Ein- und Mehrsubstratreaktionen (nach Purich und Alli-
son, 1980). H, hyperbol; HCD, hyperbol mit vollstndiger Depression; L, linear.
Mechanismus Austausch Variables Substrat-Produkt-Paar
A-P B-P A-Q B-Q
Uni Uni AP H
Ordered Bi Uni AB
BP
H
H
HCD
H
Random Uni Bi
Rapid equilibrium
Alle H H
Ordered Bi Bi AP
BP
AQ
BQ
H
H
HCD
HCD
HCD
H
HCD
HCD
H
H
H
H
HCD
H
HCD
H
Theorell-Chance Bi Bi AP
BP
AQ
BQ
H
H
HCD
HCD
H
L
H
H
H
H
H
H
HCD
H
HCD
H
Random Bi Bi Alle H H H H
d[EA
+
[
dt
= k
1
[E[[A
+
[ (k
1
k
2
)[EA
+
[ = 0 Y (2X202)
[EA
+
[ =
k
1
[E[[A
+
[
k
1
k
2
X (2X203)
Die Geschwindigkeit der Austauschreaktion ist:
v
+
= k
2
[EA
+
[ X (2X204)
Durch Einsetzen fr [EA
+
] ergibt sich:
v
+
=
k
1
k
2
[E[[A
+
[
k
1
k
2
(2X205)
Erfolgt der Austausch in Abwesenheit von B und Q, so ist [E]
0
=[E]+[E
/
]+[EA],
[EA[ =
k
1
[A[[E[
k
1
Y [E
/
[ =
k
1
k
2
[A[[E[
k
1
k
2
Y
[E[
0
= [E[ 1
k
1
[A[
k
1

k
1
k
2
[A[
k
1
k
2
_ _
(2X206)
v
+
=
k
2
[E[
0
[A
+
[
(k
1
k
2
)
k
1
1
k
1
[A[
k
1

k
1
k
2
[A[
k
1
k
2
[P[
_ _
X (2X207)
Bei gleicher spezifischer Radioaktivitt knnen [A
+
] und [A] gleichgesetzt werden.
Die reziproke Form lautet:
1
v
+
=
k
1
k
2
k
1
k
2
[E[
0
1
[A[

k
1
k
1

k
1
k
2
k
1
k
2
[P[
_ _
Y (2X208)
in Form der kinetischen Konstanten:
1
v
+
=
K
mA
V
1
[A[

K
mA
V
1
K
iA
1
K
iP
[P[
_ _
X (2X209)
Aus einem Diagramm von 1/v
+
gegen 1/[A] bei unterschiedlichen Mengen von [P] er-
hlt man Parallelen, deren Ordinatenschnittpunkte, in einem Sekundrdiagramm gegen
1/[P] aufgetragen, eine Gerade mit dem Ordinatenschnittpunkt einer reziproken maxi-
malen Austauschgeschwindigkeit ergeben: V
+
=k
1
k
2
[E]
0
/(k
1
+k
2
). Diese unterscheidet
sich von V
1
=k
2
k
4
[E]
0
/(k
2
+k
4
), der Maximalgeschwindigkeit der Hinreaktion des Ping-
Pong-Mechanismus, wobei das Verhltnis von k
1
zu k
4
ausschlaggebend ist. Sind beide
gleich, so sind auch beide Maximalgeschwindigkeiten gleich, ist k
1
grer als k
4
, ist
die Austauschgeschwindigkeit V
+
AP
grer als V
1
und umgekehrt. Offensichtlich be-
steht darber hinaus kein direkter Zusammenhang zwischen diesen beiden Gren.
156 2 Enzymkinetik
Zwischen maximalen Anfangs- und Austauschgeschwindigkeiten besteht folgender
Zusammenhang:
1
V
+
AP

1
V
+
BQ
=
1
V
1

1
V
2
Y (2X210)
in Form der Geschwindigkeitskonstanten:
k
1
k
2
k
1
k
2

k
3
k
4
k
3
k
4
=
k
2
k
4
k
2
k
4

k
1
k
3
k
1
k
3
(2X211)
d. h. alle vier Parameter mssen bekannt sein, um die Beziehung zwischen Aus-
tauschrate und Anfangsgeschwindigkeit zu beurteilen. Daraus lt sich auch allge-
mein erkennen, da es praktisch nicht mglich ist, aus Austauschexperimenten kineti-
sche Parameter zu bestimmen. Eine der wenigen Ausnahmen ist gerade der Ping-
Pong-Mechanismus. Fr die Teilreaktion des AP-Austausches in Abwesenheit von
B und Q hat die Steigung der Geraden im doppelt-reziproken Diagramm den Wert
K
mA
/V
1
, der Ordinatenschnittpunkt K
mA
/V
1
K
iA
(1+K
iP
[P]). Die Ordinatenschnittpunkte
gegen 1/[P] aufgetragen ergeben K
mA
/V
1
K
iA
als Ordinaten- und 1/K
iP
als Abszissen-
schnittpunkte. Umgekehrt werden die Konstanten K
mB
, K
iB
und K
iQ
aus dem BQ-
Austausch in Abwesenheit von A und P erhalten.
Abortive Komplexe, d. h. nicht-produktive Enzymformen, beeinflussen und er-
schweren die Analyse von Austauschdaten betrchtlich. Solche abortiven Komplexe
knnen entstehen, wenn Liganden unter Bedingungen an das Enzym binden, unter
denen es seine Katalyse nicht ausfhren kann. Ein Beispiel ist die Bindung von Pyru-
vat und NAD
+
an die Lactat-Dehydrogenase. Da beide Liganden bereits oxidiert
sind, kann kein Wasserstofftransfer stattfinden.
2.11.2 Isotopeneffekte
2.11.2.1 Primrer kinetischer Isotopeneffekt
Isotopeneffekte werden dadurch verursacht, da ein Isotop durch seine vernderte
Masse die Umsatzrate einer Reaktion beeinflut. Allerdings sind die Massendifferen-
zen zumeist gering, wie bei
13
C, das nur 8% schwerer ist als
12
C. Die maximal zu
beobachtenden Isotopeneffekte sind fr
13
C/
12
C=1,06,
15
N/
14
N=1,04 und
18
O/
16
O=1,06. Dies erfordert eine hohe Przision der Nachweismethode, z. B. der
Massenspektroskopie. Betrchtliche Massenunterschiede von 100% bzw. 200% finden
sich aber zwischen Deuterium (D) bzw. Tritium (T) und Wasserstoff. Bei Reaktionen,
in denen der Protonentransfer geschwindigkeitsbestimmend ist, beobachtet man in
D
2
O eine deutliche Verlangsamung der Reaktionsgeschwindigkeit, das Verhltnis der
Geschwindigkeitskonstanten k
H
/k
D
bewegt sich zwischen 2 und 15. Noch strker ist
der Effekt mit Tritium, fr das der Zusammenhang log (k
H
/k
T
) =1,44 log (k
H
/k
D
)
gilt. Allerdings kann praktisch nur D
2
O zu 100% eingesetzt werden, so da jedes
Molekl in einer homogenen Population reagiert, whrend in Reaktionen mit T
2
O
A2.11 Isotopenaustausch 157
nur eines von 10
10
Moleklen als
3
H vorliegt. Makroskopisch lt sich damit eine
Reduzierung der Umsatzrate nicht erkennen, der Nachweis mu auf andere Weise ge-
fhrt werden. Wird
3
H z. B. in der LDH-Reaktion an Wasser abgegeben, so bildet
sich
3
H
2
O bei nicht geschwindigkeitsbestimmendem Protonentransfer (k
H
/k
T
=1) mit
der gleichen spezifischen Radioaktivitt wie das Substrat, bei k
H
/k
T
=10 dagegen nur
zu einem Zehntel. Bei einem Umsatz von 1 mmol Lactat zu Pyruvat entstehen nur
100 lmol
3
H
2
O. Wasser kann vom Substrat aufgrund seiner Flchtigkeit unterschie-
den werden. Die Reaktion diskriminiert somit gegen die
3
H-markierten Molekle, so
da die spezifische Radioaktivitt der verbleibenden Substratmolekle ansteigt.
Die Ursache fr den Isotopeneffekt liegen im Energieunterschied der Nullpunkts-
schwingungen. Whrend die schweren C-Atome fixiert sind, ist fr die Frequenz der
Streckschwingungen die Massendifferenz zwischen D und H ausschlaggebend. Die
Energie des Grundzustandes fr die C-D-Bindung ist geringer als fr die C-H-Bin-
dung, whrend im bergangszustand beide die gleiche Energie besitzen. Damit ist
die Energiedifferenz zwischen Grund- und bergangszustand fr eine C-D-Bindung
hher als fr eine C-H-Bindung. Die Aktivierungsenergie fr die Spaltung einer C-
D-Bindung ist um 4,8 kJ/mol hher als fr eine C-H-Bindung. Das entspricht einem
etwa siebenfachen Geschwindigkeitsunterschied.
Allgemein geht man davon aus, da bei einer Reduzierung der Geschwindigkeit
um den Faktor 2 bis 15 ein primrer kinetischer Isotopeneffekt vorliegt und die Spal-
tung einer C-H-Bindung geschwindigkeitsbestimmend ist. Umgekehrt sagt die Abwe-
senheit des Isotopeneffekts aus, da die Spaltung der betreffenden Bindung nicht ge-
schwindigkeitsbestimmend ist, auch wenn sie im Verlauf der Gesamtreaktion erfolgt.
Bei Reduzierung der Geschwindigkeit um weniger als zwei ist der Protonentransfer
nur partiell geschwindigkeitsbestimmend, es existieren zwei oder mehr vergleichbar
langsame Schritte. Auch kann ein sekundrer Isotopeneffekt vorliegen (s.u.).
2.11.2.2 Einflu des kinetischen Isotopeneffekts auf V und K
m
Da sich der kinetische Isotopeneffekt in der Reduzierung der Geschwindigkeit des Pro-
tonentransfers manifestiert, ist bei einer enzymkinetischen Reaktion vor allem die Ma-
ximalgeschwindigkeit, weniger aber die Michaelis-Konstante betroffen. Dies lt sich
einfach in einer doppelt-reziproken Auftragung von 1/v gegen 1/[A] berprfen, wenn
die Umsatzgeschwindigkeit in Abhngigkeit der Substratkonzentration sowohl mit nor-
malem Wasserstoff wie in Gegenwart des Isotops gemessen wurde. Bei normalem Ver-
halten ergeben sich Geraden, die aufgrund unterschiedlicher Maximalgeschwindigkei-
ten verschiedene Ordinatenschnittpunkte, aber wegen der gleichen Michaelis-Konstan-
ten einen bereinstimmenden Abszissenabschnitt haben. Fr V
H
/V
D
>1 wird V ganz
oder teilweise durch einen Schritt kontrolliert, der eine C-H-Spaltung beinhaltet. Hohe
V
H
/V
D
-Verhltnisse bis 8 werden selten beobachtet, zumeist finden sich V
H
/V
D
-Verhlt-
nisse zwischen 1,5 und 2,0. Diese relativ geringen Isotopeneffekte sind kaum durch ei-
nen einzigen Schritt bestimmt. Eine hohe Energiebarriere kann durch mehrere kleine
Barrieren ersetzt sein, wobei jeder Schritt teilweise geschwindigkeitsbestimmend ist.
Im Falle K
m
=K
d
ist fr die Michaelis-Konstante kein Isotopeneffekt zu erwarten,
da der physikalische Bindungsschritt gegen Isotopenaustausch nicht sensitiv ist.
158 2 Enzymkinetik
Eventuell gibt es aufgrund der unterschiedlichen Gre von D und H einen steri-
schen Isotopeneffekt, wenn das aktive Zentrum knapp bemessen ist. Auch sind Bin-
dungen mit Deuterium etwas weniger polarisierbar als solche mit Wasserstoff. Wenn
die Bildung des bergangskomplexes mit der Entfernung eines Protons einhergeht,
kann auch K
m
beeinflut werden.
Zur Beschreibung des Isotopeneffekts mssen die in der einfachen Michaelis-Men-
ten-Gleichung zusammengefaten Schritte der Umwandlung von A in P und der Pro-
duktablsung differenziert werden:
E A
k
1
B EA
k
2
B EP
k
3
B E PX
k
1
A
k
2
A
k
3
A (2X212)
Nach den Steady-State-Regeln (unter Bedingungen der Anfangsgeschwindigkeit wer-
den k
2
und k
3
nicht bercksichtigt) lt sich folgende Gleichung ableiten:
v =
k
2
k
3
[E[
0
[A[
k
2
k
3
(k
1
k
2
)k
3
k
1
(k
2
k
3
)
[A[
(2X213)
wobei V=k
2
k
3
[E]
0
/(k
2
+k
3
) und K
m
=(k
1
+k
2
)k
3
/k
1
(k
2
+k
3
). Der Einflu des Isotopenef-
fekts hngt damit vom Verhltnis zwischen k
2
und k
3
ab. Fr k
2
/k
3
<1 bzw. k
2
k
3
wird V=k
2
[E]
0
bzw. V
H
/V
D
= k
2(H)
/k
2(D)
, der beobachtete nhert sich dem wahren Iso-
topeneffekt. Fr k
2
/k
3
>1 bzw. k
2
k
3
wird die Produktfreisetzung geschwindigkeits-
bestimmend und wegen
V
H
V
D
=
k
2(H)
(k
2(D)
k
3
)
k
2(D)
(k
2(H)
k
3
)
1
wird ein vorhandener Isotopeneffekt unterdrckt.
Das Verhltnis der kinetischen Konstanten ist nach Gl. (2.213):
V
K
m
=
k
1
k
2
[E[
0
k
1
k
2
X (2X214)
Dieses wiederum ins Verhltnis der Isotopen gesetzt ergibt:
V
K
m
_ _
H
v
K
m
_ _
D
=
k
2(H)
(k
1
k
2(D)
)
k
2(D)
(k
1
k
2(H)
)
=
k
2(H)
k
2(D)
1
k
2(D)
k
1
1
k
2(H)
k
1
_
_
_
_
_
_
_
_
X (2X215)
Der apparente Isotopeneffekt hngt umgekehrt vom Verhltnis k
2
/k
1
ab. Fr k
2
k

geht Gl. (2.215) gegen k


2(H)
/k
2(D)
, der Isotopeneffekt ist voll ausgeprgt. Fr k
2
k
-1
wird er dagegen unterdrckt, da (k
2(H)
/k
2(D)
)/(k
2(D)
/k
2(H)
) =1 ist. Unter dieser Bedin-
A2.11 Isotopenaustausch 159
gung ist die Katalyse deutlich schneller als der Zerfall des ES-Komplexes in E+S.
Daher kann sich ein Isotopeneffekt nicht manifestieren.
In vielen enzymatischen Reaktionen sind die Auswirkungen auf V und V/K
m
iden-
tisch. In diesen Fllen ist K
m
fr nicht markierte und fr deuterierte Substrate gleich.
Nur wenn K
m
fr das deuterierte Substrat verndert ist, sind auch die Isotopeneffekte
auf V und V/K
m
verschieden.
2.11.2.3 Andere Isotopeneffekte
Ein sekundrer kinetischer Isotopeneffekt liegt vor, wenn eine Reaktion durch eine
isotopensubstituierte C-H-Bindung in a-Stellung beeinflut wird, die im Verlauf der
Reaktion selbst nicht gespalten wird. Eine Ursache fr diesen Effekt ist eine nde-
rung in der Hybridisierung. Ein im Grundzustand tetraedrisches, sp
3
-hybridisiertes
Kohlenstoffatom geht in einen dem Carbonium-Ion entsprechenden bergangszu-
stand mit planarer sp
2
-Anordnung ber. Der Ersatz einer C-H- durch eine C-D-Bin-
dung reduziert die Frequenzen der Deformationsschwingungen. Das Substrat mit ei-
ner C-H-Bindung kann das sp
2
-Intermediat besser bilden als mit einer C-D-Bindung.
Ein Verhltnis von k
H
/k
D
=1,38 ist zu erwarten, beobachtet werden Verhltnisse von
1,021,40. Damit ist der sekundre Isotopeneffekt deutlich geringer als der primre
und gut zu identifizieren. Ein sekundrer Isotopeneffekte wurde beispielsweise fr
die Dehydratisierung von Malat in der Fumarasereaktion beobachtet.
Auch in seiner Eigenschaft als Lsungsmittel kann D
2
O die Enzymreaktion beein-
flussen. Die nderung der Protonenkonzentration in D
2
O gegenber H
2
O und die da-
mit vernderte Ionisation bei Substraten und Enzymen kann sich auf die Funktionali-
tt auswirken. In D
2
O ndert sich der mit Standardpuffer eingestellte pH-Wert:
pD=pH+0,4. Die meisten Suren sind in D
2
O drei- bis fnfmal schwcher als in
Wasser, entsprechend einer pK-Differenz von 0,50,7. Auch Zahl und Strke von
Wasserstoffbindungen und hydrophoben Wechselwirkungen verndern sich. D
2
O ist
23% viskoser als H
2
O, die O-D-Bindung ist um 0,004 nm krzer ist als die O-H-Bin-
dung. Es ergeben sich somit nderungen in der Polarisierbarkeit und der Lsungs-
mittelstruktur, die auch die Enzymstruktur beeinflussen knnen.
2.12 Anwendung statistischer Methoden
in der Enzymkinetik
2.12.1 Allgemeine Bemerkungen
Auswertung von Medaten und Interpretation von Kurvenverlufen in unterschiedlichen
Diagrammen nehmen in der Enzymkinetik einen breiten Raum ein. Daher ist die An-
wendung statistischer Verfahren unerllich. Im Rahmen dieses Buches kann darauf
nicht ausfhrlich eingegangen werden und es sei auf Fachbcher der Statistik verwie-
sen. Hier werden nur spezielle Probleme der Enzymkinetik bei der Anwendung statisti-
scher Verfahren angesprochen und einige Regeln fr diesen Bereich zusammengefat.
160 2 Enzymkinetik
Enzymuntersuchungen verlangen vielfach ein besonderes Vorgehen, das die An-
wendung statistischer Regeln erschwert. Um Kurvenverlufe zuverlssig zu interpre-
tieren und Parameter, wie Gleichgewichts- und Michaelis-Konstanten, zu ermitteln,
wren grundstzlich Mehrfachbestimmungen zur Absicherung der Medaten erforder-
lich. Andererseits sind Enzyme in verdnnten Lsungen bei Enzymtests hufig insta-
bil, so da sich die Bestimmung zusammenhngender Mereihen oft als ein Wettlauf
mit der Zeit gestaltet, was folgendes Beispiel verdeutlichen soll. Zur Analyse von
Hemm- oder Mehrsubstratmechanismen sind Mereihen bei Variation eines Parame-
ters (Substrat) unter Konstanthaltung eines zweiten (Cosubstrat, Hemmstoff) durchzu-
fhren. Fr zehn Konzentrationswerte pro Mereihe und insgesamt 5 Mereihen zur
Vernderung des zweiten Parameters resultieren 50 Messungen. Bei einer Dauer von
fnf Minuten pro Messung betrgt die reine Mezeit bereits fr Einzelbestimmungen
mehr als vier Stunden, bei Dreifachbestimmungen sind es ber zwlf Stunden. Ver-
liert das Enzym innerhalb von 20 Stunden die Hlfte seiner Aktivitt, so unterschei-
det sich der erste vom letzten Wert bei Einfachbestimmungen um 14%, bei Dreifach-
bestimmungen gar um 35%. Der durch Aktivittsverlust bedingte Fehler ist damit
weitaus grer als der Gewinn an statistischer Absicherung durch Mehrfachbestim-
mungen. Durch Zubereitung neuer Enzymprparate bzw. Enzymverdnnungen inner-
halb einer Mereihe lassen sich die ursprnglichen Aktivittsverhltnisse nur schwer
reproduzieren, nachtrgliche Messungen passen kaum in die Serie. In solchen Fllen
ist es oft vorteilhafter, in Einfachbestimmungen gewonnene Ergebnisse durch unab-
hngige Wiederholungsmessungen zu berprfen.
Die in der Enzymkinetik verwendeten Diagramme dienen in erster Linie dazu, die
fr das System angenommene Gesetzmigkeit, wie z. B. die Michaelis-Menten-Glei-
chung, zu besttigen oder auszuschlieen. Beurteilt wird dies danach, inwieweit die
Mewerte dem durch die Gesetzmigkeit vorgegebenen Kurvenverlauf gehorchen.
Aufgrund der Fehlerstreuung werden allerdings die wenigsten Werte genau auf der an-
genommenen Kurve liegen und so ist zu entscheiden, ob die Abweichungen tatschlich
nur fehlerbedingt sind oder eine andere als die angenommene Gesetzmigkeit vorliegt.
Eine normale Fehlerstreuung soll ber den gesamten Bereich um die eigentliche Funk-
tion als Mittelwert nach oben und unten gleich verteilt sein (konstanter absoluter Feh-
ler). Dies lt sich durch Residualdiagramme berprfen, bei denen die Abweichung
jedes Mewerts von der angenommenen, durch ein Regressionsverfahren ermittelten,
Funktion (z. B. hyperbole Kurve einer Michaelis-Menten-Kinetik) gegen die unabhn-
gige Variable (z. B. Substratkonzentration) aufgetragen wird (Abb. 2.43). Die Punkte
mssen gleichmig um eine Mittellinie verteilt sein. Eine systematische Abweichung
liegt vor, wenn die Punkte nach einer bestimmten Richtung von der Mittellinie abdrif-
ten. Sie kann ihre Ursache in einer artifiziellen Beeinflussung der Messung oder einem
anderen Mechanismus haben. Ein relativer Fehler liegt vor, wenn die Fehler zwar
gleichmig um die Mittellinie schwanken, sich aber ihr Ausma nach einer bestimm-
ten Richtung verndert (z. B. der Fehler nimmt mit der Gre des Mesignals zu). Da-
mit kann zwar der angenommene Mechanismus besttigt werden, bei der Kurvenanpas-
sung ist jedoch eine geeignete Gewichtung zu bercksichtigen. Normale Regressions-
verfahren gehen von einer gleichartigen Fehlerverteilung, also einem konstanten abso-
luten Fehler, aus. Residualdiagramme sind besonders bei nicht-linearen Kurvenverlu-
fen hilfreich, wo systematische Abweichungen mit dem Auge schwer erkennbar sind.
A2.12 Anwendung statistischer Methoden in der Enzymkinetik 161
Durch geeignete statistische Verfahren, wie dem W-Test nach Shapiro-Wilks oder dem
Student- oder t-Test lassen sich Ausreier in der Mereihe erkennen bzw. die Signifi-
kanz der Medaten beurteilen. Der Korrelationskoeffizient zeigt die bereinstimmung
der Daten mit dem zugrundegelegten Kurvenverlauf.
Die Anwendung statistischer Methoden ist prinzipiell anzuraten, da sie die Gefahr
einer subjektiven Beurteilung und Interpretation der Ergebnisse vermindern. Doch ha-
ben auch diese Verfahren ihre Grenzen und bedrfen der kritischen Beurteilung. Bei
enzymkinetischen Messungen werden Mechanismen, z. B. bei Hemmungen und
Mehrsubstratreaktionen, vielfach ber das Muster von Geradenscharen in linearisier-
162 2 Enzymkinetik
Abb. 2.43. Residualdiagramme (C, D, F) aus Darstellungen der Abhngigkeit der Umsatzrate von der
Substratkonzentration (A, B, E). A, C) Konstanter absoluter Fehler (r = konstant); B, D) konstanter
relativer Fehler (r/v = konstant); E, F) Anpassung einer sigmoiden Sttigungsfunktion an eine hyper-
bole Kurve.
ten Diagrammen (gemeinsame Schnittpunkte, Parallelen) identifiziert. Da aus streu-
enden Werten mittels Regressionsverfahren gewonnene Geraden innerhalb einer Me-
serie ausnahmslos die gleichen Steigungen aufweisen oder exakt auf einen gemeinsa-
men Schnittpunkt treffen, ist eher unwahrscheinlich und streng genommen lassen
sich solche Mechanismen nach statistischen Regeln berhaupt nicht nachweisen. Man
kann zwar an die Regressionsanalyse die Vorgabe stellen, Parallelen oder gemeinsa-
me Schnittpunkte fr die geringste Abweichung aller Mewerte zu suchen, doch
wird damit der Mechanismus bereits vorgegeben. Abbildung 2.44 zeigt zwei, aus
Praktikumsprotokollen entnommene, Beispiele unkritischer Anwendung linearer Re-
gressionsverfahren. Das Ziel experimenteller Arbeit sollte es sein, die Mewerte in
einer Gte zu erhalten, da das Ergebnis auch ohne statistische Analyse offenkundig
ist.
Vor der Anwendung statistischer Verfahren sollte daher auf folgende Punkte ge-
achtet werden:
1. Ist das Verfahren den vorliegenden Daten angemessen?
2. Lassen sich die Daten durch andere Gesetzmigkeiten vergleichbar gut anpas-
sen?
3. Zeigen die Daten Abweichungen in bestimmte Richtungen, die durch normale
Fehlerverteilung nicht erklrbar sind?
4. Sind artifizielle Einflsse auszuschlieen?
A2.12 Anwendung statistischer Methoden in der Enzymkinetik 163
Abb. 2.44. Unkritische Anwendung linearer Regressionen (aus Praktikumsprotokollen). A) Sekundr-
auftragung einer Bisubstratreaktion (m, Steigung), B) Stockell-Diagramm (Korr, Korrelationskoeffizi-
ent).
2.12.2 In der Enzymkinetik gebruchliche statistische Begriffe
Arithmetisches Mittel: Der Mittelwert x ist die Summe aller Mewerte x
i
geteilt
durch deren Anzahl n:
x =

n
i=1
x
i
n
X (2X216)
Median: Mittlerer Mewert einer Mereihe, wenn die Werte ihrer Gre nach geord-
net sind, bei ungerader Zahl von Mewerten: x
(n+1/2)
, bei gerader Zahl der Mittelwert
der beiden mittleren Mewerte: (x
n/2
+ x
(n/2+1)
)/2.
Mode: Der am hufigsten vorkommende Wert einer Mereihe.
Varianz: Mittlere Summe der Fehlerquadrate:
r
2
x
=

n
i=1
(x
i
x)
2
n
X (2X217)
Standardabweichung: Positive Quadratwurzel der Varianz (engl. root mean square
deviation, RMS).
r
x
=

n
i=1
(x
i
x)
2
n

_
X (2X218)
Standardabweichung des Mittelwerts:
r
x
=
r
x

n
_ X (2X219)
Lineare Regression: Anpassung von Mepunkten an eine Gerade nach der Methode
der kleinsten Fehlerquadrate. Es wird nur der Fehler der abhngigen Variablen y be-
rcksichtigt (v bei enzymkinetischen Messungen). Die unabhngige Variable x (z. B.
Substratkonzentration) wird als fehlerfrei angesehen.
y
i
= a bx
i
X (2X220)
Der Ordinatenschnittpunkt a ist
a =

x
2
i

y
i

x
i

x
i
y
i
n

x
2
i


x
i
( )
2
X (2X221)
164 2 Enzymkinetik
Die Steigung bzw. der Regressionskoeffizient b ist
b =
n

x
i
y
i

x
i

y
i
n

x
2
i


x
i
( )
2
X (2X222)
Standardabweichung der y-Werte:
r
y

1
n 2

i=1
(y
i
a bx
i
)
2
_
X (2X223)
Korrelationskoeffizient:
r =

(x
i
x)(y
i
y)

(x
i
x)
2

(y
i
y)
_ X (2X224)
Nicht-lineare Anpassung der Michaelis-Menten-Gleichung nach der Methode der
kleinsten Fehlerquadrate (nach Cornish-Bowden, 1984):
K
m
=
v
i
[A[
i

v
2
i

v
2
i
[A[
i

v
i
v
i
[A[
i
_ _
2

v
i

v
2
i
[A[
i
v
i
[A[
i
X (2X225)
V =
v
i
[A[
i
_ _
2

v
2
i

v
2
i
[A[
i
_ _
2
v
i
[A[
i
_ _
2

v
i

v
2
i
[A[
i
v
i
[A[
i
X (2X226)
A2.12 Anwendung statistischer Methoden in der Enzymkinetik 165
2.13 Literatur
Allgemeine Literatur zur Steady-State-Kinetik
Briggs, G. E. & Haldane, J. B. S. (1925) A note on the kinetics of enzyme action. Biochemical Journal
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168 2 Enzymkinetik
3 Methoden
Eine strenge Einteilung von Methoden in solche zur Bestimmung von Bindungsgleich-
gewichten und in kinetische Methoden ist kaum mglich. Vielfach enthlt das gleiche
Verfahren Aussagen zu beiden Bereichen, insbesondere bei optischen Methoden. Auch
unter den Techniken zur Messung schneller Reaktionen finden sich kinetische Metho-
den, wie Flumethoden, neben Verfahren zur Bestimmung von Gleichgewichten, wie
die Relaxationsmethoden. Andererseits sind mit Hilfe solcher Verfahren auch weiterge-
hende Untersuchungen zu Struktur und Konformation von Biomoleklen mglich, wh-
rend andere Methoden, wie die EPR-, Raman- und IR-Spektroskopie, nur sehr begrenzt
in der Enzymkinetik Anwendung finden. Hier werden diejenigen Methoden vorgestellt,
mit denen Aussagen fr zumindest einen der bisher behandelten Bereiche mglich sind.
Auch werden Verfahren angesprochen, mit Hilfe derer wichtige ergnzende Informatio-
nen gewonnen werden, wie Struktur und Konformationsnderungen von Makromolek-
len. Zunchst werden Methoden vorgestellt, die vorzugsweise dem Studium multipler
Gleichgewichte dienen, anschlieend enzymkinetische Methoden und schlielich,
nach apparativen Gesichtspunkten gegliedert, Techniken mit breiteren Anwendungsbe-
reichen. Es sei darauf verwiesen, da enzymkinetische Methoden im engeren Sinne im
wesentlichen auf Enzymtests beruhen, wie sie in der Enzymanalytik Anwendung finden
und in der entsprechenden Literatur ausfhrlich behandelt werden (z. B. Bergmeyer,
1983). Daher werden hier die fr die Enzymkinetik wichtigen Besonderheiten betont.
Auf experimentelle Vorgehensweisen wurde bereits in Kapitel 2 hingewiesen.
3.1 Methoden zur Bestimmung
multipler Gleichgewichte
Die besondere Schwierigkeit von Experimenten zum Studium von Gleichgewichten be-
ruht auf dem Umstand, da im Unterschied zu chemischen oder enzymkatalysierten
Umstzen keine stabilen, vom Substrat verschiedenen Produkte entstehen, sondern lose
Assoziationsverbindungen, die nur im Gleichgewicht mit den freien Komponenten be-
stndig sind. Jede Strung, beispielsweise durch Vernderung von Konzentrationen der
Reaktionspartner, Temperatur oder pH-Wert, bewirkt eine sofortige Gleichgewichtsver-
schiebung. Wrde man versuchen, Enzym-Ligand-Komplexe durch konventionelle
Trennmethoden, wie Gelfiltration, zu isolieren, so zerfiele der Komplex sofort whrend
des Trennverfahrens und man erhielte nur die getrennten Komponenten. Die Methoden
mssen daher so angelegt werden, da die quantitative Bestimmung sowohl der freien
Komponenten wie des Assoziationskomplexes imungestrten Gleichgewicht mglich ist.
Ein weiteres Problem besteht darin, einen geeigneten Meeffekt zu finden. Zwei
mgliche Megren werden ausgenutzt: 1. die Grendifferenz zwischen dem zu-
Enzymkinetik: Theorie und Methoden, 3. Auflage. Hans Bisswanger
Copyright 2000 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim
ISBN: 3-527-30096-1
meist niedermolekularen freien Liganden und dem, die Gre des Makromolekls
annehmenden, gebundenen Liganden; 2. spektroskopische Vernderungen durch
Wechselwirkung zwischen Ligand und Makromolekl. Diese sind meist geringfgig
und mssen durch spezielle Verfahren herausgearbeitet werden. Fr ein bestimmtes
System mu die geeignetste Methode gefunden werden. Nicht jedes Verfahren ist
gleichermaen brauchbar und erzeugt ein erkennbares Mesignal. Zuverlssige Aus-
sagen erfordern vielfach Kombinationen mehrerer Verfahren.
Bindungsmessungen bentigen, im Gegensatz zu enzymkinetischen Bestimmun-
gen, groe Mengen Makromolekl bzw. Enzym, um die zumeist sehr geringen Me-
effekte, die direkt von der Makromoleklkonzentration abhngen, sichtbar zu ma-
chen. Auch fungiert hier das Makromolekl nicht als Katalysator, sondern neben
dem Liganden als gleichberechtigter Reaktionspartner, dessen Konzentration mg-
lichst im Bereich der Dissoziationskonstanten K
d
eingesetzt werden sollte. Wird bei-
spielsweise eine Makromoleklkonzentration von 0,1 mg/ml verwendet (bei einer an-
genommenen Moleklmasse von 100000 eine molare Konzentration von 110
6
M),
so ergibt sich nach dem Massenwirkungsgesetz bei vergleichbarer Ligandenkonzen-
tration und einer angenommenen Dissoziationskonstanten von K
d
=110
4
M:
K
d

EA
EA

1 10
6
1 10
6
1 10
8
1 10
4
M X
Nur ein Prozent des eingesetzten Liganden (110
8
M) ist gebunden und neben dem
hundertfachen berschu an freiem Liganden kaum erfabar. Eine Erhhung der Li-
gandenkonzentration um den Faktor 100 zur weiteren Absttigung des Makromole-
kls steigert zwar die absolute Menge des Aggregationskomplexes (mit 110
4
M ist
Halbsttigung erreicht), verringert aber das Verhltnis des gebundenen zum freien Li-
ganden auf 0,5%:
K
d

EA
EA

5 10
7
1 10
4
5 10
7
1 10
4
M X
Erst eine zustzliche Erhhung des Makromolekls in vergleichbarer Menge bringt
eine signifikante Steigerung der Konzentration des Aggregationskomplexes auf 50%
der freien Ligandenkonzentration:
K
d

