O conhecimento da absoro de luz pela matria a forma mais usual de determinar a concentrao de compostos presentes em soluo.

. A maioria dos mtodos utilizados em bioqumica clnica envolve a determinao espectrofotomtrica de compostos corados (cromforo) obtidos pela reao entre o composto a ser analisado e o reagente (reagente cromognico), originando um produto colorido. Os mtodos que se baseiam nesse princpio so denominados mtodos colorimtricos, os quais geralmente so especficos e muito sensveis. A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve-se ao fato de eles absorverem luz visvel (regio visvel do espectro eletromagntico). A espectrofotometria medida de absoro ou transmisso de luz uma das mais valiosas tcnicas analticas amplamente utilizadas em laboratrios de rea bsica, bem como em anlises clnicas. Por meio da espectrofotometria, componentes desconhecidos de uma soluo podem ser identificados por seus espectros caractersticos ao ultravioleta, visvel, ou infravermelho. Quando um feixe de luz monocromtica atravessa uma soluo com molculas absorventes, parte da luz absorvida pela soluo e o restante transmitido. A absoro de luz depende basicamente da concentrao das molculas absorventes e da espessura da soluo caminho ptico (veja Figura 1.1).

Natureza da Cor

A intensidade da cor de uma soluo proporcional concentrao das molculas absorventes de luz. Quanto mais concentrada for a soluo, maior ser a absoro de luz. Por outro lado, a cor da soluo determinada pela cor da luz transmitida (Veja a Figura 1.2).

Concluindo, uma soluo aparece como branca porque transmite luzes de todas as cores; quando absorve luzes de todas as cores, a soluo preta. Finalmente, a soluo verde quando absorve luz vermelha e transmite luz verde (amarelo + azul), a qual denominada luz complementar. A Tabela 1.1 relaciona a cor da luz com a cor da luz complementar.

Tabela 1.1 Comprimento de ondas de diversas cores.

Absoro da Luz

A luz urna forma de radiao eletromagntica que possui caractersticas de onda e de partcula (fton). O movimento ondulatrio caracterizado pelo comprimento de onda ( ), o qual corresponde distncia linear entre duas cristas, medido em nanmetros (nm), que corresponde a 10-9 m . O contedo energtico da luz inversamente proporcional ao comprimento de onda, de tal forma que a luz violeta de = 380 nm bem mais energtica do que a luz vermelha de = 700 nm. Dentro do exposto podemos dizer que a luz constituda de partculas de energia denominadas ftons, em que o contedo energtico est intimamente relacionado com o comprimento de onda. A absoro de luz pela matria envolve a incorporao da energia contida no fton estrutura das molculas absorventes. Quando isso acontece, as molculas absorventes passam do estado fundamental (estado energtico mais baixo) para o estado excitado (estado energtico mais alto). Contudo, a durao do estado excitado normalmente breve, e a molcula retorna ao estado fundamental aps aproximadamente 10-8 segundos. Geralmente, o retorno ao estado fundamental libera energia na forma de calor. Portanto, quando um feixe de luz monocromtica (1 comprimento de onda) atravessa uma soluo que contm molculas absorventes, parte das ondas eletromagnticas seriam absorvidas pelas molculas presentes na soluo, assumindo o estado excitado, as quais retornariam a seguir ao estado fundamental, liberando a energia na forma de calor (veja Figura 1.3).

Figura 1.3 Onda eletromagntica. O fenmeno de absoro implica que o contedo energtico do fton seja igual quantidade de energia necessria para que a molcula ou tomo passe do estado fundamental para o excitado. Quando o contedo energtico do fton for maior ou menor do que a quantidade de energia necessria para o composto passar do estado fundamental para o excitado, o fenmeno de absoro no ocorre. Assim, deve-se utilizar um feixe de luz monocromtica de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado, nos mtodos de dosagem colorimtrica. O procedimento para escolha do melhor comprimento de onda simples e consiste em submeter uma soluo a feixes de luzes monocromticas de diferentes comprimentos de onda e verificar qual deles mais absorvido pela soluo.
Conceito da lei de Lambert-Beer

