MARIANA KIKUTI

ACOMPANHAMENTO DA ROTINA LABORATORIAL DO SERVIO DE DIAGNSTICO DE ZOONOSES (SDZ) DE 6 DE JULHO A 30 DE SETEMBRO DE 2009

CURITIBA

2009 MARIANA KIKUTI

ACOMPANHAMENTO DA ROTINA LABORATORIAL DO SERVIO DE DIAGNSTICO DE ZOONOSES FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO

Trabalho apresentado como um dos prrequisitos para concluso do Curso de Medicina Veterinria da Universidade

Federal do Paran. Supervisor: Prof. Dr. Alexander Welker Biondo Orientador: Prof. Dr. Hlio Langoni

CURITIBA

2009

Dedico

meu

trabalho

pessoas que sempre fizeram tudo por mim e pela minha felicidade, meus pais.

AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente aos meus pais, que sempre lutaram para me dar todas as oportunidades possveis, sempre me apoiaram em todas as decises e me aconselharam quando precisei e me ajudaram em cada parte da minha trajetria pessoal e profissional. So neles que eu me espelho para sempre ser uma pessoa melhor em todos os aspectos. Ao Igor, que esteve ao meu lado por toda a minha trajetria nesta etapa importante da minha vida, me incentivando, me aconselhando e me inspirando a ser sempre melhor, assim como toda a minha famlia, em especial minha tia Mara. Aos professores membros da banca, Prof. Alexander Welker Biondo, que no s me orientou durante os anos de graduao como me incentiva a sempre querer mais, Prof. Walfrido Khl Svoboda, que me co-orientou na iniciao cientfica e me inspirou ainda mais a apreciar a Sade Pblica, ao Prof. Antnio Waldir Cunha da Silva, que esteve presente em muitos dos projetos desempenhados, e Prof. Mrcia de Oliveira Lopes, sempre disposta a colaborar e ajudar os alunos. Ao meu supervisor de estgio, Prof. Dr. Hlio Langoni, pelas oportunidades que me foram cedidas durante todo o estgio, as orientaes e pela inspirao para sempre fazer o melhor. Aos demais colegas de trabalho durante o estgio, aos residentes Rozeani Olimpio Tom, Felipe Fornazari, Fernanda Conceio Gaio e Diego Generoso, pelos ensinamentos do dia-a-dia do estgio. Ao tcnico Benedito Donizeti Menozzi, com quem aprendi muito, e aos demais estagirios. Meus sinceros agradecimentos Leila, que gentilmente me hospedou em sua casa durante este perodo e fez muito alm, me orientando, me supervisionando e me incentivando a melhorar cada vez mais no estgio. Selene, que tambm se tornou uma pessoa muito querida por mim, assim como Luciana.

A todos os amigos, colegas, professores e funcionrios da Universidade Federal do Paran, que sem dvida fizeram parte desta minha conquista. A todos os meus colegas de classe, com quem tive o prazer de conviver durante estes anos de graduao, e tambm Camila e Maysa que me ajudaram distncia com as documentaes enquanto estive em estgio curricular. A todos os funcionrios do Hopital Veterinrio da Universidade Federal do Paran, ao Prof. Luiz Felipe Caron e Prof. Lucy Ono pela orientao e superviso durante o estgio no Departamento de Microbiologia, ao Prof. dson Prisco pela oportunidade de estgio na Anatomia Topogrfica, ao Dr. Roberto Lange e todos os demais Mdicos Veterinrios e funcionrios da Clnica Santa Mnica, ao Prof. Alexander Biondo e demais co-orientadores dos Projetos de Extenso, s Mdicas Veterinrias Maria do Carmo Pessa e Elzira Jorge Pierre da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado do Paran, e ao Mdico Veterinrio Paulo Arajo Guerra e todos os demais funcionrios da Diviso de Zoonoses da Secretaria de Estado de Sade do Paran. Todos vocs foram fundamentais no s pelo meu aprendizado, mas como modelo do tipo de profissional que eu quero ser.

O futuro pertence queles que acreditam na beleza de seus sonhos. Elleanor Roosevelt

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS........................................................................................... iii LISTA DE GRFICOS........................................................................................iv LISTA DE TABELAS ...........................................................................................v LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................vi LISTA DE SMBOLOS.......................................................................................vii RESUMO.......................................................................................................... viii 1. INTRODUO ............................................................................................... 1 2. OBJETIVO GERAL........................................................................................ 2 3. OBJETIVOS ESPECFICOS.......................................................................... 2 4. DESCRIO DO ESTGIO .......................................................................... 3 4.1 SERVIO DE DIAGNSTICO DE ZOONOSES ....................................... 3 4.2 CASUSTICA............................................................................................. 7 4.3 DIAGNSTICO DE DOENA DE CHAGAS ........................................... 12 4.3.1 INTRODUO.................................................................................. 12 4.3.2 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA........................ 13 4.4 DIAGNSTICO DE LEISHMANIOSE ..................................................... 15 4.4.1 INTRODUO.................................................................................. 15 4.4.2 PREPARO DE ANTGENOS ............................................................ 17 4.4.3 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA........................ 17 4.4.4 OBSERVAO DIRETA DO AGENTE............................................. 19 4.4.5 ISOLAMENTO EM MEIO DE CULTURA .......................................... 20 4.4.6 DIAGNSTICO MOLECULAR ......................................................... 21 4.5 DIAGNSTICO DE LEPTOSPIROSE..................................................... 23 4.5.1 INTRODUO.................................................................................. 23 4.5.2 MANUTENO DO ANTGENO ...................................................... 25 4.5.3 SOROAGLUTINAO MICROSCPICA......................................... 27 4.5.4 OBSERVAO DO AGENTE EM MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO ................................................................................................................... 29 4.6 DIAGNSTICO DE NEOSPOROSE....................................................... 30 4.6.1 INTRODUO.................................................................................. 30
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4.6.2 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA........................ 31 4.7 DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSE .................................................. 33 4.7.1 INTRODUO.................................................................................. 33 4.7.2 MANUTENO DAS CEPAS........................................................... 34 4.7.3 PREPARO DOS ANTGENOS ......................................................... 35 4.7.4 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA........................ 35 4.7.5 ISOLAMENTO DO ANTGENO ........................................................ 37 4.8 DIAGNSTICO DE RAIVA ..................................................................... 38 4.8.1 INTRODUO.................................................................................. 38 4.8.2 COLHEITA E ENVIO DO MATERIAL SUSPEITO ............................ 41 4.8.3 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA ........................... 41 4.8.4 PROVA BIOLGICA......................................................................... 44 4.9 DIAGNSTICO DE ANEMIA INFECCIOSA EQUINA ............................. 46 4.9.1 INTRODUO.................................................................................. 46 4.9.2 RECEBIMENTO DE AMOSTRAS..................................................... 47 4.9.3 IMUNODIFUSO EM GEL DE GAR .............................................. 48 5. DISCUSSO ................................................................................................ 50 6. CONSIDERAES FINAIS ......................................................................... 51 7. REFERNCIAS............................................................................................ 51 8. PREVENTING RABIES TRANSMITTED BY BATS IN RAIN FOREST PRESERVED AREAS OF SOUTHERN BRAZILIAN COAST ......................... 55 9. ANEXO......................................................................................................... 63 9.1 NORMAS PARA SUBMISSO DE ARTIGO COMPLETO DA REVISTA ZOONOSES AND PUBLIC HEALTH ............................................................ 63

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Localizao da cidade de Botucatu no estado de So Paulo ........... 6 Figura 2 Departamento de Veterinria e Sade Pblica................................. 6 Figura 3 Servio de Diagnstico de Zoonoses, sala 1 .................................... 6 Figura 4 Servio de Diagnstico de Zoonoses, sala 2 .................................... 7 Figura 5 Servio de Diagnstico de Zoonoses, sala 3 .................................... 7 Figura 6 Trypanosoma cruzi ......................................................................... 13 Figura 7 Disposio das diluies do soro na lmina para diagnstico de doena de chagas ......................................................................................................... 15 Figura 8 Distribuio das diluies do soro na lmina para diagnstico de Leishmaniose ................................................................................................... 19 Figura 9 Reao de imunofluorescncia indireta positiva para Leishmaniose ......................................................................................................................... 19 Figura 10 Formas amastigotas de Leishmania encontradas em imprint de bao corado com Pantico rpido ............................................................................. 20 Figura 11 Macerao de fragmento de rgo com pistilo ............................. 21 Figura 12 Ciclos realizados no termociclador para diagnstico molecular de Leishmaniose ................................................................................................... 22 Figura 13 Imagem digital do gel capturada pelo transluminador .................. 23 Figura 14 Amostra reagente para Leptospirose na prova de soroaglutinao microscpica .................................................................................................... 29 Figura 15 Disposio das diluies do soro para diagnstico de Neosporose ......................................................................................................................... 32 Figura 16 Distribuio das diluies do soro na lmina para diagnstico de Toxoplasmose .................................................................................................. 37 Figura 17 Amostra positiva para Toxoplasmose no diagnstico por imunofluorescncia indireta .............................................................................. 37 Figura 18 Imprint de material cerebral para diagnstico de Raiva................ 43 Figura 19 Regies para realizao do imprint na lmina de imunofluorescncia para diagnstico de Raiva ................................................................................ 43 Figura 20 Remoo do excesso de material da lmina com papel filtro....... 43 Figura 21 Amostra positiva para Raiva observada em microscpio de imunofluorescncia .......................................................................................... 44

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Figura 22 Macerao do material cerebral suspeito de Raiva para inoculao em crebro de camundongo................................................................................... 45 Figura 23 Inoculao de material suspeito de Raiva em crebro de camundongo ......................................................................................................................... 46 Figura 24 Camundongos inoculados com material positivo para Raiva apresentando plos arrepiados, paralisia e morte............................................ 46 Figura 25 Distribuio do gel de Agar em lmina para diagnstico de Anemia Infecciosa Equina ............................................................................................. 49 Figura 26 Utilizao do furador para o preparo de lmina para diagnstico de Anemia Infecciosa Equina ................................................................................ 49 Figura 27 Protocolo para lmina de diagnstico de Anemia Infecciosa Equina ......................................................................................................................... 50

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Casustica de exames diagnsticos realizados pelo Servio de Diagnstico de Zoonoses de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 ........................................................................................................................... 9 Tabela 2 Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Leishmaniose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 ................................... 9 Tabela 3 Casuistica de exames de pesquisa direta de amastigotas para diagnstico de Leishmaniose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 ................................................................................................................... 9 Tabela 4 Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Leptospirose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 .................................. 10 Tabela 5 Casuistica de exames de campo escuro para diagnstico de Leptospirose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009........ 10 Tabela 6 Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Neosporose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 .................................. 10 Tabela 7 Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Toxoplasmose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 .................................. 11 Tabela 8 Casuistica de exames de imunofluorescncia direta para diagnstico de Raiva no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 ................... 11 Tabela 9 Casuistica de provas biolgicas para diagnstico de Raiva no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009 .................................................... 11

LISTA DE ABREVIATURAS

SDZ - Servio de Diagnstico de Zoonoses FMVZ Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia UNESP Universidade Estadual Paulista AIDS Sndrome da Imunodeficincia Aquirida USP Universidade de So Paulo Unicamp Universidade Estadual de Campinas ICMS Imposto sobre Circulao de Mercadorias e Servios Enade Exame Nacional de Desempenho dos Estudantes NUPEZO Ncleo de Pesquisa em Zoonoses NUPEMAS Ncleo de Pesquisa em Mastites rpm Rotaes por Minuto RIFI Reao de Imunofluorescncia Indireta ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay SST Soluo Salina Tamponada LV Leishmaniose Visceral LIT Liver Infusion Tryptose NNN McNeal, Novy & Nicolle PCR Reao em Cadeia da Polimerase DNA cido Desoxirribonucleico EMJH Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris HCl cido Clordrico RNA cido Desoxirribonucleico RID Reao de Imunofluorescncia Direta UI Unidades Internacionais CVS Challenge Virus Standard CN Crebro Normal ICC Inoculao em Crebro de Camundongo
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pH Potencial Hidrogeninico AIE Anemia Infecciosa Equina CRMV Conselho Regional de Medicina Veterinria IDGA Imunodifuso em Gel de gar pb Pares de Base UV Ultra-violeta mL Mililitros ng Nanograma mM - Milimol V - Volt

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LISTA DE SMBOLOS % - Porcento m2 Metros quadrados C Graus Celsius L Microlitros

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RESUMO O estgio curricular no Servio de Diagnstico de Zoonoses, da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho consistiu no treinamento em tcnicas diagnsticas utilizadas na rotina do laboratrio, incluindo o diagnstico da raiva pelas provas de

imunofluorescncia direta e prova biolgica, da leptospirose pela tcnica de visualizao das espiroquetas em microscopia de campo escuro e soroaglutinao microscpica, de leishmaniose, toxoplasmose e neosporose pela tcnica de imunofluorescncia indireta e de anemia infecciosa eqina pela tcnica de imunodifuso em gel de gar. Foi realizado no perodo de 06 de julho a 30 de setembro de 2009, totalizando 504 horas, sob orientao do Prof. Dr. Hlio Langoni. Alm disso, o estgio propiciou acompanhar o preparo dos antgenos utilizados nas tcnicas diagnsticas e preparo dos materiais utilizados na rotina do laboratrio. Tambm permitiu ter uma viso geral das recomendaes do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento a respeito de casos positivos de raiva, leishmaniose, entre outras e de aplicar os conhecimentos adquiridos, durante a graduao, referentes epidemiologia, doenas infecciosas, patologia e zoonoses. Permitiu o reconhecimento da rea laboratorial como uma ferramenta que pode auxiliar mdicos e veterinrios a responderem questes envolvendo diagnstico, terapia ou prognstico de um paciente.

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1. INTRODUO

O estgio curricular supervisionado no Servio de Diagnstico de Zoonoses (SDZ), no Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho (UNESP) consistiu no treinamento em tcnicas diagnsticas utilizadas na rotina do laboratrio, incluindo o diagnstico da raiva pelas provas de imunofluorescncia direta e prova biolgica, da leptospirose pela tcnica de visualizao das espiroquetas em microscopia de campo escuro e soroaglutinao microscpica, de leishmaniose, toxoplasmose e neosporose pela tcnica de imunofluorescncia indireta e de anemia infecciosa eqina pela tcnica de imunodifuso em gel de gar. Foi realizado no perodo de 06 de julho a 30 de setembro de 2009, totalizando 504 horas, sob orientao do Prof. Dr. Hlio Langoni. Alm disso, o estgio propiciou acompanhar o preparo dos antgenos utilizados nas tcnicas diagnsticas e preparo dos materiais utilizados na rotina do laboratrio. Tambm permitiu ter uma viso geral das recomendaes do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento a respeito de casos positivos de raiva, leishmaniose, entre outras e de aplicar os conhecimentos adquiridos, durante a graduao, referentes epidemiologia, doenas infecciosas, zoonoses, entre outras. Atualmente, mais de 200 doenas infecciosas so reconhecidas como causadas por agentes que so direta ou indiretamente transmissveis entre diferentes espcies animais e os humanos, caracterizadas como zoonoses (Krauss et al., 2003). Aspectos ambientais, como saneamento bsico, alm de contribuir para a ocorrncia destas doenas tornam o seu controle difcil, permitindo a disseminao do agente pela gua de chuva, crregos e riachos, frequentados principalmente por crianas, o que as torna importante em pases em

desenvolvimento. Alm disso, o advento da AIDS induziu uma intesificao de muitas zoonoses devido imunodepresso causada pelo virus, o que leva a manifestao de muitas doenas latentes (LANGONI, 2004). O laboratrio clnico pode ajudar mdicos e veterinrios a responderem questes envolvendo diagnstico, terapia ou prognstico de um paciente. Alm disso, testes laboratoriais so importantes na triagem de pacientes clinicamente

saudveis para evidncia de doena subclnica (sem sinais ou sintomas aparentes). Quando um laboratrio de sade animal ou de sade pblica se envolve, os servios disponveis tornam-se mais especializados, geralmente enfatizando um grupo limitado de doenas, mudando o foco do induviduo para o rebanho ou para a comunidade. Os laboratrios locais geralmente promovem uma interface entre o setor privado e instituies pblicas nos nveis estaduais e nacionais (HUGH-JONES et al., 1995). Desta maneira, torna-se clara a importncia deste segmento multidisciplinar da Medicina Veterinria, que exige o entendimento de epidemiologia, imunologia, parasitologia, entre outras. O estgio curricular supervisionado realizado no Servio de Diagnstico de Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootenia da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho foi baseado no seu reconhecimento pela qualidade de ensino e pelas atividades na rea.

2. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral do estgio consistiu no aprendizado e aprimoramento de diversas tcnicas diagnsticas de denas de carter zoonticas bem como da importncia das mesmas e o seu profundo conhecimento de etiologia, patogenia e epidemiologia para a correta interpretao dos resultados dos exames diagnsticos.

3. OBJETIVOS ESPECFICOS

Os objetivos especficos consistiram do aprendizado das tcnicas de imunofluorescncia indireta para diagnstico de toxoplasmose, neosporose, leishmaniose e doena de chagas; tcnica de imunofluorescncia direta e prova biolgica para diagnstico de raiva; soroaglutinao microscpica para diagnstico de leptospirose; isolamento e cultura para diagnstico de leishmaniose; e preparo de antgenos e materiais de uso rotineiro no laboratrio.

4. DESCRIO DO ESTGIO

4.1 SERVIO DE DIAGNSTICO DE ZOONOSES

O Servio de Diagnstico de Zoonoses (SDZ) se encontra na cidade de Botucatu, estado de So Paulo, localizada a 2253'09" de latitude sul, 4826'42" de longitude oeste, e a 804 metros de altitude e dista 235 km da capital So Paulo (Figura 1). Sua populao estimada em 2009 foi de 130.348 habitantes (IBGE, 2009). Faz parte da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, criada em 1976, que resultou da incorporao dos Institutos Isolados de Ensino Superior do Estado de So Paulo, ento unidades universitrias situadas em diferentes pontos do interior paulista. Mantida pelo Governo do Estado de So Paulo, uma das trs universidades pblicas de ensino gratuito, ao lado da USP (universidade de So Paulo) e da Unicamp (Universidade Estadual de Campinas). As trs instituies tem como fonte primordial de seu oramento 9,57% do ICMS - Imposto sobre Circulao de Mercadorias e Servios, distribudo entre USP (5%), Unicamp (2,19%) e UNESP (2,34%). Possui 168 opes de cursos de graduao e conta com uma infraestrutura de 62.453.301,36 m2 de rea total, 732.471,04 m2 de rea construda e 1.900 laboratrios (UNESP, 2009). A Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia (FMVZ) Campus de Botucatu possui qualidade de ensino e ampla infra-estrutura, que asseguram Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia (FMVZ) da UNESP, cmpus de Botucatu, lugar de destaque entre as principais instituies de ensino superior do Pas, tendo obtido nota "A" nas ltimas quatro avaliaes do Enade (Exame Nacional de Desempenho dos Estudantes) e o selo 5 estrelas nas edies do Guia do Estudante 2006 e 2007. Mantm um importante Hospital Escola Veterinrio, o primeiro do gnero no Brasil, que atende perto de 15 mil casos por ano e realiza suas atividades de ensino e pesquisa em trs fazendas que, juntas, somam 1.143 hectares (UNESP, 2009).

O SDZ pertence ao Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica (Figura 2). Uma das premissas do Departamento seu esprito empreendedor nas atividades em sade animal, com forte vis para a sade pblica. A sade de populaes de animais de produo vista como um dos pr-requisitos para a produtividade, diminuio das barreiras sanitrias, comercializao e, para a indstria, melhor viabilizao dos processos industriais. Os atendimentos clnicos, individuais ou populacionais, diagnsticos de doenas, oficiais ou no, e seus controles ocorrem, conforme o caso, integralizados, principalmente, com prefeituras municipais, rgos oficiais, cooperativas, associaes de criadores e, ainda, com os mais diferentes profissionais. O Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica foi institudo em 07 de abril de 1977. Antes, as atividades inerentes ao Departamento estavam distribudas no mbito da ex-Faculdade de Cincias Mdicas e Biolgicas de Botucatu, onde foi criado o curso de Medicina Veterinria, em 22 de abril de 1963. J a partir de 1973, o Departamento comeou a oferecer residncia em Enfermidades Infecciosas. Atualmente, oferece aprimoramento profissional em quatro reas: Enfermidades Infecciosas dos Animais, Planejamento de Sade Animal e Sade Pblica, Inspeo Sanitria de Alimentos e Zoonoses e Sade Pblica. Hoje, o Departamento conta com nove docentes, que atuam nas mais diferentes especialidades e prestao de servios intra e extramuros e ministram aula na graduao e ps-graduao (UNESP, 2009). O Servio de Diagnstico de Zoonoses um laboratrio que oferece os servios de diagnstico de toxoplasmose, neosporose, leishmaniose, doena de chagas, leptospirose, raiva e anemia infecciosa eqina, esta ltima no sendo uma zoonose, porm o docente responsvel pelo laboratrio credenciado para diagnstico da mesma. Alm do diagnstico destas enfermidades nos animais, o Servio de Diagnstico de Zoonoses colabora com o Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, para o diagnstico laboratorial de leptospirose de amostras de soro de seus pacientes e ainda no diagnstico da tuberculose e brucelose daqueles atendidos e internados pela rea de Doenas Tropicais. Desenvolve atividades inerentes ao controle de mastites com diagnsticos a partir de exame citolgico e microbiolgico do leite, visando melhor qualidade do leite (UNESP, 2009).

O laboratrio oferece servios de segundas s sextas-feiras, das 8h00 s 12h00 e das 14h00 s 18h00, com plantes entre os residentes para finais de semanas e feriados. comandado pelo Prof. Dr. Hlio Langoni, que orienta quatro residentes, os quais so responsveis pelas atividades de rotina do laboratrio, como os exames diagnsticos e preparo antgenos. Conta tambm com a colaborao de um tcnico de laboratrio, habilitado tanto para preparo de materiais como para preparos de meios e diagnsticos. Esto inclusas ainda as subdivises do laboratrio com relao aos exames de pesquisa, o Ncleo de Pesquisa em Zoonoses (NUPEZO) e Ncleo de Pesquisa em Mastites (NUPEMAS). Sua infra-estrutura consiste de laboratrio, sala dos aprimorandos, infectrio e sala de lavagem. O laboratrio subdividido em trs reas, a primeira que conta com uma autoclave, trs estufas, uma geladeira, um freezer, um equipamento de gua de osmose reversa, pia, armrios para armazenamento dos materiais e bancada para a realizao dos exames (Figura 3). A segunda rea conta com um microscpio ptico comum, um microscpio de campo escuro, uma capela de fluxo laminar, armrios e bancada para a realizao dos exames de leptospirose, repique dos antgenos e preparao de material para cultura e isolamento (Figura 4). A terceira rea conta com uma estufa, bancada e equipamento para contagem de clulas somticas de leite (Figura 5). A sala dos aprimorandos contm computadores e impressora, onde realizada a parte burocrtica do laboratrio como emisso de laudos. Nela se situa tambm uma sala com microscpio de imunofluorescncia, para leitura dos testes de reao de imunofluorescncia direta e indireta. O infectrio o local onde so mantidos os animais inoculados, tanto para as bioprovas de raiva quanto para manuteno de cepas e isolamento de antgeno. Contm uma centrfuga, uma geladeira, uma bancada, pia e um fluxo de ar controlado. A sala de lavagens conta com uma autoclave e pias, onde so lavados e preparados os materiais utilizados na rotina do laboratrio. As amostras de animais suspeitos para diagnstico so recebidas juntamente com uma requisio onde devero constar os dados de identificao, estado de sade e procedncia do animal.

Figura 1. Localizao da cidade de Botucatu no estado de So Paulo (FONTE: http://pt.wikipedia.org)

Figura 2. Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 3. Servio de Diagnstico de Zoonoses, sala 1 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 4. Servio de Diagnstico de Zoonoses, sala 2 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 5. Servio de Diagnstico de Zoonoses, sala 3 (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

4.2 CASUSTICA

Durante o perodo de estgio foram realizados no SDZ 623 exames de rotina, os quais incluem 207 exames de sorologia para Leishmaniose, 6 pesquisas diretas de amastigotas de Leishmania, 75 sorologias para Leptospirose, 39 provas de campo escuro para Leptospirose, 30 sorologias para Neosporose, 70 sorologias para Toxoplasmose, 134 provas de imunofluorescncia direta para Raiva, 31 provas biolgicas de Raiva e 31 sorologias para Anemia Infecciosa Equina (Tabela 1). Alm disso, foram realizados no laboratrio 300 exames de sorologia para Doena de Chagas para fins de pesquisa.

Com relao aos exames sorolgicos de Leishmaniose, todas as 207 amostras consistiram de amostras caninas, sendo que destas 37 foram reagentes (Tabela 2). J dos 6 exames de pesquisa direta de amastigotas para diagnstico de Leishmaniose, todos consistiam de amostras caninas e 5 foram reagentes (Tabela 3). As 75 sorologias para leptospirose consistiram de amostras caninas (36), bovinas (8), equinas (21), caprinas e ovinas (10) com um total de 13 amostras que apresentaram reatividade para determinado sorovar de importncia para cada espcie (Tabela 4). Dos 39 exames de campo escuro, 15 consistiram de amostra de urina canina (2 positivas), 1 de sangue ovino (0 positivas), 18 de sangue canino (1 positiva), 1 de lquido abdominal ovino, 1 de lquido torcico ovino, 1 de lquido abomasal ovino, 1 de lquido torcico caprino e 1 de lquido abomasal caprino, estas 5 ltimas sendo negativas (Tabela 5). Do total de 30 exames de imunofluorescncia indireta realizados para diagnstico de Neosporose, 2 amostras eram de felinos, 27 de caninos e 1 de bovino e 3 amostras apresentaram-se positivas (Tabela 6). As 70 amostras que chegaram ao SDZ para exame de rotina de Toxoplasmose consistiam de 4 amostras de felinos, 16 de caprinos, 8 de ovinos, 1 de equino e 41 de caninos e obteve um total de 31 amostras positivas (Tabela 7). Com relao aos exames diagnsticos de Raiva, foram realizadas 134 provas de imunofluorescncia direta de espcies caninas (70), bovinas (8), equinas (3), ovinas (1), caprinas (4), felinas (22), quirpteros (22) e outras (4), com um total de 1 amostra positiva (Tabela 8). Foi realizado tambm um total de 31 provas biolgicas, todas negativas, das espcies caninas, bovinas, equinas, felinas, quirpteros e outras (Tabela 9).

Tabela 1. Casustica de exames diagnsticos realizados pelo Servio de Diagnstico de Zoonoses de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Tipo de exame Leishmaniose (RIFI) Leishmaniose (Pesquisa de amastigotas) Leptospirose (SAM) Leprospirose (Campo escuro) Neosporose (RIFI) Toxoplasmose (RIFI) Raiva (RID) Raiva (PB) Anemia Infecciosa Equina (IDGA) Total Quantidade 207 6 75 39 30 70 134 31 31 584 Reagente 37 5 13 3 3 31 1 0 0 90

Tabela 2. Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Leishmaniose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Espcie Caninas Humanas Silvestres Outras Total Total 207 0 0 0 207 Positivo 37 0 0 0 37

Tabela 3. Casuistica de exames de pesquisa direta de amastigotas para diagnstico de Leishmaniose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Espcie Caninas Humanas Silvestres Outras Total Total 6 0 0 0 6 Positivo 5 0 0 0 5

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Tabela 4. Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Leptospirose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Espcie Caninos Bovinos Equinos Suinos Caprinos e ovinos Total 36 8 21 0 10 Reagente Espcie 0 Felinos 2 Silvestres 11 Humanos 0 Outras espcies 0 Total Total 0 0 0 0 75 Reagente 0 0 0 0 13

Tabela 5. Casuistica de exames de campo escuro para diagnstico de Leptospirose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Amosta Urina canina Urina bovina Urina equina Urina ovina Sangue ovino Total Positivo Amostra 15 0 0 0 1 2 Rim canino 0 Rim bovino 0 Rim equino 0 Rim ovino Sangue 0 canino Total Positivo Amostra 0 0 0 0 18 0 Lq abd ovino Lq torcico 0 ovino Lq abomasal 0 ovino Lq torcico 0 caprino Lq abomasal 1 caprino Total Total Positivo 1 1 1 1 1 39 0 0 0 0 0 3

Tabela 6. Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Neosporose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Espcie Felinos Caprinos Ovinos Equinos Caninos Total 2 0 0 0 27 Positivo Espcie 1 Humanos 0 Bovinos 0 Outros 0 1 Total 30 3 Total 0 1 0 Positivo 0 1 0

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Tabela 7. Casuistica de exames sorolgicos para diagnstico de Toxoplasmose no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Espcie Felinos Caprinos Ovinos Equinos Caninos Total 4 16 8 1 41 Positivo Espcie 1 Humanos 16 Bovinos 7 Outros 0 7 Total 70 31 Total 0 0 0 Positivo 0 0 0

Tabela 8. Casuistica de exames de imunofluorescncia direta para diagnstico de Raiva no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Espcie Caninas Bovinas Equinas Sunas Ovinas Total 70 8 3 0 1 Positivo Espcie 0 Caprinas 0 Felinas 0 Quirpteros 0 Outras 0 Total Total 4 22 22 4 134 Positivo 0 0 1 0 1

Tabela 9. Casuistica de provas biolgicas para diagnstico de Raiva no SDZ de 06 de julho de 2009 a 30 de setembro de 2009.
Espcie Caninas Bovinas Equinas Sunas Ovinas Total 6 6 1 0 0 Positivo Espcie 0 Caprinas 0 Felinas 0 Quirpteros 0 Outras 0 Total Total 0 1 15 2 31 Positivo 0 0 0 0 0

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4.3 DIAGNSTICO DE DOENA DE CHAGAS

4.3.1 INTRODUO

A doena de Chagas, causada pelo protozorio Trypanosoma cruzi (Figura 6), permanece um importante problema de sade (MCKERROW et al., 2009). Este protozorio pertence classe Mastigophora, subfilo Sarcomastigophora, filo Protozoa. Dentro do gnero dos tripanossomos, as espcies podem ser divididas em dois grupos: Salivaria e Stercoraria. O T. cruzi pertence ao grupo Stercoraria por apresentar multiplicao e transformao no intestino e as formas infectantes migram para o reto do artrpode vetor, sendo eliminadas nas fezes. No caso da doena de Chagas, os vetores so insetos hematfagos da ordem Hemptera, frequentemente deniminados barbeiros (URQUHART et al., 1998). A doena de Chagas uma das patologias de mais larga distribuio no continente americano. conhecida a existncia de vetores da doena desde o sul dos Estados Unidos Argentina. So mais de cem espcies responsveis pela transmisso natural da infeco pelo Trypanosoma cruzi. Estima-se que sejam de 16 a 18 milhes os indivduos infectados e de aproximadamente oitenta milhes a populao em risco de contaminao na Amrica Latina (VINHAES & DIAS, 2000). a enfermidade humana mais relacionada com o subdesenvolvimento, o que torna mais crtica ainda a situao de milhes de pacientes chagsicos (HUEB, 2006). O protozorio Trypanosoma cruzi vivia restrito situao silvestre. Os triatomneos, hematfagos estritos, encontraram nas habitaes e modificaes do habitat feitas pelo homem uma condio ideal de abrigo e oferta alimentar abundante, tornando a transmisso vetorial no mecanismo primrio de difuso da doena (VINHAES & DIAS, 2000). A doena possui duas rotas principais de transmisso aos homens: pela espoliao sangunea atravs do triatomneo vetor e por transfuso sangnea (CASTILLO-RIQUELME et al., 2008). A fase aguda da doena de chagas se estabelece aps a contaminao por trasmisso vetorial, transfuso de sangue, congnita ou transplante de rgos e na

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maioria das vezes passa despercebida. Quando os sintomas existem, aparecem de 4 a 12 dias aps a infeco. Verifica-se dentre eles o chagoma de inoculao, o sinal de Romaa, que caracterizado por edema bipalpebral unilateral e indolor. Tambm possvel observar febre superior a 39C, mialgias, astenia, anorexia, cefalia e sndromes digestiva, cardaca e respiratria. Depois de 2 a 4 meses da doena nesta fase, as manifestaes clnicas desaparecem e raramente se detecta parasitas no sangue perifrico. A doena entra ento na fase crnica, apresentando muitas vezes um longo perodo de ausncia de sinais e sintomas. Depois desse perodo, muitos pacientes podem apresentar manifestaes envolvendo outros rgos como o corao, esfago e clon e sistema nervoso (HUEB, 2006). O principal impacto em sade na infeco por Trypanosoma cruzi a doena crnica, que se manifesta em 10 a 30% dos pacientes. Para alguns pacientes a dena fatal, enquanto para outros, procedimentos mdicos onerosos so necessrios (CASTILLO-RIQUELME et al., 2008).