EA
EA

1 10
4
1 10
4
1 10
4
1 10
4
M X
Die Gesamtkonzentration des Makromolekls ist damit auf 210
4
M&20 mg/ml, das
200fache der ursprnglich eingesetzten Menge, angewachsen.
170 3 Methoden
3.1.1 Gleichgewichtsdialyse und allgemeine Aspekte
von Bindungsmessungen
3.1.1.1 Prinzip der Gleichgewichtsdialyse
Die Gleichgewichtsdialyse ist ein zuverlssiges Verfahren zur Bestimmung von Bin-
dungsgleichgewichten, das, wie der Name besagt, auf dem Dialyse-Prinzip beruht.
Eine semipermeable Membran, die aufgrund ihres Porendurchmessers nur fr nieder-
molekulare Liganden durchlssig ist, unterteilt ein Gef in eine uere Dialysekam-
mer fr die Ligandenlsung und eine innere Dialysekammer fr die Makromolekll-
sung (Abb. 3.1). Eine einfache aber wenig exakte Vorrichtung ist ein Dialyse-
schlauch, der in eine Lsung taucht. Der Ligand diffundiert von der ueren Kam-
mer in die Makromolekllsung der inneren Kammer, bis seine Konzentration in bei-
den Kammern gleich ist. Bindet der Ligand zustzlich an das Makromolekl, so wird
der gebundene Anteil dem Dialyse-Gleichgewicht entzogen und es strmt solange Li-
gand aus der ueren Kammer nach, bis die freien Anteile des Liganden in beiden
Kammern ausgeglichen sind. Nach Einstellen des Dialyse-Gleichgewichts entspricht
damit die Konzentration des Liganden in der ueren Kammer [A]
a
der Konzentrati-
on des freien Liganden [A] im Assoziationsgleichgewicht der inneren Kammer:
A
a
A X
Da sich die Ligandenkonzentration in der inneren Kammer [A]
i
aus den Anteilen an
freiem und gebundenem Liganden [A]
geb
zusammensetzt:
A
i
A A
geb
Y
ergibt sich der gebundene Ligand aus der Konzentrationsdifferenz beider Kammern:
A
geb
A
i
A
a
X
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 171
Abb. 3.1. Prinzip der Gleichgewichtsdialyse. Die
kleinen Ligandenmolekle passieren frei die semi-
permeable Membran und verteilen sich gleich auf
beide Kammern, binden aber zustzlich an das Ma-
kromolekl, das die innere Kammer nicht verlassen
kann.
Nach der Dialyse knnen durch Probenahme aus beiden Kammern die aktuellen Ligan-
denkonzentrationen analysiert und [A] und [A]
geb
ermittelt werden. Zur Auswertung
von Bindungsexperimenten ist es erforderlich, Versuche bei unterschiedlichen
Ligandenkonzentrationen unter Konstanthaltung der Makromoleklkonzentration
durchzufhren. Die Ligandenkonzentration soll sich mglichst an der Gre der zu er-
wartenden Dissoziationskonstanten orientieren (vorteilhaft im Bereich einer Zehnerpo-
tenz ber und unter dieser).
Gegenber anderen Bindungsmethoden hat die Gleichgewichtsdialyse den Vorteil,
da [A] und [A]
geb
direkt aus der Gleichgewichtsmischung nach dem Experiment er-
halten werden knnen, whrend sie bei anderen Verfahren aus der Differenz zum ins-
gesamt eingesetzten Liganden [A]
0
=[A]+[A]
geb
zu errechnen sind. Dadurch entfallen
Fehlermglichkeiten durch Verluste des eingesetzten Liganden infolge unspezifischer
Bindungen an Kammerwnde oder Membran. Ein Nachteil besteht allerdings darin,
da der eigentliche Mewert [A]
geb
nur als Differenz der Mewerte beider Kammern
erhalten wird. Fehler in der Bestimmung von [A] in der ueren Kammer bertragen
sich zwangslufig auch auf [A]
geb
. Dieser Umstand bedingt nicht nur eine relativ
starke Fehlerstreuung, sondern fhrt auch dazu, da die Methode nur im Bereich
mittlerer Bindungskonstanten (K
d
&10
7
10
3
M) zuverlssig arbeitet. Bei schwche-
ren Bindungen, wo der Anteil an freiem Liganden im gesamten Mebereich hoch ist,
geht der geringfgige Anteil der Bindung bereits in der Fehlerschwankung von [A]
unter, bei sehr starken Bindungen umgekehrt der von [A] in der Schwankung von
[A]
geb
(Abb. 3.2).
Um kostbares Makromolekl zu sparen, arbeitet man zwar mit konzentrierten L-
sungen, aber mit geringen Volumina. Dies erfordert sehr empfindliche Nachweisme-
thoden fr den Liganden, zumeist ist dieser radioaktiv markiert. So entscheidet viel-
fach auch der Umstand, ob der Ligand in dieser Form erhltlich oder darstellbar ist,
ber die Anwendbarkeit der Methode. Zur Handhabung der geringen Testvolumina
wurden spezielle Apparaturen entwickelt (Myer et al., 1962; Englund et al., 1969).
Die Dialysekammern werden durch Bohrungen in Kunststoff- oder Teflonzylinder ge-
frst (Abb. 3.3). Breite und Tiefe der Bohrungen bestimmen das Testvolumen (z. B.
100 ll). Zwei solcher Zylinder bilden eine Dialysezelle, indem sie mit ihren ffnun-
gen flssigkeitsdicht aufeinander gepret werden, wobei zwischen ihnen eine Dialy-
semembran gespannt ist. Senkrechte, mit Stopfen verschliebare Kanle erlauben Fl-
len und Entleeren beider Kammern. Zur Bestimmung von Konzentrationsabhngig-
172 3 Methoden
Abb. 3.2. Verhltnis zwischen Megren und Feh-
lerschwankungen bei der Gleichgewichtsdialyse. Die
jeweils linken Balken reprsentieren die Mewerte
der ueren Kammer (freier Ligand), die rechten
Balken die der inneren Kammer (freier und gebun-
dener Ligand). Darber sind die Fehlerbalken ange-
zeigt.
keiten bentigt man 1020 Zellen, die in eine sich gleichmig drehende Halterung
eingespannt werden. Aufgrund der Temperaturabhngigkeit der Gleichgewichtskon-
stanten, die im physiologischen Temperaturbereich (z. B. 378C) bestimmt werden
soll, ist eine Temperierung durch Eintauchen der Zellen in ein Wasserbad erforder-
lich. Als semipermeable Membranen dienen Ultrafiltrationsmembranen aus unter-
schiedlichen Materialen und mit verschiedenen Porendurchmessern. Auch die aus
Cellulose bestehenden, stabilen Dialyseschluche (aufgeschnitten, in einfacher Lage)
eignen sich. Sie haben fr Proteine eine Ausschlugrenze von ca. 15000.
Zur Durchfhrung eines Dialyseexperiments wird eine konstante Menge des
Makromolekls in jeweils eine der beiden Dialysekammern eingefllt, in die andere
kommt die Ligandenlsung in unterschiedlicher Konzentration. Zur Verkrzung der
Dialysezeit wird auch empfohlen, eine Mischung beider Komponenten in eine der
Kammern zu geben und gegen eine Pufferlsung zu dialysieren. Allerdings besteht
hier die Gefahr, da ein unvollstndiger Ausgleich infolge zu kurzer Dialysezeit als
Bindung gewertet wird. Nach Einstellung des Dialysegleichgewichts werden genau
abgemessene Proben aus allen Kammern entnommen und darin die Ligandenkonzen-
tration z. B. durch Szintillationszhlung bestimmt. Zur Auswertung eignet sich beson-
ders das Diagramm nach Scatchard (Abschnitt 1.3.2.1), aus dem die Bindungskon-
stante, die Zahl der Bindungsstellen und gegebenenfalls abweichende Mechanismen
entnommen werden knnen.
3.1.1.2 Kontrollexperimente und Fehlerquellen
Dialysezeit. Die Dauer der Dialyse mu einen vollstndigen Ausgleich des Liganden
zwischen beiden Kammern garantieren. Dies hngt von verschiedenen Parametern ab,
wie Gre, Ladung und Polaritt des Liganden, Material und Porengre der Mem-
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 173
Abb. 3.3. Gleichgewichtsdialyseapparatur mit Doppelzelle. a) uere Kammern, i) innere Kammern,
b) Dialyseblock, d) Dichtungsstopfen, e) Einfllkanle, m) Dialysemembran, h) Halterung, s) Fest-
stellschrauben. Die Zelle kann so dimensioniert werden, da das Fllvolumen der einzelnen Kam-
mern nicht mehr als 30 ll betrgt (nach Englund et al. 1969).
bran, Dimension der Kammer, wirksame Membranoberflche, Bewegung der Dialyse-
zellen und Temperatur. Andererseits sind Enzyme uerst empfindlich gegenber ln-
gerfristiger Dialyse, vor allem bei erhhten Temperaturen, so da die Dialyse nicht
lnger als unbedingt ntig dauern soll. Zur Ermittlung der optimalen Dialysezeit
wird in eine der Kammern eine Ligandenlsung in einer mittleren Konzentration ein-
gefllt und gegen eine Pufferlsung in der anderen Kammer dialysiert. Zu bestimm-
ten Zeiten werden aus den beiden Kammern Proben entnommen und darin die Liga-
ndenkonzentration gemessen. Zur Zeit t =0 enthlt die Ligandenkammer noch die ur-
sprngliche Konzentration, die andere noch keinen Liganden. Mit dem Fortschreiten
der Dialyse gleichen sich beide Werte in exponentieller Weise einander an und tref-
fen sich schlielich beim mittleren Konzentrationswert (Abb. 3.4). Zur Sicherstellung
des Ausgleichs wird fr das eigentliche Dialyseexperiment eine etwas lngere Ge-
samtzeit gewhlt.
Konzentrationsbestimmungen. Die Zuverlssigkeit der erhaltenen Ergebnisse hngt
von der Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung sowohl des niedermolekularen
Liganden wie des Makromolekls ab. Letzteres mu in molaren Einheiten angegeben
werden, d. h. es mssen Proteingehalt und Molekulargewicht bekannt sein. Hinsicht-
lich des Proteingehalts ist zu beachten, da die blichen Verfahren zur Proteinbestim-
mung auf ein Standardprotein (z. B. Serumalbumin) geeicht sind, von dem andere
Proteine wesentlich abweichen knnen, so da eine Absolutbestimmung des Protein-
gehalts unumgnglich ist.
Stabilitt der Reaktionspartner. Durch Gehaltsbestimmung vor und nach der Dialyse
ist sicherzustellen, da sich die Reaktionspartner whrend des Versuchs nicht vern-
dern. Ligandenmolekle knnten spontan zerfallen, bei Enzymsubstraten ist mit ei-
nem katalytischen Umsatz zu rechnen. Letzterer lt sich zwar durch Entfernung es-
sentieller Faktoren, Cosubstrate, Coenzyme und Metallionen unterbinden, doch kn-
nen bei den auerordentlich hohen Enzymkonzentrationen und der langen Dialyse-
dauer bereits Spuren solcher Komponenten einen erheblichen Umsatz verursachen.
Zur Vermeidung solcher Effekte werden inaktive Substratanaloga eingesetzt, die al-
lerdings gegenber dem eigentlichen Substrat ein verndertes Bindungsverhalten be-
174 3 Methoden
Abb. 3.4. Bestimmung der minima-
len Dialysezeit. Der Ligand befindet
sich zur Zeit t =0 nur in der rechten
Dialysekammer (100%) und verteilt
sich zeitabhngig auf beide Kam-
mern. Die minimale Zeitdauer eines
Gleichgewichtsdialyseversuchs ent-
spricht derjenigen Zeit, in der sich
die Konzentrationen in beiden Kam-
mern gerade annhern.
sitzen. Ligandenverlust, z. B. durch Adsorption an Membran und Kammerwnde, ist
bei diesem Verfahren weniger strend, da die Ausgangsmenge [A]
0
nicht in die Be-
rechnung eingeht, sondern die aktuellen Konzentrationen bestimmt werden.
Auch das Makromolekl kann whrend des Versuchs Vernderungen erleiden oder
gar denaturieren, was die Ligandenbindung beeintrchtigt oder ganz verhindert. Bei
Enzymen lt sich der Erhalt der nativen Struktur durch Aktivittstests vor und nach
dem Versuch berprfen. Bei Proteinen und anderen Makromoleklen mssen zumin-
dest Gehaltsbestimmungen durchgefhrt werden, die jedoch nichts ber Funktionali-
tt aussagen. Im Gegensatz zum Liganden wird das Makromolekl in seiner Konzen-
tration whrend des Versuchs als unverndert angesehen, partielle Verluste durch De-
naturierung oder Adsorption an Kammerwnden mssen erfat und in der Auswer-
tung bercksichtigt werden.
Osmotischer Druck und Donnan-Effekt. Die semipermeable Dialysemembran hlt das
Makromolekl in einer Kammer, so da gegen die Ligandenkammer ein Konzentrati-
onsgeflle besteht. Zum Ausgleich strmt Lsungsmittel von der Kammer des Ligan-
den in die Kammer des Makromolekls. Es baut sich ein osmotischer Druck auf, die
flexible Dialysemembran wlbt sich nach auen und die Makromolekllsung wird
verdnnt. Durch Konzentrationsbestimmungen des Makromolekls vor und nach dem
Versuch kann dieser Effekt korrigiert werden, aufgrund der relativ geringen Makro-
moleklmengen ist er jedoch zumeist gering.
Strender sind dagegen die Auswirkungen des 1876 von W. Gibbs erkannten und
1911 von F. G. Donnan formulierten Ionengleichgewichts (Donnan-Effekt, Gibbs-
Donnan-Gleichgewicht). Es besagt, da die chemischen Potentiale der Kationen und
Anionen der inneren (l
i
KA
) und ueren (l
a
KA
) Kammer gleich sein mssen:
l
i
KA
l
KA
X 3X1
Proteine und andere Makromolekle tragen an ihrer Oberflche eine groe Zahl von
Ladungen, wobei sich positive und negative Ladungen gegenseitig kompensieren. Da-
bei verbleibt eine durch das Makromolekl selbst nicht neutralisierte berschula-
dung. Da diese in der Ligandenkammer keine Entsprechung hat, verteilen sich die
frei penetrierenden Ionen zur Aufrechterhaltung von Gl. (3.1) in ungleicher Weise
zwischen beiden Kammern. Ist der Ligand selbst geladen, unterliegt er ebenfalls die-
ser Ungleichverteilung. Tragen sowohl der Ligand wie die berschuladungen des
Makromolekls das gleiche Vorzeichen, wird der Ligand aus der inneren Kammer
verdrngt, der Anteil an spezifischer Bindung verringert sich dadurch scheinbar. Un-
terscheiden sich beide Vorzeichen, so bewirkt dies eine Anreicherung des Liganden
in der Makromoleklkammer unter Vortuschung bzw. Verstrkung einer Bindung.
Damit kann der Donnan-Effekt die Ergebnisse eines Gleichgewichtsdialyse-Versuchs
erheblich verflschen.
Fr die chemischen Potentiale von Anionen ([A
i
], [A
a
]) und Kationen ([K
i
], [K
a
])
der inneren und ueren Kammer gelten die Beziehungen:
l
i
KA
l
0i
KA
RTlnA
i
K
i
Y 3X2
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 175
l
a
KA
l
0a
KA
RTlnA
a
K
a
X 3X3
Die Standardpotentiale l
0i
KA
und l
0a
KA
knnen als identisch angesehen werden. Damit
ergibt sich durch Einsetzen in Gl. (3.1):
K
i
A
i
K
a
A
a
Y
K
i

K
a


A
i

A
a

X 3X4
Die Verhltnisse der Kationen und Anionen zwischen beiden Kammern sind gleich.
Aufgrund der Elektroneutralitt mu in jeder Kammer die Summe der positiven La-
dungen gleich der Summe der negativen Ladungen sein:
zE
i
K
i
A
i
und K
a
A
a
Y
wobei die Anzahl z der berschuladung des Makromolekls E
i
als positiv angenom-
men wurde. Durch Einsetzen von Gl. (3.4) folgt:
K
a

2
K
i
K
i
zE
i
Y 3X5 a
A
a

2
A
i
A
i
zE
i
X 3X5 b
Der Unterschied an Kationen und Anionen zwischen beiden Kammern ist damit:
K
i
K
a

zE
i
K
i

K
i
K
a

Y 3X6 a
A
i
A
a

zE
i
A
i

A
i
A
a

X 3X6 b
Fr eine negative berschuladung wrde sich das Vorzeichen der beiden Gleichun-
gen umkehren.
Tabelle 3.1 zeigt die Auswirkungen des Donnan-Effekts am Beispiel von Serumal-
bumin mit negativer, durch Natriumionen neutralisierter berschuladung. Es wird
176 3 Methoden
Tab. 3.1. Dialyse einer Kochsalzlsung unterschiedlicher Konzentration (Na
a
+
) gegen Serumalbumin
mit negativen berschuladungen. Die berschuladungen z[E]
0
sind durch Natriumionen neutrali-
siert, damit gilt vor der Dialyse Na
i
+
=z[E]
0
; es sind relative Werte angegeben.
Relative Na
+
-Konzentration Ungleich-
verteilung
vor der Dialyse nach der Dialyse (%)
Na
i
+
Na
a
+
Na
i
+
Na
a
+
1,0 0,01 1,000098 0,0099 99,0
1,0 1,0 1,333 0,667 66,7
0,01 1,0 0,508 0,502 1,2
gegen unterschiedlich konzentrierte Kochsalzlsungen dialysiert. Bei hundertfachem
berschu der berschuladungen des Serumalbumins gegenber dem Kochsalz in
der ueren Kammer finden sich nach der Dialyse nahezu alle Kationen in der Pro-
teinkammer. Das Serumalbumin erscheint vollstndig mit Ligand gesttigt. Selbst
bei Zugabe gleicher Mengen an Salz gegenber den berschuladungen erscheinen
zwei Drittel des Liganden gebunden, und auch noch bei hundertfachem berschu
an Salz reichert sich noch ber ein Prozent des Liganden in der Proteinkammer an.
Man erkennt daraus, da der Donnan-Effekt von der relativen Zahl der Ladungen ab-
hngt und durch hohe Salzkonzentrationen verringert werden kann.
3.1.2 Kontinuierliche Gleichgewichtsdialyse
Dieses Verfahren bentigt nicht die langen Dialysezeiten der einfachen Gleichge-
wichtsdialyse, sondern ist in 1020 Minuten durchzufhren. Es hat den zustzlichen
Vorteil, da fr die Erstellung einer Bindungskurve nur eine einzige Dialysezelle er-
forderlich ist und damit auch nur ein Bruchteil des Makromolekls bentigt wird.
Das Prinzip der Methode beruht darauf, da die Durchtrittsgeschwindigkeit einer
Substanz durch die Dialysemembran direkt proportional zu deren Konzentration ist.
Man lt das System nicht ins Dialysegleichgewicht kommen, sondern bestimmt den
pro Zeiteinheit durch die Membran tretenden Liganden. Die Dialysezelle wird, wie
in Abb. 3.5 gezeigt, so angeordnet, da die Membran horizontal liegt. In jeder Kam-
mer sorgt ein Magnetrhrer fr gleichmige Durchmischung. Die nach oben hin of-
fene obere Kammer enthlt das Makromolekl und den Liganden, die untere wird bis
zur Membran mit Pufferlsung gefllt. Im Verlauf der Dialyse wird Pufferlsung
stndig ber seitliche Kanle durch die untere Kammer gepumpt, so da sie mit
gleichfrmiger Geschwindigkeit an der Dialysemembran entlang strmt. Die abflie-
ende Lsung wird in einem Fraktionssammler aufgefangen. Durch diese Anordnung
kann der zeitliche Durchtritt des Liganden durch die Membran whrend des Dialyse-
vorgangs aus den Fraktionen analysiert werden.
Im ersten Schritt wird in der oberen Kammer zum Makromolekl eine so geringe
Menge an radioaktiv markiertem Liganden zugesetzt, da nur ein geringer Anteil der
freien Bindungsstellen abgesttigt wird. Durch die Membran tritt wiederum nur freier
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 177
Abb. 3.5. Kontinuierliche Gleich-
gewichtsdialyse. Von einem Vor-
ratsgef strmt eine Pufferl-
sung gleichmig entlang einer
Dialysemembran und splt den
von der oberen Makromolekl-
kammer durchtretenden freien Li-
ganden in einen Fraktionssamm-
ler.
Ligand, wobei nach der Zugabe etwa eine Minute bentigt wird, bis eine konstante
Durchtrittsgeschwindigkeit erreicht ist. Die Radioaktivitt jenseits der Membran
steigt zunchst rasch an, bis ein konstantes Plateau erreicht ist (Abb. 3.6). Zu diesem
Zeitpunkt wird der oberen Kammer eine weitere kleine Probe, diesmal jedoch unmar-
kierter Ligand, zugesetzt. Dieser setzt sich mit dem markierten Liganden ins Gleich-
gewicht und verdrngt ihn teilweise aus seiner Bindung vom Makromolekl. Es re-
sultiert damit ein grerer Anteil des markierten Liganden in freier Form und es
wird ein hherer Plateauwert erreicht. Dieses Vorgehen wird mit weiteren, jeweils
kleinen Gaben des unmarkierten Liganden fortgesetzt und nach jeder Zugabe erhht
sich das Plateau. Das erfolgt so lange, bis praktisch der gesamte radioaktive Ligand
verdrngt und das Makromolekl mit unmarkiertem Liganden gesttigt ist. Dies wird
durch Zugabe eines groen berschusses des unmarkierten Liganden im letzten
Schritt des Versuchs erreicht. Das gleiche Plateau erhlt man auch in einem Kontroll-
versuch zur Kalibrierung des Experiments, wenn nur markierter Ligand in der an-
fnglichen Konzentration ohne Makromolekl in die obere Kammer gegeben wird.
Die Radioaktivitt des Plateauwerts im letzten Schritt entspricht 100% des Substrats
im freien Zustand. Die Radioaktivitten der vorherigen Plateauwerte, geteilt durch
diesen Maximalwert, ergeben die Anteile des freien Liganden bei der jeweils vorlie-
genden Gesamtkonzentration. Die Differenz zwischen beiden Werten ergibt den An-
teil des gebundenen Liganden. Bei einer Dauer von 12 Minuten zum Erreichen des
Plateaus werden in kaum mehr als zehn Minuten zehn Mewerte erhalten. Es wird
davon ausgegangen, da die Gesamtmenge des markierten Liganden in der oberen
Kammer whrend des gesamten Versuchs konstant bleibt, also die Verluste durch die
Membranpassage zu vernachlssigen sind. Tatschlich verschwinden bei einem voll-
stndigen Ausgleich nach etwa zwei Stunden bei jeder Stufe ca. 1%, im gesamten
Versuch etwa 10% der ursprnglichen Menge.
178 3 Methoden
Abb. 3.6. Zeitlicher Verlauf der kontinuierlichen Gleichgewichtsdialyse. Zur Zeit t =0 wird radioaktiv
markierter Ligand in geringer Konzentration zugesetzt. Ohne bindendes Makromolekl ergibt sich die
obere Kurve, bei berschu von Makromolekl bindet der grte Anteil und es verbleibt nur eine
kleine Stufe fr den freien Liganden. Jeweils nach Erreichen der Stufenhhe werden definierte Men-
gen an unmarkiertem Liganden zugesetzt, der zunehmend den markierten aus seiner Bindung an das
Makromolekl verdrngt, bis schlielich der ursprngliche Plateauwert des Liganden in Abwesenheit
des Makromolekls erreicht ist.
3.1.3 Ultrafiltration
Der hauptschliche Anwendungsbereich dieser Methode liegt in der Konzentrierung
und Abtrennung von Makromoleklen in Lsungen. Fr bestimmte Probenvolumina
und Trennbereiche sind unterschiedliche Systeme im Handel erhltlich, die auch
nach verschiedenartigen Prinzipien arbeiten. Die Lsungen werden entweder durch
berdruck, Vakuum, Zentrifugalkraft oder nur mittels freier Diffusion durch Ultrafil-
trationsmembranen filtriert. Diese Membranen besitzen, wie auch Dialysemembra-
nen, Poren definierter Weite, die Molekle nach ihrer Gre ausschlieen. Durch die
Wahl von Membranen mit geeignetem Porendurchmesser werden bestimmte Parti-
kelfraktionen entsprechend ihrer Gre aus Homogenaten angereichert. Doch die
Trennung ist aufgrund des nicht exakten Porendurchmessers und unterschiedlicher
Moleklformen nicht sehr scharf. So wird Serumalbumin (M
r
=66000) bei der ange-
gebenen Ausschlugrenze von 30000 einer Membran nur zu etwa 95% zurckgehal-
ten. Zur vollstndigen Abtrennung ist der Unterschied zwischen der Ausschlugrenze
der Membran und der tatschlichen Moleklgre mglichst gro zu halten. Ein be-
sonderes Problem der Ultrafiltration liegt darin, da sie die zu konzentrierenden Par-
tikel auf die Membran pret und sich dort eine fest haftende Schicht bildet, die die
Membran verstopft und den Filtrationsvorgang blockiert. Auch sind die Makromole-
kle aus dieser Schicht schwierig wieder in Lsung zu bekommen.
Verschiedene der gebruchlichen Ultrafiltrationsverfahren knnen zur Bestimmung
von Bindungsgleichgewichten herangezogen werden. Das Prinzip dieser Bindungs-
messungen besteht darin, da aus einer Gleichgewichtslsung nur der freie Ligand
durch die Membran tritt, whrend das Makromolekl mit dem gebundenen Liganden
jenseits der Membran verbleibt. Allerdings ist eine strkere Konzentrierung zu ver-
meiden, da die Makromoleklkonzentration whrend des Versuchs als konstant ange-
sehen wird. Daher wird nur ein kleiner Anteil der Lsung durch die Membran ge-
pret und im Filtrat der Anteil des freien Liganden bestimmt, whrend die Ermitt-
lung des gebundenen Anteils aus der verbleibenden Lsung oberhalb der Membran
durch den Konzentrierungseffekt problematisch ist. Besser kann dieser Anteil aus der
Differenz zwischen zugegebenem und freiem Liganden berechnet werden, wobei al-
lerdings unspezifische Adsorptionen des Liganden an Membran und Kammer das Er-
gebnis verflschen. Die Ultrafiltration ist damit ungenauer als die Gleichgewichtsdia-
lyse, besitzt aber den Vorteil einer kurzen Versuchsdauer von wenigen Minuten und
eignet sich besonders fr empfindliche und instabile Systeme.
Die einfachste Form der Ultrafiltration ist das Aufbringen der Gleichgewichtsl-
sung auf einen mit einer Ultrafiltrationsmembran versehenen Filtertrichter, der auf
eine an ein Vakuum angeschlossene Saugflasche montiert ist (Abb. 3.7A). Die L-
sung des durchtretenden freien Liganden wird unterhalb der Filterplatte oder aus dem
Vakuumgef entnommen. Insgesamt darf nur ein Bruchteil der berstehenden L-
sung filtriert werden. Kritischer ist das Verfahren, die berstehende Lsung ganz ab-
zusaugen und, ohne nachwaschen, im noch feuchten Filter die Radioaktivitt des ge-
bundenen, radioaktiv markierten Liganden direkt zu messen im Vergleich zu einem
Kontrollversuch mit Liganden in Abwesenheit des Makromolekls (Suter & Rosen-
busch, 1974). Eine Beeinflussung des Gleichgewichts durch die Konzentrierung ist
nicht auszuschliessen. Eine Modifizierung dieses Verfahrens speziell fr geringe Vo-
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 179
lumina stellen auf Spritzen aufsetzbare, handelsbliche Filtrationsvorstze dar
(Abb. 3.7B), sie besitzen aber ein relativ groes Totvolumen. Filtrationseinheiten, die
die Zentrifugalkraft von Laborzentrifugen ausnutzen, ermglichen es, in einem
Durchgang mehrere Proben einzusetzen und damit die Ligandenkonzentration zu va-
riieren (Abb. 3.7C).
Speziell zum Studium der Ligandenbindung entwickelte H. Paulus (1969) eine
Apparatur, bei der in einen Plexiglaszylinder mehrere Ultrafiltrationszellen in Form
symmetrisch angeordneter senkrechter Bohrungen eingebracht sind (Abb. 3.7D). Ein
zweiter, krzerer Zylinder mit gleichen Bohrungen wird von der Unterseite angesetzt,
wobei zwischen beiden Zylindern eine Ultrafiltrations- oder Dialysemembran ge-
spannt ist. Die durchtretende Lsung wird schlielich durch Vertiefungen aufgefan-
gen, die in eine Plexiglasscheibe an der Unterseite der Apparatur eingelassen sind.
Die Bohrungen des ersten Zylinders sind von oben mit Schrauben luftdicht ver-
schliebar. In der Mitte der oberen Zylinderflche befindet sich ein Anschlustutzen
fr Druckluft, der ber radiale Kanle mit jeder Bohrung in Verbindung steht. Im un-
teren Zylinder sind seitliche Kanle so eingelassen, da die durchtretende Lsung
mit Hilfe einer Kanle von der Membranunterseite abgesaugt werden kann. Die bei-
den Zylinder werden gegeneinander so verschraubt, da die zwischenliegende Mem-
bran druck- und wasserdicht fixiert ist. Zur Versuchsdurchfhrung wird Makromole-
kllsung mit variierender Ligandenkonzentration in die Bohrungen eingefllt und
diese verschlossen. ber den zentralen Stutzen wird aus einer Stickstoff- oder Pre-
luftflasche ein Druck von ca. 275 kPa angelegt. Von dem durch die Membran treten-
den Filtrat wird eine genau abgemessene Probe entnommen und analysiert, wobei die
Konzentrierung der Lsung oberhalb der Membran gering zu halten ist. Die fr den
Versuch erforderlichen Makromoleklmengen sind durch die Dimension der Bohrun-
gen festgelegt, die so gearbeitet werden knnen, da pro Zelle 0,1 ml Lsung gen-
gen.
180 3 Methoden
Abb. 3.7. Ultrafiltrationsapparaturen. A) Filteraufsatz auf einer Saugflasche, B) Filtervorsatz auf einer
Spritze, C) Zentrifugenrhrchen mit Filtrationsmembran, D) Ultrafiltrationsapparatur nach Paulus
(1969). Druckluft gelangt ber eine zentrale ffnung in die mit verschiedenen Gleichgewichtsmi-
schungen gefllten Rhrchen und Lsung mit freiem Liganden wird durch die Membran gepret.
3.1.4 Gelfiltration
Dieses vor allem als Sulenchromatographie betriebene Verfahren dient in erster Li-
nie als prparative Methode zur Reinigung von Makromoleklen aus Homogenaten,
zur Entsalzung und Umpufferung von Makromolekllsungen und zur Bestimmung
von Moleklmassen (Molekularsiebchromatographie). Die zumeist aus Dextran, Aga-
rose oder Polyacrylamid bestehenden sphrischen Gelpartikel besitzen Poren definier-
ter Weite. Dadurch werden in dem Chromatographiegef zwei Kompartimente ge-
schaffen: ein fr alle Molekle der Lsung zugngliches ueres Volumen V
a
um die
Partikel und das innere Volumen V
i
der Partikel, in das nur Molekle eindringen kn-
nen, deren Querschnitt kleiner als der Porendurchmesser ist. Diesen steht somit das
gesamte Sulenvolumen V
g
=V
a
+V
i
zur Verfgung, dem Makromolekl dagegen nur
das uere Volumen. Bei der Passage durch eine mit solchen Partikeln gepackten
Gelfiltrationssule haben grere Molekle somit ein geringeres Volumen und einen
krzeren Weg zurckzulegen als kleinere, so da Moleklmischungen nach ihren
Gren getrennt werden. Dabei werden auch Liganden von ihren Bindungsstellen an
Makromoleklen abgestreift. Bindungsmessungen nach diesem Verfahren sind daher
so zu gestalten, da die Trennung das Gleichgewicht nicht beeinflut.
3.1.4.1 Batchverfahren
Das Bindungsgleichgewicht kann bereits mit einer sehr einfachen Anordnung be-
stimmt werden. Eine kleine Menge gequollenen Gels wird in ein passendes Gef
gegeben (Abb. 3.8). In Vorversuchen sind zunchst V
a
und V
i
zu bestimmen. Eine be-
kannte Menge des Makromolekls wird mit dem Gel vermischt. Nach dem Absitzen
des Gels ergibt sich V
a
aus der Makromoleklkonzentration einer Probe der berste-
henden Lsung. In gleicher Weise erhlt man das Gesamtvolumen V
g
durch Zusatz
des Liganden. Bei Zugabe einer Mischung von Makromolekl und Ligand zum Gel
im eigentlichen Versuch erhht sich die Ligandenkonzentration in der berstehenden
Lsung gegenber dem Vorversuch um den Anteil der Bindung an das Makromole-
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 181
Abb. 3.8. Batch-Verfahren zur Bestimmung
der Ligandenbindung. Durch die Poren der
Gelpartikel kann nur der niedermolekulare Li-
gand, nicht aber das Makromolekl eindrin-
gen.
kl. Dieses Verfahren entspricht prinzipiell der Gleichgewichtsdialyse, wobei das u-
ere Volumen der Makromoleklkammer, das innere Volumen der Ligandenkammer
quivalent ist. Der Versuch bentigt keine besondere Apparatur, jedoch ist Methode
nicht sehr genau.
3.1.4.2 Elution breiter Zonen
Entgegen der sonst blichen Chromatographiepraxis wird bei dieser von Ackers
(1975) beschriebenen Methode das Gemisch von Makromolekl und Ligand in einem
so groen Volumen aufgetragen, da whrend der Passage durch die Gelfiltrations-
sule keine vollstndige Trennung beider Komponenten mglich ist. Im Eluat finden
sich drei Zonen, zuerst das vorweg wandernde Makromolekl, das seinen Liganden
verloren hat , zuletzt der abgestreifte Ligand und dazwischen ein berlappungsbe-
reich beider Zonen, innerhalb dessen das Makromolekl den gebundenen Liganden
behlt. Der unmittelbar hinter diesem Bereich abgestreifte Ligand entspricht in seiner
Konzentration dem freien Liganden [A] in der Gleichgewichtsmischung. Dies gilt,
solange die drei Zonen in direktem Kontakt miteinander stehen und nicht voneinan-
der isoliert werden. Mit Hilfe der bekannten Menge [A]
0
des eingesetzten Liganden
kann [A]
geb
ermittelt werden.
3.1.4.3 Verfahren nach Hummel und Dreyer
Bei diesem Verfahren wird die Gelfiltrationssule mit der Ligandenlsung [A] quili-
briert und die Konzentration im Eluat photometrisch verfolgt (Abb. 3.9). Wenn im
Auslauf die gleiche Konzentration erreicht ist wie im Auftrag, wird das Makromole-
kl [E], gelst in der Ligandenlsung, in einem kleinen Volumen aufgetragen. Dann
wird wieder mit der ursprnglichen Ligandenlsung nachgesplt. Whrend des ge-
samten Vorgangs mu die Konzentration des Liganden [A] in den Lsungen gleich
bleiben. Das Makromolekl bindet einen Teil des Liganden und entzieht ihn der um-
182 3 Methoden
Abb. 3.9. Sulenchromatographisches Verfahren zur Ligandenbindung nach Hummel und Dreyer
(1962). A) Experimentelle Anordnung, B) Elutionsprofil.
gebenden Lsung. Dadurch ndert sich zwar die Gesamtkonzentration nicht, wohl
aber der Anteil des freien Liganden. Whrend der Sulenpassage wandert das Makro-
molekl mit dem gebundenen Liganden schneller als der freie Ligand und hinterlt
eine Lcke, die genau dem Anteil der Bindung entspricht. Der gebundene Ligand ad-
diert sich wiederum zu der Konzentration der umgebenden Ligandenlsung, in die
das Makromolekl hineinwandert, und zeigt ein Maximum. Das Gleichgewicht stellt
sich so ein, da die Konzentration der Ligandenlsung [A] derjenigen des freien Ligan-
den entspricht. Den gebundenen Anteil erhlt man durch Integration des Maximums
oder der Fehlstelle. Letzteres ist verllicher, da das Maximum auch eine mgliche Ab-
sorption des Makromolekls enthalten kann. Die Methode hat den Vorteil, da freier
und gebundener Ligand direkt gemessen werden. Auch ist keine radioaktive Markie-
rung erforderlich. Allerdings werden grere Substanzmengen gebraucht.
3.1.4.4 Verfahren nach Brumbaugh und Ackers
Die hohe Genauigkeit dieser Methode bertrifft die bisher genannten sulenchromato-
graphischen Verfahren, sie wird aber durch einen betrchtlichen apparativen Aufwand
erkauft. Man kann diese Methode als eine Kombination zwischen dem Batchverfah-
ren und der Hummel-Dreyer-Methode ansehen. Auch hier wird das chromatographi-
sche Geschehen photometrisch verfolgt, wobei jedoch die Sule direkt analysiert
wird. Diese befindet sich anstatt einer Kvette im Lichtstrahl eines Photometers
(Abb. 3.10) und mu daher aus UV-durchlssigem Quarzglas bestehen. Mit Hilfe ei-
nes Motorantriebs wird die Sule schrittweise durch den Lichtweg geschoben. Man
kann sich die Sule in eine grere Zahl (ca. 100) gleicher Volumenelemente einge-
teilt denken, deren Querschnitt durch die Sulendimension und deren Hhe durch die
Breite des Lichtwegs bestimmt wird. Jedes Volumenelement entspricht einem Gef
des Batchverfahrens (bzw. einer Gleichgewichtsdialysezelle) mit einem inneren Volu-
men V
i
und einem ueren Volumen V
a
. Diese Volumina werden in Vorversuchen
durch getrenntes quilibrieren mit Liganden- und Makromolekllsung ber Absorp-
tionsmessungen in jedem Volumenelement bestimmt. Der niedermolekulare Ligand A
verteilt sich zwischen beiden Kompartimenten nach der Beziehung:
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 183
Abb. 3.10. Sulenchromatographisches Verfahren zur Li-
gandenbindung nach Brumbaugh und Ackers (1974). Die
mit der Gleichgewichtsmischung beladene Sule bewegt
sich mittels Motorvorschub durch den Lichtstrahl eines
Photometers.
f
A
V
a
r
A
V
i
X 3X7
f
A
ist die Querschnittsverteilung und r der Verteilungskoeffizient, der je nach Gelsor-
te und Gre der Substanz Werte zwischen 0 und 1 annehmen kann. Bei ungehinder-
ter Diffusion des Liganden in die Poren des Gels ist r
A
=1, d. h. f
A
=V
a
+V
i
. Bei vlli-
gem Ausschlu des Makromolekls ist r
A
=0 und f
A
=V
a
. Nach quilibrieren der
Sule mit der Makromolekl-Liganden-Mischung wird der Anteil der Bindung ber
die beobachtete Abweichung von der Verteilung der freien Komponenten ermittelt.
Durch die Vielzahl der photometrisch zu vermessenden Volumenelemente ergibt sich
eine groe Datenmenge, die eine zuverlssige statistische Absicherung ermglicht
und die Genauigkeit der Methode begrndet.
3.1.5 Ultrazentrifugationsmethoden
3.1.5.1 Einfache Ultrazentrifugation
Prparative Ultrazentrifugen, die zur Grundausstattung biochemischer Labors zhlen,
ermglichen schonende Verfahren zur Bestimmung von Bindungsgleichgewichten
ohne zustzlichen apparativen Aufwand. Makromolekle wandern im Schwerefeld
der Zentrifuge rascher als der niedermolekulare Ligand und nehmen dabei den ge-
bundenen Liganden mit. Am Meniskus verbleibt der freie Ligand in der Konzentrati-
on des ursprnglichen Gleichgewichts und kann aus einer Probe bestimmt werden.
Dabei mssen die Sedimentation des Liganden selbst und eine Durchmischung am
Ende des Laufs ausgeschlossen werden.
Eine Anwendung dieser Methode auf eine kleinvolumige luftgetriebene Ultrazentri-
fuge (Airfuge

