Introduo: O primeiro mtodo oficializado do teste de esterilidade teve origem na Inglaterra, em 1932 e exigia a execuo do teste em produtos sob

a forma lquida. Mediante utilizao do caldo peptonado e incubao a 37C durante 5 dias, com vistas a deteco de bactrias aerbicas, metodologia que sofreu inovaes posteriores, de maneira a aumentar a segurana dos resultados. Como pode ser observado pela evoluo da metodologia, a preocupao inerente melhoria de testes de esterilidade visa a verificar com mais segurana a qualidade do processo esterilizante, empregado durante a fabricao de medicamentos estreis, bem como manipulao asspticas, levando-se em considerao respectivamente o aspecto probabilstico da esterilizao e o risco da re-contaminao.

Condies de trabalho: Para o teste de esterilidade tenha validade, a qualidade do ambiente de execuo do ensaio importante, devendo ser muito bem controlada e conhecida, a fim de evitar resultados falso-positivos. A rea para execuo do teste, com antecmara, consiste em compartimento pequeno, de fcil limpeza e desinfeco. As paredes no devem apresentar irregularidades de superfcie, a fim de impedir a deposio de partculas. provida de sistema de alimentao de ar filtrado no teto, com presso positiva, podendo ter lmpadas germicidas. A utilizao destas deve ser criteriosa, no sentido de proteger os operadores, bem como obter eficcia adequada durante o seu uso. de suma importncia o controle de efetividade das mesmas, em funo do tempo de uso, pois em mdia o nmero de horas teis varia de 6.000 a 7.000. Estas salas devem ser periodicamente limpas e desinfetadas, de modo a obter condies ideais para a execuo do teste. As salas convencionais chegam a apresentar at 300.000 partculas por p cbico de ar, cujos limites devem ser da ordem de 120.000. Regra geral, efetua-se a exposio de placas de Petri contendo nutrientes em ambientes asspticos, embora o resultado apresente pouca informao sobre a verdadeira contaminao vivel. Outra possibilidade ser a filtrao direta do ar, ou antecedida de lavagem do mesmo em lquido fisiolgico estril, atravs de membrana esterilizante, seguida de semeadura do filtro na superfcie do nutriente adequado. Nas salas para execuo de trabalhos asspticos, a contaminao microbiana no devem ser superior a 15 partculas viveis por metro cbico de ar, nmero este que deve ser bem inferior quando existir recurso de filtrao absoluta, e sistema de fluxo

laminar. Por outro lado, a superfcie de equipamentos deve ter contaminao inferior a 12 clulas por metro quadrado. Vrios autores estudaram a correspondncia entre a classificao das salas segundo o US Federal Standard 209E e a contagem de partculas viveis, demonstrando haver correlao. Estes dados so de suma importncia, visto que a contagem de partculas informa, no ato da determinao, o nvel de contaminao microbiana, enquanto que o mtodo que requer incubao d resultados posteriores ao momento da utilizao do ambiente. No Brasil, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) adota hoje, na Resoluo n 17 de 16 de abril de 2010, o sistema de classificao para reas limpas baseado no GMP, onde a classe 100 (M3.5) corresponde s Classes A e B, a classe 10.000 (M5.5) corresponde Classe C, e a classe 100.000 (M 6.5) corresponde Classe D. Para fins de teste de esterilidade, so empregados mdulos pequenos, do tipo capela, com fluxo laminar horizontal, que devem ser mantidas em sala limpa. O teto da capela de fluxo laminar deve ser limpo diariamente com fenol 10%, ou outro agente de ao comprovadamente eficaz. O cho da sala contendo este mdulo deve ser limpo semanalmente, e as paredes, mensalmente. Antes do uso, deve ser preparada deixando o equipamento em funcionamento durante 15 a 30 minutos. O operador outro fator a ser considerado como fonte de contaminao, o treinamento dos operados de importncia fundamental. A utilizao adequada de indumentrias prprias contribui para diminuio de risco de contaminao durante o teste.