Figura 6. Trypanosoma cruzi (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

4.3.2 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

Para o diagnstico sorolgico de doena de chagas o material a ser recebido do animal suspeito amostra de soro ou sangue total, que neste caso dever ser devidamente dessorado em centrfuga a 3.000 rpm por 10 minutos. Caso no seja possvel a realizao imediata do exame, o material dever ser estocado em freezer

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a -20C. A tcnica utilizada reao de imunofluorescncia indireta (RIFI) que consiste da deteco de anticorpos especficos contra T. cruzi. Primeiramente o soro a ser testado dever ser diludo em uma placa de ELISA de fundo reto a 1:20, ou seja, dever ser pipetado 10 L do soro e 190 L de soluo salina tamponada com pH 7,2 (SST 7,2) em um primeiro poo da placa. Em seguida, nos prximos 4 poos da placa de ELISA deve-se pipetar 100 L de SST 7,2. Retira-se ento 100 L do primeiro poo, onde a diluio 1:20, e adiciona-se ao segundo poo que j contm 100 L de SST 7,2, obtendo-se a diluio 1:40. Repete-se a operao at o quinto e ltimo poo, sempre homogeneizando entre um e outro, e desprezando os 100 L finais no ltimo poo. Obtem-se assim as diluies 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320. necessrio tambm proceder a primeira diluio de 1:20 para controles positivos e negativos referentes doena de chagas da mesma espcie animal. Em uma placa de imunofluorescncia previamente sensibilizadas com promastigotas de T. cruzi, pipetar 10 L do soro controle positivo no primeiro poo, 10 L de cada diluio do soro teste do mais diludo para o mais concentrado nos poos 6 a 2 respectivamente, e 10 L do soro controle negativo no poo 7 (Figura 7). Colocar a lmina em cmara mida e incubar em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao dos anticorpos dos soros aos antgenos da lmina. Em seguida, lavar a lminacom SST 7,2 e posicion-la no coplin para que fique mergulhada em SST 7,2 por 10 minutos (procedimento chamado de banho). Aps, desprezar a SST 7,2 do coplin e preencher com novo SST 7,2 para mais um banho de 10 minutos. Este procedimento realizado para que se eliminem excessos de anticorpos livres e demais substncias que possam vir a interferir no resultado do exame causando ligaes inespecficas. A lmina deve ento ser seca em estuda a 37C por cerca de 10 minutos. A seguir, dever ser adicionado o conjudado lmina, que consiste de um anti-anticorpo espcie-especfico ligado a isocianato de fluorescena. Este deve ser previamente diludo segundo seu ttulo em soluo de Azul de Evans com proporo 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 L do conjugado em cada poo da lmina e incub-la em cmara mida em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao do conjugado ao anticorpo aderido lmina. Em seguida lavar a lmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10

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minutos cada. Secar em estufa a 37C por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamnula para proceder a leitura em microscpio de imunofluorescncia. Aps a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como ttulo final a mais alta diluio do soro em que h fluorescncia completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas.

Figura 7. Disposio das diluies do soro na lmina para diagnstico de doena de chagas.

4.4 DIAGNSTICO DE LEISHMANIOSE

4.4.1 INTRODUO

A Leishmaniose uma doena provocada por protozorios intracelular do gnero Leishmania, sendo bastante frequente em ces (SAITO et al., 2008). Cerca de trinta espcies diferentes de Leishmania podem ser encontradas em diversas partes do Velho e do Novo Mundo. Destas, aproximadamente vinte so responsveis por uma ampla variedade de doenas clnicas em pessoas. O gnero Leishmania dividido nos subgneros Leishmania e Viannia com base nas diferenas no desenvolvimento do mosquito vetor. Vrias espcies so reconhecidas dentro dos subgneros e a classificao baseada em comparaes genticas e reatividade a anticorpos monoclonais (GREENE, 2006). As doenas causadas pela Leishmania spp. em pessoas podem ser divididas em trs formas de acordo com suas manifestaes clnicas: leishmaniose cutnea, leishmaniose mucocutnea e leishmaniose visceral (GREENE, 2006). No Brasil, a

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Leishmania (Leishmania) chagasi a espcie envolvida na transmisso da Leishmaniose Visceral. O perodo de incubao da Leishmaniose Visceral (LV) varia de 10 dias a 24 meses (BRASIL, 2006). O ciclo natural de infeco por Leishmania envolve um mosquito vetor e um hospedeiro vertebrado e diferentes formas do parasita podem ser encontradas. Fmeas de mosquitos hematfagos infectadas com Leishmania contm no seu interior as formas promastigotas e transmitem durante seu repasto sanguneo o parasita para animais domsticos, silvestres e humanos, onde a forma amastigota se desenvolve. Mosquitos do gnero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo so os vetores naturais de leishmaniose (GREENE, 2006). No Brasil, duas espcies, at o momento, esto relacionadas com a transmisso da doena, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi. A primeira considerada a principal espcie transmissora da L. (L.) chagasi, mas a L. cruzi tambm foi incriminada como vetora no estado do Mato Grosso do Sul. Em nosso pas, a distribuio geogrfica de L. longipalpis ampla e parece estar em expanso. Esta espcie encontrada em quatro das cinco regies geogrficas: Nordeste, Norte, Sudeste e Centro-Oeste (BRASIL, 2005). Aps a picada do mosquito, as promastigotas so transferidas da sua saliva para a pele do hospedeiro vertebrado. As promastigotas so ento fagocitadas por macrfagos e multiplicam-se como amastigotas. Quando h a ruptura do macrfago, as amastigotas livres penetram em outras clulas do hospedeiro e se disseminam principalmente aos rgos do sistema linftico e reas drmicas remotas generalizando a infeco. Inicialmente a infeco no apresenta sintomas aparentes mas pode progredir para doena sintomtica a no ser que a replicao das amastigotas seja impedida por mecanismos imunes (GREENE, 2006). H relativamente poucos efeitos diretos da Leishmania no hospedeiro. Na leishmaniose visceral a doena causada principalmente pela resposta imune ao parasita, como a anemia, que resulta da destruio direta da medula ssea ou da funo esplnica, e a febre que resulta de toxinas liberadas pelas clulas (PALMER et al., 1998).

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4.4.2 PREPARO DE ANTGENOS

O SDZ emprega como antgeno a forma promastigota da L. major, mantida em tubos rosqueados contendo cerca de 10 mL de meio lquido LIT (Liver Infusion Tryptose) e 5 mL de meio slido NNN (McNeall, Novy & Nicolle). Os repiques so realizados semanalmente dentro da cmara assptica com avaliao do crescimento das proastigotas em microscpio, repicando-se os que possuem melhor motilidade e maior quantidade. Os tubos so mantidos em estufa a 28-30C. Para a obteno de uma quantidade vivel de promastigotas para a preparao de lminas necessrio repicar 0,5 ml de uma cultura em LIT e NNN para um tubo de rosca contendo somente 10 ml de LIT. Deve-se proceder dois repiques em LIT, com intervalo de 7 dias para obteno de maior concentrao do agente. Em seguida, aps a verificao do crescimento das promastigotas em microscpio ptico, realizar uma srie de trs centrifugaes a 3.000 rpm por 10 minutos, sempre desprezando o sobrenadante e acrescentando SST 7,2 para purificao do antgeno. Quantificar os parasitas em microscpio ptico e, caso a quantidade de promastigotas seja inferior a 20 a 30 parasitas por campo, recentrifugar e ressuspender a suspenso at se obter a concentrao desejada. Para fixar o antgeno nas lminas deve-se colocar 10L da suspenso de promastigotas em cada poo da lmina de imunofluorescncia, que logo em seguida retirada, por aspirao, restando somente uma fina pelcula sobre cada poo. Deixar as lminas secarem a temperatura ambiente e guard-Ias em laminrio -20C.

4.4.3 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

A tcnica sorolgica utilizada no SDZ para diagnstico de Leishmaniose a de imunofluorescncia indireta (RIFI), que se baseia na deteco de anticorpos. O material enviado dever ser soro do animal suspeito ou ento sangue total que

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dever ser devidamente dessorado em centrfuga a 3.000 rpm por 10 minutos, o soro aliquotado em tubo tipo eppendorf devidamente identificado e a frao celular desprezada. Em uma placa de ELISA de fundo reto, pipetar no primeiro poo 190 L de SST 7,2 e 100 L de SST 7,2 nos 5 poos seguintes. Diluir 10 L do soro a ser testado no primeiro poo, obtendo-se a diluio 1:20. A partir da primeira diluio, transferir 100 L para o poo seguinte, homogeneizar e tranferir para o prximo, repetindo a operao at o ltimo poo, desprezando-se os 100 L finais. Obtem-se assim as diluies 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 e 1:640. Proceder da mesma maneira com os soros controles positivo e negativa da mesma espcie animal at a diluio 1:40. Em uma placa de imunofluorescncia previamente sensibilizadas com promastigotas de Leishmania major, pipetar 10 L do soro controle positivo na diluio 1:40 no primeiro poo, 10 L de cada diluio do soro teste do mais diludo para o mais concentrado nos poos 6 a 2 respectivamente, utilizando-se as diluies 1:40 a 1:640, e 10 L do soro controle negativo na diluio 1:40 no poo 7 (Figura 8). Colocar a lmina em cmara mida e incubar em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao dos anticorpos dos soros aos antgenos da lmina. Lavar com SST 7,2 e deixar a lmina em banho no coplin por 10 minutos. Descartar a SST do coplin e repreencher com SST 7,2 para novo banho por 10 minutos. Retirar a lmina do banho e secar na estufa a 37C por aproximadamente 10 minutos. Preparar a soluo do conjugado, que deve ser previamente diludo segundo seu ttulo em soluo de Azul de Evans com proporo 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 L do conjugado em cada poo da lmina e incub-la em cmara mida em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao do conjugado ao anticorpo aderido lmina. Em seguida lavar a lmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10 minutos cada. Secar em estufa a 37C por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamnula para proceder a leitura em microscpio de imunofluorescncia. Aps a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como ttulo final a mais alta diluio do soro em que h fluorescncia completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas (Figura 9).

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Figura 8. Distribuio das diluies do soro na lmina para diagnstico de Leishmaniose.

Figura 9. Reao de imunofluorescncia indireta positiva para Leishmaniose (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

4.4.4 OBSERVAO DIRETA DO AGENTE

O diagnstico direto de Leishmaniose realizado atravs da observao dos parasitas em amostras que podem ser obtidas atravs de escarificaes, puno aspirativa ou bipsia quando o exame realizado antemortem, ou atravs de imprint de rgos quando o exame realizado postmortem. Os locais para obteno de amostra podem ser leses cutneas ou rgos linfides como medula ssea, bao, fgado, linfonodos, entre outros. O imprint em lminas pode ser corado por mtodos citolgicos como o de Giemsa ou por mtodos

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histopatolgicos como a hematoxilina-eosina. A obsevao direta do agente tambm pode ser realizada a partir da cultura do materia em meio especfico para isolamento do agente. Em casos positivos podero ser encontradas as formas amastigotas intracelular (Figura 10).

Figura 10. Formas amastigotas de Leishmania encontradas em imprint de bao corado com Pantico rpido (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

4.4.5 ISOLAMENTO EM MEIO DE CULTURA

O cultivo para isolamento do agente pode ser realizado com o meio NNN, podendo-se encontrar as formas promastigotas do parasita em torno de 5 dias aps a inoculao do material no meio, acondicionado em estufa a 24-26C. Este um diagnstico utilizado principalmente postmortem, onde se obtm amostras de rgos linfides, que precisam ser mascerados com soluo tampo para que sejam inoculadas em meio de cultura (Figura 11). Para evitar contaminao, pode ser recomendado em casos de materiais de bipsia o tratamento do mesmo com soluo salina contendo antibiticos, como penicilina ou estreptomicina. A inoculao do material realizada inoculando-se cerca de 0,1 mL do material no lquido de condensao do meio NNN, e incubando por 7 dias a 24C. Aps este perodo, utiliza-se ala de platina estril para obteno de amostra deste material para observao de promastigotas em microscpio, utilizando-se a objetiva de 40x. Se o resultado for negativo, o tubo deve ser reincubado e examinado

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semanalmente por 4 a 6 semanas e ento descartado. A sensibilidade deste mtodo diagnstico de 50% para Leishmania Viannia brasiliensis.