, Fa. Beckman, Volumen pro Zentrifugenrhrchen 0,17 ml) wurde von


Alberts und Krishnan (1979) beschrieben. Das Makromolekl wird auf den Boden
des Zentrifugengefes sedimentiert, was in dieser Zentrifuge in einigen Minuten er-
reicht ist. Es wird davon ausgegangen, da der gebundene Ligand im Niederschlag
noch mit dem berstehenden freien Liganden im ungestrten Gleichgewicht steht. Szin-
tillationsmessung des Zentrifugenrhrchens mit dem Niederschlag ergibt den Anteil des
gebundenen Liganden, whrend der freie Ligand aus dem berstand erhalten wird.
3.1.5.2 Zentrifugationsmethode von Chanutin et al. (1942)
Dieses dem vorherigen an Genauigkeit berlegene Verfahren ist in kleinvolumigen
Ultrazentrifugen rasch und mit geringen Substanzmengen durchfhrbar. Der Methode
liegt eine Umformung der Bindungsgleichung (1.23) zugrunde:
A
geb
A
0
A
nE
0
A
K
d
A
Y
A
0

nE
0
A
K
d
A
A X 3X8
184 3 Methoden
Unter der Annahme von [A] =konstant ist [A]
0
, die Gesamtkonzentration des Ligan-
den, eine lineare Funktion der Makromoleklkonzentration [E]
0
. In einer Auftragung
von [A]
0
gegen [E]
0
wird eine Gerade erhalten, die die Ordinate an der Stelle des
freien Liganden [A] schneidet (Abb. 3.11B). Experimentell erhlt man solche Ge-
raden, wenn ein Makromolekl-Liganden-Gemisch fr eine bestimmte Zeit zentrifu-
giert wird. Anschlieend werden aus verschiedenen Zonen des Zentrifugengefes
Proben entnommen und darin Liganden- und Makromolekl-Konzentrationen be-
stimmt. In einem Rotor knnen mehrere Zentrifugengefe mit variierenden Liga-
ndenkonzentrationen zentrifugiert und somit verschiedene Geraden mit unterschiedli-
chen Werten fr [A] erhalten werden. Es ist dabei unerheblich, an welchen Stellen
des Gefes nach der Zentrifugation die Proben entnommen werden, solange eine Se-
dimentation stattgefunden hat und die Werte Unterschiede gegeneinander aufweisen.
Bei gengend vielen Anstzen unterschiedlicher Ligandenkonzentration kann es be-
reits ausreichen, eine Probe der Gleichgewichtsmischung vor der Zentrifugation und
die Meniskusfraktion nach der Zentrifugation zu analysieren (Abb. 3.11A). Die erhal-
tenen Geraden sind zwar nur durch zwei Punkte definiert, dies ist jedoch damit zu
rechtfertigen, da die eigentliche Auswertung ber die Sekundrauftragung erfolgt.
Nach Gl. (3.8) ergibt die reziproke Steigung St der Geraden eine lineare Funktion:
St
nA
K
d
A
Y
1
St

K
d
nA

1
n
X 3X9
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 185
Abb. 3.11. Ultrazentrifugations-
methode nach Chanutin et al.
(1942). A) Zentrifugationsgef
vor (rechts) und nach (links)
der Zentrifugation. In B) sind
die Werte fr [A]
0
und [E]
0
aus
beiden Gefen aufgetragen
und durch Geraden verbunden.
Deren Steigungen ergibt die Ge-
rade in C) und durch Extrapola-
tion die Konstanten.
Die Auftragung der reziproken Steigung gegen 1/[A] ergibt eine lineare Funktion mit
den reziproken Werten fr n und K
d
als Ordinaten- bzw. Abszissenschnittpunkte
(Abb. 3.11C). Ein hnliches Verfahren mit direkter Absorptionsmessung in einer ana-
lytischen Ultrazentrifuge beschrieben Steinberg und Schachman (1966).
3.1.5.3 Rohrzuckergradientenzentrifugation nach Draper und Hippel
Ultrazentrifugationen in Festwinkelrotoren, in denen die Gefe in einem bestimmten
Winkel zur Rotorachse stehen (Abb. 3.12A), haben zwei gravierende Nachteile. Das
durch die Zentrifugalkraft senkrecht zur Rotorachse aufgebaute Schwerefeld weist
nicht in direkter Richtung durch das Gef vom Meniskus zum Gefboden. Vielmehr
sedimentieren Partikel auf die der Rotorachse abgewandten Gefwand, wo sie zum
Boden gleiten, so da die freie Sedimentationsstrecke wesentlich krzer als die Gef-
lnge ist. Weiterhin sind Banden, in denen Makromolekle durch das Zentrifugations-
gef wandern, in wssriger Lsung nicht besonders stabil und verbreitern sich durch
das Abbremsen des Rotors und die Gefentnahme. Daher eignet sich die prparative
Ultrazentrifugation in Festwinkelrotoren hauptschlich zur Trennung von Partikeln in
Sedimenten von der berstehenden Lsung. Differenzielle Ultrazentrifugation zur Auf-
trennung verschiedener Makromolekle nach ihrer Gre ist damit nicht mglich.
Durch Verwendung von Schwenkbecher-Rotoren (Abb. 3.12B) und Dichtegradien-
ten lassen sich diese Nachteile umgehen. Die beweglichen Schwenkbecher stellen
186 3 Methoden
Abb. 3.12. Festwinkelrotor (A) und
Schwenkbecherrotor (B) mit sedimentie-
render Bande im Schwerefeld. C) Misch-
gef zur Herstellung von Rohrzucker-
gradienten.
sich in der Anlaufphase der Zentrifugation senkrecht zur Rotorachse, so da die
Wanderung der Partikel durch das Gef direkt zum Boden erfolgt. Der Dichtegra-
dient wirkt der Bandenverbreiterung entgegen. Prinzipiell sind zwei Arten der Dich-
tegradientenzentrifugation zu unterscheiden. Bei der echten Dichtegradientenzentrifu-
gation formt sich ein Gradient zunehmender Dichte vom Meniskus zum Boden wh-
rend der Zentrifugation, indem die Partikel eines dichten Mediums, wie Csiumchlo-
rid, im Schwerefeld absinken. Da die Diffusion der Teilchen der Sedimentation ent-
gegenwirkt, erfolgt keine Sedimentierung des dichten Mediums, vielmehr bildet sich
im Gleichgewicht zwischen Schwerefeld und Diffusion ein stabiler Gradient aus. Ma-
kromolekle, wie Proteine oder Nucleinsuren, sammeln sich innerhalb des Gradien-
ten in scharfen Banden an der Position ihrer eigenen Dichte. Die Trennung erfolgt
somit nicht nach der Teilchengre (die aus der Bandenbreite abgeschtzt werden
kann), sondern nach deren Dichte. Makromolekle eines Typs, wie Proteine, RNA,
Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-DNA, sammeln sich an gleichen Positionen.
Ultrazentrifugation in Rohrzuckergradienten und vergleichbaren Medien, wie Gly-
cerin, ist demgegenber keine Dichtegradientenzentrifugation im eigentlichen Sinn,
da die Teilchen hier tatschlich entsprechend ihrer Gre wandern. Der ansteigende
Dichtegradient verhindert die Bandenverbreiterung, da die Banden gegen ein zuneh-
mend dichteres Medium anlaufen. Bei gengend langer Zentrifugation wrden die
Banden schlielich am Gefboden sedimentieren. Der Gradient baut sich nicht wh-
rend der Zentrifugation auf, sondern mu zuvor durch einen Gradientenmischer ge-
formt werden (Abb. 3.12C), wobei die Rohrzuckerkonzentration vom Meniskus (z. B.
5%) zum Gefboden (z. B. 20%) linear zunimmt. Ein solcher Gradient bleibt bei vor-
sichtiger Handhabung fr einige Tage stabil. Unmittelbar vor Beginn der Zentrifugation
wird der Gradient mit der Makromolekllsung berschichtet. Dauer und Geschwindig-
keit der Zentrifugation richten sich nach der Sedimentationsgeschwindigkeit der Parti-
kel, deren Banden fr eine gute Auftrennung den Gradienten weitgehend ausnutzen,
aber nicht zu Boden sedimentieren sollen. Am Ende der Zentrifugation wird die L-
sung durch Absaugen mittels einer von oben zum Gefboden eingefhrten Kanle
oder durch Austropfen nach dem Anstechen des Gefbodens in Fraktionen gleichen
Volumens gesammelt. Die Tropfenzahl ist ein relatives Ma der Wanderungsstrecke,
aus der nherungsweise Sedimentationskoeffizient und relative Moleklmasse von Ma-
kromoleklen bestimmt werden knnen (Martin & Ames, 1961).
Der Vorteil der differenziellen Auftrennung wird bei der Anwendung der Methode
zur Bestimmung von Bindungsgleichgewichten ausgenutzt. Im Unterschied zu den
bisher besprochenen Verfahren, die einen betrchtlichen Grenunterschied zwischen
Ligand und Makromolekl voraussetzen, ist es hier mglich, Bindungen von Molek-
len hnlicher Gre sowie Assoziationen zwischen verschiedenen Makromoleklen
oder deren Untereinheiten zu erfassen. Wie oben beschrieben, wird ein linearer Rohr-
zuckergradient mit einem definierten Volumen einer Ligand-Makromolekl-Mischung
berschichtet. Die rascher sedimentierende Komponente (d. h. das Makromolekl)
mu hier in groem (zumindest zehnfachem) berschu gegenber der niedermole-
kularen Komponente vorliegen. Die anschlieende Ultrazentrifugation erfolgt solan-
ge, bis die Bande des Makromolekls ein n-faches ihrer eigenen Breite zurckgelegt
hat (Abb. 3.13). Nach der Zentrifugation wird der Gradient fraktioniert und die Liga-
ndenkonzentration in Abhngigkeit von der Wanderungsstrecke ermittelt.
A3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 187
Zu Beginn der Zentrifugation, d. h. beim ersten Schritt, ist der Anteil des gebunde-
nen Liganden ([A]
geb
)
1
gem der allgemeinen Bindungsgleichung (1.23), wobei je-
doch die Konzentration des freien Makromolekls [E] anstelle der Ligandenkonzen-
tration [A] als unabhngige Variable und [A]
0
als konstant betrachtet werden. Da die
Gesamtmenge an [E] gegenber [A] sehr gro ist, wird nherungsweise [E] =[E]
0
ge-
setzt:
A
geb

1

E
0
A
0
K
d
E
0
X 3X10
Wird nun im zweiten Schritt die Makromoleklbande infolge der Zentrifugation um
genau die Breite d der Auftragszone versetzt, so nimmt sie den gebundenen Ligan-
den mit, whrend der freie an der Startposition liegen bleibt. Der im ersten Schritt
gebundene Ligand wird damit im zweiten Schritt zur Gesamtmenge an Ligand:
A
geb

2

E
0
A
geb

1
K
d
E
0

E
0
K
d
E
0

2
A
0
und entsprechend fr den dritten Schritt der Translokation des Makromolekls um
die zweifache Auftragsbreite:
A
geb

3

E
0
A
geb

2
K
d
E
0

E
0
K
d
E
0

3
A
0
188 3 Methoden
Abb. 3.13. Rohrzuckergradientenzentrifugation zur Bindungsmessung (nach Draper & Hippel, 1979).
oder allgemein fr den iten Schritt:
A
geb

i

E
0
K
d
E
0

i
A
0
X
K
d

E
0

A
geb

i
A
0
i
s E
0
X 3X11
Die Dissoziationskonstante gewinnt man aus dem Anteil des gebundenen Liganden in
der Makromoleklbande und den eingesetzten Konzentrationen beider Komponenten.
Nach einer Methode von Yamamoto und Alberts (1974) wird bereits whrend der
Herstellung des Gradienten im Zentrifugengef bei ca. 12% Rohrzucker eine
schmale Bande des langsamer wandernden Liganden eingearbeitet, whrend der Be-
reich darber (von 511,5%) das Makromolekl enthlt (Abb. 3.14). Dieses wandert
ber die schmale Ligandenzone hinweg, so da der Ligand whrend der Zentrifugati-
on immer von einer konstanten Makromoleklkonzentration umgeben ist. Nach der
Fraktionierung wird die Menge an gebundenem Liganden analysiert.
3.2 Elektrochemische Methoden
Elektrochemische Methoden eignen sich besonders fr enzymkinetische Untersuchun-
gen, da der zeitliche Ablauf der enzymkatalysierten Reaktion kontinuierlich doku-
mentiert werden kann. Aus den erhaltenen Zeit-Umsatz-Kurven kann die Anfangsge-
schwindigkeit ermittelt werden oder man wertet sie nach der integrierten Michaelis-
Menten-Gleichung (Abschnitt 2.3.1.5) aus.
Entstehung oder Verbrauch von Gasen in enzymatischen Reaktionen werden zu-
meist mittels einer Sauerstoff- oder CO
2
-Elektrode gemessen, doch sei darauf hinge-
wiesen, da solche Bestimmungen auch mit der von Otto Warburg entwickelten ma-
A3.2 Elektrochemische Methoden 189
Abb. 3.14. Rohrzuckergradientenzentrifugati-
on zur Bindungsmessung (nach Yamamoto &
Alberts, 1974).
nometrischen Apparatur mglich sind (Abb. 3.15). Ein Reaktionsgef ist so beschaf-
fen, da die Substratlsung in einem seitlichen Ansatz von der Enzymlsung am Ge-
fboden getrennt ist. In der Mitte des Gefbodens ist noch ein weiteres rundes
Kompartiment abgeteilt, das eine Stopp-Lsung enthlt. Die Anordnung wird gas-
dicht mit einem Manometer verbunden. Durch Neigen der Apparatur wird die Sub-
strat- in die Enzymlsung gegossen und damit die Reaktion gestartet. Das Gef
taucht whrend der Dauer der Reaktion in ein Temperierbad und wird in leichter Be-
wegung gehalten. Durch Zumischen der Stopp-Lsung im inneren Kompartiment
kommt die Reaktion zum Stillstand und das Gas wird aus der wssrigen Lsung aus-
getrieben. Am Stand der Flssigkeitssule des Manometers wird die Menge des ent-
standenen bzw. verbrauchten Gases abgelesen.
3.2.1 Sauerstoffelektrode
Sauerstoff spielt in zahlreichen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle, wie bei
der Atmungskette, den Reaktionen von Oxygenasen, Hydroxylasen und Oxidasen und
er bindet an Transportproteine wie Hmoglobin und Myoglobin. Die von L. C. Clark
(1953) entwickelte Sauerstoffelektrode (Abb. 3.16A) vereinfachte das Studium sauer-
stoffabhngiger Vorgnge auerordentlich. Als Kathode dient ein in der Mitte eines
Glasrohres fixierter Platindraht. Seitlich von diesem befindet sich eine Silber/Silber-
chlorid-Anode. Beide Elektroden sind mit gesttigter Kaliumchloridlsung umsplt.
An ihnen liegt eine konstante Spannung von 0,50,8 V an. Die ganze Anordnung ist
gegen die Probenlsung mit einer Membran aus Teflon oder Polyethylen abge-
schirmt. Der Probenraum mu luftdicht mit der Elektrode verbunden sein. ber ei-
nen verschliebaren Kanal wird er mittels einer Injektionsspritze beschickt. Zum bes-
seren Austausch wird die Probe durch einen Magnetrhrer gerhrt. Gelster Sauer-
stoff dringt durch die Membran und wird an der Kathode reduziert:
190 3 Methoden
Abb. 3.15. Warburg-Manometer zur Messung gasfreisetzender
oder -verbrauchender enzymatischer Reaktionen.
Kathode 4H
+
+ 4e

+ O
2
? 2H
2
O
Anode 4Ag + 4 Cl

? 4AgCl + 4e

4H
+
+ 4Ag + 4Cl

+ O
2
? 4AgCl + 2H
2
O.
Der entstehende Strom ist der Sauerstoffkonzentration in der Lsung proportional. Be-
dingt durch die Membran hat die Sauerstoff-Elektrode eine lngere Ansprechzeit. Im
Kathodenraum sammelt sich ein Sauerstoffvorrat mit einer Halbwertszeit von ca. zwei
Minuten, der sich insbesondere bei bergngen von hoher zu niedriger Sauerstoffkon-
zentration strend bemerkbar macht. Eine Verkrzung der Ansprechzeit wird durch of-
fene Elektroden ohne Membran erreicht, allerdings besteht die Gefahr der Vergiftung
durch Komponenten der Lsung. Vor der Messung der Probe mu die Elektrode kali-
briert werden. 0% Sauerstoff wird durch Entgasen im Stickstoffstrom oder durch Zu-
satz von Natriumdithionit zur Pufferlsung erreicht, 100% durch luftgesttigtes Wasser.
Eine apparative Anordnung zur kinetischen Verfolgung sauerstoffabhngiger Reak-
tionen zeigt Abb. 3.17 (Degn et al., 1980). Als Reaktionsgef dient eine photometri-
sche Kvette, die eine simultane Verfolgung der Absorptionsnderung in der Lsung
whrend der Reaktion ermglicht. Ein Gasstrom mit definiertem Sauerstoffgehalt
berstreicht die Reaktionslsung. Zum schnellen Ausgleich des Sauerstoffs in der
Gasphase mit der Lsung wird intensiv gerhrt. Aus diesem Grund wird eine sechs-
eckige Kvette oder, wenn photometrische Messungen nicht erfolgen, ein rundes Ge-
f verwendet. Durch ein Loch am unteren Teil des Reaktionsgefes wird eine Sau-
erstoffelektrode eingefhrt, eine zweite mit von oben den Sauerstoffgehalt in der
Gasphase. Ein Mehrkanalschreiber zeichnet die Medaten beider Sauerstoffelektro-
den und des Photometers auf. Durch ein Computerprogramm kann die Kinetik der
Reaktion unmittelbar verarbeitet werden. Dabei wird die Umsatzgeschwindigkeit des
Systems v
r
bei linear ansteigendem Sauerstoffgehalt der Gasphase gemessen und di-
A3.2 Elektrochemische Methoden 191
Abb. 3.16. Schema einer Sauerstoffelektrode (A) und einer CO
2
-Elektrode (B).
rekt oder in linearisierter Form aufgetragen. Es wird davon ausgegangen, da im
Gleichgewicht v
r
gleich der Geschwindigkeit v
t
des Sauerstofftransports von der Gas-
phase in die Flssigkeit ist; v
t
ist der Differenz zwischen den Sauerstoffdrcken in
der Gasphase T
G
und der Lsung T
L
proportional:
v
r
v
t
KT
G
T
L
X 3X12
K ist bei gegebenen Bedingungen ein von Temperatur, Rhrgeschwindigkeit und dem
Verhltnis zwischen Oberflche und Volumen der Reaktionslsung abhngiger Fak-
tor. Bei linear ansteigendemSauerstoffgehalt der Gasphase wird bezglich des Sauerstoff-
austausches zwischen Gasphase und Lsung kein Steady-State erreicht, d. h. dT
L
/dt =0:
v
r
v
t
KT
G
T
L

dT
L
dt
X 3X13
K wird durch Bestimmung von T
L
nach Vernderung von T
G
aus einem Ansatz ohne
sauerstoffreaktives System (v
r
=0) erhalten:
T
L
dt
KT
G
T
L
X 3X14
3.2.2 CO
2
-Elektrode
Das Prinzip einer CO
2
-Elektrode unterscheidet sich grundlegend von dem der Sauer-
stoffelektrode. Es basiert auf einer pH-Messung mit Hilfe einer Glaselektrode. Sie ist
von einer Membran aus gummibeschichtetem Cellophan oder aus Silicongummi um-
geben, die in die Probelsung taucht (Abb. 3.16B). Gelstes Kohlendioxid diffundiert
in den Raum zwischen Membran und Glaselektrode, wobei es zu Kohlensure hydra-
tisiert. Die resultierende pH-nderung ist ber einen Faktor S dem CO
2
-Gehalt der
Lsung proportional:
192 3 Methoden
Abb. 3.17. Apparative Anordnung
zur kinetischen Verfolgung sauer-
stoffabhngiger Reaktionen mit
Hilfe von Sauerstoffelektroden
fr Messungen in Lsung und in
der Gasphase.
DpH S Dlog pCO
2
X
Daraus wird ersichtlich, da CO
2
-Messungen empfindlich auf pH-nderungen reagie-
ren, der pH-Wert der Lsung mu streng kontrolliert werden. Die CO
2
-Elektrode
wird durch eine standardisierte Hydrogencarbonatlsung oder durch unterschiedliche
CO
2
-Partialdrucke kalibriert.
3.2.3 Potentiometrie, Oxidations-Reduktions-Potentiale
Oxidations-Reduktions-Systeme (Redox-Paare), die in biologischen Systemen, wie in
der Atmungskette und in Enzymreaktionen, vorkommen, lassen sich durch potentio-
metrische Messungen erfassen. Eine Elektrode (z. B. Platinelektrode) in einer Redox-
Lsung wird geladen und zeigt gegenber einer Referenzelektrode eine durch ein Po-
tentiometer zu messende Potentialdifferenz. Redox-Potentiale sind charakteristische
Gren fr bestimmte Redox-Systeme. Sie sind bezogen auf eine Standard-Wasser-
stoffelektrode, einer mit Wasserstoffgas unter Atmosphrendruck umsplten Platine-
lektrode, die in eine Lsung von 1,228 M HCl taucht. Deren Potential wird als 0 de-
finiert. Solche Redox-Paare sind NAD
+
/NADH, NADP
+
/NADPH, FAD/FADH
2
und
Cytochrom Fe
3+
/Fe
2+
. Durch oxidierende bzw. reduzierende Reagenzien kann ein Re-
dox-Paar oxidiert bzw. reduziert werden. Bei Bestimmung der Potentialdifferenz ge-
gen das Ausma von Oxidation bzw. Reduktion wird eine potentiometrische Titrati-
onskurve erhalten.
Redox-Vorgnge lassen sich auch durch Redox-Indikatoren sichtbar machen. Diese
verndern ihre Farbe mit dem Redoxzustand und knnen in enzymatischen Redox-
Reaktionen als Elektronendonatoren oder -akzeptoren fungieren. Hufig verwendete
Elektronenakzeptoren sind Ferricyanid, 2,6-Dichlorphenolindophenol, Methylenblau,
Phenazinmethosulfat und die fr histochemische Enzymnachweise verwendeten Te-
trazoliumsalze. Das Fortschreiten der Redox-Reaktion lt sich damit photometrisch
verfolgen.
3.2.4 pH-Stat
Bei vielen Enzymreaktionen werden Protonen freigesetzt bzw. gebunden, wie bei De-
hydrogenasen:
reduziertes Substrat + NAD(P)
+
B
A
oxidiertes Produkt + NAD(P)H + H
+
,
Oxidasen, Hydrolasen, Esterasen und Proteasen (ber deren Esteraseaktivitt, die ei-
gentliche proteolytische Spaltung setzt keine Protonen frei). ber die pH-nderung
knnte die Enzymreaktion mittels einer pH-Elektrode erfat und aufgezeichnet wer-
den. Allerdings beeinflut die pH-nderung selbst die Enzymaktivitt. Um den pH-
Wert whrend der Reaktion konstant zu halten, werden Enzymreaktionen normaler-
weise in gepufferten Lsungen gemessen. Damit entfllt aber die Mglichkeit, die
A3.2 Elektrochemische Methoden 193
Reaktion ber pH-Messung zu verfolgen. Erfolgt die Reaktion dagegen in ungepuf-
ferter Lsung und wird durch Zugabe von Sure oder Base der pH-Wert konstant ge-
halten, so ist deren Verbrauch ein direktes Ma der Enzymreaktion. Das ist das Prin-
zip eines automatischen Titrators, des pH-Stats (Abb. 3.18). Er besteht aus einer pH-
Elektrode, z. B. einer Glaselektrode mit einer Kalomel-Referenz-Elektrode, einem
pH-Meter und einer Steuereinheit. Diese sendet bei pH-nderungen in der Reaktions-
lsung Impulse an den Motor einer automatischen Brette, der solange in Betrieb ge-
setzt wird, bis der eingestellte pH-Wert wieder erreicht ist. Die Zugabe wird in Ab-
hngigkeit der Zeit registriert. Die Empfindlichkeit des Gerts bestimmt sich durch
den Verdnnungsgrad der Sure bzw. Base in der Brette. Allerdings darf sich das
Probenvolumen whrend der Enzymreaktion nicht wesentlich verndern. Die Zuga-
ben erfolgen entweder im Wechsel von Zugaben und Pausen, was aber die Empfind-
lichkeit beeintrchtigt und die Gefahr des bertitrierens einschliet, oder durch eine
proportionale Kontrolle, die eine rasche Antwort des Systems ermglicht. Die Reakti-
onslsung mu gleichmig gerhrt werden. Strende Einflsse von auen, wie CO
2
oder elektrostatische Wechselwirkungen mit anderen Gerten oder Kunstfasern
(Kleider des Experimentators) sind fernzuhalten. pH-State sind in verschiedenen Aus-
fhrungen erhltlich (automatischer Probenwechsel mit zwischenzeitlichem Splen
und Probenvorbereitung, simultane Konstanthaltung der Substratkonzentration durch
eine zweite Brette, Systemsteuerung und Datenverarbeitung durch Computer).
Nach einem anderen pH-Stat-Prinzip wird die pH-nderung nicht durch Titration,
sondern mittels eines Elektrolyse-Stroms kompensiert, der Sure bzw. Base an den
Elektroden entstehen lt. Dies hat den Vorteil, da das Reaktionsvolumen konstant
bleibt. Die pH-Kontrolle erfolgt spektrophotometrisch ber pH-Indikatoren (Karcher
& Pardue, 1971).
pH-Stat-Messungen sind oft empfindlicher als photometrische Tests, auch ist es
mglich, mit stark absorbierenden Homogenaten und streuenden Suspensionen, wie
membrangebundenen oder immobilisierten Enzymen, zu arbeiten. Allerdings ist das
pH-Stat-Verfahren umstndlich in der Handhabung und hat eine relativ lange An-
sprechdauer.
194 3 Methoden
Abb. 3.18. Schematische Darstellung eines pH-
Staten.
3.2.5 Polarographie
Werden zwei Elektroden mit geringer negativer Potentialdifferenz in die Lsung ei-
ner elektro-reduzierbaren Substanz getaucht, so fliet zwischen beiden Elektroden
ein schwacher Reststrom. Bei kontinuierlicher Erhhung des Potentials wird schlie-
lich ein Punkt erreicht, bei dem die Substanz an der Kathode reduziert wird. Der
Strom beginnt anzusteigen. Dieser Stromanstieg setzt sich bei weiterer Potentialstei-
gerung solange fort, bis die Reduktion der Substanz an der Kathode durch die Diffu-
sion beschrnkt wird. Ab hier bewirkt weiterer Potentialanstieg keine Erhhung des
Stromes. Es resultiert eine sigmoide Strom-Spannungs-Kurve, ein Polarogramm. Des-
sen Wendepunkt, das Halbwellenpotential E
1/2
, ist eine charakteristische, konzentrati-
onsunabhngige Gre der betreffenden Substanz (Abb. 3.19B). Die Hhe der Kurve,
der Grenzstrom, ist ein Ma der Substanzmenge und kann fr Konzentrationsbestim-
mungen herangezogen werden. Elektro-oxidierbare Substanzen werden bei positivem
Potential an der Anode oxidiert und ergeben ein entsprechendes, aber entgegenge-
richtetes Signal.
Die Polarographie ist eine auerordentlich empfindliche Methode, die in verdnn-
ten Lsungen und mit geringen Probenvolumina arbeitet (Abb. 3.19A). Als Kathode
beim Studium von Reduktionen eignet sich eine tropfende Quecksilberelektrode.
Quecksilber tropft aus einem Reservoir durch eine Kapillare in die Lsung, wobei
die Reservoirhhe so eingestellt wird, da pro Minute 1020 Tropfen in die Lsung
fallen. Durch die sich bestndig erneuernde Oberflche wird eine Vergiftung der
Elektrode z. B. durch Proteine verhindert. Die sich bildende Quecksilberschicht am
Gefboden kann als Anode dienen. Vielfach wird jedoch eine Kalomelelektrode ver-
wendet, die mit der Probelsung durch eine Salzbrcke verbunden ist. Die angelegte
Spannung wird potentiometrisch verndert und der erzeugte Strom durch ein Galva-
nometer gemessen. Fr Oxidationen wird eine rotierende Platinelektrode oder eine
Kohlenstoffelektrode als Anode verwendet.
Ergeben Produkt oder Substrat einer Enzymreaktion ein polarographisches Signal,
so kann der enzymatische Umsatz bei konstantem Potential zeitlich verfolgt werden
A3.2 Elektrochemische Methoden 195
Abb. 3.19. Schematische Darstellung einer polarographischen Messung mittels einer tropfenden Queck-
silberelektrode (A) und eines Polarogramms zur Bestimmung des Halbwellenpotentials E
1/2
(B).
und man erhlt eine Zeit-Umsatz-Kurve, wobei die Stromstrke ein Ma des Umsat-
zes ist. Polarographischen Messungen zugnglich sind Reaktionen mit Sauerstoff
(wobei eine Sauerstoff-Elektrode verwendet werden kann), Thiolverbindungen (z. B.
von Coenzym A-abhngigen Reaktionen) und Carbonylverbindungen, wie Pyruvat
und NAD
+
bzw. NADH. Gegenber photometrischen Verfahren kann hier in trben,
stark absorbierenden Proben gemessen werden.
3.3 Kalorimetrie
Die Kalorimetrie ist eine der ltesten biologischen Methoden. Bereits 1780 studierten
Lavoisier und Laplace mit ihrer Hilfe die tierische Atmung. Trotzdem setzte sich
diese Methode in der Biochemie bisher wenig durch. Die meisten chemischen und
biologischen Prozesse sind begleitet von Wrmefreisetzung oder Wrmeaufnahme
aus der Umgebung. Die Wrmeentwicklung steht in direktem Verhltnis zum Verlauf
der Reaktion. Die Kalorimetrie ist damit eine breit anwendbare Methodik, die den
Vorteil besitzt, da Systeme direkt, ohne uere Beeinflussung oder Modifikation un-
tersucht werden knnen, auch bestehen keine besonderen Reinheitsanforderungen.
Mit Hilfe von Mikrokalorimetern ist es mglich, nderungen im Bereich von mJ zu
erfassen, womit der mikromolare Konzentrationsbereich zugnglich ist.
Zwei kalorimetrische Prinzipien werden hauptschlich angewandt. Bei adiabati-
schen Kalorimetern erfolgt kein Wrmeaustausch mit der Umgebung. Die vom Sy-
stem freigesetzte bzw. aufgenommene Wrmemenge Q=e DT wird durch die relative
Temperaturnderung erfat, mit der sie ber die Kalibrierungskonstante e proportio-
nal ist. Nach auen sind die Kalorimetergefe durch einen Luft- oder Vakuumman-
tel abgeschirmt (isoperibole Kalorimeter), der jedoch besonders bei lang andauern-
den Prozessen einen gewissen Wrmeaustausch nicht vllig ausschliet. Durch einen
heizbaren adiabatischen Metallschild innerhalb des Auenmantels, der sich automa-
tisch immer auf die Innentemperatur im Kalorimetergef einreguliert, wird der Wr-
meaustausch mit der Umgebung unterbunden (Abb. 3.20A). Mit dieser Art von Kalo-
rimetern ist es jedoch nicht mglich, bei konstanter Temperatur zu messen.
196 3 Methoden
Abb. 3.20. Schema eines adiabatisch abgeschirmten Kalorimeters (A) und eines Wrmeleitungskalori-
meters mit Zwillingsanordnung (B).
Bei Wrmeleitungskalorimetern wird die Wrme aus dem Reaktionsgef direkt
an ein ueres Wrmereservoir abgegeben und der Wrmeflu durch ein zwischen
beiden Kompartimenten angebrachtes Thermoelement kontrolliert (Abb. 3.20B). Al-
lerdings sind diese Gerte relativ trge und eignen sich deshalb eher fr langsame
Prozesse. Bei isothermischen Kalorimetern werden endo- und exothermische Effekte
durch Heizung bzw. Khlung in der Mezelle kompensiert und die zur Kompensati-
on erforderlichen Impulse zeitabhngig erfat. Das Scanning-Kalorimeter hlt Refe-
renz- und Probenzelle auf gleicher Temperatur und registriert die zur Kompensation
der Probenzelle erforderliche Wrmemenge.
Manipulationen, wie der Start einer Reaktion durch Substratzugabe oder Rhren
beeinflussen die kalorimetrischen Messungen. Zu deren Kompensation, wie auch
zum Ausgleich von unspezifischem Wrmeaustausch mit der Umgebung, kommen
mit zwei identischen Kammern ausgestattete Zwillingskalorimeter zur Anwendung.
Proben- und Referenzkammer werden gleich behandelt, die eigentliche Reaktion
luft jedoch nur in der Probenkammer ab. Um nderungen der Absorption oder der
optischen Dichte in der Mezelle zu verfolgen, werden Kalorimeter auch mit photo-
metrischen Systemen ausgerstet. Fr Enzymreaktionen eignen sich besonders mit
Misch- bzw. Durchfluzellen ausgestattete Flow-Kalorimeter. Bei einer unter Steady-
State-Bedingungen verlaufenden Reaktion nullter Ordnung ist die in der Zeiteinheit
freigesetzte Wrmemenge konstant und die Hhe der Abweichung von der Basislinie
ist proportional zur Umsatzgeschwindigkeit.
Ligandenbindung an Makromolekle lt sich kalorimetrisch verfolgen. In getrenn-
ten Experimenten wird der Anteil der Verdnnungswrme des Liganden und gegebenen-
falls auch des Makromolekls ermittelt und von den Mewerten der Bindung abgezo-
gen. Durch die kalorimetrische Titration des Makromolekls mit dem Liganden erhlt
man die Bindungskonstante K
d
und die Enthalpie der Bindung DH. Die kalorimetrisch
gemessene Wrmemenge Q ergibt fr einen einfachen Bindungsvorgang im doppelt-re-
ziproken Diagramm eine lineare Abhngigkeit von der Ligandenkonzentration [A]:
1
Q

