Ing. Mg.

Ricardo Rodriguez Vilchez

Introduccion
En ocasiones al ver una serie en la t.v.; de las policacas o de mdicos donde se hacen anlisis a pequeas muestras para averiguar si hay DNA y si este coincide con el de la vctima o con el malo, o si cierta sustancia puede afectar a la salud, etc.., entonces uno ve que los investigadores hacen una serie de estudios con las muestras, que en ocasiones son muy pequeas, y dan resultados; en la vida real sucede algo similar; cuando se tiene en el laboratorio, en una solucin, presencia de color, o cuando se sabe que hay ciertas cantidades de algn elemento pero no se sabe cuanto, se genera la inquietud de saber que elemento es, en que cantidad est y es entonces que se producen una serie de preguntas, tales como: COMO LO MIDO? y otras ms, entre ellas pueden estar: Qu es la luz?, qu es longitud de onda, cmo se mide?, que relacin hay entre luz y color?; para que sirve esto?, de qu manera se mide una solucin coloreada?. En este trabajo se propone de orientar de manera sencilla, sobre este tema tratando de dar una idea fundamental de las preguntas anteriores y otras ms que se hacen en torno al tema que se est presentando; espero este trabajo sea til tanto a profesores como alumnos para orientarse y poder entender ms acerca de la espectrofotometra a nivel laboratorio de ciencias biolgicas.

Espectroscopa
Caractersticas de la Luz Colores Qu es longitud de Onda?

Relacin entre frecuencia, velocidad y longitud de onda

Absorcin / Absorbitividad Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometra

Colorimetra y Espectrofotometra como procedimientos analticos

Fotocolormetro ESPECROFOTMETRO Curva Patrn

Referencias e Imgenes

La espectroscopia es el estudio del espectro de la luz que emiten los cuerpos, sustancias y elementos. De este estudio se puede conocer la composicin, temperatura, densidad, velocidad de desplazamiento y otros factores que les son propios y componen a estos cuerpos, sustancias o elementos

La luz tiene una naturaleza dual: Como onda Como una corriente de partculas o paquetes de energa (fotones)

Albert Einstein desarroll en 1905 la teora de

que la luz estaba compuesta de unas partculas denominadas fotones, cuya energa era inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz.

3 1 Foton

La teora electromagntica de la luz propuesta por Maxwell: La perturbacin que se propaga como ondas de luz est formada por fuerzas elctricas y magnticas, y la perturbacin se produce en cargas elctricas en movimiento.

Efecto de la emisin electromagntica

El efecto fotoelctrico demuestra el comportamiento de la luz como partcula (grnulos o corpsculos)

La naturaleza corpuscular de la luz se observa en fotos de objetos iluminados muy dbilmente.

La imagen se forma punto a punto, y muestra que la luz llega a la pelcula fotogrfica por unidades separadas que los producen.

Estos descubrimientos dieron origen a toda la tecnologa moderna de telecomunicaciones como la televisin

En estas imgenes se puede apreciar, debido a la toma fotogrfica los elementos puntuales que apoyan a esta teora

Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos una amplia gama de colores que, por lo general, se deben a la mezcla de luces de diferentes longitudes de onda. Se conoce como color puro al color de la luz con una nica longitud de onda o una banda estrecha de ellas.

Cuanto ms larga la longitud de onda de la luz visible tanto ms rojo el color. Asimismo las longitudes de onda corta estn en la zona violeta del espectro.

As todos los elementos existentes poseen un espectro ***

Hay varios tipos de espectros, los ms comunes son los espectros continuos, espectros de emisin y los espectros de absorcin. Si es colocado frente al espectroscopio se podr ver, un elemento: En situaciones en las que se le somete altas temperaturas y presiones y no se presentan lneas obscuras se trata de un espectro continuo. En situaciones normales y se observan unas lneas de colores frente a un fondo negro, se trata de un espectro de emisin. Y por ltimo si sucede la primer situacin y entre el elemento afectado y el espectroscopio se coloca un elemento a menor temperatura que el primero, se obtiene el espectro de absorcin

La luz blanca produce al descomponerla lo que se llama un espectro continuo, que contiene el conjunto de colores que corresponde a la gama de longitudes de onda que la integran.

Todos los elementos poseen un espectro propio, que se puede medir al someterse a temperaturas elevadas ya que producen espectros discontinuos .

**Para ver espectros de la tabla peridica buscar en esta pgina http://site.ifrance.com/okapi/quimica.htm **

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de onda ( = lambda).