Figura 11. Macerao de fragmento de rgo com pistilo (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

4.4.6 DIAGNSTICO MOLECULAR

Um mtodo diagnstico que tem sido cada vez mais utilizado, pela elevada sensibilidade e especificidade a reao em cadeia pela polimerase (PCR), que identifica de maneira direta o parasito, pela deteco de fragmentos de DNA especficos provenientes do seu cinetoplasto. O SDZ utiliza mtodos moleculares para diagnstico de Leishmaniose para fins de pesquisa. So utilizados fragmentos de rgos como pulmo, fgado, bao e linfonodos de animais sorologicamente positivos e que precisaram ser eutanasiados. Podem ser utilizados tambm material proveniente do isolamento do agente em meio de cultura. Este material armazenado a -80C. A extrao do DNA das amostras de tecido e cultura realizada utilizando-se Kit Illustra Tissue & Cells genomic Prep Mini Spin (GE Healthcare), conforme instrues do fabricante. A quantificao foi avaliada em espectrofotmetro (NanoVue-GE Healthcare). A amplificao do DNA para Leishmania spp. realizada utilizando-se os primers LINR4 (5'-GGGGTTGGTGTAAAATAGGG-3') e LIN19 (5'-

CAGAACGCCCCTACC CG-3') que amplificam 720pb. O perfil de ciclagem consiste

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de: 95C por 3 minutos, 32 ciclos de 95C por 30 segundos, 58C por 30 segundos e 72C por 1 minuto. A extenso final de 72C por 7 minutos. Para Leishmania chagasi os primers utilizados so RV1 (5-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3) e RV2 (5-CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3) com o seguinte perfil de ciclagem: 94C por 4 minutos, 40 ciclos de 94C por 30 seundos, 59C por 30 segundos e 72C por 30 segundos. A extenso final de 70C por 10 minutos (Figura 12). As reaes de PCR so realizadas em microtubo de 0,2 mL com volumes totais de 25 L contendo tampo de reao 10 mM Tris HCl pH 8.0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 20 M de cada primer, 0,2 unidades de Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen) e 10 ng de DNA genmico. A incubao foi realizada em termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf). A visualizao do material amplificado avaliada pela corrida eletrofortica em gel de agarose a 1,5% adicionado de 1,0 L/mL de SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen). A corrida eletrofortica realizada em cuba horizontal contendo TBE 1X (89 nM Tris-HCl, 89 mM cido brico e 20 mM EDTA) com voltagem de 65V. O gel visualizado em transluminador de luz UV e a imagem capturada pelo sistema de documentao digital (Figura 13). So utilizados 8 L do material amplificado e como marcador de peso molecular 4 L de 100pb ladder ou 50pb ladder (Invitrogen). Para todas as amostras so acrescidos 2 L do tampo de corrida (0,25% azul de bromophenol, 0,25% xileno cianol, 30% glicerol, 70% gua Milli-Q).

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Figura 12. Ciclos realizados no termociclador para diagnstico molecular de Leishmaniose (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 13. Imagem digital do gel capturada pelo transluminador (FONTE: SDZFMVZ/UNESP).

4.5 DIAGNSTICO DE LEPTOSPIROSE

4.5.1 INTRODUO

A leptospirose uma zoonose de distribuio mundial (GIUDUGLI et al., 2000). causada por espiroquetas patognicas do gnero Leptospira, que foram classificadas em sorovares baseado em suas caractersticas antignicas e

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recentemente em espcies baseado em estudos genmicos (AHMAD et al., 2005). O gnero Leptospira dividido em duas espcies: Leptospira interrogans, que compreende todas as cepas patognicas, e Leptospira biflexa, contendo cepas saprficas (no-patognicas) isoladas do meio ambiente. As espcies de Leptospira interrogans compreendem pelo menos 250 variantes antigenicamente diferentes, conhecidas como sorovares, que pertencem a 23 sorogrupos (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). Em muitos pases a leptospirose considerada uma doena ocupacional. endmica no Brasil, onde a incidncia aumenta durante o vero (GIUDUGLI et al., 2000). A maior parte das infeces humanas ocorem em homens adultos jovens e crianas, associada a exposio ocupacional ou ambiental. Estudos epidemiolgicos indicam que as infeces so comumente associadas com atividades ocupacionais como fazendeiros, lixeiros e veterinrios. A leptospirose tambm pode ser transmitida durante atividades recreacionais como pique-niques, natao e canoagem (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). Roedores e outros animais domsticos ou silvestres infectados podem transmitir a bactria atravs da urina (AHMAD et al., 2005). Nas espcies animais reservatrias, a bactria pode persistir indefinidamente nos tbulos contornados do rim sem causar doena aparente e sendo disseminada atravs da urina. Alguns sorovares so particularmente associados a um animal hospedeiro, por exemplo, a L. icterohemorrhagiae/copenhageni classificada como parasita clssico de ratos, L. canicola de ces, L. hardjo de gado e L. pomona de sunos (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). A bactria pode sobreviver longos perodos em gua fresca, solos e vegetaes midos e lama. A leptospirose humana causada pelo contato da pele no ntegra ou membranas mucosas com gua, solos midos ou lama contaminados com urina de animais infectados (AHMAD et al., 2005). Em seguida, ocorre um perodo de incubao um perodo de bacteremia pode se desenvolver. A bactria disseminada pode se replicar em vrios tecidos, mas so eventualmente neutralizadas pelo desenvolvimento de anticorpos. Em alguns casos a infeco pdoe persistir em longos perodos nos rins, olhos e tero e as leptospiras podem ser eliminadas intermitentemente por meses (OKEEFE, 2002).

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A patogenia da leptospirose no est completamente esclarecida. Na fase imune da doena a resposta imune do hospedeiro, incluindo deposio de imunocomplexos, pode ter papel importante nos danos endoteliais. Durante a fase septicmica, as leptospiras so amplamente distribudas no organismo, a disseminao e proliferao das espiroquetas em vrios tecidos podem resultar em doena sistmica, que leva a uma srie de manifestaes clnicas (DUTTA & CHRISTOPHER, 2005). As manifestaes clnicas aps infeces agudas variam sua severidade desde doena hemoltica aguda a episdios febris transitrios. A infeco tambm pode ser associada com aborto, mortalidade neonatal, infertilidade, uvete, mastite e falncia renal (OKEEFE, 2002).

4.5.2 MANUTENO DO ANTGENO

Os antgenos utilizados pelo SDZ so cultivos de cepas-padro de Leptospira, mantidas por repiques semanais em meio Ellinghausen-MacCullough-JohnsonHarris (EMJH) e Fletcher, sendo o primeiro utilizado para a prova diagnstica. O meio semi-slido de Fletcher utilizado para o armazenamento das cepas chamadas mes, que so como matrizes que sero repicadas para um meio EMJH para utilizao de rotina. Este meio garante a sobrevivncia das bactrias por tempo mais prolongado, fazendo-se necessrio o repique para novos meios a cada 3 meses. Neste meio o crescimento dos espiroquetdeos de forma lenta e pode ser observado atravs do contorno que se forma na parede do tubo, denominado de anel de Dinger. Para o crescimento timo das bactrias o meio mantido em uma estufa sob temperatura entre 25 28o C. J com ao meio EMJH, um meio lquido, que faz com que as leptospiras apresentem crescimento acelerado, gerando um alto consumo do meio, o que torna necessrio o repique semanal para novos meios. O uso constante das amostras para provas de rotina propiciam um alto ndice de contaminao pelo ambiente. As culturas so examinadas no mnimo uma vez por semana

macroscopicamente para verificao de contaminantes. No dia da prova, as culturas

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que vo ser utilizadas como antgenos devem ser avaliadas microscopicamente. S devem ser utilizados como antgenos culturas de 4 a 14 dias, que no apresentem contaminantes nem auto-algutinaes. No momento da prova, as culturas que vo ser usadas como antgeno, devem ser diludas em SST de pH 7,6 na proporo de 1:2, calculando o volume de cada antgeno de acordo com a quantidade necessria para a prova. A bateria de antgenos a ser empregada a prova de aglutinao microscpica deve incluir respresentantes de sorogrupos de todos os sorovares existentes no pas ou na regio para a espcie em questo (Tabela 9). Quaisquer outras cepas podem ser acrescentadas, desde que representem a situao epidemiolgica local (Tabela 10).

Tabela 9. Sorovares utilizados no Servio de Diagnstico de Zoonoses conforme a espcie (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).
HERBVOROS 1B 3 5 8A 9 11A 11B 14A 15 16A 16B 18 BRA CAS CAN DJA GRY COP ICT POM PYR HAR WOL TAR CANINOS 1A 1B 2A 5 7 8A 9 11A 11B 14A 15 16A AUS BRA AUT CAN CYN DJA GRY COP ICT POM PYR HAR 1A 1B 2A 2B 3 4A 5 6B 7 8A 8B 9 HUMANOS AUS BRA AUT BUT CAS BAT CAN WHI CYN DJA SEN GRY 10 11A 11B 12 13 14A 15 16A 16B 17 18 19 21 HEB COP ICT JAV PAN POM PYR HAR WOL SHE TAR AND PAT

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Tabela 10. Sorovares utilizados na rotina de diagnstico de Leptospirose no Servio de Diagnstico de Zoonoses (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP). 1A 1B 2A 2B 3 4A 5 6B 7 8A 8B 9 10 AUS BRA AUT BUT CAS BAT CAN WHI CYN DJA SEN GRY HEB australis bratislava autumnalis butembo castellonis bataviae canicola whitcombi cynopteri djasiman sentot gryppotyphosa hebdomadis 11 A 11 B 12 13 14 A 15 16 A 16 B 17 18 19 21 COP ICT JAV PAN POM PYR HAR WOL SHE TAR AND PAT copenhageni icterohaemorrhagiae javanica panam pomona pyrogenes hardjo wolffi shermani tarssovi andamana patoc

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4.5.3 SOROAGLUTINAO MICROSCPICA

A tcnica diagnstica sorolgica padro-ouro para Leptospirose a soroaglutinao microscpica, e a utilizada pelo SDZ. Esta tcnica indireta, e se baseia na deteco de anticorpos referentes a cada sorovar. O material a ser recebido o soro do animal suspeito ou sangue total que dever ser devidamente dessorado em centrfuga a 3.000 rpm por 10 minutos, despresando-se a parte celular e aliquotando o soro em tubos tipo eppendorf devidamente identificado e armazenado a -20C at a realizao da prova. Para a prova diagnstica de Leptosiporse, primeiramente necessrio a diluio inicial do soro a 1:50 em soluo salina tamponada com pH 7,6 (SST 7,6), para isto, em um tubo de ensaio, coloca-se 100 L do soro a ser testado e 4.900 L de SST 7,6. Primeiramente realizada a prova de triagem. Para isto utiliza-se uma placa de ELISA de fundo reto e pipeta-se 50 L do soro diludo nos poos formando uma fileira, o nmero de poos de acordo com o nmero de sorovares a ser testado. O mesmo realizado para obter-se uma fileira controle, porm, ao invs de pipetar 50 L do soro, utiliza-se 50 L de SST 7,6. Acrescenta-se ento nos respectivos poos, 50 L da soluo de cada sorovar na linha controle e na linha do soro teste, passando a ser a diluio final de cada poo 1:100. Homogeneizar suavemente a placa e incubar em estufa a 37C por 1 hora para que ocorra a ligao antgenoanticorpo, que se traduzir em aglutinao. Com ala de Henly, colocar uma gota do contedo de cada poo em fileiras sobre uma lmina e examinar sem lamnula em microscpio de campo escuro, com leo de imerso colocado entre a lmina e o condensador. A observao de ser feita na objetiva de 10X e ocular de 10X. Devese observar o grau de aglutinao para cada sorovar, considerando positivos aqueles que possurem 50% ou mais de aglutinao, ou seja, 50% de leptospiras aglutinadas e 50% livres, tendo como referncia os respectivos controles. O soro que na prova de triagem, mostrou 50% de aglutinao, ou mais, dever ser submetido prova de titulao, realizando-se a mesma somente para os

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sorovares reagentes. Para esta prova, utiliza-se 100 L do soro diludo a 1:50 (100 L do soro em 4.900 L de SST 7,6) no primeiro poo da linha e 50 L de SST 7,6 nos prximos 5 poos. Pipeta-se 50 L da diluio inicial (1:50) no segundo poo, homogeneizando, e pipetar 50 L deste para o prximo, assim sucessivamente at o ltimo poo, desprezando os 50 L finais. Assim se obtem as diluies 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600. Adicionar 50 L do sorovar a ser titulado em cada poo, obtendo ento as titulaes 100, 200, 400, 800, 1600 e 3200. Homogeneizar suavemente a placa e incubar em estufa a 37C por 1 hora para que ocorra a ligao antgeno-anticorpo e realizar a leitura conforme descrito na prova de triagem. Considerar como ttulo a maior diluio do soro capaz de aglutinar 50% ou mais das leptospiras, em relao ao controle (Figura 14).

Figura 14. Amostra reagente para Leptospirose na prova de soroaglutinao microscpica (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

4.5.4 OBSERVAO DO AGENTE EM MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO

A prova de observao direta do agente em microscopia de campo escuro pode ser realizada com amostras de urina (quando se suspeita que o animal esteja em fase de leptospirria), sangue (quando a suspeita que esteja em fase de

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leptospiremia) ou ainda lquidos cavitrios quando se trata de fetos abortados. O material enviado dever ser protegido da luz para evitar a inapropriao do mesmo para a prova. Esta prova diagnstica precisa ser realizada o mais breve possvel quando da chegada do material, uma vez que depende da observao direta do agente, e sua motilidade uma caracterstica importante na identificao que se perde com o passar do tempo. Pode ser realizada a observao direta do material, aplicando-se uma gota do material enviado em lmina coberta com lamnula e observada em microscpio de campo escuro. Pode-se tambm diluir o material em SST 7,6 para que se torne menos concentrado, especialmente quando o material enviado for sangue, a fim de evitar que a frao celular dificulte a visualizao. Quando a amostra for positiva, possvel observar espiroquetdeos com movimentos longitudinais e ao redor do prprio eixo. A amostra negativa no exclui a doena, porm a positiva confirma se o animal apresenta infeco.

4.6 DIAGNSTICO DE NEOSPOROSE

4.6.1 INTRODUO

Neospora caninum um protozorio recentemente descoberto, parasita de animais de produo e de companhia, amplamente distribudo pelo mundo (DUBAY, 2003). No geral muito similar ao T. gondii com relao sua estrutura e ciclo, com duas importantes diferenas: neosporose primariamente uma doena de rebanho bovino e os ces e candeos so hospedeiros definitivos, enquanto que a toxoplasmose primariamente uma doena de humanos, ovelhas e cabras e os feldeos so os hospedeiros definitivos (DUBEY et al., 2007). O ciclo deste parasita consiste de 3 estgios: taquizotos, cistos tissulares e oocistos (DUBEY et al., 2007). Os taquizotos penetram as clulas hospedeiras e podem se tornar intracelular em 5 minutos de contato com as mesmas. Nos animais infectados, os taquizotos podem ser encontrados em muitas clulas, incluindo

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clulas

neurais,

macrfagos,

fibroblastos,

clulas

endoteliais

vasculares,

hepatcitos, entre outras (DUBEY & LINDSAY, 1996). Esta forma do parasita encontrada nos hospedeiros intermedirios. O cisto pode ser encontrado nas formas redonda ou oval, principalmente no sistema nervoso central. A fase do parasista resistente no meio ambiente, o oocisto, excretada nas fezes de cndeos no estgio no esporulado, e esporula em 24 horas (DUBEY et al., 2007). O Neospora caninum apresenta uma ampla gama de hospedeiros. Evidncias de infeces naturais foram encontradas em ces, gado, ovinos, caprinos, eqinos e veados. Infeces experimentais foram induzidas em camundongos, ratos, ces, raposas, caprinos, felinos, ovinos, coiotes, sunos, gerbils, coelhos e bovinos (DUBEY & LINDSAY, 1996). Ces podem ser os hospedeiros intermedirios e definitivos de Neospora caninum. A transmisso vertical a principal via de infeco de bovinos, porm carnvoros podem se infectar atravs da ingesto de tecidos infectados (DUBEY et al., 2007). O Neospora caninum pode causar aborto tanto em gado de corte como em gado de leite. Vacas de qualquer idade podem abortar a partir do terceiro ms de gestao. A maioria dos abortos causados por neosporose ocorrem entre 5 e 6 meses de gestao. Os fetos podem vir a bito dentro do tero, serem reabsorvidos, mumificados, autolizados, nascerem vivos com sinais clnicos ou nascerem clinicamente normais com infeco crnica (DUBEY et al., 2007).