1
Q
m

K
d
Q
m
A
X 3X15
Q
m
, die Wrmemenge beim Erreichen der Sttigung, ist der Bindungsenthalpie pro-
portional: Q
m
=DH [A]
q
. [A]
q
ist die molare Menge des gebundenen Liganden bei
vollstndiger Sttigung. In entsprechender Weise lassen sich durch kalorimetrische
Bestimmungen Aggregationen von Proteinen und Untereinheiten, Protonierungen von
Aminosureresten, Wasseranlagerungen, Konformationsnderungen und Denaturie-
rungsvorgnge erfassen.
3.4 Spektroskopische Methoden
Die spektroskopischen Methoden, insbesondere die Absorptionsspektroskopie, finden
fr enzymkinetische Untersuchungen, fr Enzymtests wie auch fr Untersuchungen
von Ligandenbindungen, Konformationsnderungen, Katalysemechanismen usw. brei-
A3.4 Spektroskopische Methoden 197
teste Anwendung. Dies liegt an der einfachen Handhabung und der Mglichkeit, zeit-
liche Vorgnge, wie Enzymreaktionen, kontinuierlich zu registrieren. In den Reaktions-
ablauf kann jederzeit (durch Zugaben oder Modifikationen) eingegriffen werden. Hoch-
wertige Absorptionsspektrophotometer sind preisgnstig und vielseitig anwendbar, so
auch zur Konzentrationsbestimmung verschiedenster biologisch relevanter Substan-
zen, wie Proteine, Nucleinsuren, Lipide und niedermolekulare Metabolite. Im folgen-
den wird ein berblick ber das Prinzip der fr Enzymuntersuchungen wichtigsten pho-
tometrischen Methoden gegeben und auf spezielle Anwendungen eingegangen. All die-
sen Methoden gemeinsam ist das Prinzip, in eine Probenlsung Licht einzustrahlen und
dessen Vernderung durch die Probe (Absorption, ORD, CD) oder das von der Probe
selbst ausgesandte Licht (Fluoreszenz, Raman-Effekt) zu beobachten.
Ein Lichtquant kann mit einem Molekl auf verschiedene Weise in Wechselwir-
kung treten. Abbildung 3.21 zeigt das Termschema der Zustnde eines Elektrons. Es
existiert in einem Grundzustand S
0
und einem angeregten Zustand S
1
. Die Energie-
differenz zwischen beiden betrgt ca. 340 kJ/mol. Jeder dieser Zustnde besitzt ver-
schiedene Schwingungsniveaus, deren Energiedifferenzen ca. 40 kJ/mol ausmachen
und Rotationsniveaus, die sich in weniger als 4 kJ/mol unterscheiden. Bei normaler
Temperatur verharren die Molekle bevorzugt im untersten Schwingungsniveau des
Grundzustandes, es werden jedoch verschiedene Rotationsniveaus eingenommen. Die
Absorption eines Lichtquants der entsprechenden Frequenz regt das Molekl zum
bergang in den angeregten Zustand S
1
an, wobei die verschiedenen Schwingungs-
und Rotationsniveaus besetzt werden knnen. Daraus sollte ein Absorptionsspektrum
198 3 Methoden
Abb. 3.21. Termschema des Energiegehalts eines Elektrons. Durch Energieaufnahme mittels Photo-
nenbestrahlung gelangt das Elektron vom Grundzustand S
0
in den angeregten Zustand S
1
. Von hier
kehrt es entweder direkt (Absorption) oder, bei lngerer Verweildauer im untersten Schwingungsni-
veau des S
1
-Zustands, unter Aussendung von Fluoreszenzlicht, in den Grundzustand zurck, bzw. es
folgt einem Intersystem-bergang in einen energiermeren Triplett-Zustand T
1
. Die Linien ber den
Zustnden entsprechen den Schwingungsniveaus.
mit einer groen Zahl eng benachbarter scharfer Banden resultieren. Durch Einflsse
der Umgebung, insbesondere in Lsung, wie auch durch andere Faktoren, werden die
Banden derart verbreitert, da sie zu einer oder wenigen breiten Absorptionsbanden
verschmelzen, die charakteristisch fr das jeweilige Molekl sind.
Im angeregten Zustand S
1
kann das Molekl nicht verweilen. Zumeist erfolgt
strahlungslose Desaktivierung, d. h. die Anregungsenergie geht in Form von Wrme
auf die Umgebung ber. Dies geschieht durch Zusammenste mit Moleklen der
gleichen Art oder mit Fremdmoleklen, wobei bestimmte Verbindungen, wie gelster
molekularer Sauerstoff, besonders effizient sind. Man fat diese Vorgnge der Desak-
tivierung des angeregten Zustands auch als externe Konversionen zusammen. Teilwei-
se erfolgt die Desaktivierung im Molekl durch Umverteilung der Energie auf in-
terne Schwingungen (interne Konversion) und schlielich kann ber einen verbotenen
strahlungslosen Spinumkehrproze der angeregte Singulett- in einen energiermeren
angeregten Triplettzustand T
1
bergehen (intersystem crossing). Letzterer besitzt eine
lange Lebensdauer in der Grenordnung von ms bis zu einigen s und fhrt zur
Emission von Phosphoreszenzlicht. Allerdings wird dieser Zustand aufgrund seiner
auerordentlich langen Lebensdauer in Lsung zumeist durch interne und externe
Konversionen vollstndig desaktiviert und ist dann nur in fester Phase und bei tiefen
Temperaturen zu beobachten.
Wird das angeregte Elektron im S
1
-Zustand nach seiner Anregung nicht sofort de-
saktiviert, so wechselt es zunchst strahlungslos auf das unterste Schwingungsniveau
(Abb. 3.21). Hierbei ist die Zeitdauer der jeweiligen Vorgnge entscheidend. Die An-
regung des Molekls geschieht so rasch (&10
15
s), da sich die Kerne aufgrund ih-
rer Massentrgheit nicht so schnell dem angeregten Zustand anpassen knnen und
den Kernabstand des Grundzustands zunchst beibehalten (Franck-Condon-Prinzip).
Es erfolgt ein vertikaler bergang (Abb. 3.22) durch mehrere Schwingungsniveaus
A3.4 Spektroskopische Methoden 199
Abb. 3.22. Franck-Condon-Prinzip fr ein zweiatomiges Molekl. Der bergang des Elektrons er-
folgt in Resonanz vom Grundzustand S
0
auf ein in gleicher Phase schwingendes Niveau des angereg-
ten Zustandes S
1
.
bis zum Niveau mit der hchsten Wahrscheinlichkeit fr den Kernabstand, der dem ur-
sprnglichen Zustand am nchsten kommt. Von hier wechselt das Elektron rasch (10

12
s) in das unterste Schwingungsniveau mit einer durchschnittlichen Verweildauer
von einigen ns. Schlielich kehrt das angeregte Elektron unter Emittierung von energie-
rmerem, d. h. langwelligerem Licht (Fluoreszenz) in den Grundzustand zurck. Dieser
Vorgang konkurriert mit den oben erwhnten Desaktivierungsprozessen. In dem Mae,
wie diese schneller sind als der Emissionsvorgang, wird die Fluoreszenzerscheinung
abgeschwcht oder vllig gelscht, es wird dann nur Absorption beobachtet.
3.4.1 Absorptionsspektroskopie
3.4.1.1 Lambert-Beersches Gesetz
Grundlage der Absorptionsmessungen ist das Lambert-Beersche Gesetz, das die Ab-
schwchung der Lichtintensitt I
0
einer bestimmten Wellenlnge k nach dem Durch-
tritt durch die Lsung einer absorbierenden Verbindung der molaren Konzentration c
beschreibt:
I I
0
e
edc
X 3X16
d ist die Schichtdicke und e der molare Absorptionskoeffizient (lmol
1
cm
1
). I/I
0
wird als Transmission oder Durchlssigkeit bezeichnet und zumeist in Prozent ange-
geben. Ungehinderter Lichtdurchtritt, d. h. I =I
0
, bedeutet eine Transmission von 1
oder 100%, 0% Transmission ist vllige Lichtundurchlssigkeit, z. B. bei geschlosse-
nem Strahlengang. Diese beiden Grenzwerte dienen der Eichung von Photometern
bei gegebener Wellenlnge. Nach Gl. (3.16) nimmt die Lichtintensitt exponentiell
mit der Konzentration des absorbierenden Stoffes ab. Eine lineare Abhngigkeit be-
steht hinsichtlich des negativen Logarithmus der Transmission:
A logIaI
0
edc X 3X17
A ist das Absorptionsma. Die frher blichen Bezeichnungen Extinktion oder opti-
sche Dichte sind nicht mehr gltig (als optische Dichte bzw. Opazitt gilt genau ge-
nommen der Quotient I
0
/I).
3.4.1.2 Spektrale Eigenschaften von Enzymen und Liganden
Grundstzlich zeigen alle Verbindungen Absorption und sind damit dieser Methodik
zugnglich. Allerdings befinden sich die Absorptionsmaxima vieler Substanzen, wie
der aliphatischen Verbindungen, im experimentell schwer zugnglichen UV-Bereich,
der auch durch die Vielzahl sich berlagernder Spektren in Reaktionsmischungen un-
bersichtlich und schwer analysierbar ist. Fr viele Problemstellungen, wie fr en-
zymkinetische Untersuchungen, Ligandenbindungen oder Konformationsnderungen,
ist weniger die absolute Absorption einer Verbindung von Bedeutung als das Ausma
200 3 Methoden
einer spektralen Vernderung. Die Umwandlung von Substrat in Produkt ist um so
besser photometrisch zu verfolgen, je mehr sich die Spektren beider Partner vonein-
ander unterscheiden. Ein ideales Beispiel sind NAD
+
und NADP
+
, die durch Redukti-
on zu NADH bzw. NADPH (+H
+
) eine zustzliche Absorptionsbande im gut zugng-
lichen Bereich bei 340 nm zeigen, so da Reaktionen, an denen diese Verbindungen
als Cosubstrate teilnehmen, ber das Erscheinen oder Verschwinden dieser Bande
einfach mebar sind. Mit diesem optischen Test sind nicht nur die von diesen Verbin-
dungen direkt abhngigen Dehydrogenasen zugnglich, sondern auch Enzyme, deren
Produkt wiederum Substrat einer Dehydrogenase ist, wie auch diejenigen Enzyme,
die das Produkt einer Dehydrogenase als Substrat akzeptieren. Deren Reaktionen kn-
nen mit denen der Dehydrogenasen gekoppelt und Substratverbrauch bzw. Produktzu-
nahme des zu testenden Enzyms ber den NAD-Umsatz der Dehydrogenase bestimmt
werden (gekoppelter Test). Auf diese Weise lassen sich bis zu drei Reaktionen mitein-
ander verknpfen. Gekoppelte Tests sind zwar fr Aktivittsbestimmungen von Enzy-
men sehr hilfreich, fr enzymkinetische Untersuchungen sind sie weniger zu empfeh-
len, da Einflsse der gekoppelten Reaktionen und der als Indikatorenzym fungierenden
Dehydrogenase bei Variation verschiedener Parameter nicht auszuschlieen sind.
Die meisten Substrat/Produkt-Paare von Enzymreaktionen zeigen nicht so deutliche
spektrale Unterschiede wie NAD
+
/NADH. Meistens erschpfen sich die nderungen in
geringfgigen spektralen Verschiebungen oder Intensittsunterschieden, teilweise sind
berhaupt keine nderungen zu erkennen, wie bei vielen Isomerisierungen. Auch Liga-
ndenbindungen und Konformationsnderungen von Proteinen zeigen hchstens gering-
fgige spektrale nderungen, die nur mit sehr empfindlichen Photometern, wie Doppel-
strahl- und Doppelwellenlngenphotometer (s. u.), erfabar sind.
Whrend fr enzymkinetische Messungen die Absorptionseigenschaften der Sub-
strate und Produkte entscheidend sind, konzentrieren sich Bindungsmessungen und
Konformationsuntersuchungen auf die spektralen Eigenschaften des Proteins und ggf.
gebundener Cofaktoren. Aufgrund des bereinstimmenden Aufbaus der Proteine aus
den 20 proteinogenen Aminosuren zeigen deren Spektren eine einheitliche Form. Im
fernen UV-Bereich findet sich der Beitrag der Peptidbindung (&190 nm) wie auch
der Amino- und Carboxylgruppen. Hier absorbieren aber auch anorganische Ionen,
wie Cl

(181 nm) und OH

(187 nm) sowie Sauerstoff in gasfrmiger und gelster


Form. Fr Messungen in diesem Bereich mu daher das optische System des Photo-
meters mit Stickstoff begast werden. Lsungen sind zu entlften. Allerdings ist auf-
grund geringer Lampenintensitt dieser Bereich mit konventionellen Gerten kaum
zugnglich.
Zwischen 190 und 210 nm zeigen Sekundrstrukturelemente von Proteinen, a-He-
lix, b-Faltblattstruktur und ,Zufallsknuel, Absorptionsbanden. Die Bande der a-He-
lix hat die geringste Intensitt, besitzt aber eine charakteristische Schulter zwischen
200 und 210 nm (Abb. 3.23). Aus diesen Absorptionen kann der Anteil der Sekundr-
strukturen bei bestimmten Proteinen ermittelt werden, auch lassen sich Konformati-
onsnderungen an Sekundrstrukturen studieren. In diesem Bereich zeigen auch die
drei aromatischen Aminosuren sehr ausgeprgte Maxima, Phenylalanin das kurzwel-
ligste und intensivste (<190 nm mit einer Schulter bei 206 nm), Tyrosin das langwel-
ligste (220 nm) und schwchste. Das Tryptophanspektrum liegt dazwischen (Abb.
3.24). Histidin hat eine Bande bei 210 nm, Methionin besitzt hier eine Schulter. Cy-
A3.4 Spektroskopische Methoden 201
stein zeigt eine Absorption zwischen 200 und 210 nm, die bei Deprotonierung der
Thiolgruppe in der Intensitt zunimmt, auch entsteht in diesem Fall eine zustzliche
Bande zwischen 230 und 240 nm. Dieser Effekt lt sich zur quantitativen Thiolgrup-
penbestimmung in Proteinen ausnutzen. Die brigen Aminosuren zeigen im Bereich
unterhalb 200 nm einander sehr hnliche Absorptionen, die im wesentlichen von der
Carboxylgruppe herrhren. Zwischen 190 und 220 nm tragen damit sehr viele Fakto-
ren zum Proteinspektrum bei, das hier eine sehr starke Absorptionsbande aufweist.
Spezifische Effekte aus dieser Gesamtabsorption herauszuarbeiten ist allerdings
schwierig. Hierfr eignet sich die im lngerwelligen Bereich zwischen 260 und
300 nm liegende zweite Absorptionsbande wesentlich besser. Diese Bande ist zwar
deutlich schwcher, wird jedoch nur gebildet aus Absorptionsbeitrgen der drei aro-
matischen Aminosuren (Abb. 3.24). Von diesen zeigt Phenylalanin die kurzwelligste
und schwchste Absorption. Sein Maximum bei 257 nm ist achtmal schwcher als
202 3 Methoden
Abb. 3.23. UV-Spektren von Sekundr-
strukturelementen von Proteinen (nach
Rosenheck & Doty, 1961).
Abb. 3.24. UV-Spektren aromatischer
Aminosuren (nach Wettlaufer, 1962).
das des Tyrosins und 35mal schwcher als das des Tryptophans (Tab. 3.2). Phenylala-
nin ist daher in Proteinspektren nur bei Abwesenheit der beiden anderen aromati-
schen Aminosuren zu erkennen. Charakteristisch fr das Phenylalaninspektrum in
diesem Bereich ist eine ausgeprgte Feinstruktur mehrerer kleiner Maxima, die ne-
ben Tyrosin und Tryptophan an der kurzwelligen Flanke der gemeinsamen Absorpti-
onsbande, insbesondere in fester Phase bei tiefen Temperaturen, erkennbar werden.
Tyrosin hat ein langwelliges Absorptionsmaximum von 274 nm, das in Anwesenheit
von Tryptophan von dessen starker Absorption bei 280 nm berdeckt wird. In nativen
Proteinen, die alle aromatischen Aminosuren enthalten, zeigt die gemeinsame lang-
wellige Absorptionsbande vor allem die Charakteristika des Tryptophanspektrums
A3.4 Spektroskopische Methoden 203
Tab. 3.2. Spektrale Eigenschaften von Aminosuren und Coenzymen in wssriger Lsung. e: Molarer
Absorptionskoeffizient; U
F
: Quantenausbeute (teilweise nach Fasman, 1989).
Verbindung Absorptionsmaximum Emissionsmaxima
k
max
(nm) e (lmol
1
cm
1
) k
max
(nm) U
F
(%)
Phenylalanin 206
242
257
267
9300
86
197
91
282 4
Tyrosin 224
274,6
8800
1420
303 21
Tryptophan 219
280
35000
5600
350 20
Histidin 211 5860
Cystein 250 360
Cystin 248 350
Adenin 259 14900 321 0,026
Coenzym A 260 16000
FAD 260
375
438
445
46200
9300
14600
11300
536 2,5
FMN 450 12200 536 24
NAD, NADP 260 18000
NADH, NADPH 260
340
14100
6220
470 1,9
Pyridoxalphosphat 295
388
6700
6500
392
Thiamindiphosphat 235
267
10100
9200
p-Aminobenzoesure 305 360
ANS 350 515 0,4
ANS in Ethanol 470 37
TNS 317 500 0,08
TNS in Ethanol 429 52
DANSYL-Amid 320 580 5,5
DANSYL proteingebunden 468 84
Fluorescein 495 518 92
Rhodamin B 575 630 80
mit einem Maximum bei 280 nm. Die Intensitt dieser Bande dient vielfach als Ma
der Proteinkonzentration. Das Absorptionsmaximum von Tyrosin wird intensiviert
und verschiebt sich bei Ionisierung der phenolischen Hydroxylgruppe im alkalischen
Milieu um 20 nm nach lngeren Wellenlngen zu 295 nm. Damit kann Tyrosin in
Proteinen mittels alkalischer Titration quantitativ bestimmt werden.
Aus der Kenntnis der Aminosurezusammensetzung eines speziellen Proteins lt
sich durch berlagerung der individuellen Aminosurespektren ein Proteinspektrum
errechnen. Solche kalkulierten Spektren weichen jedoch deutlich von gemessenen
Spektren des nativen Proteins ab, insbesondere ist die Intensitt der Banden geringer
als die Summe der einzelnen Aminosureanteile. Dies beruht darauf, da im Inneren
des gefalteten Proteins Aminosurereste abgeschirmt sind. Durch partielle Entfaltung
des Proteinmolekls mittels Harnstoff, Guanidiniumchlorid und anderen Detergentien
werden diese Reste zunehmend exponiert, die spektrale Intensitt steigt an. Durch
schrittweise Denaturierung lassen sich so Aussagen ber die Proteinstruktur gewin-
nen. Auch Konformationsnderungen von Proteinen, die mit Verbergen oder Exponie-
ren aromatischer Aminosurereste einhergehen, geben sich ebenfalls durch spektrale
Vernderungen zu erkennen. Weiterhin fhren nderungen der Polaritt der Umge-
bung bestimmter Aminosurereste zu spektralen Verschiebungen. Eine Polarittsab-
nahme bewirkt eine Rotverschiebung der Absorptionsmaxima aromatischer Amino-
suren, verursacht durch den Unterschied im Energiegehalt zwischen Grundzustand
und angeregtem Zustand. Komplexbindungen, wie Charge-Transfer-Komplexe oder
Metallkomplexe, bewirken ebenfalls spektrale nderungen.
Auf solchen Effekten beruht das Prinzip der Bestimmung der Ligandenbindung
bei Proteinen durch spektroskopische Titrationen mit der Differenzspektroskopie. Die
Wechselwirkungen des bindenden Liganden mit dem Protein fhren entweder direkt
zu einer Vernderung des Protein- oder Ligandenspektrums, oder die Bindung gibt
sich durch eine von ihr induzierte Konformationsnderung zu erkennen.
3.4.1.3 Aufbau von Spektralphotometern
Die Entwicklung von Photometern geht auf die Gttinger Physiker Julius Elster und
Hans Geitel zurck, die 1891 die erste Vakuum-Photozelle beschrieben. Hauptbe-
standteile eines Spektralphotometers sind die Lichtquelle, ein Monochromator zur
spektralen Aufspaltung des Lichts und eine Photozelle bzw. ein Photomultiplier zur
Messung der Lichtintensitt. Zum Gert gehren zudem Vorrichtungen zur Anzeige
und zur Registrierung des Mesignals (Abb. 3.25).
Lichtquelle. Eine ideale Lichtquelle fr Spektralphotometer sollte den gesamten spek-
tralen Bereich mit gleichbleibender Lichtintensitt, einem Kontinuum, abdecken. Al-
lerdings existieren solche Lichtquellen nicht, vielmehr zeigen alle erhltlichen Lam-
pen deutliche Charakteristiken mit einem Intensittsmaximum in einem bestimmten
Wellenlngenbereich. Auch ist es nicht mglich, den UV- und den sichtbaren Spek-
tralbereich mit einer einzigen Lampe vollstndig abzudecken. Kufliche Spektralpho-
tometer sind daher mit einer Wasserstoff- bzw. Deuteriumlampe fr den UV-Bereich
von 190 bis 340 nm und einer Wolfram- oder Halogenlampe fr den sichtbaren Be-
204 3 Methoden
reich von 320 bis 900 nm ausgestattet. Durch einen Umlenkspiegel wird das Licht der
betreffenden Lampe durch die Probe geleitet. Einfache Gerte verzichten auf die UV-
Lampe. Fr Messungen bei konstanten Wellenlngen reichen oft Filterphotometer
mit einer Quecksilberlampe aus, die distinkte Linien aussendet (Linienspektrum). Sie
besitzen eine hohe Stabilitt und eignen sich gut fr enzymkinetische Messungen wie
fr Proteinbestimmungen. Mit Hilfe von Interferenz- oder Flssigkeitsfiltern wird eine
bestimmte Linie herausgeblendet, ein Monochromator ist daher nicht erforderlich.
Monochromator. Die spektrale Auflsung des Lichts erfolgt bei den meisten Photo-
metern mit Hilfe von Beugungsgittern. Gegenber den frher hufig verwendeten
Glas- oder Quarzprismen haben sie den Nachteil eines greren Streulichtanteils und
damit einer geringeren spektralen Reinheit. Der Vorzug von Gittern macht sich je-
doch beim Registrieren von Spektren geltend. Bei gleichmiger Drehung des Gitters
wird durch den Austrittsspalt des Monochromators kontinuierlich das spektral aufge-
lste (monochromatische) Licht ausgeblendet und in die Probenlsung gelenkt. Bei
Gittern ist das Ausma der Drehung proportional zur Wellenlnge. Die Drehung er-
folgt durch einen Schrittmotor, dessen Vorschub direkt als Signal fr die Wellenln-
genskala des Spektrums dient. Prismen zeigen dagegen keine lineare Aufspaltung des
Lichts, was die Aufnahme kontinuierlicher Spektren erschwert. Die spektrale Rein-
heit von Gittern, d. h. deren Gte, hngt ab von Dichte und Gestalt der Furchen. Ein
hoher Grat zwischen den Furchen verursacht Lichtstreuungen. Durch Abflachung
kann diese Strung vermindert werden, wobei das Gitter auf eine bestimmte Wellen-
lnge und einen bestimmten Einfallswinkel optimiert wird (geblazed). Hufig werden
durch ein Laser-Holographie-Verfahren hergestellte streulichtfreie holographische
Konkavgitter verwendet. Fr optisch sehr reines Licht knnen auch zwei Monochro-
matoren hintereinander geschaltet werden. Die Breite von Ein- und Austrittsspalt des
Monochromators bestimmt die Schrfe des spektralen Ausschnitts. Als Ma gilt die
Bandbreite des Lichtstrahls, d. h. die spektrale Breite bei halber Intensitt. Der Ge-
winn an optischer Reinheit bei enger Ausblendung geht jedoch einher mit dem Ver-
lust an Lichtintensitt und damit an Empfindlichkeit. Weiterhin mu die Spaltbreite
mit der Qualitt des Gitters harmonieren, schlechte spektrale Auflsung eines einfa-
chen Gitters kann nicht durch einen engen Spalt kompensiert werden.
A3.4 Spektroskopische Methoden 205
Abb. 3.25. Bauprinzip eines
Spektralphotometers.
Kvetten. Zur Vermeidung von Reflexionen und Streuungen werden rechteckige K-
vetten mit plangeschliffenen Flchen verwendet. Sie haben zumeist eine Schichtdicke
von 1 cm. Im sichtbaren Spektralbereich (340800 nm) werden Glas- oder Kunst-
stoffkvetten eingesetzt, die jedoch fr UV-Licht undurchlssig sind. In diesem Be-
reich sind Kvetten aus Quarzglas zu verwenden.
Photomultiplier. Die Lichtintensitt wird nach dem Durchtritt durch die Probenk-
vette in einer Photozelle bzw. einem Sekundrelektronenvervielfacher (Photomulti-
plier) gemessen. Die fr die Elektronenauslsung zumeist verwendeten Photokatho-
den aus Alkalimaterial haben eine optimale Ansprechbarkeit in einem bestimmten
Spektralbereich. Neben der Lichtquelle zeigen auch alle brigen optischen Materia-
len, wie Beugungsgitter, Spiegel und Sammellinsen, eine wellenlngenabhngige
Charakteristik. Diese Effekte berlagern sich dem Spektrum einer absorbierenden
Probe, das dadurch starke Verzerrungen erleidet. Zur Erzeugung wahrer Spektren ver-
fgen die Photometer ber Korrektureinrichtungen. Mittels Widerstandsleisten wird
das Photomultipliersignal wellenlngenabhngig auf ein einheitliches Niveau justiert.
Computergesteuerte Gerte fhren die Korrektur ber Rechenprogramme durch. Pho-
tomultiplier besitzen auch bei vlligem Lichtausschlu einen Dunkelstromanteil, der
ein bestndiges Hintergrundrauschen verursacht und die Empfindlichkeit des Gerts
beeinflut.
Diodenzeilen-Photometer (Diodenarray-Photometer) verwenden anstatt eines Photo-
multipliers einen Mehrkanalphotodetektor. Eine groe Zahl von Photodioden ist line-
ar angeordnet. Das polychromatische Licht der Lampe wird direkt durch die Kvette
geleitet und erst danach im Gittermonochromator spektral aufgelst. Das gesamte
Spektrum wird auf den Mehrkanalphotodetektor projiziert und dort insgesamt erfat.
Spektren knnen auf diese Weise innerhalb weniger Millisekunden aufgenommen
werden. Diese Technik wird in Rapid-Scanning-Stopped-Flow-Apparaten eingesetzt,
die in der Lage sind, pro Sekunde mehrere hundert Spektren zu messen.
Registrierung. Zur Aufzeichnung durch Laborschreiber wird der im Photomultiplier
induzierte Strom in eine diesem proportionale Spannung berfhrt. Dieses Transmis-
sionssignal wird nach dem Lambert-Beerschen Gesetz mittels eines Transmissions-
Absorptions-Wandlers in ein Absorptionssignal transformiert. Durch Verstrkung las-
sen sich auch noch kleinste Absorptionsunterschiede sichtbar machen, doch setzt das
Rauschen des Gerts Grenzen. Daher bestimmt sich die Gte von Gerten nach dem
Signal-Rausch-Verhltnis, das aussagt, wie schwach ein Mesignal gerade noch sein
darf, damit es ber dem Hintergrundrauschen noch zu erkennen ist. Die Registrie-
rung erfolgt fr kinetische Messungen zeitabhngig, bei spektralen Untersuchungen
in Abhngigkeit der Wellenlnge. Computergesteuerte Gerte bilden das Meergebnis
zunchst auf einem Bildschirm ab, es kann dann abgespeichert und durch einen
Drucker dokumentiert werden. Die Computersteuerung ermglicht auch die unmittel-
bare Verarbeitung und Berechnung der Daten. So knnen Ausschnitte ausgeblendet,
Steigungen (z. B. zur Bestimmung von Reaktionsgeschwindigkeiten) mit Regressions-
verfahren berechnet und Datenstze (Spektren) voneinander subtrahiert werden.
206 3 Methoden
3.4.1.4 Doppelstrahl-Spektralphotometer
Einfache Photometer sind nach dem Einstrahlprinzip gebaut, es befindet sich jeweils
nur eine Kvette im Strahlengang. Referenz- bzw. Leerwerte werden getrennt gemes-
sen und durch Nullpunktsunterdrckung oder rechnerisch von den Mewerten abge-
zogen. Das gilt auch fr Flle, wo Spontanreaktionen, z. B. durch Instabilitt des
Substrats, in der Melsung neben der eigentlichen Enzymreaktion ablaufen. Hier
bringt das Zwei- oder Doppelstrahlprinzip eine wesentliche Verbesserung (Abb. 3.26).
Der vom Monochromator kommende Lichtstrahl trifft auf eine schnell rotierende, mit
einem Reflexionsspiegel versehene Lochblende, die diesen wechselweise total reflek-
tiert bzw. ungehindert passieren lt. Die beiden alternierenden Strahlen werden auf
spiegelsymmetrischen Wegen durch zwei unterschiedliche Kvetten, eine Proben-
und eine Referenzkvette, geleitet. Nach dem Durchtritt durch die Kvetten werden
die beiden Strahlen ber eine mit der ersten baugleichen und sich in gleicher Fre-
quenz drehenden zweiten Lochblende auf einem einheitlichen Wege zum Photomulti-
plier gefhrt. Dieser unterscheidet zwischen beiden Lichtstrahlen. Als Megre wird
die Differenz zwischen Proben- und Referenzstrahl ausgegeben. Nach einem anderen
Konstruktionsprinzip wird der Lichtstrahl durch einen Strahlenteiler in zwei Strahlen
jeweils halber Intensitt gespalten und diese auf parallelen Wegen ebenfalls durch
zwei Kvetten geschickt. Die rotierende Blende ist hier unntig, allerdings mu jeder
Strahl nach dem Durchtritt durch die Kvette mit einem eigenen Photomultiplier ge-
messen werden.
Enthalten Proben- und Referenzkvette eines Zweistrahlphotometers die gleiche
absorbierende Substanz in identischer Konzentration, so erfassen beide Strahlen das
gleiche Absorptionsspektrum, der Probenstrahl mit positivem, der Referenzstrahl mit
negativem Vorzeichen. Beide Meeffekte kompensieren sich gegenseitig, das Photo-
meter registriert eine Basislinie. Dies ermglicht es, auch bei hohen Absorptionen ge-
ringfgige Differenzen zwischen zwei Proben sichtbar zu machen. Allerdings verur-
sachen bei starken Absorptionen bereits schwache Einflsse, wie geringfgige Kon-
zentrationsdifferenzen, schlecht justierte Strahlengnge oder Unterschiede in der
Schichtdicke beider Kvetten, deutliche Effekte und tuschen spektrale Unterschiede
zwischen den Proben vor.
A3.4 Spektroskopische Methoden 207
Abb. 3.26. Bauprinzip eines
Doppelstrahlspektralphotometers
mit Tandemkvettenanordnung
fr Differenzspektroskopie.
3.4.1.5 Differenzspektroskopie
Das Zweistrahlverfahren eignet sich besonders dafr, durch Wechselwirkungen ver-
schiedener Komponenten verursachte spektrale Verschiebungen mittels der Differenz-
spektroskopie zu studieren, die hier am Beispiel der Makromolekl-Liganden-Bin-
dung beschrieben werden soll. Voraussetzung fr die Anwendbarkeit dieser Methode
ist das Auftreten einer durch die Bindung verursachten spektralen nderung, wobei
es zunchst zweitrangig ist, ob diese das Liganden- oder das Proteinspektrum oder
auch beide betrifft, aber aufgrund seiner makromolekularen Struktur ist das Protein
dafr prdestiniert. Spektrale nderungen werden entweder durch direkte Wechsel-
wirkung des Liganden mit Gruppen der Bindungsregion des Makromolekls oder
durch bindungsinduzierte Konformationsnderungen verursacht. Es mu sich jedoch
um spezifische Effekte handeln, nicht z. B. um durch die Ligandenlsung verursachte
pH- oder Ionenstrke-nderungen. Zur Erkennung spektraler Vernderungen ist es
zunchst erforderlich, mittels der Zweistrahlanordnung die absoluten Spektren so-
wohl des Makromolekls wie des Liganden zu kompensieren. Dies wird durch Tan-
demkvetten erreicht, die durch eine geschliffene Trennwand in ihrer Mitte in zwei
Kammern gleicher Schichtdicke unterteilt sind (Abb. 3.26). Zur Durchfhrung einer
Bindungsmessung wird so vorgegangen, da die Makromolekllsung in gleicher
Konzentration jeweils in eine Kammer von Proben- und Referenzkvette gegeben
wird. Die beiden anderen Kammern werden mit Pufferlsung aufgefllt. Da sich die
Absorptionen beider Kvetten ausgleichen, mu eine Basislinie erhalten werden. Ab-
weichungen an dieser Stelle deuten auf Konzentrationsdifferenzen hin. Nun wird eine
definierte Menge des Liganden in die Probenkvette zur Makromolekllsung gege-
ben und die gleiche Menge in die mit Pufferlsung gefllte Kammer der Referenzk-
vette, um die Ligandenabsorption zu kompensieren. Da die Makromolekllsung
durch den Ligandenzusatz in der Probenkvette verdnnt wurde, mu zur Vermeidung
von Konzentrationsdifferenzen eine gleiche Menge an Pufferlsung zur Makromolekl-
lsung in der Referenzkvette gegeben werden. Aufgrund der zumeist sehr geringen
spektralen Verschiebungen ist die Methode sehr empfindlich gegenber Konzentrati-
onsdifferenzen. Daher sind die einzelnen Ligandengaben volumenmig sehr gering
zu whlen und beim Durchmischen ist darauf zu achten, da keine Lsung aus den
Kammern entfernt wird. Vorteilhaft ist ein kleiner Magnetrhrer am Kvettenboden.
Durch wiederholte Ligandenzustze (spektroskopische Titration) lt sich der Verlauf
der Bindung verfolgen. Zunchst steigt die spektrale Vernderung im Mae der Liga-
ndenzugabe an und strebt bei Absttigung der Bindungsstellen einem Plateauwert zu.
Die Auswertung spektroskopischer Titrationen ist in Abschnitt 1.3.2.2 beschrieben.
Differenzspektren entsprechen in ihrer Form der ersten Ableitung des Absorptions-
spektrums, falls sie nur durch eine spektrale Verschiebung ohne Intensittsvernde-
rung verursacht werden. Sie zeigen die geringste nderung an der Stelle der ur-
sprnglichen Maxima, whrend sie selbst Maxima bzw. Minima an den Flanken des
Absorptionsspektrums aufweisen. Eine Verschiebung nach lngeren Wellenlngen (ba-
thochrome Verschiebung), die ihre Ursache in Energieunterschieden von Grundzustand
und angeregtem Zustand in Lsungsmitteln unterschiedlicher Polaritt hat, zeigen aro-
matische Aminosuren beim bergang von einer polaren in eine weniger polare Umge-
bung (Abb. 3.27). Dies tritt ein, wenn Reste durch Ligandenbindung abgeschirmt
208 3 Methoden
werden oder sich von der ueren Hlle des Proteins nach innen bewegen. nderungen
solcher Art knnen durch lsungsmittelabhngige Differenzspektren sichtbar gemacht
werden. Dabei wird die Polaritt des Lsungsmittels Wasser in der Probenkvette
durch Zugaben weniger polarer Lsungsmittel wie Glycerin, Rohrzucker, Ethylen-
glykol oder Polyethylenglykol gegenber der Referenzkvette schrittweise erniedrigt.
Die Reste an der Auenseite des Proteins treten in Kontakt mit der zunehmend apo-
laren Umgebung, whrend sich diese im Inneren des Proteins nicht verndert, so da
Hinweise ber die Position verschiedener Reste erhalten werden. Eine noch detaillier-
tere Analyse ist durch Einsatz von Lsungsmitteln verschiedener Moleklgre mg-
lich. So sind fr das niedermolekulare Ethylenglykol Bereiche des Proteinmolekls
zugnglich, in die das hochmolekulare Polyethylenglykol nicht eindringen kann. Eine
Differenz zwischen beiden Lsungsmitteln vergleichbarer Polaritt zeigt Regionen
an, die sich zwar an der Auenseite, aber in engen Faltungen und Taschen befinden,
wie aktive oder regulatorische Zentren. Noch weitergehend kann durch Zugabe von
Harnstoff, Detergentien oder chaotropen Substanzen der Vorgang der vlligen Auffal-
tung der Proteinstruktur und der stufenweisen Exponierung einzelner Reste aus dem
Moleklinneren studiert und daraus auf strukturelle Eigenschaften des Proteins ge-
schlossen werden. Ein hnliches Ziel verfolgen temperaturabhngige Differenzspek-
A3.4 Spektroskopische Methoden 209
Abb. 3.27. Spektrale Verschiebungen und Differenzspektren der aromatischen Aminosuren Phenyla-
lanin, Tyrosin und Tryptophan beim bergang von der wssrigen Phase in 20% Dimethylsulfoxid. A)
Absorptionsspektren (Verschiebung gestrichelt gezeichnet), B) Differenzsspektren (nach Herskovits,
1969).
tren, bei denen die Temperatur der Probenkvette gegenber der der Referenzkvette
schrittweise gesteigert wird. Es lassen sich damit enthalpische und entropische Vor-
gnge der Proteinfaltung untersuchen.
pH-abhngige Differenzspektren zeigen Protonierungsvorgnge an Gruppen des Ma-
kromolekls, wie Tyrosyl- oder Thiolresten. Spektrale nderungen ergeben sich auch
durch Ladungseffekte in der Nhe von Chromophoren und durch Lsen bzw. Knp-
fen ionischer Bindungen und Wasserstoffbrcken und dadurch verursachte Konforma-
tionsnderungen. Bei verschiedenen Makromoleklen spielen reversible Aggregati-
onsvorgnge von Untereinheiten fr Aktivitt und Regulation eine wichtige Rolle.
Solche Prozesse lassen sich durch konzentrationsabhngige Differenzspektren unter-
suchen, bei denen die Makromoleklkonzentration gegenber der Referenzkvette
zur Verschiebung des Aggregationsgleichgewichts vermindert oder erhht wird. Zur
Vermeidung von Konzentrationsdifferenzen zwischen beiden Kvetten wird deren
Schichtdicke entsprechend verndert. So wird eine zehnfache Verdnnung der Pro-
benlsung durch eine zehnfache Schichtdicke der Probenkvette kompensiert.
Wo das Makromolekl selbst keine deutlichen spektralen nderungen erkennen
lt, kann durch Einfhrung chromophorer Gruppen an definierte Positionen, z. B. an
Thiol- oder Aminogruppen, nachgeholfen werden. So sind Bindungsmessungen an
Chymotrypsin durch vorherige Zugabe von Proflavin mglich, das durch Liganden-
oder Substratbindung wieder verdrngt wird.
3.4.1.6 Doppelwellenlngen-Spektralphotometer
Fr Messungen in trben bzw. stark streuenden Lsungen entwickelte B. Chance 1954
das Doppel- oder Zweiwellenlngen-Photometer, mit dem membrangebundene Cytoch-
rome der Atmungskette in Mitochondriensuspensionen untersucht werden konnten.
Durch einen Monochromator mit zwei separat einstellbaren Gittern werden zwei Licht-
strahlen unterschiedlicher Wellenlnge erzeugt, ein Proben- und ein Referenzstrahl
(Abb. 3.28). Mittels einer rotierenden Spiegelscheibe werden beide Strahlen alternie-
rend auf genau dem gleichen Weg durch die Kvette geleitet. Das Photomultipliersi-
gnal beider Strahlen wird getrennt erfat und als Differenzsignal registriert.
Der Verlust an Lichtintensitt durch Streuung ist weitgehend wellenlngenunab-
hngig. Bei Messungen in Suspensionen wird daher die Wellenlnge des Proben-
strahls auf die Absorptionsbande der zu untersuchenden Verbindung eingestellt, die
Referenzwellenlnge dagegen auerhalb der Absorptionsbande. Der Referenzstrahl
erfat den Anteil der Streuung, der von der Absorption der Probe abgezogen wird.
Der groe Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, da durch den identischen Lichtweg
beider Strahlen Fluktuationen in der Kvette, wie sie bei Suspensionen stndig auf-
treten, kompensiert werden, da dieselbe Kvette zur gleichen Zeit Probe und Refe-
renz ist. Dadurch reduzieren sich vor allem kvettenbedingte Schwankungen.
Die Methode eignet sich auch zur Erfassung sehr kleiner spektraler nderungen bei
Bindungsstudien oder enzymkinetischen Messungen. Der Probenstrahl wird auf eine
Position der ausgeprgtesten Absorptionsnderung, vielfach an der Flanke der Absorp-
tionsbande, eingestellt, der Referenzstrahl dagegen auf einen isosbestischen Punkt gleich-
210 3 Methoden
bleibender Absorption, der sich oft nahe dem Absorptionsmaximum befindet. Letzterer
korrigiert Schwankungen in der Kvette. Mit dieser Methode ist es mglich, Effekte mit
maximalen Absorptionsnderungen von 0,005 zu erfassen. Bei kommerziell erhltlichen
Gerten sind in der Regel Zweistrahl- und Zweiwellenlngenoptik kombiniert.
3.4.1.7 Photochemische Aktionsspektren
Otto Warburg entdeckte, da mit CO inaktiviertes Hmoglobin durch Belichtung wie-
der regeneriert werden kann. Castor und Chance (1955) entwickelten eine spezielle
Apparatur zur Messung solcher photochemischer Aktionsspektren, mit deren Hilfe
verschiedene Pigmente, wie Cytochrome, Phytochrome und Chlorophylle, in ihrem
Wirkungszustand untersucht werden knnen (Abb. 3.29). Eine Zellsuspension bzw.
ein Zellextrakt wird durch Gaszuleitungen einer definierten Gasatmosphre, z. B. ei-
nem bestimmten CO: O
2
-Verhltnis, ausgesetzt. Durch Bestrahlung mit einer Lampe
A3.4 Spektroskopische Methoden 211
Abb. 3.28. Bauprinzip eines
Doppelwellenlngenphotome-
ters.
Abb. 3.29. Schema einer Appa-
ratur zur Messung photochemi-
scher Aktionsspektren.
wird die Wechselwirkung des Pigments mit einer Komponente des Systems vern-
dert, z. B. CO freigesetzt, so da vermehrt Sauerstoff binden kann. Die Vernderung
der Sauerstoffkonzentration in der Lsung wird durch eine Sauerstoffelektrode detek-
tiert. Durch Einfhrung von Flssigfarbstofflasern konnte die Emissionsintensitt bei
enger spektraler Bandbreite gesteigert werden.
3.4.2 Biolumineszenz
Die Biolumineszenz ist eine besonders in der Enzymanalytik gebruchliche, aueror-
dentlich sensitive Methode zur Bestimmung von ATP, FMN und NAD(P)H. Es kn-
nen Enzymreaktionen, die von diesen Verbindungen abhngen, analysiert und diese
auch mit weiteren Enzymreaktionen gekoppelt werden. Zwei Biolumineszenz-Sy-
steme sind kommerziell erhltlich. Bei der Luciferase des Glhwrmchens (Photinus
pyralis) reagiert ATP mit dem Cofaktor Luciferin unter Lichtemission bei 562 nm.
Die Luciferase aus dem Bakterium Photobacterium fischeri ist FMN-abhngig und
reagiert mit NADH und NADPH. Da der Nachweis des zu untersuchenden Substrats
(z. B. ATP) selbst auf einer Enzymreaktion beruht, handelt es sich bei Biolumines-
zenzmessungen grundstzlich um gekoppelte Tests mit den bereits erwhnten Nach-
teilen fr die Bestimmung von Anfangsgeschwindigkeiten fr enzymkinetische Stu-
dien. Nach dem Start der Reaktion (z. B. durch ATP-Zugabe) erreicht die Intensitt
des emittierten Lichts nach ca. drei Sekunden einen maximalen Wert, der anschlie-
end (aufgrund von Produkthemmung) wieder abfllt. Die Lichtintensitt beim Maxi-
mum ist proportional der ATP-Konzentration. Grere Genauigkeiten werden durch
Integration der Kurve ber einen bestimmten Zeitbereich erreicht.
Die apparativen Erfordernisse fr Lumineszenzmessungen sind vergleichsweise ge-
ring. Luminometer bestehen aus einem empfindlichen Photomultiplier, einem Ver-
strker und einem Digitalmeter. Geeignete Testkombinationen mit den erforderlichen
Komponenten sind kommerziell erhltlich.
3.4.3 Fluoreszenz
3.4.3.1 Quantenausbeute
Als Ma der Intensitt der von einer Verbindung emittierten Fluoreszenzstrahlung
dient die Quantenausbeute U
F
. Sie ist das Verhltnis der durch die Verbindung emit-
tierten (q
e
) zu den von ihr absorbierten Photonen (q
a
). Ihre Gre hngt ab von der
Schnelligkeit der Prozesse, die um die Energie des angeregten Zustands konkurrieren
(vgl. Abschnitt 3.4):
U
F
=
q
e
q
a
=
k
e
k
e
k
ic
k
is