LEI DE LAMBERT Lambert (1870) observou a relao entre a transmisso de luz e a espessura da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromtica, atravessava um meio transparente homogneo, cada camada deste meio absorvia igual a frao de luz que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. A partir desta concluso foi enunciada a seguinte lei: " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ". Esta lei pode ser expressa pela seguinte equao: =================== I = Io . 10-x1 =================== Onde: I = Intensidade da luz transmitida Io = Intensidade da luz incidente x = constante denominada coeficiente de absoro e que depende do meio absorvente empregado 1 = Espessura do meio absorvente LEI DE BEER Beer em 1852 observou a relao existente entre a transmisso e a concentrao do meio onde passa o feixe de luz. Uma certa soluo absorve a luz proporcionalmente concentrao molecular do soluto que nela encontra, isto ,

" A intensidade de um feixe de luz monocromtico decresce exponencialmente medida que a concentrao da substncia absorvente aumenta aritmeticamente ". Expressa pela equao: ================= I = Io . 10-kc ================= Onde: I = Intensidade da luz transmitida Io = Intensidade da luz incidente k = Constante denominada coeficiente de absoro c = Concentrao do meio absorvente As leis de Lambert-Beer so o fundamento da espectrofotometria. Elas so tratadas simultaneamente, processo no qual a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada soluo depende da concentrao do soluto e da espessura da soluo (1).

A lei de Lambert-Beer pode ser expressa matematicamente pela relao: T= e-a . 1 . C Onde: T= Transmitncia e = Logaritmo Natural de Euler a= Constante 1= Espessura da soluo c = Concentrao da soluo (cor)

Convertendo a equao para forma logartmica: -lnT=a . l . c Utilizando-se logaritmo na base 10, o coeficiente de absoro convertido no coeficiente de extino K . assim: -log T=k. l . c em que: k = a/2.303. As determinaes das concentraes de compostos, o "1" (caminho ptico), so mantidas constantes e tm grande importncia para os bioqumicos, portanto: -log T =k' . c em que: k'=k. l O -log (I/Io) foi denominado densidade ptica (DO) ou absorbncia (A) ou extino (E). Portanto, A = k' . c. A relao entre A e a concentrao da soluo linear crescente, conforme mostrado na Figura 1.5.

Figura 1.5 Curva de absorbncia versus concentrao de glicose (umol/mL). Comparando com a equao da reta tem-se: y = a . (x) + b; A =k' . c + 0,02.
Desvios da Lei de Lambert-Beer

Nem todas as reaes colorimtricas seguem a lei de Lambert-Beer, sendo esta vlida para condies restritas, em que: A luz utilizada aproximadamente monocromtica; As solues a serem analisadas estejam diludas (baixas concentraes); No devem estar presentes na mesma soluo mais de uma substncia absorvente de luz; O aumento da concentrao da substncia analisada no altera as caracteristicas qumicas do meio. A principal causa de desvios da lei a utilizao de solues concentradas. Essa observao pode ser ilustrada pelo grfico da Figura 1.6, no qual o aumento na concentrao acompanhado pelo aumento crescente e proporcional de A, at um

ponto limite. A partir deste ponto (solues concentradas), deixa de existir a proporcionalidade linear entre os valores (ver Figura 1.6). Limite de linearidade representa o limite de concentrao para a qual a lei de Lambert-Beer vlida. Para concentraes superiores ao limite de linearidade observado no desvio da lei de Lambert-Beer, deixa de existir a proporcionalidade linear entre concentrao e absorbncia.

Limite de linearidade representa o limite de concentrao para a qual a lei de Lambert-Beer vlida. Para concentraes superiores ao limite de linearidade observado no desvio da lei de Lambert-Beer, deixa de existir a proporcionalidade linear entre concentrao e absorbncia.
Componentes do espectrofotmetro

Alguns componentes so comuns a todos os espectrofotmetros, como verificado a seguir. A luz, habitualmente fornecida por uma lmpada, fracionada pelo prisma ou rede de difrao (monocromador) nos comprimentos de onda que a compem (luzes monocromticas). O comprimento de onda selecionado dirigido para a soluo contida em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz absorvida e parte transmitida. A reduo da intensidade luminosa medida pelo detector (clula foteltrica) porque o sinal eltrico de sada do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal eltrico amplificado e visualizado no galvanmetro em nmeros, lido como uma absorbncia e proporcional concentrao da substncia absorvene existente na cubeta.

Figura 1.7 Esquema ptico dos principais componentes do espectrofotmetro. As letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difrao, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de amostras com cubeta contendo soluo, (f) clula foteltrica, (g) amplificador.