CARACTERSTICAS DE LAS ONDAS

nodo

La longitud y la frecuencia de onda son inversamente proporcionales y se relacionan mediante la siguiente ecuacin

U.V.

L u z v i s i b l e

X GAMMA

350 nm

750 nm
Infrarrojo
Microondas Radio

La luz visible es slo una pequea parte del espectro electromagntico con longitudes de onda que van aproximadamente de 350 nanmetros hasta unos 750 nanmetros
<nanmetro, nm = milmillonsimas de metro>.

La luz blanca est compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda

As la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de onda visibles. En el espectro visible, las diferencias en longitud de onda se manifiestan como diferencias de color.

La distribucin de los colores se determina por la longitud de onda de cada uno de ellos.

Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les conoce como infrarrojas y las mas cortas que el violeta, ultravioletas.

Ultravioleta

Luz visible

Infrarrojo

102 -104

~ 104

104-107

UV Violeta Azul 4000 A

Verde Amarillo Naranja Rojo Espectro Visible

IR 7500 A

Relacin entre frecuencia, velocidad y longitud de onda*

Frecuencia natural Cualquier objeto oscilante tiene una 'frecuencia natural', (vibracin en ausencia de perturbacin).

frecuencia es el Nmero de vibraciones por segundo

As Frecuencia, es nmero de veces que la onda se repite por segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

Quin es HERTZ?

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemn que construy un dispositivo para generar y detectar en un laboratorio ondas electromagnticas, demostrando su existencia as como, se reflejan estas ondas, se refractan y se comportan como las ondas de luz
Estim que la frecuencia f de la onda era de alrededor de 3 x 107 Hz. Y determin que su longitud l era de 10 m. Con estos valores estableci que la velocidad v de la onda es

v = f l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s
o sea, la velocidad de la luz.

1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u oscilacin por segundo. (1 Hertz = 1 ciclo/seg) Un kilohercio (kHz) = mil de ciclos por segundo Un megahercio (MHz) = un millon de ciclos por segundo Un gigahercio (GHz) = mil millones de ciclos por segundo

Un pndulo de 1 m de longitud presenta una frecuencia de 0,5 Hz, es decir que el pndulo va y vuelve una vez cada 2 segundos.

Longitud de onda = velocidad de propagacin / frecuencia

l= c / u
Donde c = vel. de la luz en m. por seg.

c = l . u (m-1s-1) u=c/l

Frec = Vel / l
Como la luz viaja a una velocidad de 3 x 108 m/s

Freclimite luz visible = 3x108 (m/s) / 10-6 (m)=

3x1014 Hz Es decir: 300 000 000 000 ciclos por segundo

Relacin entre Medidas en valores Hertz y Metros

Las ondas electromagnticas de frecuencias extremadamente elevadas, como la luz o los rayos X, suelen describirse mediante sus longitudes de onda, que frecuentemente se expresan en nanmetros. Un ejemplo es: Una onda electromagntica con una longitud de onda de 1 nm tiene, aproximadamente una frecuencia de 300 millones de GHz.

l= vel / u
El sonido se propaga a una velocidad de 340 m cada segundo

La nota La tiene una frecuencia de 440 Hz l = 340 (m/s) / 440 Hz (ciclos por seg) = 0.77 m

4 x 10-5 cm = 400 nm (luz violeta) 7 x 10-5 cm = 700 nm (luz roja)

Algunas equivalencias 1m 0.001 mm 10-6 m

nm = mm

0.001m

10-9 m

0.0001m = 0.1 nm

10-10 m

Comparacin de las mediciones de las longitudes de onda con la luz visible.

El color de un cuerpo depende de la luz que recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el color rojo se d cuando absorbe en casi su totalidad, todas las radiaciones menos las rojas, las cuales refleja o deja pasar dependiendo su estructura (slida o transparente).

La energa UV es mayor que, cualquier color del espectro visible. Sin embargo los rayos X son ms energticos que la luz UV, como se puede apreciar por su longitud de onda.

Con base a lo anterior se puede entender que existe una relacin inversa entre la longitud de onda y la energa del fotn correspondiente.