k
ec
Y (3X18)
k
e
, k
ic
und k
is
sind die Geschwindigkeitskonstanten der Emission, der internen Kon-
version und der strahlungslosen Spinumkehr (Intersystem-Crossing), k
ec
ist die
212 3 Methoden
Summe aller externen Konversionen. Demnach emittiert eine Verbindung nur dann
mebar in Fluoreszenzlicht, wenn die konkurrierenden Prozesse langsamer sind als
die Lebensdauer des angeregten Zustands. Whrend k
ec
durch Faktoren der Umge-
bung des Chromophors bestimmt wird und daher von auen beeinflubar ist, sind k
ic
und k
is
durch die Konstitution des Molekls vorgegeben.
Die Quantenausbeute, hnlich dem Absorptionskoeffizienten eine Stoffkonstante,
kann Werte von 01 bzw. 0100% annehmen. Bei einer Quantenausbeute von 1 bzw.
100% wird das gesamte vom Chromophor absorbierte Licht als Fluoreszenzstrahlung
emittiert, bei 0% liegt keine Fluoreszenz vor. Zur Ermittlung der Quantenausbeute wird
die Fluoreszenzintensitt der betreffenden Verbindung gemessen. Unter gleichen Bedin-
gungen werden die absorbierten Photonen durch eine stark streuende Lsung oder eine
anstelle der Kvette eingebrachte voll reflektierende Magnesiumoxidblende bestimmt.
Bei hnlichen spektralen Eigenschaften verhalten sich die Quantenausbeuten zweier
Verbindungen nherungsweise wie deren maximale Fluoreszenzintensitten, so da
sich die Quantenausbeute einer unbekannten Probe mit Hilfe einer Standardverbindung
bestimmen lt. Die Quantenausbeute ist stark temperaturabhngig, mit steigender
Temperatur nimmt sie infolge der Zunahme desaktivierender Zusammenste ab.
3.4.3.2 Strungen von Fluoreszenzmessungen
Die unter dem Begriff externe Konversionen zusammengefaten Vorgnge werden
allgemein als Fluoreszenzlschung (engl. quenching) bezeichnet. Die hauptschlichen
Ursachen sind Zusammenste von Moleklen im aktivierten Zustand, der durch Ab-
fangen der Anregungsenergie desaktiviert wird. Besonders wirksam in dieser Hin-
sicht ist gelster, molekularer Sauerstoff, der durch Entgasen oder Besplen der L-
sungen mit inertem Stickstoffgas entfernt werden mu. Fluoreszenzlschungen wer-
den oft durch Verunreinigung des Lsungsmittels oder der eingesetzten Prparate ver-
ursacht, daher sind hchste Reinheitsanforderungen zu erfllen. Auch knnen sich
die Chromophore bei hheren Konzentrationen gegenseitig desaktivieren, indem sich
Molekle im angeregeten Zustand zu Dimeren zusammenlagern und miteinander in
Resonanz treten (Excimere). Aufgrund dieser Konzentrationslschung ist die Fluores-
zenzintensitt nur in sehr verdnnten Lsungen proportional zur Menge des Chromo-
phors. Bei hheren Konzentrationen wird ein Abweichen von der Linearitt bis hin
zum vlligen Verschwinden der Fluoreszenz beobachtet. Fluoreszenzmessungen erge-
ben daher nur in sehr verdnnten Lsungen zuverlssige Werte.
Reabsorption des emittierten Lichts (innerer Filtereffekt) verursacht ebenfalls Fluo-
reszenzlschung. Dieser Effekt wird immer dann beobachtet, wenn sich in der Lsung
Substanzen befinden, deren Absorptionsspektrum mit dem Spektrum des emittierten
Lichts berlappt. Das Ausma dieses Effekts hngt sowohl von der Konzentration
der absorbierenden Substanz wie von der Wegstrecke ab, die das emittierte Licht in
der Lsung zurcklegt und kann durch Variation der Kvettengre erkannt werden.
Eine bei Fluoreszenzmessungen grundstzlich auftretende Strung ist die Streu-
strahlung, die im Emissionsspektrum als scheinbare Fluoreszenzbande mit einem Ma-
ximum entsprechend der Anregungswellenlnge zu beobachten ist. Sie kann vielerlei
Ursachen haben, so Streuungen an Schwebeteilchen und Luftblasen in der Lsung,
A3.4 Spektroskopische Methoden 213
Rayleigh- bzw. Tyndall-Streuung (vgl. Abschnitt 3.4.5.2) kolloidaler Lsungen (Pro-
teinlsungen), Reflexionen an Kvettenwnden durch Verunreinigungen und Finger-
abdrcke oder im Kvettenraum durch unvollstndige Eliminierung des durchfallen-
den Lichts. Die Streustrahlung ist an der Vernderung der Anregungswellenlnge zu
erkennen. Um sie mglichst gering zu halten, sind hchste Anforderungen an die
Reinheit der Probe und der Kvette zu stellen.
Als weitere Strung macht sich der Raman-Effekt insbesondere bei schwachen
Fluoreszenzen bemerkbar. Er leistet einen weiteren Beitrag zur Streustrahlung und ist
verantwortlich fr das Auftreten zustzlicher Banden. Photonen treten mit den
Schwingungs- und Rotationszustnden des Molekls in Wechselwirkung, ohne diese
in den angeregten Zustand zu versetzen. Es werden Photonen emittiert, deren Fre-
quenzen v
R
um die Betrge dieser Schwingungsniveaus ber oder unter der Anre-
gungsfrequenz v
0
liegen: v
R
=v
0
v
/
. Man erhlt somit in bestimmter Entfernung von
der Anregungswellenlnge lngerwellige (Stokessche) und krzerwellige (Anti-Stokes-
sche) Linien. Die Tatsache, da hier, im Gegensatz zur Fluoreszenz, auch kurzwelli-
ge, d. h. hherenergetische, Emission mglich ist, kann man sich so veranschauli-
chen, da eines von zwei Photonen einen bestimmten Energiebetrag an das Molekl
abgibt, der vom zweiten wieder aufgenommen wird. Raman-Linien unterscheiden
sich von Fluoreszenzbanden durch ihre relative Schrfe und durch ihre Eigenschaft,
sich mit der Anregungswellenlnge zu verschieben. Sie sind auch im Lsungsmittel
in Abwesenheit des Chromophors zu beobachten.
3.4.3.3 Fluoreszierende Verbindungen (Fluorophore)
Aus Gl. (3.18) ist zu ersehen, da ohne die Kenntnis der molekularen Konstitution einer
Verbindung nicht vorhergesagt werden kann, ob und mit welcher Intensitt die Verbin-
dung Fluoreszenzlicht emittiert. Fluoreszenzerscheinungen finden sich bei Verbindun-
gen mit konjugierten Doppelbindungen, bei aromatischen und heterozyklischen Rings-
ystemen und auch bei den Lanthaniden (Europium, Gadolinium und Terbium in der
dreiwertigen Oxidationsstufe). Letztere lassen sich hufig anstelle natrlicherweise ge-
bundener Metallionen in biologische Systeme einbauen. Von den aufgefhrten organi-
schen Verbindungsklassen zeigen allerdings nur wenige Vertreter mebare Emissionen
und vielfach hngt dies vom Zustand ab, in dem sich die Verbindung befindet, wie dem
Ionisierungsgrad und der Polaritt der Umgebung. Der Indolring von Tryptophan zeigt
eine starke Fluoreszenz mit maximaler Intensitt zwischen pH 911, wo die Carboxyl-
gruppe deprotoniert und die Aminogruppe ungeladen ist. In der zwitterionischen Form
zwischen pH 48 ist die Emission schwcher (Abb. 3.30). Sowohl im sauren Bereich
unterhalb pH 2, wie auch im alkalischen Bereich ber pH 12, wird die Indolfluoreszenz
gelscht, im einen Fall durch die protonierte Carboxylgruppe, im anderen Fall durch
Wechselwirkung mit Hydroxylionen. NAD
+
bzw. NADP
+
fluoreszieren nur in reduzier-
ter Form als NADH bzw. NADPH (vgl. Tab. 3.2). Auf dieser Eigenschaft beruhen die
sehr empfindlichen fluorimetrischen Dehydrogenase-Tests.
Ein hufig zu beobachtendes Phnomen ist eine hypsochrome Verschiebung
(Blauverschiebung) des Emissionsmaximums eines Chromophors, vielfach verbunden
mit einer Intensittssteigerung, beim bergang von einer polaren in eine zunehmend
214 3 Methoden
apolare Umgebung. Ein markantes Beispiel ist die stark lipophile Verbindung 1-Anili-
nonaphthalin-8-sulfonat (ANS, Abb. 3.31). In Wasser zeigt sie nur eine sehr schwache
Fluoreszenz, die beim bergang in zunehmend apolare Lsungsmittel, wie Alkohole
steigender Kettenlnge, unter Verschiebung des Emissionsmaximums um 2030 nm
zu krzeren Wellenlngen sehr stark zunimmt (Abb. 3.32). Blauverschiebungen wer-
den immer dann beobachtet, wenn das Dipolmoment des Chromophors im angeregten
Zustand hher ist als im Grundzustand. Es kommt dann zu einer Wechselwirkung mit
den polaren Lsungsmittelmoleklen. Bei der Rckkehr zum Grundzustand wird durch
den Verlust an Solvatationsenergie ein geringerer Energiebetrag frei als in apolaren L-
sungsmitteln. Aufgrund seines lipophilen Charakters bindet ANS mit hoher Affinitt an
apolare Bereiche von Proteinen, hufig an Bindungszentren. Dies wird von einer starken
Zunahme der Fluoreszenzintensitt begleitet. So bindet ANS unter Zunahme der Quan-
tenausbeute von 0,4 auf 98% in die Bindungstasche des Porphyrins beim Apomyoglo-
bin. Einen solchen Effekt zeigen neben anderen knstlichen Chromophoren, wie Tolui-
dinnaphthalin-6-sulfonat (Abb. 3.31), auch natrlich vorkommende Chromophore, wie
die aromatischen Aminosuren, insbesondere das Tryptophan. Ein gegenber der wss-
rigen Umgebung apolares Milieu herrscht im Inneren eines Proteinmolekls, und so
liegt das Emissionsmaximum von proteingebundenem Tryptophan zwischen 330 und
340 nm gegenber 350 nm bei der freien Aminosure.
Diese sensitive Reaktion von Fluorophoren mit ihrer Umgebung macht die Fluo-
reszenzspektroskopie zu einem wertvollen Hilfsmittel fr Enzymuntersuchungen.
Strukturelle nderungen im Proteinmolekl, Wechselwirkungen mit anderen Kompo-
nenten, Ligandenbindung, Proteinaggregation, Membranassoziation u.a. knnen sehr
empfindlich gemessen werden, wobei es durchaus von Vorteil ist, da nur relativ we-
nige Verbindungen Fluoreszenzlicht emittieren, da dadurch die beobachteten Effekte
spezifisch sind und kaum von unspezifischen Signalen berlagert werden. Zunchst
wird man versuchen, die von der Natur vorgegebenen Chromophore auszunutzen, da
dies keine Vernderung des Makromolekls erfordert.
In Proteinen zeigen nur die drei aromatischen Aminosuren Fluoreszenzemission,
wobei diejenige des Phenylalanins am schwchsten ist, whrend Tryptophan und Ty-
A3.4 Spektroskopische Methoden 215
Abb. 3.30. Abhngigkeit der
Quantenausbeute von Tryp-
tophan vom pH-Wert des
Lsungsmittels (nach Brand
und Witholt, 1967).
216 3 Methoden
Abb. 3.31. Strukturformeln wichtiger Fluoreszenzfarbstoffe.
rosin in ihrer Quantenausbeute vergleichbar sind (Tab. 3.2). Dies gilt allerdings nur
fr die freien Aminosuren. Im Proteinverband besitzt Tryptophan immer die hchste
Fluoreszenzintensitt durch partielle Lschung der Tyrosinfluoreszenz. Im angeregten
Zustand sinkt der pK-Wert der phenolischen Hydroxylgruppe, das resultierende Phe-
nolat besitzt eine sehr geringe Quantenausbeute. Tryptophan ist im Protein immer an
seiner Fluoreszenz zu erkennen, wie auch das Ausbleiben der Tryptophanfluoreszenz
ein sicheres Indiz fr das Nichtvorhandensein dieser Aminosure ist. Die schwchere
Tyrosinfluoreszenz wird nur bei Abwesenheit von Tryptophan sichtbar, allenfalls ist
sie bei kurzwelliger Anregung an der Flanke der Tryptophanbande zu erkennen. Phe-
nylalanin ist nur in Abwesenheit der anderen aromatischen Aminosuren nachweis-
bar. Damit besitzt praktisch jedes Protein einen eigenen Chromophor, dessen spektra-
le Eigenschaften bei Konformations- und Bindungsuntersuchungen wertvolle Infor-
mationen liefern kann.
Von den anderen natrlich vorkommenden Verbindungen zeigen NAD(P)H, Fla-
vine, Pyridoxalphosphat, Steroide (Cholesterin, Gallensuren und Steroidhormone),
die Bestandteile der Folsure Pteridin und p-Aminobenzoesure, wie auch Anthranil-
sure eine deutliche Fluoreszenz (Tabelle 3.2). Sehr geringe Quantenausbeuten haben
dagegen Purine und Pyrimidine und deren Nucleotide (z. B. Adenosinphosphate und
die Nucleinsuren). Durch geeignete Modifikation lassen sich verschiedene nicht
emittierende Verbindungen in Chromophore berfhren, wie die Adenosinverbindun-
gen AMP, ADP, ATP, NAD, NADP und Coenzym A durch Einfhrung einer N-6-
Ethenogruppe (e-Gruppe) am Pyrimidinring (Abb. 3.31). Sie behalten noch teilweise
ihre biologische Aktivitt. Ein fluoreszierendes Analogon des Thiamins und seiner
Derivate ist das Thiochrom.
Wo die Eigenfluoreszenz der Proteine und deren Cofaktoren nicht ausreicht, kn-
nen auch Chromophore eingefhrt werden. Neben den bereits erwhnten Verbindun-
gen, wie ANS und TNS, die nicht-kovalent an hydrophobe Regionen des Proteins
binden, lassen sich auch Chromophore mit gruppenspezifischen reaktiven Resten ko-
valent an das Protein binden. Solche Gruppierungen sind Jodacetamid, Maleinsurei-
mid, Aziridin oder Disulfid fr Thiolgruppen, Isothiocyanat, Succinimid oder Sulfo-
A3.4 Spektroskopische Methoden 217
Abb. 3.32. Blauverschiebung und Intensittszunah-
me des Fluoreszenzspektrums von Anilinonaphtha-
linsulfonal bei abnehmender Polaritt des Lsungs-
mittels: 1) Ethylenglycol, 2) Methanol, 3) Ethanol,
4) n-Propanol, 5) n-Butanol, 6) n-Oktanol (nach
Stryer, 1968).
nylchlorid bzw. -fluorid fr Aminogruppen, Hydrazin oder Amin fr Aldehyd- und
Ketongruppen. Azide sind photoaktivierbare Gruppen, mit deren Hilfe Chromophore
durch Bestrahlung von Licht der Wellenlnge 300-350 nm kovalent mit dem Zielmo-
lekl verbunden werden. Hufig gebrauchte Chromophore sind Fluorescein, Rhoda-
min, NBD (7-Chlor-4-nitrobenzofurazan) und der 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sul-
fonyl-(DNS-, DANSYL-)-Rest (Abb. 3.31).
3.4.3.4 Aufbau von Spektralfluorimetern
Spektralfluorimeter zur Messung der Fluoreszenzemission (Abb. 3.33) entsprechen in
ihrem Aufbau im wesentlichen den Spektralphotometern, allerdings bentigen sie
eine strkere Lichtquelle. Hierzu wird fr den gesamten Spektralbereich zumeist eine
Xenon-Hochdruck-Bogenlampe verwendet, die allerdings im ferneren UV-Bereich re-
lativ lichtschwach ist. Um Lampenschwankungen, wie die Wanderung des Lichtbo-
gens, auszugleichen, werden Ratio-Systeme verwendet, bei denen durch einen Strah-
lenteiler ein bestimmter Anteil des Lichts vor der Kvette in einen Referenzphoto-
multiplier geleitet wird. Das Mesignal des Gerts ist dann das Verhltnis der Intensi-
tten von Me- und Referenzstrahl.
Der prinzipielle Unterschied von Fluorimetern gegenber Absorptionsphotometern
besteht darin, anstelle des intensiven, durchfallenden Lichts der Lampe das von der
Probe nach allen Richtungen emittierte, schwchere Licht zu erfassen. Das durchfal-
lende Licht mu durch Lichtfallen streuungsfrei eliminiert werden, whrend das
Emissionslicht zur Vermeidung von Reflexionen im rechten Winkel zur Einstrahlung
gemessen wird. Dazu werden allseitig geschliffene Kvetten verwendet. Das emit-
tierte Licht passiert einen zweiten Monochromator, ehe es den Photomultiplier er-
reicht. Dieser ist viel empfindlicher als bei Absorptionsphotometern, da er nicht dem
vollen Licht der Lampe, sondern nur der schwachen Emission der Probe ausgesetzt
ist. Aus diesem Grunde sind Fluoreszenzmessungen wesentlich empfindlicher als Ab-
sorptionsmessungen. So empfngt der Photomultiplier beim Leerwert ohne emittie-
rende Probe kein Licht und kann fr minimale Mengen entsprechend verstrkt wer-
den, whrend bei der Absorptionsspektroskopie der Leerwert in Abwesenheit der ab-
sorbierenden Verbindung hchste Lichtintensitt bedeutet und geringfgige Absorp-
218 3 Methoden
Abb. 3.33. Bauprinzip eines Spek-
tralfluorimeters.
tionen kleiner Substanzmengen durch Schwankungen der Lampe und des voll ange-
regten Photomultipliers berdeckt werden. Dafr sind Photomultiplier in Fluorime-
tern uerst empfindlich gegen hohe Lichtintensitten, wie starke Streustrahlung oder
einfallendes Tageslicht.
Durch zwei getrennte Monochromatoren knnen zwei unterschiedliche Spektrenty-
pen aufgenommen werden. Vor der Kvette befindet sich der Anregungs- oder Excita-
tionsmonochromator. Er liefert Anregungsspektren des Chromophors im Wellenlngen-
bereich unterhalb einer konstant gehaltenen Emissionswellenlnge (Fluoreszenzen sind
immer lngerwelliger als Absorptionen). Da ein Chromophor nur in dem Mae emittie-
ren kann, wie er Licht absorbiert, sollte das Anregungs- mit dem Absorptionsspektrum
des Chromophors identisch sein. Tatschlich erhlt man bei vielen Fluorimetern unkor-
rigierte Spektren, denen sich, wie bereits bei Spektralphotometern besprochen, die Wel-
lenlngenabhngigkeiten der Lampe und anderer optischer Teile berlagern. Die echten
Spektren bentigen Korrekturanordnungen (bei Fluorimetern oft nur optional).
Hinter der Kvette befindet sich der Fluoreszenz- oder Emissionsmonochromator
fr das Emissionsspektrum, dessen Bereich ber der konstanten Anregungswellenln-
ge liegt. Es zeigt die eigentliche Fluoreszenzcharakteristik des Chromophors. In der
Regel wird man als Anregungswellenlnge das Absorptionsmaximum der Verbindung
whlen, da hier die hchste Fluoreszenzausbeute zu erwarten ist. Bei einheitlichen
Chromophoren ist es aber ebenso mglich, an anderen Stellen, wie den Flanken oder
einer schwcheren Absorptionsbande, zu messen, vor allem, wenn im betreffenden
Bereich Strungen, wie Raman-Linien, erscheinen. Dies bedingt zwar eine Intensi-
ttseinbue, die Form des Spektrums bleibt aber erhalten. Eine Verschiebung der An-
regungswellenlnge dient auch der Kontrolle der Fluoreszenzerscheinung. Verndert
sich dadurch die Spektrenform, so ist das ein Hinweis fr das Vorliegen andersartiger
Effekte, wie Verunreinigungen, Raman-Banden oder berlagerung unterschiedlicher
Fluoreszenzen.
Mit Spektralfluorimetern lassen sich auch Phosphoreszenzen messen. Durch rotie-
rende Blenden wird alternierend der Anregungs- und der Emissionsstrahlengang frei-
gegeben, so da die lngerwhrende Lumineszenz von der kurzzeitigen Fluoreszenz-
erscheinung unterschieden wird.
3.4.3.5 Strahlungslose Energiebertragung
Eine spezielle Eigenschaft der Fluoreszenz ist das Phnomen der strahlungslosen
bertragung der Anregungsenergie von einem Singulett-Zustand auf einen zweiten.
Es wird ein bestimmter Chromophor (Donor) angeregt, whrend ein zweiter, selbst
nicht angeregter Chromophor (Akzeptor) Licht emittiert. Dieser Effekt tritt immer
dann auf, wenn das Emissionsspektrum des Donors mglichst weitgehend mit dem
Absorptionsspektrum des Akzeptors berlappt (Abb. 3.34) und der Abstand der bei-
den Chromophoren weniger als 8 nm betrgt. Nach der Theorie von Theodor Frster
(1948) ist die Geschwindigkeit der Energiebertragung k
T
:
k
T
= 8Y71 10
23
k
e
r
6
J n
4
x
2
(s
1
) (3X19)
A3.4 Spektroskopische Methoden 219
und deren Effizienz E:
E =
r
6
r
6
R
6
0
(3X20)
umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstands r der beiden Chromophore
voneinander. R
0
ist der Abstand bei 50% bertragungseffizienz:
R
0
= 978Y 5 (J n
4
j
2
U
D
)
6
(nm) X (3X21)
J ist das Integral der spektralen berlappung von Donorfluoreszenz und Akzeptorab-
sorption, n ist der Brechungsindex des Lsungsmittels, U
D
ist die Quantenausbeute
des Donors und k
e
die Geschwindigkeitskonstante der Emission, j ist ein Faktor fr
die Orientierung der Dipolmomente beider Chromophore zueinander:
j = cos c 3 cos a cos b Y (3X22)
a und b sind die Neigungswinkel der beiden Dipole zur gemeinsamen Verbindungsachse
und c ist der Winkel, den die Dipole miteinander bilden. j kann Werte zwischen 0
(senkrechte Ausrichtung) und 4 (parallele Ausrichtung) annehmen und erfordert die ge-
naue Kenntnis der molekularen Anordnung beider Chromophore. Diese ist zwar ohne
genaue Strukturdaten nicht bekannt, doch kann in vielen Fllen davon ausgegangen wer-
den, da die Chromophore auf dem Makromolekl relativ gut beweglich sind und damit
keine bestimmte Orientierung einnehmen. Dann gilt fr j ein mittlerer Wert von 2/3.
Mit Hilfe der Frsterschen Beziehung lassen sich Abstnde zwischen zwei auf
dem gleichen Makromolekl fixierten Chromophore in wssriger Lsung messen,
was ansonsten nur mittels Rntgenstrukturanalyse an Proteinkristallen mglich ist.
220 3 Methoden
Abb. 3.34. Strahlungslose Fluoreszenzenergie-bertragung. Das Fluoreszenzspektrum eines Donor-
Chromophors (FD) berdeckt sich weitgehend mit dem Anregungsspektrum eines Akzeptor-Chromo-
phors (AA). Bei Anregung des Donors (AD, Anregungsspektrum des Donors) beobachtet man das
Fluoreszenzspektrum des nicht angeregten Akzeptors (FA).
Gelingt es, ein Chromophorenpaar mit geeigneten spektralen berlappungen an be-
stimmten Stellen eines Makromolekls, wie aktive oder regulatorische Zentren, ein-
zufhren, so lt sich deren Abstand ermitteln. Als Chromophore dienen entweder
Analoga der eigentlichen Liganden oder kovalent an definierte Aminosurereste fi-
xierte Fluorophore. Mit diesem Verfahren konnte gezeigt werden, da die drei unter-
schiedlichen katalytischen Zentren des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes mehr als
4 nm voneinander entfernt sind. Damit war die ursprngliche Vorstellung eines nur
von Liponsure und Lysin gebildeten schwingenden Arms von 1,4 nm Lnge, der
alle diese Zentren von einem Punkt aus erreicht, nicht aufrecht zu erhalten. Es zeigte
sich, da der schwingende Arm an einer beweglichen Peptiddomne fixiert ist. Beim
gleichen Enzymkomplex war es mit diesem Verfahren auch mglich, den Aufbau der
Komplexstruktur aus seinen Untereinheiten zu verfolgen. Bei dem bifunktionellen al-
losterischen Enzym Aspartokinase:Homoserin-Dehydrogenase konnte der Abstand
der beiden verschiedenen katalytischen Zentren zu 2,9 nm bestimmt und eine durch
die Bindung des allosterischen Hemmstoffes Threonin induzierte Konformationsnde-
rung nachgewiesen werden, bei der sich die beiden Zentren um 0,7 nm voneinander
entfernen. Bei Ribosomen konnte die Entfernung der beiden tRNA-Bindungsstellen
bestimmt werden. Diese Beispiele demonstrieren die vielfltigen Anwendungsmg-
lichkeiten der Methode. Sie eignet sich auch fr Bindungsstudien, wobei der Ligand
durch seine Bindung an das Protein entweder selbst die Rolle eines Donors oder Ak-
zeptors bernimmt, oder die Wechselwirkung eines in der Nhe der Bindungsstelle
plazierten Chormophorenpaares beeinflut.
Einen Energiebertragungseffekt erkennt man entweder an der Lschung der Fluo-
reszenz des angeregten Donors oder besser an der Emission des nicht angeregten Ak-
zeptors. Energiebertragung kann auch stattfinden, wenn der Akzeptor aufgrund sei-
nes Absorptionsspektrums zwar die Anregungsenergie des Donors bernimmt, selbst
aber kein Fluoreszenzlicht ausstrahlt. In diesem Falle wird nur die Fluoreszenzl-
schung des Donors beobachtet. Die strahlungslose Energiebertragung ist von der in
Abschnitt 3.4.3.2 beschriebenen Reabsorption der Emissionsstrahlung zu unterschei-
den, die deutlich schwcher ist und nur bei hheren Konzentrationen auftritt.
3.4.3.6 Fluoreszenzpolarisation
Linear polarisiertes Licht kann nur solche Chromophore anregen, deren Dipole in Rich-
tung der Polarisationsebene liegen, nicht aber senkrecht dazu. Es wird somit nur der
Anteil der in Vorzugsrichtung orientierten Molekle angeregt, die dann wiederum po-
larisiertes Licht emittieren (Photoselektion). Allerdings verndern die Molekle durch
ihre Bewegung whrend der Lebensdauer des angeregten Zustands die ursprngliche
Orientierung, was zu einer partiellen Depolarisation des Fluoreszenzlichts fhrt. Die
Abnahme der Polarisation P hngt nach der Gleichung von Perrin (1926) vom molaren
Volumen des Chromophors V (ml/mol), der absoluten Temperatur T, der Viskositt des
Lsungsmittels g und der Lebensdauer des angeregten Zustands s
0
ab:
1
P
=
1
P
0