4.6.2 REAO DE IMUNOFLUORECNCIA INDIRETA

Para o diagnstico sorolgico de neosporose o material a ser recebido do animal suspeito amostra de soro ou sangue total, que neste caso dever ser devidamente dessorado em centrfuga a 3.000 rpm por 10 minutos. Caso no seja possvel a realizao imediata do exame, o material dever ser estocado em freezer a -20C. A tcnica utilizada reao de imunofluorescncia indireta (RIFI) que consiste da deteco de anticorpos especficos contra Neospora. Primeiramente o soro a ser testado dever ser diludo em uma placa de ELISA de fundo reto a 1:25, ou seja, dever ser pipetado 5 L do soro e 120 L de soluo salina tamponada com pH 7,2 (SST 7,2) em um primeiro poo da placa. Em seguida, nos prximos 4 poos da placa de ELISA deve-se pipetar 50 L de SST

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7,2. Retira-se ento 50 L do primeiro poo, onde a diluio 1:25, e adiciona-se ao segundo poo que j contm 50 L de SST 7,2, obtendo-se a diluio 1:50. Repetese a operao at o quinto e ltimo poo, sempre homogeneizando entre um e outro, e desprezando os 50 L finais no ltimo poo. Obtem-se assim as diluies 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400. necessrio tambm proceder a primeira diluio de 1:25 para controles positivos e negativos referentes doena de chagas da mesma espcie animal. Em uma placa de imunofluorescncia previamente sensibilizadas com taquizotos de Neospora, pipetar 10 L do soro controle positivo no primeiro poo, 10 L de cada diluio do soro teste do mais diludo para o mais concentrado nos poos 6 a 2 respectivamente, e 10 L do soro c ontrole negativo no poo 7 (Figura 15). Colocar a lmina em cmara mida e incubar em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao dos anticorpos dos soros aos antgenos da lmina. Em seguida, lavar a lminacom SST 7,2 e posicion-la no coplin para que fique mergulhada em SST 7,2 por 10 minutos (procedimento chamado de banho). Aps, desprezar a SST 7,2 do coplin e preencher com novo SST 7,2 para mais um banho de 10 minutos. Este procedimento realizado para que se elimine excessos de anticorpos livres e demais substncias que possam vir a interferir no resultado do exame causando ligaes inespecficas. A lmina deve ento ser seca em estuda a 37C por cerca de 10 minutos. A seguir, dever ser adicionado o conjudado lmina, que consiste de um anti-anticorpo espcie-especfico ligado a isocianato de fluorescena. Este deve ser previamente diludo segundo seu ttulo em soluo de Azul de Evans com proporo 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 L do conjugado em cada poo da lmina e incub-la em cmara mida em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao do conjugado ao anticorpo aderido lmina. Em seguida lavar a lmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10 minutos cada. Secar em estufa a 37C por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamnula para proceder a leitura em microscpio de imunofluorescncia. Aps a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como ttulo final a mais alta diluio do soro em que h fluorescncia completa na borda de pelo menos 50% dos taquizotos.

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Figura 15. Disposio das diluies do soro para diagnstico de Neosporose.

4.7 DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSE

4.7.1 INTRODUO

O gnero Toxoplasma tem uma nica espcie, Toxoplasma gondii, pertence famlia Sarcocystidae, classe Coccidia (URQUHART et al., 1998). um parasita intracelular obrigatrio, pertencendo ao filo Apicomplexa. Apresenta o ciclo intestinal de ocorrncia exclusiva nos feldeos e um ciclo extra-intestinal comum aos feldeos e s demais espcies (LANGONI, 2005). Possui como hospedeiro definitivo, portanto, todos os feldeos, porm o gato domstico o mais importante. Como hospedeiros intermedirios esto inclusos todos os mamferos, incluindo o homem, ou aves (URQUHART et al., 1998). A enfermidade uma das mais comuns parasitoses que afetam animais homeotrmicos em todo o mundo, constituindo importante zoonose de distribuio mundial (LANGONI et al., 2001). Estima-se que um tero da populao humana mundial tenha sido infectada por T. gondii. Este parasita tem sido considerado um patgeno oportunista, associado enfefalites ou infeces sistmicas em imunocomprometidos, particularmente em indivduos com AIDS (KIM & WEISS, 2008). O Toxoplasma gondii apresenta trs formas evolutivas: os taquizotos, caractersticos da infeco aguda, com multiplicao rpida, podendo atravessar a

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placenta e atingir o feto; os bradizotos, caractersticos da infeco crnica, forma de multiplicao lenta, organizados sob a forma de cistos teciduais que podem resistir por toda a vida do hospedeiro nos tecidos muscular e nervoso; e os esporozotos, produzidos no epitlio intestinal de feldeos, eliminados em oocistos no esporulados nas fezes destes animais, que tornam-se infectantes sob as condies ambientais (GONALVEZ NETTO et al., 2003). O ciclo evolutivo inclui uma fase sistmica facultativa, que uma causa importante de aborto em ovinos e tambm pode causar uma zoonose. As infecces humanas so particularmente graves se ocorrerem durante a gravidez e podem resultar em aborto ou em distrbios adquiridos congnitos que acometem principalmente o sistema nervoso central (URQUHART et al., 1998). A principal forma de infeco ocorre atravs de ingesto acidental de alimentos contaminados com oocistos esporulados ou com cistos teciduais, sendo a higiene a melhor forma de preveno da doena (SOUZA, 2003).

4.7.2 MANUTENO DAS CEPAS

O SDZ faz a manuteno das cepas de T. gondii: RH, AS-28, BTU 2, BTU 3, BTU 4, BTU 6, BTU 8, BTU 9 e BTU 12. As cepas RH e AS-28 so cepas-padro isoladas de seres humanos. As cepas BTU foram isoladas de animais e receberam esta nomenclatura devido ao isolamento na cidade de Botucatu (BTU) e a numerao esta relacionada com a ordem cronolgica de isolamento de cada cepa. A manuteno as cepas realizada semanalmente visando tambm a produo de taquizotos utilizados para sensibilizao de lminas para o teste de imunoflourescncia indireta. A manuteno feita em camundongos de 30 dias inoculados com 1 mL por animal por via intraperitoneal. Para cada cepa so inoculados 5 camundongos, que so mantidos por uma semana, tempo para que haja produo suficiente de taquizotos. Ao final deste perodo, os animais so eutanasiados com ter para a realizao do lavado intraperitoneal. O lavado tem como funo a recuperao dos taquizotos presentes no lquido peritoneal.

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Para o lavado, posiciona-se o corpo do animal em decbito dorsal e prepara a regio abdominal com lcool iodado. Incisa-se a pele desta regio e, com seringa contendo 5 mL de soluo fisiolgia com antibitico (500 mL de soro fisiolgico, 0,5 mL de penicilina e 0,5 mL de estreptomicina), perfura-se a cavidade na regio lateral para injetar a soluo, atentando-se para evitar a perfurao de vsceras. Recuperase a soluo injetada na cavidade com a seringa devidamente identificada com a cepa que o animal continha. Todas as 5 amsotras de lavado de cada cepa so analisadas

microscopicamente quanto quantidade e motilidade dos taquizotos e quanto presena de contaminantes. So ento separadas 2 das melhores amostras de cada cepa para reinoculao em camundongos, 2 amostras que sero guardadas em geladeira por cerca de 2 semanas e a que apresentar pior qualidade descartada. 4.7.3 PREPARO DOS ANTGENOS

O preparo dos antgenos para a confeco de lminas de imunofluorescncia realizada com o exsudato peritoneal de camundongos de 30 dias previamente inoculados com taquizotos. Realiza-se a inativao deste antgeno incubando cerca de 50 mL da soluo antignica em tubo de centrfuga juntamente com a mesma quantidade de formol 2% em estufa a 37C por 30 minutos, homogeneizando por inverso a cada 10 minutos. Aps a incubao, centrifugar-se a 3.000 rpm por 10 minutos e ento descarta-se o sobrenadante. Acrescenta-se ao pellet de antgeno 2 - 3 mL de SST 7,2. Homogeneiza-se em vrtex e centrifuga-se novamente, a 3.000 rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante, ressuspender em soluo fisiolgica at obter 20 a 30 parasitos por campo, utilizando o aumento de 40x para a leitura. Deve-se recentrifugar e ressuspender a suspenso at obter a concentrao adequada. Para a preparao das lminas, adiciona-se a cada um dos poos 10 L da soluo antignica, espera-se de 2 a 3 minutos e, logo em seguida, retira-se o excesso, deixando-se uma fina pelcula sobre cada poo. Depois de secas e temperatura ambiente, as lminas so colocadas dentro de um laminrio, que guardada em freezer a -20C.

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4.7.4 REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

A tcnica sorolgica utilizada no SDZ para diagnstico de Toxoplasmose a de imunofluorescncia indireta (RIFI), que se baseia na deteco de anticorpos. O material enviado dever ser soro do animal suspeito ou ento sangue total que dever ser devidamente dessorado em centrfuga a 3.000 rpm por 10 minutos, o soro aliquotado em tubo tipo eppendorf devidamente identificado e a frao celular desprezada. Em uma placa de ELISA de fundo reto, pipetar no primeiro poo 150 L de SST 7,2 e 50 L de SST 7,2 nos 4 poos seguintes. Diluir 10 L do soro a ser testado no primeiro poo, obtendo-se a diluio 1:16. A partir da primeira diluio, transferir 50 L para o poo seguinte, homogeneizar e tranferir para o prximo, repetindo a operao at o ltimo poo, desprezando-se os 50 L finais. Obtem-se assim as diluies 1:16, 1:64, 1:256, 1:1024 e 1:4096. Proceder da mesma maneira com os soros controles positivo e negativa da mesma espcie animal utilizando-se somente a primeira diluio de 1:16. Em uma placa de imunofluorescncia previamente sensibilizadas com taquizotos de Toxoplasma, pipetar 10 L do soro controle positivo diludo a 1:16 no primeiro poo, 10 L de cada diluio do soro teste do mais diludo para o mais concentrado nos poos 6 a 2 respectivamente, e 10 L do soro controle negativo na diluio 1:16 no poo 7 (Figura 16). Colocar a lmina em cmara mida e incubar em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao dos anticorpos dos soros aos antgenos da lmina. Lavar com SST 7,2 e deixar a lmina em banho no coplin por 10 minutos. Descartar a SST do coplin e repreencher com SST 7,2 para novo banho por 10 minutos. Retirar a lmina do banho e secar na estufa a 37C por aproximadamente 10 minutos. Preparar a soluo do conjugado, que deve ser previamente diludo segundo seu ttulo em soluo de Azul de Evans com proporo 1:5 (1 parte de Azul de Evans para 4 partes de SST 7,2). Pipetar 10 L do conjugado em cada poo da lmina e incub-la em cmara mida em estufa a 37C por 30 minutos para que

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ocorra a ligao do conjugado ao anticorpo aderido lmina. Em seguida lavar a lmina com SST 7,2 e proceder 2 banhos com SST 7,2 de 10 minutos cada. Secar em estufa a 37C por aproximadamente 10 minutos e colocar glicerina tamponada e lamnula para proceder a leitura em microscpio de imunofluorescncia. Aps a leitura dos controles, fazer a leitura do soro teste, considerando como ttulo final a mais alta diluio do soro em que h fluorescncia completa na borda de pelo menos 50% dos taquizotos (Figura 17).

Figura 16. Distribuio das diluies do soro na lmina para diagnstico de Toxoplasmose.

Figura 17. Amostra positiva para Toxoplasmose no diagnstico por imunofluorescncia indireta (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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4.7.5 ISOLAMENTO DO ANTGENO

O isolamento de antgeno de T. gondii pode ser realizado atravs de amostras de rgos como bao, fgado e pulmo. Para isto, primeiramente necessria a digesto de tecidos, com o objetivo de romper cistos e liberar o agente. Esta digesto pode ser realizada tanto com tripsina quanto com pepsina. A digesto feita incubando-se cerca de 20 gramas de tecido em 20 mL de soluo salina 0,18% com antibiticos (SSA) por 20 minutos temperatura ambiente. Em seguida, mascera-se o tecido em gral com pistilo e adiciona-se 200 mL de tripsina 0,5% em soluo salina 0,18% ou 100 mL de soluo HCl-pepsina, digerir por 60 minutos a 30C sb agitao constante. Filtra-se em gase estril e centrifuga a 3.000 rpm por 10 minutos. Descarta-se o sobrenadante e ressuspende em 10 mL de SST. Centrifuga novamente a 3.000 rpm por 10 minutos descarta o sobrenadante e ressuspende em 10 mL de SST. Esta operao repetida por 5 vezes. Ao final, ressuspender em 10 mL de SST e inocular 1 mL, via subcutnea, em camundongos.

4.8 DIAGNSTICO DE RAIVA

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4.8.1 INTRODUO

O vrus da raiva est classificado na familia Rhabdoviridae, gnero Lyssavirus . Tm forma de bastonete com uma extremidade achatada e outra arredondada, resultando num aspecto de projtil. Possui um invlucro lipdico e uma genoma de RNA. Todas as espcies de animais de sangue quente so suscetveis infeco com o vrus da raiva, embora existam diferenas de suscetibilidade, sendo que as aves encontram-se entre as espcies mais resistentes (ETTINGER, 1996). Os vrus rbico so classificados sorolgica e genotipocamente com base em, respectivamente, reatividade sorolgica cruzada em testes de vrus neutralizao e perfil gentico (CUBAS et al., 2007). Com a utilizao de anticorpos monoclonais muitos estudos confirmaram que amostras de vrus rbicos originrias de diferentes hospedeiros naturais apresentavam variantes com caractersticas antignicas particulares. Foram identificadas no Brasil at o presente as variantes denominadas 2 (encontrada principalmente em ces), 3 (usualmente identificada em morcegos Desmodus rotundus), variante 4 (identificada em morcegos insetvoros Tadarida brasiliensis), variante 5 (relacionada a morcegos hematfagos na Venezuela, porm no Brasil isolada de uma raposa ou cachorro-do-mato - Cerdocyon thous) e variante 6, isolada de um morcego insetvoro Lasiurus cinereus (BATISTA et al., 2007). Outras variantes desconhecidas foram detectadas, sendo uma em sagis (Callithrix jacchus) e duas em morcegos insetvoros (Histiotus velatus e Nyctinomops laticudatus) (CUBAS et al., 2007). Com relao aos gentipos, o gnero Lyssavirus foi subdividido em sete gentipos denominados gentipo 1 (vrus rbico), gentipo 2 (Lagos bat), gentipo 3 (Mokola), gentipo 4 (Duvenhage), gentipo 5 (European bat Lyssavirus 1), gentipo 6 (European bat Lyssavirus 2) e mais recentemente gentipo 7 (Australian bat Lyssavirus ). O conhecimento das variantes permite definir a distribuio geogrfica e o hospedeiro de origem das vrias amostras virais, teis em estudos epidemiolgicos e de controle (CUBAS et al., 2007). Na natureza, o vrus rbico mantido por ciclos ocasionalmente interrelacionados, denominados ciclos urbano e silvestre, areo e rural. Ciclo urbano refere-se raiva em ces e gatos domsticos, seu carter zoontico mais evidente