Entonces, las energas en el rango ultravioleta-visible excitan los electrones a niveles de energa superiores dentro de las molculas y las energas infrarrojas provocan solo vibraciones moleculares

El color percibido de una solucin depende de la combinacin de colores complementarios que la atraviesan

Proceso de Absorcin La energa de excitacin a una molcula proveniente de un fotn durante el proceso de absorcin se representa as: donde: A es el absorbente en su estado de energa bajo, A* es el absorbente en su nuevo estado de excitacin energtica hn representan a la constante de Planck y la frecuencia respectivamente A + hn A* A + calor

 La energa del fotn incidente posee una longitud de onda (l)

A* es inestable y rpidamente revierte a su estado energtico ms bajo, perdiendo as la energa trmica correspondiente. La absorcin de determinadas longitudes de onda depende de la estructura de la molcula absorbente (absortividad, a)

Cuando un rayo de luz monocromtica con una intensidad I0 pasa a travs de una solucin, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor que I0 Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

a = absortividad

I0
b Longitud del medio absorbente
o ancho de la celda

I
c = concentracin
(nmero de partculas por cm3)

Absortividad (a)
a es una constante de proporcionalidad que comprende las caractersticas qumicas de cada compuesto, o molcula y su magnitud depende de las unidades utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentracin en moles por litro y la trayectoria a travs de la celda en centmetros, la absortividad se denomina absortividad molar y se representa con el
smbolo

En consecuencia cuando b se expresa en centmetros y c en moles por litro. A = bc

Donde A representa la absorbancia del compuesto

Las leyes de Lambert y Beer *

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz monocromtica (I0) pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente (I) a medida que la longitud del medio absorbente aumenta

I = I0e-ab
I0
1 cm.

I0
2 cm.

I0
3 cm.

Ancho de la celda

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentracin del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac

I0

I0

I0

Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert donde la fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absorbida por la muestra.

Ley de lambert Beer:

I = I0
Si despejamos:

-abc e

I/I0 = e-abc

Al cociente de las intensidades se denomina Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:

Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:

Log10 I/I0 = 2.303 abc

Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relacin entre la intensidad de luz transmitida por una muestra problema (I) con la intensidad de luz incidente sobre la muestra (I0):

T = I / I0
Se expresa como % T

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido b a travs de la solucin y la concentracin c del color absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = abc

A menudo b es dada en trminos de cm. y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene unidades de lg1cm1.

Qu relacin guardan la transmitancia y la absorbancia?

De acuerdo a las caractersticas de la sustancia analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la solucin
LUZ A B S O R B I D A

Luz transmitida

I0

T = I/I0

Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitancia

Absorbancia contra concentracin (comportamiento lineal)
Absorbancia

Concentracin

% Transmitancia contra concentracin (pendiente con signo negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentracin

Absorbancia

De loA anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en base diez del recproco de la transmitancia (T) o bien al log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o (blanco) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 log10 T = log10 T

mg

La representacin grfica correspondiente a absorbancia y transmitancia en un gradiente de concentraciones es la siguiente:

bc
Concen tracin

Obtencin de TRANSMITANCIA utilizando valores de

Absorbancia

Con base en la relacin:

T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%) %T = 10-abc x 100. Aplicando logaritmos a la expresin anterior log10 %T = -abc log Invirtiendo trminos log %T = log10 100 -abc log log10 %T = 2 abc
10 10

10 + log10 100

10 = 2 abc * 1

Como abc = Absorbancia = A

log10 %T = 2 A.

Se le llama espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un conjunto de elementos o un elemento en su estado puro, en funcin de la longitud de onda de la radiacin lumnica y a las mediciones a una determinada longitud de onda.

* Arco iris en Marte

Cmo se puede medir la radiacin que emiten o absorben los cuerpos?.

Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiacin, es decir, de separar la radiacin en sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrgrafo, y Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrmetro. Cuando es capaz de medir tambin la intensidad de la radiacin, se llama espectrofotmetro.

Espectroscopio

1817

Espectgrafo

Espectmetro

De fluorescencia

Imagen de Marte vista con ayuda de espectmetro de rayos Gamma

De Emisin ptica Para metales

Colorimetra y Espectrofotometra como procedimientos analticos *

Las tcnicas colorimtricas se fundamentan con la medicin de la absorcin de radiacin visible por sustancias coloreadas. Sin

determinar

embargo,

necesario llevar a cabo un tratamiento de color empleando substancias que que reaccionen de forma proporcional con el compuesto de inters

cuando una muestra a no posee coloracin, es

Las diferentes sustancias se analizan mediante reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la concentracin de la sustancia a analizar mayor es el color de la reaccin.