1
P
0

1
3

Rs
0
V

T
g
X (3X23)
A3.4 Spektroskopische Methoden 221
P
0
ist die Polarisation starrer Molekle (T=0 K) und R die Gaskonstante. Es ergibt sich
eine lineare Abhngigkeit von 1/P gegen T/g, wenn die Polarisation des emittierten
Lichts bei Variation von Temperatur bzw. Viskositt des Lsungsmittels (oder beider
gleichzeitig) gemessen wird. Die Gerade schneidet die Ordinate bei 1/P
0
, so da die
Steigung nur s
0
und V als Unbekannte enthlt. Mit dieser Methode ist es daher mg-
lich, bei Kenntnis von s
0
das Volumen eines Chromophors zu bestimmen (wie umge-
kehrt bei Kenntnis von V die Lebensdauer des angeregten Zustands zu ermitteln), wo-
bei das bewegliche Element das Volumen bestimmt. Ist ein kleiner Chromophor an ein
groes Proteinmolekl fixiert, so diktiert letzteres die Beweglichkeit, wobei auch Hy-
drathlle und Form (kugelfrmig, elliptisch etc.) eingehen. Bei Kenntnis der Molekl-
masse lassen sich daher Informationen ber die Moleklgestalt gewinnen. Ist der Chro-
mophor an der Proteinoberflche frei beweglich, dann wird neben der langsamen Bewe-
gung des Proteins auch die schnelle des Chromophors beobachtet, im Perrin-Diagramm
berlagern sich dann zwei Geraden. Auf die Weise erhlt man auch die fr den Orien-
tierungsfaktor j der Frsterschen Beziehung notwendige Information.
Fluoreszenzpolarisation wird mit Spektralfluorimetern gemessen, bei denen die
Emission in zwei symmetrischen Strahlengngen senkrecht zur Einstrahlungsrichtung
ber zwei Emissionsmonochromatoren und Photomultiplier erfat wird. Im Anre-
gungsstrahlengang befindet sich ein Polarisationsfilter zur Erzeugung linear polari-
sierten Lichts, in den beiden Emissionsstrahlengngen sind Analysatorfilter ange-
bracht, von denen einer parallel, der zweite senkrecht zur Polarisationsebene der An-
regung orientiert ist (Abb. 3.35). Als Mewert ermittelt das Gert die Fluoreszenzpo-
larisation P als das Verhltnis zwischen der Differenz und der Summe der Fluores-
zenzintensitten in paralleler (F
II
) und senkrechter (F
^
) Richtung:
P =
F
II
F
l
F
II
F
l
X (3X24)
222 3 Methoden
Abb. 3.35. Schema einer Fluoreszenz-Polarisati-
onsmessung. Ein senkrecht gestellter Polarisati-
onsfilter vor der Kvette erzeugt linear polari-
siertes Licht. Das von der Kvette ausgestrahlte
Fluoreszenzlicht wird durch zwei Analysatorfil-
ter auf den Anteil des polarsierten Lichts in par-
alleler und senkrechter Richtung zur Polarisati-
onsebene der Einstrahlung analysiert.
3.4.3.7 Pulsfluorimetrie
Die Pulsfluorimetrie, eine Weiterentwicklung der Fluoreszenzpolarisation, ist prinzi-
piell den schnellen Memethoden (Abschnitt 3.5) zuzuordnen. Der Chromophor wird
durch einen Lichtblitz, der krzer ist als die Lebensdauer s
0
des angeregten Zu-
stands, angeregt. Nach Erlschen des Lichtblitzes wird das Abklingen der Fluores-
zenz zeitlich verfolgt (Abb. 3.36A). Die Fluoreszenzintensitt S
0
im Moment der An-
regung (t =0) nimmt exponentiell mit der Zeit t ab:
S
t
= S
0
e
tat
0
X (3X25)
Bei halblogarithmischer Auftragung von ln S
t
gegen t erhlt man s
0
aus der Steigung
der resultierenden Geraden. Erfolgt die Anregung mit linear polarisiertem Licht, so
kann der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensitten parallel (F
II,t
) und senkrecht
(F
^, t
) zur Polarisationsebene getrennt registriert werden, die Megre ist die Aniso-
tropie A
t
:
A
t
= A
0
e
tas
ri
=
F
IIYt
F
lYt
F
IIYt
2F
lYt
X (3X26)
Der aus den Fluoreszenzintensitten der drei Raumrichtungen (x-Richtung parallel, y-
und z-Richtung bei gleicher Intensitt jeweils senkrecht zur Anregung) zusammenge-
setzte Nenner entspricht der Gesamtfluoreszenz S
t
. A
0
ist die Anisotropie zum Zeit-
punkt der Anregung, s
ri
ist die Rotationsrelaxationszeit des Chromophors, deren rezi-
proker Wert eine lineare Kombination aus den Rotationsdiffusionskonstanten D
i
(i =1, 2, 3) der drei Hauptdrehachsen eines Partikels ist:
A3.4 Spektroskopische Methoden 223
Abb. 3.36. Pulsfluorimetrie. A) Zeitverlauf der Fluoreszenzintensitten in paralleler (F
II
) und senk-
rechter (F
^
) Richtung zur Polarisationsebene der Einstrahlung nach Anregung mit einem kurzzeitigen
Lichtblitz. B) Halblogarithmische Darstellung der zeitlichen Vernderung der Anisotropie bei berla-
gerung zweier unterschiedlich schneller Bewegungsprozesse.
D
i
=
k
B
Tc
i
6gV
X (3X27)
V ist das hydrodynamische Volumen des Partikels, k
B
die Boltzmannkonstante, g die
Viskositt des Lsungsmittels, T die absolute Temperatur und c
i
eine Funktion des
Achsenverhltnisses eines Ellipsoids, s
ri
ergibt sich aus der Steigung einer halbloga-
rithmischen Auftragung von A
t
gegen t, wobei aus Zahl und Gre der Rotationsrela-
xationszeiten auf die Moleklform geschlossen werden kann (Abb. 3.36B). Bei einer
Kugelgestalt (D
1
=D
2
=D
3
) wird eine lineare Abhngigkeit erhalten mit einer einheit-
lichen Rotationsrelaxationszeit:
s
ri
=
1
6D
=
gV
k
B
T
X (3X28)
Zwei unterschiedliche Relaxationszeiten ergeben sich auch bei freier Beweglichkeit
eines an ein Makromolekl gebundenen Chromophors.
Eine rasche Folge sehr kurzer Lichtblitze (&1 ns), erzeugt durch eine Blitzlicht-
lampe, einen Laser oder mittels einer Kerr-Zelle, regt die Probelsung an, ein Photo-
nenzhler registriert zeitabhngig die emittierten Photonen. Die Kerr-Zelle enthlt
eine stark dipolare Flssigkeit (Nitrobenzol, Acetonitril, Benzonitril), deren Molekle
sich durch ein ueres Feld so ausrichten, da ein durchfallender, linear polarisierter
Lichtstrahl in seiner Polarisationsebene um 908 gedreht wird. Ein nachfolgendes Po-
larisationsfilter ist so gestellt, da der Strahl nicht passieren kann. Durch kurzzeitiges
Abschalten des ueren Feldes (wenige ns) desorientieren sich die Molekle in der
Kerr-Zelle, der Lichtstrahl gewinnt seine ursprngliche Polarisationsebene zurck
und kann den Filter passieren.
3.4.4 Circulardichroismus und optische Rotationsdispersion
Asymmetrische Strukturen besitzen die Eigenschaft der optischen Rotation, sie len-
ken die Ebene von polarisiertem Licht ab. In Proteinen finden sich optisch aktive
Zentren bei asymmetrischen Kohlenstoffatomen aller Aminosurereste auer Glycin.
Diese sind hier allerdings nicht von Interesse, da sie im Verlauf von Enzymreaktio-
nen oder Bindungsprozessen unverndert bleiben und sich nicht als Mesignal eig-
nen. Dagegen zeigen Strukturelemente, wie sie auch in aktiven Zentren vorkommen,
wie a-Helix und b-Faltblatt, asymmetrische Eigenschaften, die durch katalytische und
regulatorische Vorgnge beeinflut werden knnen.
Optische Rotation lt sich auf zwei unterschiedliche Arten messen. Die optische
Rotationsdispersion (ORD) beobachtet den Unterschied in den Brechungsindices, der
Circulardichroismus (CD) Absorptionsdifferenzen zwischen links und rechts zirkular
polarisiertem Licht. Zirkular polarisiertes Licht kann man sich als Summe zweier li-
near polarisierter Komponenten mit einem Phasenunterschied von 908 vorstellen,
whrend linear polarisiertes Licht aus zwei in Gegenrichtung zirkular polarisierte
Strahlen besteht (Abb. 3.37).
224 3 Methoden
Die ORD-Methode mit die Abhngigkeit des Ablenkwinkels linear polarisierten
Lichts von der Wellenlnge:
U =
180 d (n
L
n
R
)
k
X (3X29)
U (Grad) ist die optische Rotation, d die Schichtdicke, k die Wellenlnge, n
L
und n
R
sind die Brechungsindices fr links- und rechtsdrehendes Licht. Fr Protein- und Nu-
cleinsurelsungen rotiert das polarisierte Licht bei einer Chromophorenkonzentrati-
on von &10
4
M um 0,010,1 Grad/cm. Gute Instrumente erfassen noch Ablenkun-
gen von 10
4
Grad.
Fr die CD-Methode gilt:
H =
2Y303 180 (A
L
A
R
)
4p
X (3X30)
A
L
A
R
ist die Absorptionsdifferenz von rechts- und linkspolarisiertem Licht. Die El-
liptizitt H (Grad) ist definiert als Bogentangente des Verhltnisses der kleinen zur
groen Achse. Die Differenz betrgt ca. 0,030,3% der gesamten Absorption. Zum
Vergleich verschiedener Proben wird die molare Rotation [U]
[U[ =
100 U
cd
=
[a[M
r
100
(3X31 a)
bzw. die molare Elliptizitt [H]
[H[ =
100 H
cd
=
[W[M
r
100
= 3Y300 (e
L
e
R
) (3X31 b)
angegeben; c ist die Konzentration der Probe, [a] die spezifische Drehung, [W] die
spezifische Elliptizitt, M
r
die relative Moleklmasse der Probe, e
L
und e
R
sind die
Absorptionskoeffizienten fr links- und rechtsdrehendes Licht.
A3.4 Spektroskopische Methoden 225
Abb. 3.37. Linear polarisiertes Licht entsteht durch Summierung gleicher Anteile von rechts (R) und
links (L) orientiertem zirkular polarisiertem Licht (A). B) Zirkular polarisiertes Licht entsteht aus
zwei phasenverschobenen, senkrecht zueinander orientierten Anteilen von linear polarisiertem Licht
(nach Van Holde, 1985).
Das CD-Spektrum einer Verbindung kann im Bereich von dessen Absorptionsspek-
tren erhalten werden, auerhalb der Absorption ist [H] =0. Es zeigt auch die Form
des Absorptionsspektrums, allerdings, abhngig von der Moleklstruktur, mit positi-
vem (positiver Cotton-Effekt) oder negativem (negativer Cotton-Effekt) Vorzeichen
und unterschiedlicher Intensitt (Abb. 3.38). ORD-Spektren erscheinen als die erste
Ableitung von CD-Spektren, allerdings reichen sie nach hheren und tieferen Wellen-
lngen weit aus dem Absorptionsbereich heraus. Bei positivem Cotton-Effekt wird,
von tiefen Wellenlngen kommend, zuerst ein Minimum, dann ein Maximum durch-
laufen, bei negativem Cotton-Effekt erscheint das Maximum vor dem Minimum. In
beiden Fllen entspricht der Wendepunkt dem Maximum bzw. Minimum des CD-
226 3 Methoden
Abb. 3.38. Schematische Dar-
stellung von Absorptions- (A),
ORD- und CD-Spektren einer
asymmetrischen Verbindung
mit positivem (B) und negati-
vem (C) Cottoneffekt.
Spektrums. Das weite Auslaufen des ORD-Spektrums ber die Absorptionsbande
hinaus wurde besonders frher, als der ferne UV-Bereich apparativ wenig zugnglich
war, dazu verwendet, mit Hilfe der Drude-Gleichung
[U[
k
=
k
k
2
k
2
0
(3X32)
von Meeffekten bei zugnglichen Wellenlngen k auf die optische Rotation bei der
Wellenlnge k
0
des Wendepunkts des ORD-Spektrums zu schlieen; k ist eine Kon-
stante.
Die Verwandtschaft zwischen ORD- und CD-Spektroskopie wird auch dadurch of-
fenkundig, da beide ber die Krnig-Kramers-Transformation ineinander berfhr-
bar sind:
[H(k)[ =
2k
p

0
[U(k
/
)[k
/
k
2
k
/2
dk
/
Y (3X33)
so da prinzipiell nur eine der beiden Methoden angewandt zu werden braucht und die
jeweils andere keinen zustzlichen Informationsgewinn bringt. Trotz des greren tech-
nischen Aufwands wird zumeist der CD-Spektroskopie der Vorzug gegeben. Sie ergibt
einfachere Spektren, was sich insbesondere bei atypischem Verhalten oder bei berla-
gerungen verschiedener Effekte als vorteilhaft erweist. Auch erschwert das breite Aus-
laufen der ORD-Spektren die Auswertung bei berlagerung verschiedener Effekte.
Eine breite Anwendung hat die CD-Spektroskopie bei der Bestimmung von Sekun-
drstrukturelementen von Proteinen. Wie Abb. 3.39 zeigt, ergeben a-Helix, b-Falt-
blatt- und Zufallsknuel-Strukturen deutlich unterschiedliche Spektren im fernen UV-
Bereich zwischen 190240 nm. a-Helix und b-Faltblatt einerseits und Knuelstruktur
andererseits zeigen gegenlufige CD-Spektren. Fr die a-Helix ist die durch Excimer-
enbildung verursachte Aufspaltung (Exciton-Splitting) in eine Doppelbande zwischen
210 und 220 nm charakteristisch. Es lassen sich daraus Vorhersagen ber die relati-
ven Anteile dieser Strukturelemente in Proteinen machen. Weiterhin knnen durch
Substrat- oder Effektorbindung verursachte Konformationsnderungen, die solche
Strukturelemente einbeziehen, sichtbar werden.
Optische Aktivitt besitzen auch Disulfidbrcken innerhalb von Proteinstrukturen
und die Seitenketten der aromatischen Aminosuren (Abb. 3.40). Wie bei Absorptions-
spektren zeigen diese Aminosurereste im fernen UV-Bereich zwischen 200240 nm
die strksten Effekte, allerdings werden diese Spektren berlagert von denjenigen der
Sekundrstrukturen. Bei 210 nm besitzt auch Histidin ein CD-Spektrum. Charakteristi-
scher fr die aromatischen Aminosuren ist der nahe UV-Bereich zwischen 250 und
300 nm, wo insbesondere Tryptophan ein ausgeprgtes CD-Spektrum hat. Tyrosin be-
sitzt demgegenber eine schwchere, negative Bande, whrend Phenylalanin wie be-
reits bei der Absorption eine zwar wenig intensive, jedoch charakteristische Feinstruk-
tur aufweist. Die CD-Spektroskopie ist daher die geeignetste spektroskopische Metho-
de, aromatische Aminosuren in Proteinen nachzuweisen. Auch prosthetische Gruppen
und Coenzyme, wie Porphyrine und NADH, ergeben CD-Spektren.
A3.4 Spektroskopische Methoden 227
228 3 Methoden
Abb. 3.39. CD-Spektren der Sekundrstruktur-
elemente von Proteinen. 1) a-Helix, 2) b-Falt-
blatt, 3) Zufallsknuel (nach Greenfield &
Fasman, 1969).
Abb. 3.40. CD-Spektren von Derivaten aromatischer Aminosuren im fernen (A) und nahen (B) UV-
Bereich. 1) N-Acetyl-L-tyrosylamid, 2) N-Acetyl-L-phenylalanylamid, 3) N-Acetyl-L-tryptophanyla-
mid (nach Shikari, 1969).
Fr das Studium regulatorischer oder kinetischer Mechanismen sind auch hier, mehr
als die Spektren selbst, deren nderungen als Folge des jeweiligen Vorgangs von In-
teresse. Neben der Erkennung von Konformationsnderungen hat die CD-Methode
den Vorzug, da selbst optisch inaktive Liganden durch ihre Wechselwirkung mit den
asymmetrischen Strukturen des Proteinmolekls CD-Signale erzeugen knnen, so da
solche spezifischen Signale ein direktes Ma der Ligandenbindung darstellen.
Der Aufbau eines ORD-Gerts entspricht im wesentlichen dem eines Absorptions-
photometers (Abb. 3.41A). Das Licht wird ber einen Monochromator spektral auf-
gelst, tritt durch die Mezelle und wird in einem Photomultiplier detektiert. Spezi-
fisch fr die ORD-Anordnung ist ein vor der Mezelle angebrachter Polarisationskri-
stall, der planpolarisiertes Licht erzeugt, das die Mezelle passiert. Im Gegensatz zu
den rechteckigen Absorptions- und Fluoreszenzkvetten besitzen die Mezellen eine
zylindrische Form. Das austretende Licht fllt durch einen Analysatorfilter, mit des-
sen Hilfe der Ablenkwinkel gemessen wird. Beim CD-Gert wird monochromati-
sches Licht auch durch einen Polarisator planpolarisiert (Abb 3.41B), dann tritt es
durch eine im Winkel von 458 zur Polarisationsebene orientierte doppelbrechende
Quarz-Platte, die das Licht in zwei im rechten Winkel zueinander orientierte Kompo-
nenten gleicher Intensitt, jedoch unterschiedlicher Brechungsindices aufspaltet. Die
Dicke der Platte ist so gewhlt, da sich beim Austritt der langsame gegenber dem
schnellen Strahl um eine Viertelwelle (Viertelwellenmodulator, Lambda-Viertel-Plat-
te) verzgert. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes knnen die Brechungsindices
beider Strahlen und damit die Rotationsrichtung des resultierenden zirkularpolarisier-
ten Lichts umgedreht werden.
A3.4 Spektroskopische Methoden 229
Abb. 3.41. Bauschema eines ORD-
(A) und CD-Spektrometers (B).
3.4.5 Infrarot- und Raman-Spektroskopie
Infrarot (IR)- und Raman-Spektroskopie detektieren bergnge zwischen Schwin-
gungsniveaus von Moleklen. Aufgrund deren unterschiedlicher Frequenzen erhlt
man Informationen ber die Art der Schwingungen (Torsions-, Translations-, Valenz-
und Deformationsschwingungen), ber die beteiligten Atome als Bindungspartner
(C-O, C-N und C-H) und ber die Art der Bindung (Einfach- Zweifach- und Drei-
fachbindungen). Das erlaubt Rckschlsse auf die Moleklstruktur, was allerdings
bei Makromoleklen, wie Proteinen, zu sehr komplexen Ergebnissen fhrt. IR- und
Raman-Spektroskopie vermitteln prinzipiell die gleiche Information, sie verhalten
sich zueinander wie Absorptions- und Fluoreszenz-Spektroskopie. Die IR-Spektrosko-
pie beobachtet Absorptionen bei der Frequenz der Moleklschwingungen, die Ra-
man-Spektroskopie dagegen die Streuung des um die Schwingungsenergie vernder-
ten Photons. Fr Schwingungsspektren wird allgemein die Wellenzahl ~ v = 2pak (cm