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neste ciclo em funo da natureza da relao entre ces e humanos. O ciclo areo refere-se raiva em morcegos (sendo os demais ciclos denominados ciclos terrestres), a presena de morcegos potencialmente contaminados com o vrus em reas sinantrpicas representa um problema srio, especialmente para animais de estimao e seres humanos, constituindo-se em uma fonte de contaminao perigosa, particularmente pela possibilidade de passar insuspeita. Em toda a Amrica Latina, os morcegos hematfagos Desmodus rotundus so os principais hospedeiros do vrus no ciclo areo. Ciclo rural refere-se raiva dos herbvoros, que envolve, principalmente bovinos e eqinos e na qual o principal vetor o morcego hematfago. O termo silvestre refere-se raiva associada a espcies silvestres, sendo por vezes utilizada englobando o ciclo areo (BATISTA et al., 2007). A maioria das infeces pelo vrus rbico se d por transmisso percutnea, atravs da mordedura ou arranhadura de animais infectados. A transmisso por via area pode ocorrer raramente, mas no tem significncia epidemiolgica no ciclo da infeco (BATISTA et al., 2007). Aps a ocorrncia da infeco, o vrus da raiva migra centripetamente nas fibras nervosas perifricas at o sistema nervoso central, e termina por afetar os neurnios, levando a comportamento anormal e paralisia. Depois que o vrus da raiva atinge o crebro e multiplica-se nos neurnios, o organismo migra centrifugamente nas fibras nervosas, desde o sistema nervoso central at as glndulas salivares, permitindo que o vrus seja eliminado na saliva, com a continuao da transmisso. O vrus da raiva pode ser encontrado em outros tecidos e rgos perifricos, mas que no so importantes na sua transmisso (ETTINGER, 1996). A mortalidade da raiva em humanos, aps mordeduras no tratadas de ces raivosos, varia de 38% a 57%, dependendo da severidade e localizao da leso e da concentrao viral na saliva. A exposio animais raivosos de outras espcies, como lobos, pode resultar em 80% de mortalidade. Mordeduras na cabea, face, pescoo e mos, particularmente quando h sangramento representam maior risco e so geralmente associadas com um perodo de incubao menor. Todavia, todas as mordeduras devem ser tratadas com a mesma urgncia. Em casos de morcegos raivosos, o risco est presente mesmo em uma agresso superficial, em parte

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devido habilidade nica destes agentes para replicar na epiderme e derme (HEMACHUDHA et al., 2002). A raiva uma zoonose de grande relevncia devido sua alta taxa de

mortalidade (GREENE, 2006). Uma pessoa morre de raiva a cada 15 minutos e mais de 300 so expostas. Mundialmente, estima-se que entre 45.000 a 60.000 pessoas morrem pela enfermidade a cada ano. Por outro lado, 50 milhes de doses de vacinas so utilizadas em 10 milhes de tratamentos ps-expositivos no mundo (CUBAS et al., 2007). A raiva humana foi inserida na lista nacional de doenas e agravos de notificao compulsria e imediata na Portaria Interministerial 5, de 21 de fevereiro de 2006 (BRASIL, 2009). No Brasil, a raiva endmica, em grau diferenciado de acordo com a regio geopoltica. A regio Nordeste responde por 54,2% dos casos humanos registrados de 1980 a 2003; seguida da regio Norte, com 17,5%; Sudeste, com 10,8%; Centro-Oeste, com 10,4% e Sul, com 0,4%. Desde 1987 no h registro de casos nos estados do Sul, sendo o ltimo no Paran, cuja fonte de infeco foi um morcego hematfago. No perodo de 1991 a 2003, ces e gatos foram responsveis por transmitir 80% dos casos humanos de raiva; os morcegos, por 10,6% e outros animais (raposas, sagis, gato selvagem, bovinos, eqinos, caititus, gambs, sunos e caprinos), 4,8%. Casos cuja fonte de infeco foi desconhecida representaram 4,6% (BRASL, 2005). Alm da sade pblica, a importncia econmica da raiva est relacionada a sua ocorrncia em animais de produo. Considera-se que as perdas anuais diretas e indiretas causadas pecuria pelos ataques de morcegos hematfagos superam 50 milhes de dlares (CUBAS et al., 2007).

4.8.2 COLHEITA E ENVIO DO MATERIAL SUSPEITO

Quando h a suspeita de raiva e deseja-se realizar o diagnstico postmortem, deve-se enviar a cabea do animal suspeito, o encfalo inteiro ou fragmentos do tecido cerebral de ambos os hemisfrios, como crtex, cerebelo e o hipocampo. Quando tratar-se de eqdeos, necessrio encaminhar tambm a medula espinhal. Para a realizao deste procedimento recomenda-se a utilizao de luvas, culos

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protetor e mscara. Os instrumentos para retirada do crebro devem ser preferencialmente estreis e, na impossibilidade, devem ser bem limpos aps imerso em soluo desinfetante. Pequenos animais silvestres como morcegos, gambs, sagis, entre outros, devem ser encaminhados inteiros para possibilitar a identificao da espcie. Depois de coletado o material deve-se tomar a medidas necessrias para o acondicionamento mais proprcio do material durante o seu envio. Deve-se acondicionar o material cerebral em saco plstico duplo, bem amarrado, e colocar em caixa de isopor com gelo tambm em saco plstico duplo bem amarrado, ou ainda com elemento gelado reciclvel. Identificar e encaminhar anexo com ficha epidemiolgica contendo dados sobre o animal e endereo com dados completos para notificao so de suma importncia. Caso o transporte exceda 24 horas poder ser conservado em soluo salina com glicerina a 50%.Em ltima hiptese proceder ao congelamento do material, pois desta mateira o material pode se tornar imprprio para a realizao das provas diagnsticas.

4.8.3 REAO DE IMUNOFLUORECNCIA DIRETA

Para o diagnstico de raiva, uma das tcnicas utilizadas pelo SDZ a reao de imunofluorescncia direta (RID), que se baseia na deteco de antgeno. Para isto, utiliza-se fragmentos cerebrais de cerca de 1 grama da regio do hipocampo, da regio do crtex e do cerebelo. Em equinos importante tambm a utilizao de fragmento de medula. Posiciona-se em uma esptula de madeira descartvel o fragmento que ser utilizado para o imprint com a superfcie de corte voltada para cima (Figura 18). Com a ajuda da esptula realiza-se o imprint em lmina de imunofluorescncia direta devidamente identificada nos campos laterais direito e esquerdo (Figura 19). Retirase o excesso de material com papel filtro fazendo leve presso contra a lmina (Figura 20). Os imprints so feitos em duplicada do material do hipocampo e cerebelo. Alm disto, fragmentos das regies utilizadas tambm so estocados em freezer a -20C como contra-prova. No caso de quirpteros realiza-se duas lminas de imprint sem diferenciao das regies. importante ressaltar que o manipulador

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sempre dever usar como equipamentos de proteo individual mscara, culos e luvas de procedimento, e que para que esteja apto a realizar esta tcnica necessrio que obtenha titulao sorolgica antirrbia igual ou superior a 0,5 UI/mL. As lminas ficam ento mergulhadas em acetona por 1 a 4 horas estocadas a -20C para a fixao e inativao viral. As lminas so em estufa a 37C para que seja possvel corar. Pipetar 25 L da suspenso de CVS na regio esquerda da lmina e 25 L da suspenso de CN do lado direito da lmina. A soluo de CVS (Challenge Virus Standard) consiste de uma suspenso de crebro de camundongos infectados com a cepa padro (CVS) que contm diludo o conjugado, ou seja, o anticorpo contra o vrus da raiva marcado com fluorescena. A soluo de CN (crebro normal) consiste de suspenso de crebros de camundongos sadios que contm diludo o conjugado. A cada bateria de lminas a serem coradas utiliza-se tambm duas lminas com imprint de material sabidamente positivos para atuarem como controles positivos da tcnica. Em seguida, incuba-se as lminas em estufa a 37C por 30 minutos para que ocorra a ligao antgeno-anticorpo. Aps este procedimento, as lminas so lavadas com soluo salina tamponada com pH 8,5 (SST 8,5) e mergulhadas no coplin para banho de 10 minutos. A SST 8,5 ento descartada e o coplin repreenchido com SST 8,5 para novo banho de 10 minutos. Aps os banhos as lminas so postas para secar em estufa a 37C por aproximadamente 10 minutos e ento esto prontas para colocao de glicerina tamponada e lamnula para leitura em microscpio de imunofluorescncia (Figura 21). Figura 18. Imprint de material cerebral para diagnstico de Raiva (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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Figura 19. Regies para realizao do imprint na lmina de imunofluorescncia para diagnstico de Raiva.

Figura 20. Remoo do excesso de material da lmina com papel filtro (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 21. Amostra positiva para Raiva observada em microscpio de imunofluorescncia (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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4.8.4 PROVA BIOLGICA

A prova biolgica para diagnstico de raiva pode tambm ser chamada de inoculao em crebro de camundongo (ICC). Para isto so utilizados camundongos lactentes de 21 dias de idade. So utilizados cerca de 1 grama de material contendo fragmentos de cada segmento cerebral do material suspeito (hipocampo, cerebelo e crtex) que sero mascerados juntos com a utilizao de cadinho e pistilo (Figura 22). Este material ento diludo na concentrao 1:5 (peso-volume) em um diluente contendo gua deionizada ou soluo fisiolgica, soro equino e antibitico (lincomicina). Aps a obteno de uma papa, este material deve ser centrifugado em um tubo de falcon a 3.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante acondicionado em tubo tipo eppendorf em geladeira por no mnimo 1 hora para ao do antibitico. Em seguida, so inoculados 0,03mL via intracerebral em 10 camundongos de 21 dias (Figura 23). Os animais devem ser observados diariamente durante 30 dias no caso material proveniente de herbvoros, quirpteros e equinos, e observao de 21 dias no caso de caninos e felinos. Para materiais oriundos de equinos, a

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incoulao feita separadamente conforme o segmento cerebral, ou seja, so inoculados 10 camundongos para cada segmento. No caso de positividade os animais apresentaro plos arrepiados, dificuldade de locomoo, paralisia e morte (Figura 24). Para confirmao do resultado necessrio realizar a prova de imunofluorescncia direta do material cerebral dos camundongos que morrerem a partir do quarto dia aps inoculao. Anteriormente a esse perodo a morte pode ser devido trauma craniano ou a infeco bacteriana. Normalmente a morte dos camundongos ocorre entre o 7 e 9 dia ps inoculao, podendo levar mais tempo, o que comum com as amostras de eqinos, onde muitas vezes os camundongos comeam a apresentar sintomas no 18 dia e as vezes at mais tarde, havendo a necessidade de se observar os animais at 30 dias aps a inoculao.

Figura 22. Macerao do material cerebral suspeito de Raiva para inoculao em crebro de camundongo (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 23. Inoculao de material suspeito de Raiva em crebro de camundongo (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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Figura 24. Camundongos inoculados com material positivo para Raiva apresentando plos arrepiados, paralisia e morte (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

4.9 DIAGNSTICO DE ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

4.9.1 INTRODUO

anemia

infecciosa

equina

(AIE)

uma

doena infecciosa viral

potencialmente fatal aos eqdeos (UNITED STATES, 2003). causada por um lentivrus, o vrus da anemia infecciosa equina, da famlia Retroviridae (QUINN et al., 2005). A AIE pode comprometer irreversivelmente o desempenho dos animais suscetveis que so os equinos, mulas e burros de qualquer raa, idade e sexo. A doena conhecida mundialmente como febre do pntano. A AIE , at o momento,

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uma doena incurvel e a legislao pertinente preconiza o sacrifcio dos animais soropositivos (GONALVES & RIBEIRO, 2005). A transmisso do vrus feita mecanicamente por insetos hematfagos, sobretudo espcies Tabanus e de Stomoxys, que podem transferir o vrus para outro hospedeiro ao se alimentar (QUINN et al., 2005). A transmisso pode ocorrer tambm de forma vertical (intra-uterina) ou horizontal, por meio de utenslios contaminados (agulhas, freios, esporas e outros), leite materno e smen (GONALVES & RIBEIRO, 2005). Ocorre com mais freqncia no vero, durante perodos de alta atividade de insetos (QUINN et al., 2005). O risco de transmisso entre animais positivos para AIE e animais sadios aumenta com a prevalncia da doena na propriedade, a diversidade e abundncia dos vetores e a proximidade entre animais (GONALVES & RIBEIRO, 2005). O vrus replica-se em macrfagos, em moncitos e em clulas de Kupffer. Uma viremia associada a clulas desenvolve-se, com disseminao pelo organismo. Os equinos infectados tornam-se persistentemente infectados aps a insero do provrus no genoma das clulas hospedeiras (QUINN et al., 2005). A infeco resuta em episdios peridicos de anemia, hemorragias, trombocitopenia, leucopenia, supresso transitria da resposta imunolgica e aumento significativo nos nveis de cobre e enzimas hepticas. Sinais neurolgicos e leses no Sistema Nervoso Central tem sido associados doena. Podem apresentar ainda sinais clnicos como perda de peso, depresso, desorientao, andar em crculos e hipotermia, porm, nem todos os animais infectados apresentam sinais (GONALVES & RIBEIRO, 2005). O controle da disseminao da doena envolve minimizar ou eliminar o contato de eqdeos com secrees, excrees e sangue de animais soropositivos (UNITED STATES, 2003).

4.9.2 RECEBIMENTO DE AMOSTRAS

O material utilizado para o diagnstico da anemia infecciosa equina o soro sanguneo. Se for enviado o sangue total, sendo imediatamente dessorado por centrifugao a 3.000 rpm por 10 minutos. O soro deve estar devidamente acondicionado e enviado refrigerado ou congelado, no devendo estar hemolisado.

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Todo material recebido dever estar acompanhado pela ficha de requisio (ficha prpria, de cor branca), assinada pelo Mdico Veterinrio requisitante, e seu nmero junto ao CRMV (de preferncia, tambm o carimbo), constando tambm resenha do animal e todos os dados completos (proprietrio, animal e Mdico Veterinrio requisitante). Aps o recebimento do material, o mesmo registrado em pasta de arquivo prpria e acondicionar o soro em microtubos de plstico tipo eppendorf e manter congelado a 20C at o momento do exame.

4.9.3 IMUNODIFUSO EM GEL DE GAR

O diagnstico de anemia infecciosa equina, apesar de no ser uma zoonose, realizado no SDZ. Para isto, utiliza-se a tcnica de imunodifuso em gel de gar (IDGA) ou prova de Coggins. Esta prova se baseia na deteco de anticorpos. Para a prova de IDGA necessrio secar lminas lisas novas e coloc-las sobre uma placa de petri. Enquanto isto, deve-se preparar cerca de 25 mL de gel de gar, que ser composto de 0,25g de agarose, 1,25 mL de tampo borato, 23,25 mL de cloreto de sdio 5% e 0,25 mL de azida sdica 1%. Aquecer em banho maria tubos de gar Noble, tampo borato e gar base at a compela fuso do gar, que deve ficar translcido e homogneo. Em seguida, distribui-se 5 mL de gel por lmina (Figura 25), formando uma camada fina de gar sobre a mesma. Aps a solidificao em temperatura ambiente e com a placa de petri destampada, deixar de 1 a 2 horas em cmara mida dentro da geladeira. Fazer as cavidades com o furador (Figura 26), obedecendo a linha de marcao e aspirar o gar de cada cavidade com a bomba de vcuo. Em cada lmina podem ser realizadas 3 rosetas e cada cavidade deve estar bem seca e sem defeitos na borda do gar. O soro teste, soro controle e antgeno devem ser pipetados de acordo com o protocolo (Figura 27). So pipetados 25 L do antgeno na cavidade central, 25 L do controle em cada uma das cavidades da borda, intercaladas pelos soros testes, que tambm so pipetados 25 L em cada cavidade. Incubar em cmara mida em estufa a 25C, durante 48 horas. A leitura inicial realizada em 24 horas e final depois de 48 horas.

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Figura 25. Distribuio do gel de Agar em lmina para diagnstico de Anemia Infecciosa Equina (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

Figura 26. Utilizao do furador para o preparo de lmina para diagnstico de Anemia Infecciosa Equina (FONTE: SDZ/FMVZ/UNESP).