Tambin es posible leda cuando su encuentra en las espectro, como las UV o Infrarroja

que la muestra pueda ser espectro de absorcin se regiones no visibles del referentes a las regiones de

Visn de las abejas

Orbitas de TITAN

Casiopea A: ecos de luz en infrarrojo

La diferencia entre colorimetra espectrofotometra consiste en el tipo

instrumental empleado:

y
de

El colormetro es un aparato en los que la longitud de onda se selecciona por medio de filtros pticos que son insertados en este.

En el espectrofotmetro la longitud de onda es seleccionada mediante dispositivos monocromadores los cuales estn integrados a la mquina.

Algunos de los procedimientos colorimtricos o espectrofotomtricos con los que se cuenta para precisar la concentracin de una sustancia en solucin son los siguientes:

Referencia de color
Espectrofotmetro

Un espectrofotmetro es un instrumento que descompone un haz de luz (haz de radiacin electromagntico), separndolo en bandas de longitudes de onda especficas, formando un espectro atravesado por numerosas lneas oscuras y claras, semejante a un cdigo de barras del objeto, con el propsito de identificar, calificar y cuantificar su energa

Distribucin de la luz en el espectrofotmetro

Espectrofotmetro Mecanismo Interno

Met.Cient. I

COLOR

LONGITUD DE ONDA (l)

Rojo (R) Verde (G)

700 nm 546.1 nm 435.8 nm

Azul (B)

Es usual que al seguir una receta para la determinacin de la concentracin de un compuesto en particular se indica una longitud de onda (l) especfica a la que hay que leer con el colormetro o espectrofotmetro.
Porque leer a diferentes l (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes?

La explicacin radica en el hecho de que cada producto qumico se caracteriza por zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor intensidad conformando en su conjunto el espectro de absorcin de tal sustancia.

Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorcin caracterstico

Absorbancia

l Las longitudes de onda con mayor absorcin (picos) correspondern de forma general a aquellas con las que se leer la muestra para determinar su concentracin
Absorbancia

l La relacin entre la absorbancia por una sustancia a una l determinada y su concentracin es directamente proporcional es decir: a mayor concentracin mayor proporcin de luz absorbida.

Absorbancia

Conc.

As, el espectro de absorcin de la clorofila es:

Colorante comn, la Rodamina 6G

en Metanol..

Espectro de Absorcin (lnea contnua) y Espectro de Transmisin (lnea discontnua).

celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismtica

Se asume que el tubo, celda o cubeta en la cual se vierte la solucin a leer no debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un comportamiento constante ante la variacin de la longitud de onda es comn que las celdas del espectrofotmetro o colormetro sean de este material .

Curva Patrn
El razonamiento para el determinacin de una desconocida es: proceso de concentracin

A partir de concentraciones conocidas de las cuales tambin se sabe su absorbancia (curva patrn), es posible interpolar (intercalar) la concentracin del problema sabiendo su absorbancia (lnea roja en figura siguiente)

CURVA PATRN
0.6

0.5

A B S 0 R B A N C I A

Absorbancia del problema

0.4

0.3

0.2

Interpolacin
0.1

0 0 2 4 6 8 10 12

Concentracin mg/lt

Con base en que la Absorbancia guarda una relacin lineal con la concentracin, se comprende la existencia de una relacin de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentracin:

Donde: A1 = Absorbancia del problema. A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin conocida. C1 = Concentracin del problema. C2 = Concentracin del estndar. Si despejamos C1 = Conc del problema
A1 (problema) * Conc estndar Conc. (problema) = A2 (estndar)

A1 / A2 = C1 / C2

Un aspecto importante de la evaluacin espectrofotomtrica, es que muchas molculas orgnicas no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo Por lo que es comn, actualmente, que la mayora de los espectrofotmetros, actuales, se encuentren provistos con lo necesario para leer en de tales intervalos
As, los grupos carbonilo presentes en los aldehdos (RCHO), cetonas (RCOR), cidos carboxlicos (RCOOH), l steres (RCOOR) y amidas (RCONHR) dan lugar a absorciones intensas en la regin del espectro de infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.

Absorciones mximas (picos de absorcin) de algunos compuestos que absorben en la regin ultravioleta:

Grupos funcionales cuyos picos de absorcin se localizan en la regin del infrarojo

CUIDADOS
Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados. El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un pao limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla. La cubeta se sujeta por los lados opacos. La cantidad a adicionar es, mximo, hasta partes de la cubeta No se deben derramar lquidos, sobre todo solventes, cidos o lcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede daar parte del mecanismo Se debe mantener, el espectrofotmetro, limpio y libre de humedad.