1
), auch Kayser genannt, angegeben.
3.4.5.1 IR-Spektroskopie
Die ausgeprgtesten IR-Signale erhlt man mit asymmetrischen und polarisierbaren
Gruppen. Die Substanzen werden als Flssigkeiten direkt vermessen, feste Verbin-
dungen werden in Nujol u.a. Materialien eingebettet bzw. in Kaliumbromid gepret.
Wasser und gelste Salze, wie Puffersubstanzen, erzeugen selbst starke Absorptionen
und schrnken die Anwendung der IR-Methode auf Enzyme stark ein. Es ist erforder-
lich, auerhalb des Absorptionsbereichs des Wassers zu arbeiten. Durch Verwendung
von schwerem Wasser (D
2
O) lt sich dessen Spektrum soweit verschieben, da auch
der zunchst durch Wasser verdeckte spektrale Bereich zugnglich wird. Eine we-
sentliche Verbesserung, die auch eine breitere Anwendung fr Protein- und Enzy-
muntersuchungen in wssrigen Lsungen ermglicht, wurde durch Kombination mit
der Fourier-Transformation (FT-IR-Spektroskopie) erreicht, die die ursprnglich sehr
langen Mezeiten von 1020 Minuten auf Sekunden reduzierte. Als Lichtquelle wird
ein Nernst-Stift aus einer Mischung von Zirkonium- und Yttriumoxid oder ein gesin-
terter Siliciumcarbid-Stab (Globar) verwendet. Das Licht fllt durch einen Monochro-
mator in die Kvette. Zur Detektion wird die Erwrmung durch die einfallende IR-
Strahlung mit einem Thermoelement gemessen. Beim Bolometer wird die temperatu-
rabhngige nderung des Widerstands von Platindrhten oder Halbleitern bestimmt.
Bei der pneumatischen Golay-Zelle verfolgt man die Erwrmung eines Gases nach
dem Lichtauffall auf eine geschwrzte Metallplatte ber die Bewegung eines flexi-
blen Diaphragmas.
3.4.5.2 Raman-Spektroskopie
Molekle werden mit Lichtquanten hherer Energie angeregt als fr Schwingungen
erforderlich (UV- oder sichtbarer Bereich). Sie geben entweder einen bestimmten
Energiebetrag als Schwingungsenergie an das Molekl ab und werden dadurch selbst
230 3 Methoden
energiermer (Stokessche Linien) oder sie bernehmen diesen Energiebetrag vom
Molekl und werden energiereicher (Anti-Stokessche Linien). Die Erregerlinie, die
sog. Rayleigh-Streuung, die durch elastische Streuung der Quanten an den Moleklen
verursacht wird, besitzt die weitaus hchste Intensitt, die lngerwelligen Stokess-
chen Linien sind wiederum intensiver als die kurzwelligen Anti-Stokesschen Linien.
Die Anregung erfolgt normalerweise bei Wellenlngen, die sich nicht mit der Ab-
sorptionsbande der Verbindung berlagern. Bei der Resonanz-Raman-Methode fllt
dagegen die Anregungswellenlnge mit der Absorptionsbande zusammen, wodurch
die mit elektronischen bergngen gekoppelten Schwingungen verstrkt werden, was
ganz spezifische Schwingungsbanden erzeugt. Wie auch die Fluoreszenzspektrosko-
pie durch den Raman-Effekt gestrt wird, beeintrchtigen Fluoreszenzerscheinungen
die Raman-Spektroskopie. Die Frequenz der Raman-Linien wird angegeben als Diffe-
renz zwischen der Anregungsfrequenz und der betreffenden Raman-Linie. Es werden
bereits relativ schwache Wechselwirkungen, wie Wasserstoffbrckenbindungen, er-
fat. Damit eignet sich diese Methode auch zum Studium katalytischer Mechanis-
men. In wssriger Lsung wird die Raman-Spektroskopie zugnglich durch Anre-
gung mit langwelligem, monochromatischem, intensivem Laserlicht, wie dem
Nd:YAG-Laser (mit Neodym dotierter Yttrium-Aluminium-Granat, Wellenlnge
1064 nm). hnlich der Fluoreszenz-Spektroskopie wird die Streustrahlung der Probe
im rechten Winkel zur Anregung gemessen. Durch Verwendung gepulster Laser las-
sen sich auch sehr schnelle Prozesse erfassen.
3.4.5.3 Anwendungen
IR- und Raman-Spektroskopie werden vor allem fr Strukturuntersuchungen an Pro-
teinen, zur Bestimmung von Sekundrstrukturen (a-Helix, b-Struktur), Strukturvern-
derungen, Bindung von Liganden, prosthetischen Gruppen und Metallen angewandt.
Mit diesen Verfahren wurden beispielsweise Wechselwirkungen von Sauerstoff und
Kohlenmonoxid mit Hmoglobin untersucht. Schwefelhaltige Gruppen geben auf-
grund der hohen Polarisierbarkeit des Schwefels eine starke Raman-Streuung und es
lassen sich Bildung und Spaltung von Disulfidbrcken verfolgen. Mittels der IR-
Spektroskopie konnten R- und T-Zustnde beim Hmoglobin durch ligandeninduzier-
te Vernderungen von Thiolspektren unterschieden werden. Intensive Effekte beson-
ders in der Resonanz-Raman-Spektroskopie zeigen Metalloproteine, wie die porphy-
rinhaltigen Hmproteine (Cytochrome, Hmoglobin), Proteine mit Fe-S-Komplexen
(Komponenten der Atmungskette, Ferredoxin) und Kupferproteine. Durch FT-IR- und
Raman-Spektroskopie wurden verschiedene Enzymreaktionen und enzymkatalytische
Mechanismen studiert, wie die Spaltung von Fructosebisphosphat zu Glycerinalde-
hydphosphat und Dihydroxyacetonphosphat durch die Aldolase und das Auftreten
des Acyl-Zwischenprodukts im proteolytischen Mechanismus von Chymotrypsin und
Papain. Zur direkten Verfolgung von Enzymreaktionen bei enzymkinetischen Unter-
suchungen eignen sich beide Verfahren allerdings weniger.
A3.4 Spektroskopische Methoden 231
3.4.6 Elektronenspinresonanz-Spektroskopie
Bereits mit der IR- und Raman-Spektroskopie wurden Methoden angesprochen, die nur
noch randstndig dem Themenkreis dieses Buches zuzuordnen sind. Dies gilt noch
mehr fr die erwhnte Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR, auch EPR von
elektronenparamagnetischer Resonanz), die wegen der fr alle Proteine zugnglichen
Methode der Spinmarkierung wertvolle Informationen zu Struktur und Bindung liefert
und daher hier erwhnt werden soll. Allerdings steht der apparative Aufwand einer brei-
teren Anwendung im Weg. Fr Details, wie fr verwandte Methoden, besonders der
NMR-Spektroskopie, sei auf Fachbcher der physikalischen Chemie verwiesen.
Mit Hilfe der ESR-Spektroskopie werden Molekle mit paramagnetischen Eigen-
schaften, d. h. mit ungepaarten Elektronen, studiert. Ungepaarte Elektronen besitzen
die Spinquantenzahl S=1/2, entsprechend einem magnetischen Moment von m
s
=1/
2. In einem magnetischen Feld bewegen sie sich entweder parallel (m
s
=+1/2) oder anti-
parallel (m
s
=1/2) zur Feldachse z. Ein oszillierendes Magnetfeld im rechten Winkel
zur Feldachse induziert bergnge zwischen den beiden Spinzustnden, wenn die Fre-
quenz des Feldes im Bereich der Larmor-Frequenz des sich bewegenden Elektrons liegt.
Der Energiegehalt E
m
eines Elektronenspins im magnetischen Feld H ist:
E
m
= gl
B
m
s
H Y (3X34)
l
B
ist das Bohrsche Magneton (9,27310
24
J T
1
), H die Feldstrke, g wird als g-
Faktor bezeichnet (s. u.). Die Differenz der Energiegehalte zweier Elektronen a und b
mit den magnetischen Momenten m
s
=+1/2 bzw. m
s
=1/2 ist:
DE = E
a
E
b
= gl
B
H X (3X35)
Resonanz tritt ein fr
hm = gl
B
H X (3X36)
h ist das Plancksche Wirkungsquantum und m die Mikrowellenfrequenz. Entspre-
chend werden bei der ESR-Spektroskopie Molekle mit ungepaarten Elektronen in
magnetischen Feldern beobachtet, die in Resonanz mit einer monochromatischen
Strahlung treten.
Lokale permanente Felder H
loc
in der Umgebung des ungepaarten Elektrons, ins-
besondere das magnetische Moment des Kerns, berlagern sich mit dem externen
magnetischen Feld H und fhren zur Hyperfeinstruktur-Aufspaltung, einer besonderen
Eigenschaft von ESR-Spektren. Ist ein Elektron um einen Kern mit dem Kernspin I
lokalisiert, dann kann H
loc
entlang der externen Feldachse 2I+1 Werte annehmen ent-
sprechend den 2I+1 Werten des magnetischen Moments des Kerns m
I
:
H
loc
= H a m
I
Y (3X37)
a ist die Hyperfein-Kopplungskonstante. Fr ein Wasserstoffatom (I =1/2) hat die
Hlfte der Radikale der Probe m
I
=+1/2. Sie treten in Resonanz, wenn das uere
Feld die Bedingung erfllt:
232 3 Methoden
hm = gl
B
(H 1a2a)
bzw.
H = (hmagl
B
) 1a2a X (3X38 a)
Die andere Hlfte mit m
I
=1/2 erfllt die Resonanzbedingung dagegen bei:
H = (hmagl
B
) 1a2a X (3X38 b)
Anstatt einer Linie zeigt nun das Spektrum zwei Linien mit der Hlfte der ursprng-
lichen Intensitt, die durch die Kopplungskonstante a getrennt und um ein durch den
g-Faktor bestimmtes Feld zentriert sind.
Enthlt das Radikal ein Stickstoffatom (I =1), so spaltet es in drei Linien auf
(m
I
=1, 0, 1), da der Stickstoffkern drei mgliche Spinorientierungen hat und jede
von einem Drittel aller Radikale der Probe eingenommen wird (Abb. 3.42A).
Die meisten kommerziellen Gerte benutzen ein magnetisches Feld von 0,3 Tesla
(1 Tesla =10
4
Gauss), entsprechend einer Resonanz mit einem elektromagnetischen
A3.4 Spektroskopische Methoden 233
Abb. 3.42. ESR-Spektrum eines Nitroxyl-Radikals (A). A
0
ist die anisotrope Kopplungskonstante, g
0
der isotrope g-Faktor, W die Linienbreite, h
0
die Amplitude, H die magnetische Feldstrke (nach
Graupe, 1982). B) Strukturformeln stabiler Nitroxylradikale. 1) Di-tert.-Butyl-Nitroxyl, 2) Tetrame-
thylpyrrolidin-Nitroxyl (Proxyl), 3) Tetramethylpiperidin-Nitroxyl (Tempo).
Feld der Frequenz von 10
10
Hz (10 GHz) und einer Wellenlnge von 3 cm (X-
Band, Mikrowellenregion). Das magnetische Feld wird variiert und durch Messung
der Absorption der Mikrowellenstrahlung aus einem Mikrowellengenerator (Klystron)
mittels eines Mikrowellendetektors das ESR-Spektrum aufgenommen. Die Darstel-
lung erfolgt als 1. Ableitung des Absorptionsspektrums.
ESR-Spektren sind charakterisiert durch ihre Linienform, den g-Faktor und die
Kopplungskonstante a. Letztere ergibt sich aus dem Abstand der spektralen Linien
und ist ein Ma fr die Wechselwirkung des Elektrons mit dem lokalen Feld des
Kerns. Den g-Faktor erhlt man aus dem Mittelpunkt des Spektrums (Abb. 3.42A).
Er ist ein Ma fr das mit dem externen Magnetfeld in Wechselwirkung stehende
Gesamtmoment aus Spin- und Orbitalmoment. Der g-Faktor fr ein Elektron betrgt
g
e
=2,0023. Die Abweichung des durch die ESR-Spektroskopie bestimmten g-Faktors
von diesem Wert, g=(1r) g
e
, hngt ab von der Fhigkeit des angelegten Feldes, den
lokalen Elektronenstrom des Radikals zu beeinflussen. Diese Wechselwirkung ist ab-
hngig von der Orientierung des Magnetfeldvektors zu den molekularen Achsen. Bei
anisotropen Anordnungen (in Einkristallen) ist die Spektrenform von der relativen
Neigung des Kristalls zum Magnetfeld abhngig, bei isotroper Verteilung in Lsun-
gen wird ein einheitliches Spektrum erhalten. Durch Einschrnkung der freien Be-
weglichkeit, z. B. bei Bindung eines Radikals an ein Makromolekl, verbreitern sich
die Banden des Spektrums und werden asymmetrisch. Diese Eigenschaft erlaubt es,
direkt Bindungen paramagnetischer Liganden zu verfolgen bzw. Beeinflussungen ge-
bundener Radikale zu untersuchen.
Natrlich auftretende paramagnetische Verbindungen sind die bergangsmetalle
Cr
3+
, Mn
2+
, Co
2+
, Cu
2+
und die Lanthaniden. Am Beispiel der Pyruvat-Formiat-
Lyase konnte ein Enzym nachgewiesen werden, das ein stabiles paramagnetisches In-
termediat bildet. Stabile Radikale knnen synthetisiert und, hnlich den Fluoreszenz-
chromophoren, ber seitenkettenreaktive Gruppen, wie Maleinimid oder Isothiocya-
nat kovalent am Protein fixiert werden (Spin-Label). Zumeist handelt es sich um
durch tertire Butylgruppen isolierte Nitroxylradikale, die als stabile Tetramethylpi-
peridin- bzw. Tetramethylpyrrolidin-1-oxyle eingesetzt werden (Abb. 3.42B).
3.5 Messung schneller Reaktionen
In den letzten Jahrzehnten wurde eine groe Zahl von Methoden zur Messung
schneller Reaktionen entwickelt, wovon die bereits in Abschnitt 3.4.3.7 behandelte
Pulsfluorimetrie mit einem zeitlichen Auflsungsvermgen im Bereich von Nanose-
kunden zu den schnellsten zhlt. Die verschiedenartigen Verfahren lassen sich weit-
gehend auf ein bereinstimmendes Schema zurckfhren. Fr die spezielle Methode
charakteristisch ist ein Bauteil, das der Auslsung (Initiierung) der schnellen Reak-
tion dient und dessen Konstruktionsprinzip den erfabaren Zeitbereich und den Typ
der zu untersuchenden Reaktionen bestimmt (Abb. 3.43). Fr die Auswahl einer ge-
eigneten Methode ausschlaggebend ist daher nicht nur die Zeitauflsung, sondern
auch die Anwendbarkeit auf eine spezielle Reaktion. Das Prinzip von Flumethoden
beruht auf der raschen Durchmischung der Reaktanten, sie eignen sich daher beson-
ders fr schnelle enzymatische Reaktionen zum Studium enzymkatalytischer Mecha-
234 3 Methoden
nismen. Mit einer zeitlichen Auflsung im Millisekundenbereich sind sie in der Ska-
la schneller Reaktion vergleichsweise langsam. Bis zu tausendfach schnellere Reak-
tionen sind mit Relaxationsmethoden mebar. Ihr Prinzip basiert auf einer kurzzeiti-
gen Strung des Gleichgewichts und somit knnen keine Reaktionsumstze, sondern
nur im Gleichgewicht befindliche Reaktionen verfolgt werden, wie Ligandenbindun-
gen, Isomerisierungen oder spontane und induzierte Konformationsnderungen bei
Makromoleklen. Die noch schnelleren Bestrahlungsmethoden setzen die Sensitivitt
des Systems gegenber Lichtimpulsen voraus. Zur Charakterisierung eines bestimm-
ten Prozesses ist es daher oft notwendig, verschiedene Methoden und unterschiedli-
che Versuchsanstze auf geeignete Weise miteinander zu kombinieren.
All diesen Methoden gemeinsam ist die Notwendigkeit der Detektion des Reakti-
onsverlaufes nach dessen Initiierung. Hierfr ist die Art der Reaktion und weniger
die zeitliche Auflsung bestimmend, daher bedienen sich die verschiedenen Metho-
den vergleichbarer Nachweisverfahren. Fr Enzymreaktionen eignen sich besonders
die optischen Verfahren, wobei die Absorptionsphotometrie als universelles und ein-
faches Verfahren die breiteste Verwendung findet, aber auch Fluoreszenz-, CD-,
ESR- und NMR-Spektrometrie werden mit schnellen Methoden kombiniert. Daneben
kommen auch Messung der Lichtstreuung, der elektrischen Leitfhigkeit oder die Be-
stimmung von Sauerstoff zur Anwendung. Da die meisten dieser Verfahren bereits
behandelt wurden, wird hier nur auf Besonderheiten bei der Adaptation an die jewei-
lige schnelle Methode hingewiesen.
Das dritte wichtige Bauteil schneller Methoden dient der raschen Registrierung
der Mesignale. Frher kamen zumeist Speicheroszillographen zum Einsatz, die zu-
nehmend durch computergesteuerte schnelle Speicher verdrngt werden. Letztere er-
mglichen auch die unmittelbare Auswertung und Verarbeitung der Medaten.
A3.5 Messung schneller Reaktionen 235
Abb. 3.43. Zeitliche Auflsung von Methoden zur Messung schneller Reaktionen.
3.5.1 Flumethoden
3.5.1.1 Continuous-Flow-Methode
Diese Methode war das erste Verfahren zur Verfolgung schneller Reaktionen. Rasch-
ig gelang es mit einer einfachen Apparatur bereits 1905, eine Reaktion in der Gas-
phase bis zu 25 ms zu verfolgen. H. Hartridge und F.J.R. Roughton entwickelten
1923 einen Continuous-Flow-Apparat, mit dessen Hilfe sie die Bindung von Kohlen-
monoxid an Hmoglobin studierten. Das Prinzip dieser Methode hat sich bis heute
erhalten (Abb. 3.44A). Zwei Komponenten, z. B. eine Enzym- und eine Substrat-L-
236 3 Methoden
Abb. 3.44. Schematische Darstellung von Fluapparaturen. A) Continuous-Flow-Apparatur, B) Stopped-
Flow-Apparatur, C) Multi-Mixing-Apparatur. 1,2 Reaktionsspritzen; 3,4 Vorratsspritzen; a, Antrieb; b,
Beobachtungsrhre; d, Detektor; f, Ausflu; k, Kvette; l, Lampe; m, Mischkammer; p, Photomulti-
plier, q, dritte Reaktionsspritze (mit Quenchflssigkeit); s, Stoppspritze; t, Trigger; v, Dreiwegeventil.
sung, werden in Reaktionsspritzen gefllt. Mittels eines konstanten, durch Motoran-
trieb erzeugten Vorschubs werden diese Spritzen simultan ber eine Mischkammer
entleert und damit die Reaktion gestartet. Die Reaktionslsung strmt weiter in kon-
tinuierlichem Flu durch eine Beobachtungsrhre, in der der Reaktionsverlauf op-
tisch (photometrisch oder fluorimetrisch) oder mittels eines Thermoelements verfolgt
wird. Im Falle der optischen Messung dient die Rhre als Kvette und mu entspre-
chend gearbeitet sein (Quarzglas bei UV-Messungen).
Bei dieser Methode wird die zeitliche Koordinate des Reaktionsablaufes in eine
rumliche der Beobachtungsrhre bertragen. Die Reaktion schreitet vom Zeitpunkt
des Mischens zeitlich voran, whrend sich das Reaktionsgemisch mit konstanter Ge-
schwindigkeit entlang der Beobachtungsrhre bewegt. Die rumliche Entfernung von
der Mischkammer ist dem Alter der Reaktion proportional:
Alter (s) =
Volumen Beobachtungs-Mischpunkt (cm
3
)
Flu%geschwindigkeit (ml/s)
=
Flu%strecke (cm)
Flu% (cm/s)
X
Bei kontinuierlicher Strmung hat die Reaktionsmischung an einem bestimmten Be-
obachtungspunkt immer das gleiche Alter. So ist bei einer Flugeschwindigkeit von
10 m/s die Reaktion 1 cm hinter der Mischkammer1 ms alt. Jeder Zeitpunkt im Re-
aktionsablauf kann daher prinzipiell zeitunabhngig gemessen werden, d. h. kurze
Zeitablufe lassen sich ber lngere Zeiten beobachtet. Das unterscheidet dieses Ver-
fahren von anderen schnellen Methoden, da die Signale durch zeitliche Mittelung zu-
verlssiger gestaltet werden knnen. Dieser Vorteil wird allerdings mit einem sehr
groen Substanzverbrauch erkauft, da whrend der Medauer die Strmung konstant
gehalten werden mu. Bentigt die Erfassung eines Mepunkts 1 s, so flieen bei ei-
nem Durchmesser von 5 mm in dieser Zeit 200 ml durch die Rhre. Da zur Verfol-
gung des Zeitverlaufs der Reaktion mehrere Mepunkte in verschiedenen Entfernun-
gen zur Mischkammer aufgenommen werden mssen, wren fr eine einzige Kurve
einige Liter der Reaktionslsung erforderlich. Mit dem von Hartridge und Roughton
untersuchten Hmoglobin war das kein groes Hindernis, zum Studium von Enzym-
reaktionen sind solche Mengen aber nicht zu beschaffen. Daher war die Entwicklung
dieser Methode zu einer Zeit, als die technischen Voraussetzungen fr rasche Regi-
strierungen noch nicht bestanden, nur mglich, weil der schnelle Reaktionsverlauf
langsam gemessen werden konnte. Der eigentliche Durchbruch der schnellen Kinetik
gelang mit der Entwicklung des Speicheroszillographen und schlielich schneller Da-
tenspeicher, wie auch der Empfindlichkeitssteigerung von Photometern, so da Reak-
tionszeit und Reaktionsvolumen deutlich reduziert werden konnten. Eine Verringe-
rung des Rhrendurchmessers bis auf 1 mm erlaubte die Senkung des Substanzbe-
darfs fr eine Messung auf 10 ml.
Ein weiterer Vorteil der Continuous-Flow-Methode liegt in ihrer kurzen Totzeit, al-
so der Zeit zwischen dem Start der Reaktion und dem Einsetzen des Mesignals. Sie
bestimmt das zeitliche Auflsungsvermgen der Apparatur. Bei der Continuous-
Flow-Methode liegt der erste Mepunkt unmittelbar hinter der Mischkammer am An-
fang der Beobachtungsrhre, so da der Weg, den die reagierende Lsung unbeob-
achtet zurcklegt, uerst kurz ist. Gute Gerte erreichen Totzeiten von 0,2 ms. Die
Totzeit hngt auch von der Flugeschwindigkeit ab und liee sich durch deren Stei-
A3.5 Messung schneller Reaktionen 237
gerung weiter reduzieren. Allerdings wird bei hohen Flugeschwindigkeiten die ho-
mogene Durchmischung der Reaktionslsung schwierig. Inhomogene Lsungen bil-
den Schlieren und verursachen bei den sehr empfindlichen Meeinstellungen Strun-
gen im Reaktionsablauf. Eine homogene Durchmischung innerhalb von Millisekunden
stellt hohe Anforderungen an die Konstruktion der Mischkammer. Aus mehreren Dsen
werden die Reaktionslsungen im Gegenstrom in das Innere der Mischkammer einge-
spritzt und damit starke Turbulenzen erzielt (Abb. 3.45). Zu hohe Flugeschwindigkei-
ten bewirken in den engen Dsen Reibungseffekte und damit Erwrmungen der Reak-
tionslsung, die den Reaktionsablauf beeinflussen und zu Schlierenbildung fhren.
Eine Modifikation zur Reduzierung des Reaktionsvolumens ist die von B. Chance
entwickelte Puls-Flow-Methode, bei der Lsungen in kurzen, kontinuierlichen Sten
in die Rhre gepret werden. Eine weitere Anwendung ist die Kombination der Con-
tinuous-Flow-Methode zur Messung von ESR-Spektren (Yamazaki et al., 1960).
3.5.1.2 Stopped-Flow-Methode
Eine breitere Anwendung schneller Methoden fr Enzymreaktionen fand erst durch
die von B. Chance (1943) entwickelte Stopped-Flow-Apparatur statt. Im Unterschied
zur Continuous-Flow-Methode werden die Reaktionsspritzen nicht kontinuierlich,
sondern in einem schnellen Impuls ber die Mischzelle in die Beobachtungskammer
entleert. In dieser wird, nachdem der Flu zum Stillstand gekommen ist, der Reakti-
onsverlauf verfolgt (Abb. 3.44B). In der Regel handelt es sich bei dieser Beobach-
tungskammer um eine photometrische Kvette, die so angeordnet ist, da der opti-
sche Strahl fr Absorptionsmessungen senkrecht zur Strmungsrichtung durchfllt,
bei fluorimetrischen Messungen wird das Fluoreszenzlicht senkrecht zur Anregung
betrachtet. Die Reaktionslsung mu den gesamten Weg durch die Kvette zurckzu-
legen, bis die Reaktion registriert werden kann, was die Totzeit deutlich heraufsetzt.
Mit Gerten aus Einzelanfertigungen knnen Totzeiten unter 1 ms erreicht werden,
kommerziell erhltliche Gerte haben Auflsungen um 5 ms. Eine Verringerung der
Totzeit wird durch Reduzierung der Schichtdicke der Kvette (z. B. auf 0,2 mm) er-
reicht, allerdings auf Kosten der Empfindlichkeit. Wie bereits bei der Continuous-
Flow-Methode besprochen, ist eine homogene Durchmischung essentiell. Durch Mi-
schung eines Farbstoffs mit Wasser lt sich diese berprfen. Zeigt das Mesignal
238 3 Methoden
Abb. 3.45. Querschnitt durch
eine Mischkammer fr Flu-
apparaturen; a) von vorne;
b) von der Seite (nach Gib-
son & Milnes, 1964; mit Ge-
nehmigung des Verlags).
nach dem Stillstand des Flusses einen Drift, so liegt unvollstndige Durchmischung
vor. Temperaturdifferenzen im Strmungssystem fhren auch zu Schlierenbildung,
daher mssen smtliche mit den Lsungen in Kontakt tretenden Bauteile der Appara-
tur gleichmig thermostatisiert werden.
Der Impuls zur Entleerung der Reaktionsspritzen wird hydraulisch oder durch Ent-
spannen eines Gases aus einer Druckflasche in einen Kolben ausgelst, der ber ei-
nen Antriebsblock beide Reaktionsspritzen simultan antreibt. Nach einem anderen
System werden die Reaktionslsungen direkt unter Gasberdruck gesetzt und der
Flu durch ffnen eines elektromagnetischen Ventils ausgelst. Die beiden Reakti-
onsspritzen haben in der Regel das gleiche Volumen, so da sich beide Reaktions-
partner nach dem Mischen 1: 1 verdnnen. Durch Verwendung von Spritzen mit un-
terschiedlichen Volumina kann aber auch ein anderes Mischungsverhltnis erhalten
werden, wenn beispielsweise die Enzymlsung nicht verdnnt werden soll (generati-
ver Flow-Apparat, B. Chance, 1974). Mittels seitlich angebrachter Vorratsspritzen
lassen sich die Reaktionsspritzen wieder fllen und Wiederholungsmessungen durch-
fhren. Da die Apparatur Lufteinschlsse und freigesetzte Gasblasen in der Misch-
kammer fein zerstubt und die Kvette undurchsichtig wird, empfiehlt es sich nicht,
die Apparatur nach jedem Schu zu splen und neu zu fllen. Vielmehr wird die ab-
reagierte Lsung in der Kvette durch die folgende Lsung in die sich anschlieende
Stopp-Spritze gedrckt, die durch den Anschlag ihres Stempels an einen Widerstand
den Flu zum Stillstand bringt und das Reaktionsvolumen festlegt wie auch gleich-
zeitig den Impuls (Trigger) zum Start der Registrierung auslst (End-Stopp-System).
Nach jedem Schu mu die Stopp-Spritze entleert werden. Nach einem anderen Bau-
prinzip wird der Flu durch einen im Bereich der Reaktionsspritzen angebrachten
Widerstand gestoppt, an den der Antriebsblock anschlgt (Front-Stopp-System). Das
hat den Vorteil, da die Beobachtungskammer keinen hohen Drcken ausgesetzt
wird, was die Konstruktion des Gerts vereinfacht. Allerdings knnen durch die Ent-
spannung der Lsung in der Beobachtungskammer Gasblasen freigesetzt werden.
Dem wird durch einen begrenzten Gegendruck entgegengewirkt, der durch eine Ver-
engung zwischen Kvette und dem Auslaufgef erzeugt wird.
Die ber das optische System erfaten Mesignale werden entweder auf einem
Speicheroszillographen sichtbar gemacht und abfotographiert oder in einem digitalen
Datenspeicher gespeist. Von dort lassen sie sich auf einem Bildschirm wiedergeben
und ber einen Drucker aufzeichnen, wie auch durch einen angeschlossenen Compu-
ter verarbeiten (Datenberechnung, Kurvenglttung etc.).
P. Strittmatter (1964) entwickelte eine einfach zu bauende, aber wirkungsvolle
Stopped-Flow-Apparatur (Abb. 3.46). Als Mischkammer dient ein aus Kunststoff ge-
fertigter Tauchkolben, der genau in eine photometrische Kvette eingepat ist, die
wiederum in einem Photometer fixiert ist. Beim Entleeren der Reaktionsspritzen
durch einen Motorantrieb werden die Reaktionslsungen ber Schluche in den
Tauchkolben gedrckt und verlassen diesen, nach Passieren der Mischkammer, durch
eine an der Unterseite des Kolbens angebrachte ffnung. Die in die Kvette eindrin-
gende Reaktionsmischung drckt den Tauchkolben nach oben und gibt den Lichtweg
fr die photometrische Messung frei. Mit diesem Gert sind Totzeiten von wenigen
Millisekunden zu erreichen. Es knnen im Labor vorhandene Photometer verwendet
werden, die allerdings zur Erfassung des schnellen Mesignals umgerstet werden
A3.5 Messung schneller Reaktionen 239
mssen. Bei Verwendung von Mikrokvetten sind fr jede Messung nur einige Zehn-
tel Milliliter an Probelsung erforderlich.
Absorptions-Photometer mit variabler Wellenlnge und D
2
- und Halogenlampe fr
UV- und sichtbaren Bereich sind die hufigsten Detektionssysteme fr Stopped-Flow-
Gerte. Aufgrund der in kurzer Zeit zu erfassenden geringen Absorptionsnderungen
(0,010,2) mu das Gert wesentlich empfindlicher arbeiten als normale Spektralpho-
tometer. Der Lampenstrom mu stabilisiert sein. Eine Steigerung der Empfindlichkeit
durch Reduzierung des Hintergrundrauschens lt sich auch ber eine Erhhung der
Lichtintensitt mittels Spaltverbreiterung erreichen, allerdings unter Einbue an spek-
traler Auflsung. Durch eine Doppelstrahlanordnung, wie in Abb. 3.47 dargestellt,
lt sich die Empfindlichkeit des Gerts weiter steigern. Die Reaktionslsungen pas-
sieren vor Erreichen der Mischkammer Kvetten jeweils der halben Schichtdicke der
Mezelle. Ein Referenzstrahl fllt durch diese beiden Referenzkvetten und mit die
Absorptionen der getrennten Reaktionskomponenten, die von der Absorption der
Mezelle abgezogen wird. Als Mesignal erscheint somit die Differenz der Reakti-
onspartner vor und whrend der Reaktion. Speziell fr sehr geringe Absorptionsdiffe-
renzen und bei Messungen in trben Lsungen wird das Doppelwellenlngen-Prinzip
angewandt, bei dem der Referenzstrahl den gleichen Weg, jedoch mit unterschiedli-
cher Wellenlnge, durch die Mezelle nimmt wie der Mestrahl. Wie auch beim
Doppelwellenlngen-Photometer (vgl. Abschnitt 3.4.1.6) wird der Referenzstrahl auf
die Wellenlnge des isosbestischen Punkts bzw. der Trbung auerhalb des Absorpti-
240 3 Methoden
Abb. 3.46. Stopped-Flow-Appara-
tur nach Strittmatter (1964).
Abb. 3.47. Doppelstrahl-Stopped-
Flow-Apparatur.
onsmaximums eingestellt. Zustzlich lt sich diese Anordnung ausnutzen, die zeitli-
che Absorptionsnderung in der Mezelle gleichzeitig bei zwei verschiedenen Wel-
lenlngen zu verfolgen. Rapid-Scan-Stopped-Flow-Apparate erlauben die zeitliche
Verfolgung von nderungen ber den gesamten Spektralbereich. Das Licht der Licht-
quelle wird direkt durch die Mezelle geschickt und erst hinter dieser spektral zer-
legt. Ein Multikanalphotodetektor (Diodenzeilen-Detektor) erfat den gesamten Spek-
tralbereich in wenigen ms. In einer Sekunde knnen somit ber 100 Spektren aufge-
nommen werden (Hollaway & White, 1975).
Fr Fluoreszenzmessungen wird mit den fr die Absorptionsmessung verwendeten
D
2
- bzw. Halogen-Lampen, oder besser mit einer Xenonlampe angeregt und das
Emissionslicht im senkrechten Winkel nach dem Durchtritt durch einen Emissionsfil-
ter bzw. -monochromator erfat. Fluoreszenzpolarisation erfordert zwei Photomulti-
plier jeweils im rechten Winkel zum linear polarisierten Anregungsstrahl und zuein-
ander senkrecht orientierte Polarisationsfilter fr die beiden Emissionsstrahlen (vgl.
Abschnitt 3.4.3.6). Zur Messung von Konformationsnderungen bei Enzymen eignen
sich mit Circulardichroismus-Optik ausgerstete Stopped-Flow-Apparaturen, wobei
eine Quecksilber-Bogenlampe oder eine Xenonlampe als Lichtquelle dient (Bayley &
Anson, 1975). Auch mit NMR-Stopped-Flow-Apparaturen lassen sich Konformations-
nderungen verfolgen, die allerdings hhere Konzentrationen der Reaktionspartner er-
fordern und eine geringe Zeitauflsung (ber 10 ms) aufweisen (Grimaldi & Sykes,
1975). Zum Studium von Assoziations-Dissoziations-Vorgngen bei Makromoleklen
dient die Lichtstreuungs-Stopped-Flow-Apparatur, die Licht eines Lasers oder einer
anderen Lichtquelle verwendet, auch wird die Rntgenstrahlung eines Synchrotrons
herangezogen (Flamig & Parkhurst, 1977; Moody et al., 1980). Lichtsensitive Reak-
tionen lassen sich durch kurzzeitige Bestrahlung mit einem Lichtblitz oder Laser aus-
lsen. Durch Kombination dieser Methode mit einem Stopped-Flow-Apparat knnen
Reaktionspartner rasch gemischt und die Reaktion durch Lichtblitze aktiviert werden,
wie die Reaktion von Sauerstoff mit der mit CO blockierten Cytochromoxidase, die
nach Bestrahlung CO abspaltet und damit die Bindungsstellen fr den Sauerstoff frei-
gibt (vgl. Flash-Photolyse, Abschnitt 3.5.3). Stopped-Flow-Apparaturen werden auch
mit der Temperatur-Sprung-Methode kombiniert (Abschnitt 3.5.2.1). Durch Enzymre-
aktionen hervorgerufene Temperaturnderungen lassen sich mit einer Kalorimeter-
Stopped-Flow-Apparatur messen, wobei ein dnnes Thermoelement bzw. ein Thermi-
stor als Sensor Verwendung findet. Die Ansprechzeiten liegen in der Grenordnung
von 50 ms (Nakamura, 1978). Reaktionsbedingte nderungen in der Protonenkonzen-
tration knnen in einer pH-Stopped-Flow-Apparatur mit einer Glaselektrode gemes-
sen werden.
Eine Modifikation der Stopped-Flow-Methode ist das Multi-Mixing-System
(Abb. 3.44C). Die beiden Reaktionspartner durchlaufen nach ihrer Mischung eine be-
stimmte Strecke, whrend der sie unbeobachtet bereits miteinander reagieren knnen,
und treffen dann auf eine zweite Mischkammer, bei der, ber eine dritte Reaktions-
spritze, ein weiterer Reaktionspartner zugefhrt wird. Erst an dieser Stelle erfolgt die
(photometrische) Beobachtung. Durch Vernderung der Flugeschwindigkeit oder der
Flustrecke zwischen den beiden Mischkammern kann die Reaktionszeit der beiden
ersten Partner verndert werden. Eine Vereinfachung dieser Methode ist die
Quenched-Flow-Technik, bei der die dritte Reaktionsspritze eine Lsung enthlt, die
A3.5 Messung schneller Reaktionen 241
die Reaktion der beiden ersten Partner z. B. durch pH-Vernderung oder Denaturie-
rung des Enzyms (mit Perchlorsure oder Trichloressigsure) augenblicklich stoppt.
Der Reaktionsumsatz wird anschlieend auf chemischem Wege analysiert, auch kann
der dritten Reaktionsspritze ein Indikator zugesetzt werden. Die Apparatur bentigt
keine Vorrichtungen zur raschen Registrierung (Fersht & Jakes, 1975). Bray (1961)
verwendete als Quench-Flssigkeit in flssigem Stickstoff gekhltes Isopentan, in das
die Reaktionslsung gespritzt wird und augenblicklich gefriert. Diese Rapid-Free-
zing-Methode eignet sich besonders fr ESR-Messungen mit freien Radikalen bzw.
mit paramagnetischen Metallen.
3.5.1.3 Messung von Enzymreaktionen durch Flumethoden
Zur Verfolgung schneller enzymatischer Umstze ist die Stopped-Flow-Apparatur die
Methode der Wahl. Mit ihr lassen sich Reaktionen analysieren, die mit normalen
photometrischen Methoden nicht mehr zu erfassen sind, wie die wahre Anfangsge-
schwindigkeit insbesondere bei geringen Substratkonzentrationen, die bei manuellem
Mischen bereits vor Einsetzen des Mevorgangs in der Kvette abluft. Vor allem
dient sie dem Studium der Pre-Steady-State-Reaktionen, also der vor der Steady-
State-Phase ablaufenden Prozesse. Diese starten mit der zumeist diffusionskontrollier-
ten Bindung des Substrats an das Enzym. Obwohl prinzipiell ein rascher Proze,
kann er als Reaktion zweiter Ordnung vielfach durch geeignete Wahl der Konzentra-
tionen der Reaktionspartner sichtbar gemacht werden. Daran schliet sich oft eine
Isomerisierung des Enzyms zur aktiven Konformation an. Schlielich wandelt sich
das Substratmolekl am Enzym im katalytischen Proze ber einen bergangszu-
stand zum Produkt um. Die mit Hilfe der Apparatur tatschlich zu beobachtenden Vor-
gnge hngen von der Art des Mesignals ab. Wie in der konventionellen Enzymkinetik
knnen Substratabnahme oder Produktbildung verfolgt werden. In diesen Fllen beob-
achtet man eine sog. Burst-Kinetik (engl. burst, bersten), die sich in einem raschen An-
stieg zu erkennen gibt, bevor die lineare Steady-State-Phase erreicht wird (Abb. 3.48).
Der Burst p resultiert aus der raschen Wechselwirkung des Substrats mit dem noch un-
besetzten Enzym unmittelbar nach dem Mischen und reprsentiert den ersten Reakti-
onsdurchsatz. Das Substrat ist in seiner Bindung an das Enzym nicht durch bereits ge-
bundene Substrat- oder Produktmolekle behindert, die zur Verzgerung der Gesamtre-
aktion in der Steady-State-Phase beitragen. Die Hhe des Bursts (Amplitude) gibt die
Menge der im ersten Durchsatz gebildeten Produktmolekle an. Durch Extrapolation
der linearen Steady-State-Phase auf die Ordinate zur Zeit t =0 ergibt sich daher bei Sub-
stratsttigung die Zahl der an diesem Proze beteiligten aktiven Zentren. In einer dop-
pelt-reziproken Darstellung von gegen 1/[A]
0
erhlt man die Konzentration der aktiven
Zentren bei unendlicher Substratkonzentration aus dem Ordinatenschnittpunkt
(Abb. 3.48). Zur Auswertung des Pre-Steady-State-Prozesses, z. B. zur Ermittlung der
Reaktionsordnung wie auch zu einer mglichen Auflsung mehrerer sich berlagern-
der Prozesse, ist die Steady-State-Phase von der gesamten Kurve abzuziehen.
Gegenber einfachen Steady-State-Messungen mu die Enzymkonzentration deut-
lich erhht werden, um Meeffekte in der kurzen Zeit sichtbar zu machen. Dies er-
laubt es auch, die Vorgnge am Enzym selbst zu messen, z. B. durch Beobachtung
242 3 Methoden
der Proteinabsorption bzw. -fluoreszenz. Auf diese Weise lassen sich Pre-Steady-
State-Reaktionen ohne berlagerung des Mesignals durch die Produktbildung ver-
folgen. Allerdings sind die zu erwartenden Vernderungen im Bereich der Eigenab-
sorption des Proteins relativ gering. Bessere Effekte werden erhalten, wenn das Pro-
tein chromophore prosthetische Gruppen, wie Flavine oder Hmgruppen, besitzt. Mit
der Stopped-Flow-Methode lassen sich weiterhin Wechselwirkungen des Enzyms mit
Cofaktoren, Metallionen, Hemmstoffen, allosterischen Effektoren u.a. untersuchen.
Reaktionen, wie Dehydrogenasen, bei denen Protonen freigesetzt oder gebunden wer-
den, knnen auch in ungepufferter oder schwach gepufferter Lsung, mit Hilfe geeig-
neter pH-Indikatoren, verfolgt werden, wobei der pK
a
-Wert des Indikators mglichst
nahe am pH-Wert der Reaktionsmischung liegen sollte.
Eine spezielle Anwendung ist die pH-Sprung-Stopped-Flow-Methode. Das Enzym
wird in schwach gepufferter Lsung in eine Reaktionsspritze gegeben, whrend die
zweite Spritze eine auf einen anderen pH-Wert eingestellte Pufferlsung enthlt. Beim
Mischen erleidet das Enzym einen raschen Sprung in das andere pH-Milieu und Vern-
derungen des Enzymmolekls selbst, wie auch Wechselwirkungen mit Liganden bei
vernderter Protonierung bestimmter Gruppen lassen sich verfolgen. Nach einem ver-
gleichbaren Prinzip werden Sprnge in der Ionenstrke und in der Reaktantenkonzen-
tration erzeugt oder andere Lsungsmittel unter nderung der Polaritt zugemischt.
3.5.1.4 Bestimmung der Totzeit
Die Zeit, die zwischen dem Start der Reaktion in der Mischkammer und der Erfassung
des Mesignals durch das Detektionssystem verstreicht, die Totzeit, bestimmt das zeit-
liche Auflsungsvermgen schneller kinetischer Apparaturen und ist ein wichtiges Qua-
littskriterium. Experimentell lt sich die Totzeit mit Hilfe von Farbreaktionen ermit-
teln, die durch berschu eines Reaktionspartners als Reaktionen pseudo-erster Ord-
nung ablaufen. Ihr exponentieller Reaktionsverlauf kann in einer halblogarithmischen
Darstellung linearisiert werden. Die so erhaltene Gerade wird auf einen Leerwert extra-
poliert, der den Farbstoff in der entsprechenden Konzentration vor Beginn der Reaktion
A3.5 Messung schneller Reaktionen 243
Abb. 3.48. Zeitverlauf einer
Burst-Reaktion mit (1) und
ohne (3) anschlieender Stea-
dy-State-Phase; 2) ist die ex-
trapolierte Steady-State-
Phase. Die senkrechten Pfeile
zeigen die zeitliche Absorpti-
onsnderung der Pre-Steady-
State-Reaktion.
enthlt. Die Differenz zwischen diesem Punkt und dem Start der Registrierung auf der
Zeitachse entspricht der Totzeit (Abb. 3.49). Als Indikatorreaktionen dienen die Reduk-
tion von 2,6-Dichlorphenolindophenol durch Ascorbinsure oder die alkalische Hydro-
lyse von 2,4-Dinitrophenylacetat zu 2,4-Dinitrophenol. Ebenso fr Absorptions- und
Fluoreszenzoptik anwendbar ist die Chemilumineszenz-Reaktion von Luminol (3-Ami-
nophthalhydrazin) mit Wasserstoffperoxid und Kaliumhexacyanoferrat in alkalischer
Lsung, die aufgrund ihrer Lichtentwicklung keine Lichtquelle bentigt. Speziell fr
fluorimetrische Detektoren eignet sich die starke Fluoreszenzzunahme von Anilinona-
phthalinsulfonat (ANS) bei der Bindung an Serumalbumin.
3.5.2 Relaxationsmethoden
Der zunchst von J. C. Maxwell fr die Rckkehr eines molekularen Systems zu sei-
nem thermischen Gleichgewichtszustand angewandte Begriff der Relaxation bezeich-
net eine Gruppe von Methoden, die den Vorgang der Wiedereinstellung des Gleichge-
wichtszustandes nach kurzzeitiger Strung beobachten. Nach der vant Hoffschen Re-
aktionsisobare hngt die thermodynamische Gleichgewichtskonstante K von der abso-
luten Temperatur T ab:
d ln K
dT