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Figura 27. Protocolo para lmina de diagnstico de Anemia Infecciosa Equina.

5. DISCUSSO

Conforme discutido na introduo, as atividades laboratoriais podem ajudar mdicos e veterinrios a responderem questes envolvendo diagnstico, terapia e prognstico de um paciente (HUGH-JONES et al., 1995), fato que pode ser notado durante o estgio curricular no Servio de Diagnstico de Zoonoses, uma vez que imprescindvel noes do histrico do animal e sua situao clnica para uma correta interpretao dos laudos, que usualmente realizada em conjunto com os funcionrios do laboratrio. Os laboratrios locais geralmente promovem uma interface entre o setor privado e instituies pblicas nos nveis estaduais e nacionais (HUGH-JONES et al., 1995), que tambm pde ser observado durante o estgio, sendo que o SDZ recebia amostras de Prefeituras locais para o programa de monitoramento da raiva urbana e tambm amostras de animais suspeitos de leishmaniose, sendo responsvel pela notificao de resultados positivos s Vigilncias Epidemiolgicas das Prefeituras envolvidas. O estgio permitiu a satisfao plena de todas as minhas expectativas, atravs do aprendizado de tcnicas diagnsticas, epidemiologia, patogenia das diversas doenas bem como da sua importncia em sade pblica.

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6. CONSIDERAES FINAIS

O estgio no Servio de Diagnstico de Zoonoses na UNESP Botucatu permitiu a realizao plena dos objetivos gerais e especficos, abrangendo no somente as tcnicas diagnsticas como tambm o reconhecimento da importncia de conhecimentos multidisciplinares para uma correta interpretao dos resultados, bem como noes gerais de gerenciamento de um laboratrio de diagnstico como este.

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8. PREVENTING RABIES TRANSMITTED BY BATS IN RAIN FOREST PRESERVED AREAS OF SOUTHERN BRAZILIAN COAST
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Corresponding author: Alexander Welker Biondo Name of the Institution: Universidade Federal do Paran, Brazil Place where the work was carried out: City of Guaraqueaba, Curitiba surroundings, Paran State, Southern Brazil Title: Preventing rabies transmitted by bats in rain forest preserved areas of Southern Brazilian coast. Running title: preventing rabies by bats Authors: Kikuti, Mariana; Departamento de Medicina Veterinria, Universidade Federal do Paran, Curitiba, 80035, Brazil Pierre, Elzira Jorge; Secretaria Estadual da Agricultura e do Abastecimento do Estado do Paran, Curitiba, 80035, Brazil Silva, Maria do Carmo Pessa; Secretaria Estadual da Agricultura e do Abastecimento do Estado do Paran, Curitiba, 80035, Brazil Paploski, Igor Adolfo Dexheimer; Departamento de Universidade Federal do Paran, Curitiba, 80035, Brazil Medicina Veterinria,

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Oliveira, Eduardo Alexandre de; Departamento de Universidade Federal do Paran, Curitiba, 80035, Brazil

Medicina

Veterinria,

Souza, Pauline Sperka de; Secretaria Estadual da Agricultura e do Abastecimento do Estado do Paran, Curitiba, 80035, Brazil da Silva, Antnio Waldir Cunha; Departamento de Universidade Federal do Paran, Curitiba, 80035, Brazil Medicina Veterinria,

Biondo, Alexander Welker; dual affiliation: Universidade Federal do Paran, Departamento de Medicina Veterinria, Universidade Federal do Paran, Curitiba, 80035, Brazil and University of Illinois, Urbana, IL 61802, USA. Corresponding author: Dr. Alexander W. Biondo. Departamento de Medicina Veterinria, Setor de Cincias Agrrias, Campus Agrrias, Universidade Federal do Paran. Rua dos Funcionrios 1540, Juvev, Curitiba, Paran State, 80035, Brazil. +55 41 3350-5723. E-mail address: abiondo@illinois.edu

Summary Guaraqueaba city is a rain forest environmental protected area located at the Southern coast of Brazil. The local Health Service has noticed in past years bats feeding from humans and domestic animals, and bat colonies located in local houses and schools. In 2007, two non hematophagous bats were tested positive on direct immunofluorescence for rabies in a nearby city. Native fauna and environmental laws protect non hematophagous bats in Brazilian protected areas such as Guaraqueaba, making non hematophagous bat population control almost impossible. Accordingly, the aim of this study was to evaluate a prevention protocol on rabies transmitted by bats based on lectures and post-evaluation in local elementary schools, which were also geo-referenced for further monitoring. Interdisciplinary task force included health, agricultural sectors and areas of environment, education and community participation. Several students referred handling and playing with bats at day time, exposing themselves to what may actually represent a higher risk of rabies transmission then hematophagous bat feeding directly from humans. Training of teachers and students may effectively spread rabies prevention information in their communities. Insertion of this subject into science contents of the local elementary school educational program was proposed in order to establish a continuing education program on public health.

Keywords Rabies, prevention, education, bats, schools

Bullet Ponts

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1. Rabies transmitted by non-hematophagus bats has been a growing concern on tropical countries, particularly because they are protected by environmental and native fauna laws. 2. Non-hematophagus bats may daily share common spaces with people in preserved areas when living in human-made facilities such as schools, houses and churches. 3. Education in schools of preserved areas about non-hematophagus bat role on the ecosystem balance of rain forests along with the potential diseases they may transmit may be crucial to rabies prevention associated to environmental preservation.

Introduction Rabies is characterized as one of the most important zoonoses due to its large number of human deaths per year (Hemachudha et al., 2002). All mammals can became ill with rabies and its transmittion can occur through contaminated animals' saliva (Greene, 2006). Since bats are the only mamals capable of flying and some of them feeding from blood (hematophagous or vampires), they are considered as potencial responsibles for the rabic virus' spread. Infection of wild animals, domestic animals and human beings occur by inoculating contaminated saliva when feeding (Greene, 2006). Not surprisingly, both hematophagous and non-hematophagous bats are the most common wildlife animal involved in human rabies (Belloto et al., 2005). Vampire attacks on humans are common in several areas of Latin America (Belotto et al., 2005), and rabies transmition from bats to humans has been reported in the last 70 years in Brazil, Mexico, Guianas, Bolivia, Argentina, Suriname and Peru (Lopez et al., 1992). Cases of human rabies transmitted by bats were increasing in Brazil between 1980 and 1990 (Mayen, 2003, Cunha et al., 2006, Scheffer et al., 2007), requiring special atention due to its adaptation to human made structures as schools and churches. Outbreaks of bat-transmitted rabies are usually related to recurring factors such as small, remote populations, environmental changes by human activity (deforestation, domestic animals), poor living conditions, difficult access to health services, lack of community awareness on bat-transmitted rabies (Schneider, 2009). Guaraqueaba city, Paran State shore, Southern Brazil, is a rain forest environmental protected area formed by small communities which fit into most of these risk factors. The city of Guaraqueaba is formed by the continental part and several islands, the entire municipality is inside an Ambiental Protection Area (APA) and is kept as one of the few natural reserves of the former Atlantic Forest in Brazil. According to brazilian legislation, an APA has the main objective of protect the biological biodiversity, being the activities desenvolved in the area under a several restrictions. Bats play an important role in seed dispersion, plant pollination and natural insect control; their interaction with natural enviroment may be a complex and delicate balance on natural ecossystem dinamics (Kunz and Pierson, 1994, Mayen, 2003). This regulation of animal populations occurs through the predation of arthropodes and small vertebrates such as night-flying insects like mosquitoes and moths (Medelln, 1998). Due to the fact that bats have an important role in the enviroment maintenance and that Guaraqueaba is located inside an APA, it is

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impossible to take drastic measures in controling the hematophagous bats population, such as the sistematic use of warfarin gel, which would eliminate a high number of bats and could bring an environmental unbalance. Local Health Service has noticed in past years bats feeding from humans and domestic animals such as dogs, cats, horses and poultry. Also, bat colonies were reportedly found in houses and schools. The island of Sibu was the place where the aggressions complaining mostly occured. In Pontal do Paran, city located approximately 20 km of Guaraqueaba, two non hematophagous bats tested positive on direct immunofluorescence for rabies by the Agriculture Secretariat of Paran State (Secretaria de Agricultura e do Abastecimento do Estado do Paran). This fact increases the risk of circulation of the virus among bat colonies in Guaraqueaba. For these reasons, a bat-transmitted rabies prevention protocol based on lectures on public health directed to teachers and students and post-evaluation in local elementary schools was prepared by students and professors of Universidade Federal do Paran Veterinary School (UFPR), SEAB employees and the City Hall of Guaraqueaba. The schools were also geo-referenced for further monitoring.

Materials and Methods The protocol for bat-transmitted rabies prevention in Guaraqueaba city consisted of an interdisciplinary task involving health and agricultural sectors and also areas of environment, education and community participation. It counted with the participation of 6 Veterinary graduation students, 2 professors from UFPR and 7 Animal Health Service employees from SEAB. The participants were divided in 5 groups of 3 people each. All 31 elementary schools of the municipality were visited from April 13th to 18th, 2008. Each group was equipped with one GPS, one laptop, the schedule of schools to be visited, questionnaires to be applied to students and teachers, additional teaching material about rabies to be distributed to the teachers and a comic book about how to prevent rabies to be distributed to the students. The transportation of the groups from the base to each school occurred by car to the groups that were visiting schools on the continent parts of Guaraqueaba or by motorboat to the groups that were visiting schools on the islands. All of the schools were previously aware of this event through the Municipal Secretary of Education of Guaraqueaba and, in addition, each group brought with themselves an official letter allowing the activity to be presented to the schools responsible. After that, the group filled out a note paper with the geo-reference of the school and additional comments, such as presence of bats or bats traces. A questionnaire of 14 questions was applied to each teacher about their previous acknowledgment of rabies. A 50 minutes lecture addressed mainly to the students began with the use of a leptop. On those schools which electricity was not provided, the laptop worked on battery. The lectures focused on general information on rabies, urban and sylvatic cycle of the disease, clinical signs in animals and symptoms in humans attacked by rabid bats, how to prevent rabies, general information on the types of bats and their importance to the environment, and mainly the procedures to be taken in cases of bat attacks directly to humans or animals. To strengthen the information, a cartoon video was shown to the students on how to prevent animal rabies, produced by Pasteur Institute of So Paulo. In order to evaluate the knowledge acquired from the lecture, a questionnaire of eight questions was then applied to the literate students. At the end of the

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participation on each school, all students received a comic book named Abaixo a Raiva (Stop Rabies) and a booklet with recommendations on how to prevent rabies.

Results As a result of this protocol, 31 elementary schools were geo-referenced, 684 students attended to an educational lecture on rabies transmitted by bats and learned the procedures to be taken in cases of bat aggression to people. In addition to that, through the questionnaires applied to 50 teachers before the lectures it was possible to realize that 46% (23/50) of them have a university degree, while 20% (10/50) have not finished the graduation, 30% (15/50) have finished high school and 4% (2/50) have not finished high school. 90% (45/50) of the teachers claimed teaching health subjects and 98% (48/49) claimed discussing zoonosis with their students. When questioned about the information on rabies previously received, 51% (25/49) have not recieved any. 27% (13/47) of the teachers did not know or answered mistakenly the question about what kind of microorganism causes rabies. 88% (43/49) of them recognize the bats as animals susceptible to rabies, 0% (0/49) fishes, 51% (25/49) swine, 12% (6/49) poultry, 96% (47/49) cats and dogs and 71% (35/49) recognize equine and bovine as susceptible, while 2% (1/49) of the teachers did not know the answer to this question. About the transmission of rabies, 92% (42/50) recognize dog bites as a source of transmission, 26% (13/50) cat scratches, 38% (19/50) bovines saliva, 90% (45/50) bat bites and 2% (1/50) mistakenly recognize insect bites as a source of transmission. When questioned about rabies signs in bats, 63% (26/41) identify changes of natural behavior such as flying during the day and 32% (13/41) as walking on the floor as a sign of the disease. About the signs of rabies in livestock animals, 88% (37/42) recognize salivation as a sign, 74% (31/42) hostility, 26% (11/42) paralysis of members and 5% (2/42) do not recognize that rabies affects these animals. Regarding the vaccination as a prevention of rabies, 76% (29/38) of the teachers recognize the vaccination of people and 96% (46/48) the vaccination of animals as effective ways of prevention. 4% (2/50) of the teachers claimed already have been asked for advice by people of the community bitten by bats and all instructed correctly the prophylactic measures to be taken such as wash the injury and seek for medical assistance. Regarding the questionnaire applied to the students, 94% (307/325) recognize dogs as susceptible to rabies, 82% (267/325) ovine, 83% (271/325) swine, 91% (295/325) equine, 94% (306/325) bovine and 10% (33/325) fishes. When questioned about rabies transmission sources to humans, 75% (243/325) recognize handling bats, 75% (243/325) contact with bovines saliva, 88% (286/325) bat bites and 82% (267/325) dog bites. 86% (214/250) of the students claim bats are able to enter residences and can bite the inhabitants. Regarding the procedures to be taken in cases of bat bites, 94% (225/240) of the students answered correctly that the injury should be washed with soap and water and the person should seek medical assistance. When questioned about ways to prevent bats entering the residences, 87% (255/293) of them answered keeping doors and windows closed and blocking all holes in the house. Also, through additional comments noted by the groups about the schools, it was possible to realize that in every school at least one person related the cohabitation of bats and the people from the community and several students related handling bats.

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Discussion In small populations like these in Guaraqueaba city, that constantly cohabit with wild animals, specially bats, monitoring the populations at risk is very important, as well as health education. Some of the recommendation of rabies experts on prevention of bat-transmitted rabies such as greater rabies awareness in at-risk populations and epidemiological surveillance were stimulated with this project. Also, it was able to form an intersectoral approach on rabies prevention involving health, agricultural sectors and areas of environment, education and community participation as recommended by specialists (Schneider, 2009, Schneider et al., 2009), being this project a well succeeded experience regarding the concept of one world, one health. The questionnaire applied to teachers shows that many investments in their education still need to be done, specially regarding health issues. Health education is considered to be an important tool on the prevention of several diseases (Dandoy and Scanlon, 1999), yet most educational systems are not ready to insert this content in schools. In Asian countries, from patients seeking post-exposure only 15% of them reported learning about rabies in school. Public Health education in schools as part of the educational system could make a difference mainly instructing how to first aid care to the wound properly and to seek the nearest rabies prevention centre as soon as possible (Dodet et al., 2008). Evaluating the questionnaires answered by the students, it was possible to conclude that at a first moment, this protocol is effective on health education. The protocol is also effective regarding the diagnosis of the community real situation. The educational program should be continuing, forming teachers and students as a reference in prevention in their communities. For this to be possible, additional teaching material was distributed to the teachers and there was a proposition of inserting this subject in the science classes of the countys Public Educational System. Analyzing the additional comments made by the groups about the schools it was possible to realize that before the lectures, most of the students and the teachers didnt realize the risk of cohabiting with bats or even the risk of bats spoliation to people, since some of the students claimed knowing someone that have been already bitten by chiropters. Also, many of them related handling and played with bats, exposing themselves to diseases in a way that may represent a higher risk of rabies transmission that the feeding habits of hematophagous bats directly to humans.

References Belotto, A., Leanes, L.F., Schneider, M.C., Tamayo, H. and Correa, E. Overview of rabies in the Americas. Virus Research 111: 5-12, 2005. Brazil. Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis. Instruo Normativa n 141, de 19 de dezembro de 2006. Brazil. Lei Federal n 6.902, de 27 de abril de 1981. Brazil. Lei Federal n 5.197, de 3 de janeiro de 1.967.