Link de um video mostrando todos os componentes do espectrofotmetro e seu funcionamento: Clique aqui para ver o video Link de um aparelho espectrofotmetro, onde h se pode interagir e ver como se utiliza o espectrofotmetro em um experimento. Clique aqui para ver o aparelho. Aperte F5 para reiniciar a simulao. Link explicativo de como funciona o aparelho. Tem o passo a passo de como utilizar o aparelho citado acima.Clique aqui para ver o guia.

Espectro de absoro Quando uma soluo de um dado composto submetida a leituras de absorbncia ao longo de uma faixa de comprimentos de onda eletromagntica, passamos a ter informaes referentes capacidade do composto em absorver luz. A representao grfica dos valores de comprimento de onda ( ) versus absorbncia denominada espectro de absoro. Como a interao da luz com a matria depende da estrutura qumica dos compostos, o espectro de absoro uma forma de caracterizao que permite verificar qual a faixa de comprimento de onda em que um dado composto apresenta sua maior afinidade de absoro. Embora dois ou mais compostos possam absorver luz dentro da mesma faixa de comprimento de onda, isso no invalida a especificidade do mtodo, pois, normalmente, esta no reside no espectro de absoro. Contudo, a sensibilidade do mtodo depende da escolha do melhor comprimento de onda eletromagntica para leituras espectrofotomtricas, pois s assim poderemos detectar o composto em baixas concentraes.

Curva de absoro para Permanganato de Potssio Os resultados das leituras espectrofotomtricas de uma soluo de KMnO4 (4,5 mg/%) esto resumidos na Figura 1.8. Os dados de comprimento de onda ( ) versus absorbncia foram utilizados na elaborao da curva de absoro.

Figura 1.8 Representao da escolha do melhor comprimento de onda atravs da curva de KMnO4. Para efeito comparativo, seria conveniente construir uma curva de transmisso, ou seja, um grfico de comprimento de onda versus transmitncia. Por outro lado, o valor de melhor comprimento de onda para KMnO4 encontrado na literatura de 520 nm, sendo recomendada a faixa de comprimento de onda de 490 a 530 nm como aceitvel do ponto de vista de sensibilidade para medidas espectrofotomtricas. O melhor comprimento de onda para uma determinada soluo aquele no qual h maior absoro e, portanto, menor transmisso de luz; ou seja: maior absorbncia e menor transmitncia. Curva-padro A curva-padro corresponde relao grfica entre os valores de absorbncia (A) e os de concentrao. Com base na anlise grfica possvel verificar a linearidade da reao e calcular um fator de converso de valores de absorbncia em concentrao. Inicialmente, verificamos no espectrofotmetro a absorbncia (A) das solues cujas concentraes sejam conhecidas, por exemplo:

Com os dados obtidos foi construdo o seguinte grfico:

Curva padro de KMnO4

Quando quisermos saber a concentrao de uma soluo, acha-se a densidade tica leva-se este dado a curva, encontrando-se imediatamente sua concentrao. Fator de Calibrao : Pode-se determinar tambm a concentrao de uma soluo pela seguinte relao: ==================== Cd = Ad X FC ==================== Onde: Cd - concentrao do desconhecido Ad - absorbncia do desconhecido FC (fator de calibrao) mdia dos valores de Cp/Ap Ap - absorbncia do padro Cp - concentrao do padro
Bibliografia e Autores

Referncia Bibliogrfica utilizada:

Prticas de Laboratrio de Bioqumica e Biofsica, Guanabara Koogan, Compri-Nardy M., Stella M.B., Oliveira C. (2009), 200 pgs. Relatrios de aula Prtica das disciplinas do Departamento de Biofsica, IBIO, Ufrgs. Sites Relacionados: http://www.rsc.org/education/teachers/learnnet/spectra/index2.htm Autor do site: Marcus Fabiano de Almeida Mendes E-mail Professora coordenadora: Mara Silvera Benfato E-mail Revisores: rtur K. Schulle Fernanda S. Hackenhaar Paula R. Viacava Paulo V. G. Alabarse Tssia Meideiros Tiago B. Salomon Tradutores do vdeo sobre o aparelho de espectofotometro: Marcus Fabiano de Almeida Mendes Tiago B. Salomon Mara S. Benfato

http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/bibliografia.html