Reporte espectrofotometra y electroforesis

Objetivo El objetivo fundamental de la practica es la comprobacin de la migracin electrofortica de los aminocidos sometidos a un campo elctrico en funcin de su carga y PI asi como Adquirir los conocimientos bsicos sobre espectrofotometra de absorcin visible, conociendo la Ley de Lambert-Beer y sus aplicaciones en Qumica. Para ello se realizar un experimento en el laboratorio que muestre cmo utilizar un espectrofotmetro para llevar a cabo la determinacin cuantitativa de un compuesto de sulfato de cobre intro Por electroforesis se entiende el mtodo basado en el movimiento de iones o molculas cargadas por accin de un campo elctrico. En la Bioqumica y Biologa Molecular sirve para la separacin e identificacin de biomolculas. La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la separacin de compuestos que poseen grupos ionizables (aminocidos, pptidos, protenas, cidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Fsico Qumica de Biomolculas Licenciatura en Biotecnologa Una partcula cargada en un campo elctrico intenso esta sometida a dos fuerzas importantes, la fuerza elctrica proporcional a la carga y al campo elctrico, y una fuerza hidrodinmica de frenado debido a la viscosidad del medio, obtenida mediante la ley de Stokes. En cambio, se puede despreciar en este anlisis otra fuerza debida a la agitacin trmica llamada fuerza browniana y que causa la difusin de las partculas. La fuerza de Stokes es proporcional a la velocidad, por lo que al someter la partcula al campo elctrico, sta acelera en un lapso de tiempo muy breve hasta que las dos fuerzas queden iguales, la partcula ha alcanzado la velocidad lmite. De esta ltima, se deduce que la mobilidad electrofortica es proporcional a la carga de la molcula, pero es inversamente proporcional a su tamao (a) y a la viscosidad de la solucin Entre los distintos mtodos de electroforesis que se utilizan, cabe destacar: La electroforesis de zona, que se realiza en distintos soportes, tales como papel, acetato de celulosa, almidn, agar, poliacrilamida, etc., a bajos (6 V/cm) o altos campos elctricos (20 V/cm), y en presencia o ausencia de agentes desnaturalizantes. Emigracin Origen Origen nodo Ctodo Prediccin del comportamiento electrofortico de los aminocidos En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga elctrica, 2) su tamao, 3) la intensidad del campo elctrico y 4) la temperatura del medio. Si la molcula tiene carga positiva migrar hacia el ctodo; si tiene carga negativa, hacia el nodo.

Por tanto, a la vista de la tabla, se puede decir que al pH de 6,1 al que se realiza la electroforesis, los aminocidos neutros se quedarn en el origen, los aminocidos cidos emigrarn al nodo y los aminocidos bsicos emigrarn al ctodo.

Espectrofotometra ultravioleta visible. Ley de Lambert-Beer. Los mtodos espectroscpicos de anlisis estn basados en la medida de la radiacin electromagntica que es absorbida o emitida por una sustancia. En funcin de ello se clasifican fundamentalmente en: Mtodos de absorcin: Se basan en la disminucin de la potencia de un haz de radiacin electromagntica al interaccionar con una sustancia. Mtodos de emisin: Se basan en la radiacin que emite una sustancia cuando es excitada previamente por medio de otro tipo de energa (trmica, elctrica). Mtodos de fluorescencia: Se basan en la radiacin que emite la sustancia cuando es excitada previamente por un haz de radiacin electromagntica. Otras clasificaciones de los mtodos espectroscpicos se establecen en funcin de la regin del espectro electromagntico que interviene en la tcnica. As, pueden utilizarse regiones como rayos X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc. Dado que los primeros mtodos espectroscpicos desarrollados corresponden a la regin del visible recibieron la denominacin de mtodos pticos, la cual se utiliza todava con frecuencia. A continuacin, se ofrece una breve informacin sobre la ley de Lambert-Beer y la espectrofotometra de absorcin en la regin visible del espectro. Si se considera que se dispone de una fuente de radiacin que hace llegar a la muestra un haz de radiacin, de longitud de onda previamente seleccionada, cuya potencia es P , la muestra de
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espesor b absorbe una parte de esa radiacin incidente, de forma que la potencia del haz disminuye despus de atravesar la muestra siendo su nueva potencia P. El cociente entre la potencia de la radiacin que sale de la muestra y la de la que incidi sobre ella, se define como transmitancia: T=P/P0. La transmitancia tambin puede expresarse en tanto por ciento, multiplicando el cociente anterior por 100. Es ms frecuente utilizar el concepto de absorbancia, o densidad ptica, que se define como el logaritmo de la transmitancia cambiado de signo: A = log (P0/P) = - log T De acuerdo con estas expresiones, si la muestra no absorbe radiacin, P y P0 coinciden, por lo tanto A=0, y se transmite toda la radiacin T=1 (100% de transmitancia). Si, en otro caso, se transmite solo un 1% de radiacin (T=0.01), P=P0/100, la absorcin de radiacin que ha tenido lugar corresponde a A=2. Al incidir radiacin electromagntica visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o totalmente reflejada. En el primer caso el objeto aparecer de color negro y en el segundo de color blanco. Puesto que nosotros percibimos los objetos por

medio de la luz reflejada, si hacemos incidir un haz de luz blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, ste absorber ciertas longitudes de onda y reflejar otras, siendo stas ltimas las responsables del color. Se dice que este color (observado) es complementario del que se percibira si la luz absorbida se pudiera detectar. Dado que en la parte experimental de esta prctica las medidas van a realizarse con espectrofotometra visible, es conveniente conocer para qu longitud de onda tiene cada color su mxima absorcin, lo que se muestra en la tabla siguiente: Colores de la luz visible Longitud de onda de mxima absorcin(nm) 380-420 420-440 440-470 470-500 500-520 520-575 Color absorbido Color observado

Violeta Azul-violeta Azul Verde-azul Verde Amarillo-verde

Amarillo-verde Amarillo Anaranjado Rojo Prpura Violeta

Complicacin de la ninhidrina

La ninhidrina es un poderoso agente reactivo comn para visualizar las bandas de separacin de aminocidos por cromatografa o electroforesis, tambin es utilizada con fines cuantitativos para la determinacin de aminocidos Reacciona con todos los

aminocidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado prpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloracin producida por la ninhidrina es independiente de la coloracin original del aminocido. Esta prueba es positiva tanto para protenas como para aminocidos. en aquellos casos donde no da positiva la prueba de biuret y da positiva la de ninhidrina, indica que no hay protenas, pero si hay aminocidos libres

Es una de las reacciones mas sensibles para identificar aminoacidos en general, ya que detecta una parte de aminoacido en 1 500 000 partes de agua. Aminoacidos y muchas aminas primarias dan un color violeta caracteristico. La prolina da coloracion amarilla. Por su sensibilidad esta reaccin se emplea para valoracion cuantitativa de amonoacidos por colorimetria. La valoracion de aminoacidos en orina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatias, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se presente hiperaminoacidemia, estas se ven acompaadas por aminoaciduria paralela. Algunas enfermedades metabolicas congenitas dan lugar a la eliminacion anormal de algunos aminoacidos en la orina (p ej fenilcetonuria). Biblio Armstrong, F Bioqumica. Editorial Reverte, S.A. Barcelona Espaa. 1982