P
=
DH
0
RT
2
X (3X39)
Eine entsprechende Abhngigkeit gilt fr den Druck P:
d ln K
dP

T
=
DV
0
RT
(3X40)
244 3 Methoden
Abb. 3.49. Bestimmung der Totzeit t ei-
ner Stopped-Flow-Apparatur mit Hilfe
einer Reaktion pseudo-erster Ordnung
( ) durch halblogarithmische Li-
nearisierung () und Extrapolation
( ) auf die Absorption des Leer-
werts; a) Start der Reaktion in der
Mischkammer, b) Beginn der Registrie-
rung.
und fr die elektrische Feldstrke E:
d ln K
dE

TYP
=
DM
RT
X (3X41)
DH
0
ist die Standard-Reaktionsenthalpie bei der Temperatur T, DV
0
die Volumennde-
rung pro Formelumsatz der Reaktion unter Standardbedingungen, R die Gaskonstante.
Die Differenz der partiellen molaren Polarisationen zwischen Produkten und Substra-
ten, DM, reprsentiert die durch die Reaktion hervorgerufene nderung im Ladungszu-
stand der Reaktionspartner. Fr jede dieser drei Abhngigkeiten wurde, ursprnglich
von Manfred Eigen und seinen Mitarbeitern in Gttingen, eine spezielle Technik ent-
wickelt, mit denen das zeitliche Auflsungsvermgen gegenber den Flu-Methoden
um einige Zehnerpotenzen verbessert werden konnte. Bei jedem dieser Verfahren befin-
det sich das Reaktionssystem zunchst im Gleichgewichtszustand. Der kurzzeitig ange-
legten Strung, also der Temperatur-, Druck- oder Feldstrkenderung, vermag das Sy-
stem aufgrund seiner Trgheit nicht augenblicklich zu folgen. Die Apparatur beobachtet
die Anpassung des Systems an die vernderten Bedingungen. Es ist damit nicht mg-
lich, enzymatische Umstze direkt zu messen, wohl aber lassen sich Verschiebungen
im Gleichgewicht befindlicher Enzymreaktionen untersuchen. Weiterhin knnen Ligan-
den-Bindungen, Konformationsvernderungen, Assoziationsgleichgewichte u. a. beob-
achtet werden. Allerdings sind diese Gleichgewichtsverschiebungen und damit die
Mesignale relativ gering und erfordern hohe Megenauigkeiten.
3.5.2.1 Temperatursprung-Methode
Von den Relaxationsmethoden hat die Temperatursprung-Methode (T-Sprung, engl. T-
jump) die breiteste Anwendbarkeit, insbesondere bei enzymatischen Untersuchungen.
Die in einer Beobachtungskammer befindliche Reaktionsmischung wird durch einen
kurzzeitigen Temperaturpuls aufgeheizt und mit optischen oder polarographischen
Verfahren beobachtet (Abb. 3.50). Der Temperatursprung wird zumeist durch Entla-
A3.5 Messung schneller Reaktionen 245
Abb. 3.50. Schema einer Temperatursprung-
Apparatur; a, b, Elektroden; f, Beobach-
tungsfenster; k, Kvette.
dung eines Hochvolt-Kondensators ber eine Funkenstrecke ausgelst. Der Stromsto
entldt sich ber Gold- oder Platinelektroden durch die Lsung in der Beobachtungs-
zelle und wird zur Erde abgeleitet. Reibung der im elektrischen Feld wandernden Io-
nen bewirkt eine rasche Temperaturerhhung (Joulesche Erwrmung).
Das Ausma der Temperaturerhhung lt sich nach der Beziehung
DT =
CU
2
8Y36c
p
qV
durch die Spannung U (in der Regel zwischen 10000 und 100000 V) und die Kon-
densatorkapazitt C (0,010,1 lF) festlegen und liegt zumeist zwischen 5108C. V ist
das Reaktionsvolumen, c
p
die spezifische Wrme und q die Dichte der Lsung. DT
hngt weiterhin ber die Spannung vom Widerstand ab, der in der Lsung am hch-
sten ist. Um, insbesondere bei Enzymlsungen, die Erwrmung nicht zu hoch werden
zu lassen, mu der Widerstand R in der Beobachtungszelle mglichst gering sein.
Nach R*d/QL ist dies durch einen geringen Elektrodenabstand d, einen breiten Elek-
trodenquerschnitt Q und eine hohe Leitfhigkeit L zu erreichen. Zur Steigerung der
Leitfhigkeit wird in der Lsung eine hohe Elektrolytkonzentration bentigt (0,1
0,2 M KNO
3
, das gegenber den Elektroden relativ inert ist). Die Dauer des Tempe-
ratursprungs ist von Widerstand und Kapazitt abhngig und lt sich durch Erniedri-
gung dieser Gren verkrzen. Allerdings sind Zeiten unter 1 ls nicht realisierbar, da
eine Druckwelle entsteht, die mit der Messung interferiert und aus wssriger Lsung
Gasblasen freisetzt. Aufgrund der Massentrgheit erfolgt die Temperaturerhhung ra-
scher als die thermische Ausdehnung. Dies bewirkt einen Druckanstieg, bei einer
Temperaturdifferenz von 108C in wssriger Lsung um 5 MPa, der sich in einer
Druckwelle entspannt. Obwohl unter Verwendung eines 5 m langen Koaxialkabels
anstelle eines Kondensators eine Pulsdauer von 50 ns erreicht werden konnte (Hoff-
mann, 1971), limitiert dieser Effekt die Methode auf einen Bereich von 1 ls. Bei
Messungen um 48C ist dieser Effekt am geringsten.
Anstelle des Prinzips der Jouleschen Erwrmung kommen auch Bestrahlungen mit
Mikrowellen oder Laserlicht zur Anwendung, insbesondere fr Messungen bei gerin-
ger Ionenstrke oder in nichtwssrigen Lsungsmitteln. Durch Absorption von Mikro-
wellen einer Frequenz von 10
10
s
1
in wssriger Lsung aus einem Mikrowellenim-
pulsgenerator erreicht man eine Aufheizung von 18C in 1 ls. Dieser relativ geringe
Effekt wie auch der hohe Preis des Mikrowellengenerators steht einer breiten Anwen-
dung dieses Verfahrens entgegen. Durch Pulse eines Neodynium-Lasers, dessen Wel-
lenlnge mit flssigem Stickstoff von 1060 auf 1410 nm erhht wurde, kann inner-
halb von 25 ns eine Erwrmung von einigen 8C erzielt werden, da in diesem Bereich
Wasser eine starke Absorption zeigt. Diese Methode ist damit rascher als die im Mi-
krosekundenbereich erscheinende Druckwelle. Andererseits ist die Aufheizung der
Melsung bei Lichtwegen ber 1 mm inhomogen, da die Lichtabsorption der wss-
rigen Phase exponentiell mit dem Lichtweg zunimmt. Es lassen sich daher nur gerin-
ge Volumina untersuchen.
Bei T-Sprung-Apparaturen werden prinzipiell die gleichen Detektionsverfahren
eingesetzt wie bei der Stopped-Flow-Methode. Aufgrund der geringen Meeffekte
sind auch hier hohe Anforderungen an die Empfindlichkeit gestellt. Absorptionsspek-
246 3 Methoden
troskopie ist das am hufigsten verwendete Verfahren, daneben kommen Fluoreszenz-
und Fluoreszenzpolarisationsmessungen zur Anwendung und in geringem Mae auch
die Bestimmung der optischen Rotation, die allerdings einen greren Lichtweg be-
ntigt. Daneben wurden auch Apparaturen zur Verfolgung der Lichtstreuung und der
elektrischen Leitfhigkeit entwickelt, wobei das letztgenannte Verfahren beim Prinzip
der Jouleschen Erwrmung nicht anwendbar ist.
Durch Kombination mit einer Stopped-Flow-Apparatur lassen sich die Anwen-
dungsmglichkeiten der T-Sprung-Methode erweitern. Der Umstand, da sie nur fr
Reaktionen im Gleichgewicht anwendbar ist, erfordert auch, da die Reaktionspart-
ner in vergleichbarer Menge vorhanden sein mssen, um eine Gleichgewichtsver-
schiebung zugnglich zu machen, d. h. Reaktionen, deren Gleichgewicht berwiegend
auf einer Seite liegt, sind nicht erfabar. Das gilt fr viele quasi-irreversible Enzym-
reaktionen. Bei der Stopped-Flow-Temperatursprung-Methode werden die Partner ei-
ner solchen Reaktion rasch gemischt und unmittelbar danach der Temperatursprung
ausgelst. Da die Zeitauflsung der T-Sprung-Methode um drei Zehnerpotenzen bes-
ser ist als die des Stopped-Flow-Verfahrens, strt eine im Millisekundenbereich ab-
laufende Enzymreaktion die T-Sprung-Messung nicht. Abbildung 3.51 zeigt das Sche-
ma einer solchen Apparatur. In eine normale Stopped-Flow-Apparatur ist eine kombi-
nierte Beobachtungszelle mit Elektroden eingebaut, die mit den Bauteilen einer T-
Sprung-Apparatur verbunden ist.
Wie fr Flow-Apparaturen die Totzeit, ist bei T-Sprung-Gerten die Zeit zum Er-
reichen des hheren Temperaturniveaus eine fr die Zeitauflsung charakteristische
Gre. Sie ist definiert als die Zeit, die ntig ist, um 90% des maximalen Niveaus zu
erreichen und sie kann durch Protonierungsreaktionen mit einem pH-Indikator be-
stimmt werden.
T-Sprung-Apparaturen finden Anwendung zur Untersuchung von Enzymreaktio-
nen, Ligandenbindungen, Konformationsnderungen von Enzymen, spontanen oder li-
gandeninduzierten bergngen allosterischer Enzyme, katalytischen Mechanismen
oder Aggregationsprozessen. Oftmals lt sich ein Mesignal in mehrere Einzelpro-
zesse mit verschiedenen Zeitkonstanten auflsen, wie die Bindung eines Liganden,
gefolgt von einer Isomerisierungsreaktion des Enzyms. Reaktionen, die kein ausrei-
chend groes Mesignal aufweisen, lassen sich in bestimmten Fllen durch Verknp-
A3.5 Messung schneller Reaktionen 247
Abb. 3.51. Schema einer Stop-
ped-Flow-Temperatursprung-
Apparatur.
A,E, Reaktionsspritzen;
a, Antrieb; b, Kvettenblock;
f, Funkenstrecke; l, Lampe;
h, Hochspannungsgenerator;
k, Kondensator;
pm, Photomultiplier;
o, Oszillograph, Detektor;
s, Stoppspritze; t, Trigger.
fung mit einer anderen, gut nachweisbaren Reaktion zugnglich machen. So kann die
temperaturabhngige pH-Verschiebung eines rasch reagierenden Puffersystems mit ei-
nem anderen protonenabhngigen Proze, z. B. einer Dehydrogenase-Reaktion, ge-
koppelt werden. Die T-Sprung-Apparatur wird damit zu einem pH-Sprung-Apparat.
3.5.2.2 Drucksprung-Methode
Verschiedene Drucksprung-Systeme (P-Sprung, engl. P-jump) zur Erzeugung kurzzei-
tiger Druckdifferenzen in Lsungen wurden beschrieben. In der von Strehlow und
Becker (1959) entwickelten Apparatur (Abb. 3.52) wird die Probe in die Kammern
eines Druckgefes (Autoklav) gegeben, mit einer flexiblen Teflonmembran ver-
schlossen und mit einem druckbertragenden Medium (Wasser, Paraffin) umgeben.
Dieses wird mit einer elastischen Polyethylenmembran abgedeckt und der verbleiben-
de Raum des Autoklaven mit komprimiertem Gas von 5,5 MPa gefllt. Eine ffnung
des Autoklavs wurde zuvor mit einer leitfhigen, druckstabilen Membran aus Kupfer-
Beryllium-Bronze verschlossen. Ein magnetischer Auslser lst die Arretierung einer
ber dieser Membran fixierten Metallnadel. Diese durchstt die Membran und star-
tet damit gleichzeitig die Registrierung. Durch den hohen Druck zerreit die Mem-
bran und der Druck in der Lsung entspannt sich. Die Zeitauflsung der Methode ist
limitiert durch die Dauer des Reiens der Membran und durch die Fortpflanzungsge-
schwindigkeit der Druckwellenfront. Sie liegt mit 20100 ls deutlich unter derjeni-
gen der T-Sprung-Methode. Bei einer Fortentwicklung dieser Apparatur (Knoche,
1974) fllt der Gasraum weg und die Paraffinlsung wird direkt unter steigenden
Druck gesetzt, bis die den Autoklaven verschlieende Metallmembran platzt.
Nach einem anderen Prinzip besteht das Druckgef aus einer langen Rhre, die
durch eine Trennscheibe aus Aluminium in zwei Kammern geteilt wird, die beide
Wasser enthalten, die eine unter Normaldruck, die andere unter berdruck. Die Pro-
benkammer befindet sich unter der Niederdruckkammer und ist von dieser durch eine
flexible Gummimembran getrennt. Der Druck in der Hochdruckkammer wird so lan-
ge erhht, bis die Trennscheibe platzt und sich der Druck in Form einer Schockwelle
248 3 Methoden
Abb. 3.52. Schema einer Drucksprung-
Apparatur.
auf die Probenlsung bertrgt. Die Hhe des berdrucks wird durch die Reifestig-
keit der Trennscheibe bestimmt, es werden Drcke bis zu 100 MPa erreicht (Knoche,
1974).
Schnelle sich wiederholende Drucknderungen werden nach der von Macgregor et
al. (1985) entwickelten Apparatur dadurch erhalten, da die Beobachtungszelle durch
eine Anordnung von piezoelektrischen Kristallen abgeschlossen wird. Die Kristalle
expandieren und kontraktieren zyklisch durch eine wechselweise angelegte und weg-
genommene Hochspannung. Die Probelsung steht unter einem stationren Druck
von etwa 10 MPa, der sich durch den Drucksprung um jeweils 500 kPa erhht.
Auf dem Prinzip periodischer Druckvernderung von Schallwellen in Lsungen
beruht auch die Ultraschallmethode, die hier nur kurz erwhnt wird, da sie fr Enzy-
muntersuchungen kaum Bedeutung hat. Die Strung hat hier nicht die Form eines
kurzzeitigen Sprunges, sondern einer rasch oszillierenden Sinuswelle. Wenn die Fre-
quenz dieser Welle im Bereich der Geschwindigkeitskonstanten (bzw. der reziproken
Relaxationszeit, vgl. Abschnitt 3.5.4) der Reaktionslsung zu liegen kommt,
schwingt das System in Resonanz mit der Schallwelle. Die Konzentrationsvernde-
rung des Systems zur Rckgewinnung des Gleichgewichtszustandes folgt mit verrin-
gerter Amplitude und verzgert die Schallwellenfront. Es lt sich daraus die Ge-
schwindigkeitskonstante der Reaktion erhalten. In der Dispersionsmethode wird die
Schallgeschwindigkeit, in der Absorptionsmethode der Absorptionskoeffizient als
Funktion der Frequenz bestimmt. Die Ultraschallfrequenz wird von 0,05100 MHz
variiert. Reaktionen bis in den Nanosekundenbereich lassen sich in wssriger Lsung
verfolgen. Allerdings werden dafr groe Probenvolumina und hohe Konzentrationen
(10 mM) bentigt.
Die Mesignale bei der P-Sprung-Methode werden konduktometrisch oder optisch
verfolgt, wobei die lichtdurchlssigen Teile der Beobachtungszelle den hohen Drk-
ken standhalten mssen. Man verwendet dazu Saphirfenster.
Die Anwendungsmglichkeiten der Druck-Sprung-Methode auf biologische Sy-
steme und speziell fr Enzymuntersuchungen sind beschrnkt. Wie Gl. (3.40) zeigt,
ist die druckabhngige Vernderung der Gleichgewichtskonstanten der Volumennde-
rung des Systems proportional, d. h. es sind nur solche Reaktionen zugnglich, die
mit einer ausgeprgten Volumennderung einhergehen. Biologische Makromolekle
zeigen trotz ihrer komplexen Strukturen eine hohe Druckstabilitt. Lebewesen in der
Tiefsee halten unbeschadet Drcken bis zu 100 MPa stand. Fr die Abhngigkeit der
Geschwindigkeitskonstanten von Druck gilt analog Gl. (3.40):
d ln k
dP

T
=
DV
=[
RT
X (3X43)
DV
=[
ist die Differenz zwischen den Volumina von bergangs- und Ausgangszustand
(Aktivierungsvolumen). Durch Druckerhhung verschiebt sich das Gleichgewicht
nach dem Le-Chatelier-Braunschen Prinzip des kleinsten Zwanges in Richtung einer
Volumenabnahme. Relativ starke Volumennderungen und damit eine gute Druckab-
hngigkeit zeigen Protonierungsreaktionen sowie ionische und hydrophobe Wechsel-
wirkungen, whrend das Lsen und Knpfen von Wasserstoffbrckenbindungen nur
mit sehr geringen Volumenvernderungen einhergehen. Proteine besitzen aufgrund ih-
A3.5 Messung schneller Reaktionen 249
rer quasikristallinen Struktur eine sehr hohe Druckstabilitt. Die Denaturierung eines
Proteins verluft ber viele Einzelschritte, die teilweise mit Volumenzunahme oder -
abnahme begleitet sind und sich im Gesamtproze weitgehend kompensieren. Es re-
sultiert eine vergleichsweise geringe Volumennderung, so da druckabhngige Dena-
turierung kaum zu erreichen ist. Insgesamt besitzen Proteine ein negatives Reaktions-
volumen, sie werden durch Druck destabilisiert, whrend DNA aufgrund ihres positi-
ven Reaktionsvolumens durch Druck stabilisiert wird.
3.5.2.3 Feldsprung-Methode
Die elektrische Feldsprung-Methode (E-Sprung, engl. electric field method) ist noch
in geringerem Mae als die P-Sprung-Methode auf biologische Systeme anwendbar
und daher nur der Vollstndigkeit wegen aufgefhrt. Die Apparatur ist einer T-
Sprung-Apparatur hnlich, nur da die Melsung anstatt einem Stromsto einem
Hochspannungspuls ausgesetzt wird. Bei einer Spannung von 100000 V kme Was-
ser innerhalb von Sekunden zum Kochen. Das elektrische Feld wird daher ber einen
Rechteckimpuls von wenigen Nano- bis Mikrosekunden aufgebaut und wieder entla-
den. Anstelle eines Kondensators wird ein 0,31 km langes Koaxialkabel durch einen
Hochspannungsgenerator aufgeladen. ber eine Funkenstrecke wird ein Kondensator
aufgeladen, der in Form zweier Elektroden an der Beobachtungszelle angebracht ist
und sich rasch wieder entldt. Auf diese Weise wird die Probe kurzzeitig einem hohen
elektrischen Feld ausgesetzt. Mit dieser Methode lassen sich Protonierungsreaktionen
untersuchen, auch war es mglich, Relaxationszeiten einer Hmoglobin-Sauerstoff-Mi-
schung zu bestimmen und Helix-Knuel-bergnge bei Proteinen zu verfolgen.
3.5.3 Flash-Photolyse, Pico- und Femtosekunden-Spektroskopie
Die von Norrish & Porter (1949) zunchst fr Reaktionen in der Gasphase ent-
wickelte und spter auf Lsungen bertragene Blitzlichtphotolyse dient der Untersu-
chung wenig stabiler Verbindungen mit Halbwertszeiten unter einer Sekunde. Mit die-
ser Methode wurden u.a. Prozesse der Photosynthese und des Sehvorgangs, Porphyrin-
Metall-Komplexe, Bindung von O
2
und CO an Hmoglobin und Myoglobin untersucht.
Ein Beispiel der Verfolgung einer Enzymreaktion mit Hilfe der Flash-Photolyse ist die
Freisetzung von ATP aus einem photosensitiven ATP-Derivat durch UV-Bestrahlung
mittels eines Laser-Pulses. Das Prinzip der Flash-Photolyse besteht darin, durch einen
kurzen, sehr intensiven Lichtblitz eine Komponente des Reaktionssystems zu aktivieren
und die dadurch initiierte Reaktion zu verfolgen. Es mu sich dabei um photosensitive
Molekle handeln, die in freie Radikale oder in Triplettzustnde berfhrt werden. Die-
ser Umstand begrenzt den Anwendungsbereich der Methode auf Systeme, die solche
Verbindungen enthalten bzw. in die sie eingefhrt werden knnen.
Zur Erzeugung der Lichtblitze dienen Entladungs-Blitzlichtlampen mit Argon-,
Krypton- oder Xenonfllung. Damit werden Zeitauflsungen von wenigen Mikrose-
kunden erreicht. Der Picosekundenbereich wird durch gepulste Laser zugnglich. Ab-
250 3 Methoden
bildung 3.53A zeigt schematisch eine apparative Anordnung, bei der Lichtblitze ei-
ner Xenonblitzlampe durch Entladung eines Kondensators erzeugt werden. Die Lam-
pe ist parallel zu einem die Reaktionslsung enthaltenden Quarzzylinder angeordnet.
Zur optimalen Durchstrahlung ist die Einheit von einem innen mit einem Reflektor-
schirm aus Magnesiumoxid ausgekleideten Zylinder umgeben. Der Reaktionsverlauf
im Zylinder wird durch eine in Lngsrichtung zum Zylinder angebrachte photometri-
sche Anordnung gemessen, wobei als photometrische Lampe ebenfalls eine Flashlam-
pe dient, die einen zum Photolyseblitz etwas verzgerten Lichtblitz aussendet (Flash-
Spektroskopie). Es wird zu einem einzigen Zeitpunkt der gesamte Wellenlngenbe-
reich erfat. Zur zeitlichen Verfolgung des Reaktionsverlaufs bei einer bestimmten
Wellenlnge (kinetische Spektrophotometrie) werden dagegen kontinuierliche Licht-
quellen verwendet.
Durch die Einfhrung von Lasern konnte die Flash-Photolyse in den Nano- und Pico-
sekundenbereich vordringen. Mit gepulsten Festphasen-Lasern mit Rubin (694 nm),
Nd
3+
in Glas oder YttriumAluminium-Granat (YAG, 1063 nm) werden Pulse zu
1030 ns Dauer erhalten. Phasenkopplung (Mode-Locking) des Lasers ermglicht Puls-
lngen im Bereich von 30100 Femtosekunden (fs). Durch Modulierung des Laserlichts
sind auch die Wellenlngen 347 (Rubin), 532, 355 und 266 nm (Nd: YAG) zugnglich.
Daneben kommen auch mit Blitzlichtlampen gepumpte Farbstofflaser zur Anwendung,
die zwar eine deutlich schwchere Lichtintensitt besitzen, jedoch einen greren Wel-
lenlngenbereich abdecken und auch preisgnstiger sind. Die Pulsdauer liegt bei ihnen
zumeist ber 100 ns. Um die fr die Anregung der Molekle erforderliche Energie zu
erhalten, mssen die Lichtpulse verstrkt werden. Im UV-Bereich werden auch Exci-
mer-Laser verwendet, die Dimerbildung im angeregten Zustand zwischen einem Edel-
A3.5 Messung schneller Reaktionen 251
Abb. 3.53. Schema einer Flash-
Photolyse-Apparatur mit Blitz-
lampe (A) und Laser (B).
gas und einem Halogen ausnutzen, wie ArCl (308 nm) und XeCl (248 nm). Sie haben
Pulslngen von 20 ns. Fr die Flash-Spektroskopie wird der Lichtpuls aufgeteilt in zwei
Strahlen, einer dient der Anregung der Probe, der andere als spektroskopischer Licht-
puls. Zur zeitlichen Verzgerung wird er ber einen Reflexionsspiegel gelenkt und ge-
langt schlielich in eine fluoresziernde Lsung, die ihrerseits ein Lichtkontinuum inner-
halb eines bestimmten Spektralbereichs aussendet (Abb. 3.53B). Ein spektrales Konti-
nuum wird auch erhalten, indem der Lichtpuls in eine Wasser- oder Wasser-Alkohol-
Zelle fokussiert wird. Fr kinetische Spektrophotometrie im Nanosekundenbereich
mu die Lichtintensitt der photometrischen Lampe sehr hoch sein, um Strungen
durch Streulicht und den Photolyseblitz zu vermeiden. Um die Ermdung des Photo-
multipliers zu vermeiden, wird wiederum in sehr kurzen Pulsen gemessen mit einer
Blitzlampe oder einer gepulsten Xenonbogenlampe.
Eine Modifikation der Flash-Photolyse ist die Puls-Radiolyse, die anstelle von
Lichtpulsen Elektronenpulse von 1100 ns aus einem Mikrowellen-Linear-Elektro-
nen-Beschleuniger (LINAC) verwendet. Im Unterschied zur Photoanregung, bei der
spezifisch eine bestimmte gelste Verbindung angeregt wird und das Lsungsmittel
fr die Strahlung durchlssig ist, wird die Elektronenenergie in verdnnten Lsungen
nahezu vollstndig an das Lsungsmittel abgegeben. Die Elektronenbestrahlung be-
wirkt Radikalbildungen, Ionisierungen und Anregung von Moleklen zu erlaubten
(Singulett-Singulett) und verbotenen (Singulett-Triplett) bergngen. In Wasser bilden
sich neben H
3
O
+
, OH

, H

, H
2
und H
2
O
2
auch Hydroxyl-Radikale (OH

) mit oxidieren-
den, und hydratisierte Elektronen (e

aq
) mit reduzierenden Eigenschaften, deren Reakti-
vitten durch diese Methode untersucht werden konnten. Mit Hilfe der Puls-Radiolyse
werden daher weniger die unmittelbaren Einwirkungen des Elektronenpulses auf die zu
untersuchenden Verbindungen, sondern eher deren Reaktionen mit solchen reaktiven
Partikeln untersucht. So konnte die Reduktion von Methmoglobin durch hydratisierte
Elektronen und die nachfolgende Sauerstoffbindung verfolgt werden.
3.5.4 Auswertung schneller kinetischer Reaktionen
(Transient-Kinetik)
Aus Experimenten mit schnellen Methoden, insbesondere den Relaxationsmethoden,
werden Relaxationskurven erhalten (Abb. 3.54A). Das System nhert sich asympto-
tisch dem durch die neuen Bedingungen (erhhte Temperatur, entspannter Druck)
aufgezwungenen Gleichgewicht. Die maximal erreichbare nderung sei D
0
, die Ab-
weichung vom ursprnglichen Gleichgewicht zu einer beliebigen Zeit t sei D
t
. Eine
charakteristische Gre ist die Relaxationszeit s, das ist diejenige Zeit, bei der 63,2%
der maximalen Abweichung D
0
erreicht sind (Abb. 3.54A):
D
t
= D
0
e
(tas)
X (3X44)
Fr t =s ist.
D
t
= D
0
e
1
= D
0
0Y368 X
252 3 Methoden
Die Relaxationszeit kann auch aus der Differenz der Schnittpunkte einer Ursprungs-
tangenten mit den horizontalen Geraden fr Anfangs- und Endzustand erhalten wer-
den oder aus der Steigung eines halblogarithmischen Diagramms der Abweichung D
t
gegen die Zeit (Abb. 3.54B):
ln
D
t
D
0
=
t
s
X (3X45)
Die Relaxationszeit ist eine komplexe Gre, die sich zusammensetzt aus den Ge-
schwindigkeitskonstanten und Konzentrationsgliedern der Komponenten der betref-
fenden Reaktion. Hier soll die Relaxationszeit fr den Fall einer bimolekularen Reak-
tion, wie er einfachen Bindungsgleichgewichten zugrundeliegt, abgeleitet werden:
E A
k
1
B EA X
k
1
A (1X18)
Durch Strung des Gleichgewichts ndern sich die Konzentrationen der Reaktions-
partner ([A] etc.) um den Betrag d zu [A] usw.:
[E[ = [E[ d
E
Y [A[ = [A[ d
A
Y [EA[ = [EA[ d
EA
X (3X46)
Die Gesamtmengen der Reaktionspartner bleiben durch die Strung unverndert:
[A[
0
= [A[ [EA[ = [A[ [EA[ Y (3X47 a)
[E[
0
= [E[ [EA[ = [E[ [EA[ X (3X47 b)
Damit ist
[A[ d
A
[EA[ d
EA
= [A[ [EA[
[E[
0
d
E
[EA[ d
EA
= [E[ [EA[
A3.5 Messung schneller Reaktionen 253
Abb. 3.54. Ermittlung der
Relaxationszeit s aus einer
Relaxationskurve (A). B)
Halblogarithmische Dar-
stellung; D
0
ist die maxi-
male Abweichung, D
t
die
Abweichung zur Zeit t.
und demzufolge
d
A
= d
E
= d
EA
= d X (3X48)
Die Differentialgleichung fr die zeitliche nderung der Reaktionspartner der zu-
grundeliegenden Reaktion (1.18)

d[A[
dt
= k
1
[A[[E[ k
1
[EA[
lt sich durch Einsetzen von Gl. (3.46) und (3.48) umformen zu:

d([A[ d)
dt
= k
1
([A[ d)([E[ d) k
1
([EA[ d)

d[A[
dt

dd
dt
= k
1
[A[[E[k
1
[EA[k
1
([A[[E[)k
1
d k
1
d
2
X (3X49)
Im Gleichgewicht, auch nach der Strung, sind die Konzentrationen zeitunabhngige
Gren, d. h.:

d[A[
dt
= k
1
[A[[E[ k
1
[EA[ = 0 X (3X50)
Damit entfallen auch die ersten beiden Glieder der linken Seite von Gl. (3.49), fr
kleine Vernderungen kann das quadratische Glied vernachlssigt werden:

dd
dt
= k
1
([A[ [E[) k
1
d =
d
s
X (3X51)
Der Klammerausdruck, der auch aufgrund der im Gleichgewicht unvernderlichen
Konzentrationsglieder nur konstante Gren enthlt, wird durch 1/s ersetzt. Durch In-
tegration nach der Zeit t fr eine bestimmte Konzentrationsnderung D

D
t
D
0
dd
d
=

t
0
dt
s
(3X52)
erhlt man die bereits oben aufgefhrten Gl. (3.44) und (3.45). Nach Gl. (3.51) hat
die Relaxationszeit fr den vorliegenden Reaktionsmechanismus die Bedeutung:
1
s
= k
1
([A[ [E[) k
1
X
Die Geschwindigkeitskonstanten knnen durch Bestimmung der Relaxationszeiten
bei verschiedenen Konzentrationen von [A[ und [E[ ermittelt werden. Aus einem Dia-
gramm von 1/s gegen [A[ [E[ lassen sich k
+1
aus der Steigung, k
1
aus dem Ordina-
254 3 Methoden
tenschnittpunkt und K
d
=k
1
/k
+1
aus dem Abszissenschnittpunkt ablesen. Allerdings
sind auf der Abszissenskala die Konzentrationswerte nach der Strung, d. h. bei der
hohen Temperatur, anzugeben, die unter Anwendung von Gl. (3.47) bei Kenntnis von
K
d
erhltlich sind. Entsprechend gelten die auf diese Weise bestimmten Konstanten
fr die Bedingungen nach der Strung.
Gem Gl. (3.44) ist die Relaxationskurve eine exponentielle Funktion, was aller-
dings nur solange zutrifft, als das quadratische Glied von Gl. (3.49) tatschlich zu
vernachlssigen ist, also bei kleinen nderungen. Andernfalls erhielte man Abwei-
chungen vom linearen Verlauf in Abb. 3.54B. Nicht-Linearitten knnen aber auch
aus der berlagerung verschiedener Prozesse resultieren. Zur Unterscheidung kann
die Vernderung, d. h. der Temperatursprung, reduziert werden. Bleibt die nicht-linea-
re Charakteristik erhalten, so berlagern sich tatschlich mehrere Relaxationszeiten.
Fr n Zustnde der Reaktionspartner sind n1 Relaxationszeiten zu erwarten. Unter-
scheiden sich diese um mehr als eine Grenordnung, dann knnen sie in der Regel
durch Variation der Zeitachse entkoppelt werden. Andernfalls mu man versuchen,
sie rechnerisch zu zerlegen.
Nach dem Schema der Herleitung der Relaxationszeit fr eine bimolekulare Reak-
tion lt sich diese auch fr andere Reaktionsmechanismen berechnen. Tabelle 3.3
zeigt eine Zusammenstellung fr verschiedene, hufig auftretende Mechanismen. Die
Konstanten gewinnt man durch geeignete graphische Darstellungen, wie in Abb. 3.54
fr den bimolekularen Mechanismus gezeigt.
A3.5 Messung schneller Reaktionen 255
Tab. 3.3. Bedeutung von Relaxationszeiten s bei verschiedenen Reaktionsmechanismen (nach Hiromi,
1979).
Reaktionsmechanismus Reziproke Relaxationszeit (1/s) Bemerkungen
e
k
I
k
I
k
I

k
I
ne
k
I

n
n
P
k
I
[e[
nI
k
I

k
I
ef
k
I
k
I
([e[ [f[) k
I

k
I
ef
k
I
k
I
[f[ k
I
B im berschu
k
I
ei
k
I
i (k
I
k
I
)[i[ E ist Katalysator
k
I
ef
k
I
k
I
([e[ [f[) k
I
([[ [[)
k
I
ef
k
I
P k
I
([e[ [f[) Rk
I
[[
k
I
ef g
k
I
k
I
([e[[f[ [e[[g[ [f[[g[)) k
I

k
I
3.6 Literatur
Allgemeine Methoden und Enzymanalytik
Bergmeyer, H. U. (1983) Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie, Weinheim.
Clark, J. M. & Switzer, R. L. (1977) Experimental biochemistry. W. H. Freeman, San Francisco.
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Umbreit, W. W., Burris, R. H. & Stauffer, J. F. (1972) Manometric and biochemical techniques, 5.
Aufl. Burgess Publ. Co. Minneapolis.
Williams, B. L., & Wilson, K. (1975) Principles and techniques of practical biochemistry. Edward Ar-
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