Amostragem: Sendo o teste de esterilidade um ensaio limite, exige-se critrio de amostragem que procure oferecer segurana no resultado final, quando extrapolado ao lote. Portanto, a retirada de amostras a serem submetidas ao teste deve estar relacionada com a fase de processamento, visto que este ensaio complementa as informaes sobre a perfeita execuo de cada processo operacional esterilizante e/ou manipulao assptica de produto. Em se tratando de matria-prima, cada embalagem deve ser submetida a amostragem. Por outro lado, a abertura de todos os frascos de matria-prima estril nem sempre possvel, tanto no aspecto econmico e de praticidade. Outros aspectos importantes devem ser considerados no que diz respeito ao critrio de amostragem dos produtos manipulados pela indstria farmacutica. No caso de envasamento assptico, o lote conceituado como sendo o total de unidades

decorrente de uma operao de enchimento. Em se tratando de esterilizao contnua, como acontece com os equipamentos cirrgicos embalados e expostos radiao durante certo tempo, o lote para fins de teste de esterilidade pode corresponder a ao conjunto de unidades processado num certo intervalo de tempo.

Preparo da amostra: A execuo do teste de esterilidade em produtos farmacuticos deve ser precedida de preparao das amostras, de maneira a evitar resultados falsos. Consiste em efetuar um tratamento, visando desinfeco da superfcie externa dos frascos, ampolas, ou outros materiais de acondicionamento e o ou embalagem, pelo uso de solues antisspticas volteis ou no, tais como fenol a 5%, lcool iodado, formaldedo a 5%, lcool isoproplico etc. Este tratamento, em funo da natureza da substncia e da concentrao utilizada, exige um tempo de contato, este contato pode dar-se por imerso dos recipientes amostrados nestes antisspticos, ou por nebulizao dos mesmos.

Mtodo de inoculao: So adotadas duas possibilidades de inoculao da amostra ao meio de cultura, qualquer que seja a forma de inoculao da amostra, fundamental que se avalie e comprove a sua no interferncia, ocasionando falso-positivo.

Inoculao direita: Este mtodo utilizado desde a oficializao inicial da prova de esterilidade, em 1932 at os dias atuais. Consiste na inoculao de quantidades ou volumes prestabelecidos da amostra em volumes estipulados de diversos meios de cultura, na forma lquida ou mediante semeadura da amostra em nutriente slido. Portanto, com esta tcnica deve haver, de cada unidade, uma tomada de ensaio, a qual ser introduzida num tubo de ensaio ou frasco contendo meio de cultura previamente esterilizado e controlado quanto ausncia de contaminao e comprovado quanto capacidade promotora de crescimento. O mtodo de inoculao direta simples e de fcil execuo, porm, conforme a natureza da amostra, exigem-se recursos intermedirios, a fim de que o resultado do teste seja vlido.

Inoculao indireta: Esta tcnica foi introduzida em 1957, por Holdowsky, e seguida de estudos por diversos pesquisadores. Baseia-se no tratamento prvio da amostra com solubilizao, ou lavagem em lquido fisiolgicos, seguida de filtrao esterilizante e inoculao da membrana filtrante no meio de cultura. Com isso, o produto testado no entra em contato com o meio de cultura. Dados comparativos entre a inoculao direita e indireta de antibiticos mostravam grande eficincia na deteco de contaminantes viveis nestes produtos, quando testados pelo mtodo de filtrao. Hoje ressalta-se a importncia do mtodo indireto em sistemas fechados, incorporados oficialmente na USP XXIII(USP,1947) e apresentado significativas vantagens comparativamente ao mtodo convencional. A membrana filtrante empregada constituda de estres de celulose, ou de materiais sintticos que resistam, por exemplo, a produtos oncolgicos extremamente agressivos, com dimetro de 47 mm, de borda hidrofbica e tamanho de poro de 0,45+/- 0,02 um. Existe certa divergncia na escolha de filtros para uso industrial e laboratorial do teste, pois, no primeiro caso emprega-se, geralmente, o de 0,22 um, enquanto que, em provas de esterilidade, o de 0,45 um. O comparativo das caractersticas das membranas de 0,22 um e 0.45 um aponta para a primeira, uma reteno absoluta, importante na obteno de filtrado estril, porm uma vazo lenta. A membrana de 0,45 mm ainda eficaz na reteno de microrganismos, pois o seu objetivo analtico e no de remoo esterilizante. Da ser a opo de escolha para o teste de esterilidade. Na utilizao destas membranas, o requisito primordial que satisfaam os testes de reteno microbiana e de integridade. O primeiro teste, de natureza destrutiva, deve ser aplicado ao material, a fim de comprovar sua eficincia filtrante. De forma igualmente sumria, relativamente s caractersticas negativas e positivas do mtodo indireto, deve-se dizer que, como desvantagem, apresenta maior nvel de manipulao e preparaes prvias, exige maior treinamento tcnico, impedimento de aplicao para suspenses, leos, cremes e pomadas no solubilizveis e aumento o risco de falso-negativos.