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Chomel, B. B. The modern epidemiological aspects of rabies in the world. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 16:11-20, 1993. Cunha, E.M.S., Silva, L.H.Q., Lara, M.C.C.S.H., Nassar, A.F.C., Albas, A., Sodr, M.M. and Pedro, W.A. Bat rabies in the north-northwestern regions of the state of So Paulo, Bazil: 1997-2002. Rev Sade Pblica, 40(6): 1082-6. 2006. Dandoy, S. and Scanlon, F. Teaching Kids about rabies. American Journal of Public Health. 89(3): 413-414. March, 1999. Dodet, B., Goswami, A., Gunasekera, A., Guzman, F., Jamali, S., Montalban, C., Purba, W., Quiambao, B., Salahuddin, N., Sampath, G., Tang, Q., Tantawichien, T., Wimalaratne, O. and Ziauddin, A. Rabies awareness in eight Asian countries. Vaccine. Vol. 26, p. 6344-6348. 2008. Gonalves, M. A. S. Estudo da relao causal do surto de raiva em 1991/1992 provocado por morcegos em trs municpios (Conde, Apor e Ipir) do estado da Bahia. Monografia de bacharelado, Universidade Federal da Bahia, Salvador Bahia, 1997. Greene, C. E. Infectious Diseases of the Dog and Cat, 3 edition, Saunders Elsevier, St. Louis, Missouri, U.S.A., 2006. Hemachudha, T., Laothamatas, J. and Rupprecht, C. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. The Lancet Neurology. Vol. 1, p. 101-109. June, 2002. Kalko, E.K.V. 1997. Diversity in tropical bats, p. 13-43. In: H. ULRICH (Ed.). Tropical biodiversity and systematics. Proceedings of the International Symposium on Biodiversity and Systematics in Tropical Ecosystems, Bonn, Zoologisches Forschungsinstitut und Museum Alexander Koenig. 1994. Kunz, T.H. and Pierson, E.D. Bats of the World: an introduction, p. 1-46. In: R.W. OWAK (Ed.). Walkers bats of the World. Baltimore, The Johns Hopkins University Press, 287p. 1994. Lopez, R. A., Miranda, P. P., Tejada, V. E. and Fishbein, D. B. Outbreak of human rabies in the Peruvian jungle. The lancet 339: 408-412, 1992. Mayen, F. Haematophagous Bats in Brazil, Their Role in Rabies Transmission, Impact on Public Health, Livestock Industry and Alternatives to an Indiscriminate Reduction of Bat Population. J. Vet. Med. B 50, 469472, 2003. Medelln, R. A. Prey of Chrotopterus auritus, with notes on feeding behavior. Journal of Mammalogy, 69(4): 841-844. 1988. Patterson, B. and Pascual, R. The fossil mammal fauna of South America, p. 247309. In: KEAST, A., ERK, F.C. and GLASS, B. (Eds). Evolution, mammals and southern continents. Albany, State University New York Press, 543p. 1972. Scheffer, K.C., Carrieri, M.L., Albas, A., Santos, H.C.P., Kotait, I. and Ito, F.H. Rabies virus in naturally infected bats in the State of So Paulo, Southeastern Brazil. Rev Sade Pblica, 41(3), 2007.

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Schneider, C. Human rabies from vampire bats: emerging in Latin America? Rabid Bytes Newsletter 13, p. 6. 2009. Schneider, M.C., Romijn, P.C., Uieda, W., Tamayo, H., da Silva, D.F., Belotto, A., da Silva, J.B. and Leanes, L.F. Rabies transmitted by vampire bats to humans: An emerging zoonotic disease in Latin America? Rev Panam Salud Publica/ Pan Am J Public Health. 25(3): 260-269. 2009.

Este artigo seguiu as normas para submisso de artigo completo constantes nas instrues aos autores da revista Zoonoses and Public Health.

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9. ANEXO

9.1 NORMAS PARA SUBMISSO DE ARTIGO COMPLETO DA REVISTA ZOONOSES AND PUBLIC HEALTH

Zoonoses and Public Health

Edited by: Mary Torrence Print ISSN: 1863-1959 Online ISSN: 1863-2378 Frequency: Ten times a year Current Volume: 56 / 2009 ISI Journal Citation Reports Ranking: 2008: 44/51 Infectious Diseases; 37/134 Veterinary Sciences Impact Factor: 1.333

TopAuthor Guidelines
Content of Author Guidelines: 1. General, 2. Ethical Guidelines, 3. Submission of Manuscripts, 4. Manuscript Types Accepted, 5. Manuscript Format and Structure, 6. After Acceptance. Relevant Documents: Copyright Transfer Agreement Form; Colour Work Agreement Form; Online Open Exclusive Licence Form Useful Websites: Submission Site, Articles published in Zoonoses and Public Health, Author Services, Wiley-Blackwell Publishing's Ethical Guidelines, Guidelines for Figures

1. GENERAL
Zoonoses and Public Health brings together veterinary and human health researchers and policy-makers by providing a venue for publishing integrated and global approaches to zoonoses and public health. The Editors will consider papers that focus on timely collaborative and multi-disciplinary research in zoonoses and public health. This journal provides rapid publication of original papers, reviews, and potential discussion papers embracing this collaborative spirit. Papers should advance the scientific knowledge of the sources, transmission, prevention and control of zoonoses and be authored by scientists with expertise in areas such as microbiology, virology, parasitology and epidemiology. Articles that incorporate recent data into new methods, applications, or approaches (e.g. statistical modeling) which enhance public health are strongly encouraged. Please read the instructions below carefully for details on the submission of manuscripts, the journal's requirements and standards as well as information concerning the procedure after a manuscript has been accepted for publication in Zoonoses and Public Health. Authors are encouraged to visit Wiley-Blackwell Publishing's Author Services for further information on the preparation and submission of articles and figures.

2. ETHICAL GUIDELINES
Zoonoses and Public Health adheres to the below ethical guidelines for publication and research. 2.1. Authorship and Acknowledgements Authorship: Authors submitting a paper do so on the understanding that the manuscript has been read and approved by all authors and that all authors agree to the submission of the manuscript to the Journal. ALL named authors must have made an active contribution to the conception and design and/or analysis and interpretation of the data and/or the drafting of the paper and ALL must have critically reviewed its content and have approved the final version submitted for publication. Participation solely in the acquisition of funding or the collection of data does not justify authorship and, except in the case of complex large-scale or multi-centre research, the number of authors should not exceed six. Zoonoses and Public Health adheres to the definition of authorship set up by The International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE). According to the ICMJE authorship criteria should be based on 1) substantial contributions to conception and design of, or acquisition of data or analysis and interpretation of data, 2) drafting the article or revising it critically for important intellectual content and 3) final approval of the version to be published. Authors should meet conditions 1, 2 and 3. It is a requirement that all authors have been accredited as appropriate upon submission of the manuscript. Contributors who do not qualify as authors should be mentioned under Acknowledgements.

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Acknowledgements: Under Acknowledgements please specify contributors to the article other than the authors accredited. Please also include specifications of the source of funding for the study and any potential conflict of interests if appropriate. Suppliers of materials should be named and their location (town, state/county, country) included. 2.2. Ethical Approvals Experimental Subjects: experimentation involving human subjects will only be published if such research has been conducted in full accordance with ethical principles, including the World Medical Association Declaration of Helsinki (version, 2002 www.wma.net/e/policy/b3.htm) and the additional requirements, if any, of the country where the research has been carried out. Manuscripts must be accompanied by a statement that the experiments were undertaken with the understanding and written consent of each subject and according to the above mentioned principles. A statement regarding the fact that the study has been independently reviewed and approved by an ethical board should also be included. Editors reserve the right to reject papers if there are doubts as to whether appropriate procedures have been used. When experimental animals are used the methods section must clearly indicate that adequate measures were taken to minimize pain or discomfort. Experiments should be carried out in accordance with the Guidelines laid down by the National Institute of Health (NIH) in the USA regarding the care and use of animals for experimental procedures or with the European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and in accordance with local laws and regulations.All studies using human or animal subjects should include an explicit statement in the Material and Methods section identifying the review and ethics committee approval for each study, if applicable. Editors reserve the right to reject papers if there is doubt as to whether appropriate procedures have been used. Ethics of investigation: Papers not in agreement with the guidelines of the Helsinki Declaration as revised in 1975 will not be accepted for publication. 2.3 Appeal of Decision Authors who wish to appeal the decision on their submitted paper may do so by e-mailing the editorial office with a detailed explanation for why they find reasons to appeal the decision.

2.4 Permissions
If all or parts of previously published illustrations are used, permission must be obtained from the copyright holder concerned. It is the author's responsibility to obtain these in writing and provide copies to the Publishers. 2.5 Copyright Authors submitting a paper do so on the understanding that the work and its essential substance have not been published before and is not being considered for publication elsewhere. The submission of the manuscript by the authors means that the authors automatically agree to sign a Copyright Transfer Agreement form when the manuscript is accepted for publication. The work shall not be published elsewhere in any language without the written consent of the publisher. The articles published in this journal are protected by copyright, which covers translation rights and the exclusive right to reproduce and distribute all of the articles printed in the journal. No material published in the journal may be stored on microfilm or videocassettes, in electronic databases and the like, or reproduced photographically without the prior written permission of the publisher. Authors are required to sign a Copyright Transfer Agreement (CTA) for all papers accepted for publication. Signature of the CTA is a condition of publication and papers will not be passed to the publisher for production unless a signed form has been received. Please download the Copyright Transfer Agreement here. Please send completed copyright forms to the editorial assistant: Gareth Watkins. OnlineOpen is a pay-to-publish service from Wiley-Blackwell that offers authors whose papers are accepted for publication the opportunity to pay up-front for their manuscript to become open access (i.e. free for all to view and download) via the Wiley InterScience website. Each OnlineOpen article will be subject to a one-off fee of $3000 to be met by or on behalf of the Author in advance of publication. Upon online publication, the article (both full-text and PDF versions) will be available to all for viewing and download free of charge. Any authors wishing to send their paper OnlineOpen will be required to complete the payment form (OOF) available from our website at: http://www.blackwellpublishing.com/pdf/OnlineOpen_ELF_ZPH.pdf (Please note: this form is for use with OnlineOpen material ONLY. ) Once complete this form should be sent to the Editorial Office along with the rest of the manuscript materials at the time of acceptance or as soon as possible after that (preferably within 24 hours to avoid any delays in processing). Prior to acceptance there is no requirement to inform an Editorial Office that you intend to publish your paper OnlineOpen if you do not wish to.

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For questions concerning copyright, please visit Wiley-Blackwell Publishing's copyright FAQ.

3. SUBMISSION OF MANUSCRIPTS
Manuscripts should be submitted electronically via the online submission site ScholarOne Manuscripts. The use of an online submission and peer review site speeds up the decision-making process, enables immediate distribution, and allows authors to track the status of their own manuscripts. If assistance is needed (or if for some reason online submission is not possible), the Editorial Office can be contacted and will readily provide any help users need to upload their manuscripts. Editorial Office: Gareth Watkins e-mail: gwatkins@wiley.com Online Submission:To submit a manuscript, please follow the instructions below. 3.1 Getting Started 1. Launch your web browser (Internet Explorer 5 or higher or Netscape 7 or higher) and go to the journal's ScholarOne Manuscripts homepage (http://mc.manuscriptcentral.com/zph).2. Log-in or click the 'Create Account' option if you are a first-time user of ScholarOne Manuscripts. If you are creating a new account.- After clicking on 'Create Account', enter your name and e-mail information and click 'Next'. Your e-mail information is very important.- Enter your institution and address information as appropriate, and then click 'Next.'- Enter a user ID and password of your choice (we recommend using your e-mail address as your user ID), and then select your area of expertise. Click 'Finish'.4. Log-in and select 'Author Center.' 3.2 Submitting Your Manuscript 5. After you have logged in, click the 'Submit a Manuscript' link in the menu bar.6. Enter data and answer questions as appropriate. You may copy and paste directly from your manuscript and you may upload your pre-prepared covering letter.7. Click the 'Next' button on each screen to save your work and advance to the next screen.8. You are required to upload your files.- Click on the 'Browse' button and locate the file on your computer.- Select the designation of each file in the drop down next to the Browse button.- When you have selected all files you wish to upload, click the 'Upload Files' button.9. Review your submission (in PDF format) before sending to the Journal. Click the 'Submit' button when you are finished reviewing. You may suspend a submission at any phase before clicking the 'Submit' button and save it to submit later. After submission, you will receive a confirmation e-mail. You can also access Manuscript Central any time to check the status of your manuscript. The Journal will inform you by e-mail once a decision has been made. 3.3. Manuscript Files Accepted Manuscripts should be uploaded as Word (.doc) or Rich Text Format (.rft) files (not write-protected) plus separate figure files. GIF, JPEG, PICT or Bitmap files are acceptable for submission, but only high-resolution TIF or EPS files are suitable for printing. The files will be automatically converted to a PDF document on upload and will be used for the review process. The text file must contain the entire manuscript including title page, abstract, text, references, tables, and figure legends, but no embedded figures. Figure tags should be included in the file. Manuscripts should be formatted as described in the Author Guidelines below. Please note that any manuscripts uploaded as Word 2007 (.docx) will be automatically rejected. Please save any .docx file as .doc before uploading. Revised manuscripts must be uploaded within 2 months of authors being notified of conditional acceptance pending satisfactory revision. Final manuscript must be accompanied by a signed Copyright Transfer Agreement form (see Section 2.5 for more details). Reviewers evaluate the papers, the Editors decide on acceptance, changes, or rejection. No changes will be made without the approval of the author. Your manuscript will be destroyed three months after publication. Only appropriately marked originals will be returned. The publisher cannot be held responsible for any damage or loss through the post. 3.4. Blinded Review All manuscripts submitted to Zoonoses and Public Health will be reviewed by two experts in the field. Zoonoses and Public Health uses single-blinded review. The names of the reviewers will thus not be disclosed to the author submitting a paper. Please upload: Your manuscript with title page under the file designation 'main document' Figure files under the file designation 'figures'

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All documents uploaded under the file designation 'title page' will not be viewable in the HTML and PDF format you are asked to review at the end of the submission process. The files viewable in the HTML and PDF format are the files available to the reviewer in the review process.

4. MANUSCRIPT TYPES ACCEPTED

Original Articles should not exceed 20 typewritten pages, including illustrations, tables and references. Short Communications should not exceed 5 typewritten pages, including figures, tables and references. Short Communications may be published more rapidly. Review articles - including illustrations, tables and literature references - should not exceed 40 typewritten pages (format DIN A4 or 8.5 11'). The number of illustrations and tables must be kept to a minimum.

5. MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE

5.1. Format Language: The language of publication is English. Authors for whom English is a second language must have their manuscript professionally edited by an English speaking person before submission to make sure the English is of high quality. It is preferred that manuscripts are professionally edited. A list of independent suppliers of editing services can be found at http://authorservices.wiley.com/bauthor/english_language.asp. All services are paid for and arranged by the author, and use of one of these services does not guarantee acceptance or preference for publication. Abbreviations, Symbols and Nomenclature: All specifications must be stated according to the S.I. system. Concentrations of chemical solutions are to be given in mol/l. All other concentrations should be given in % (volume or weight). Any abbreviations of chemical, biological, medical or other terms should only be employed when it is certain that they are internationally known. The full name must be stated in brackets when the abbreviation is first used. All biological, medical, chemical or other terms should be used according to the most recent recommendations of the respective international nomenclature. Enzymes should be given in I.U. (International Units), according to Enzyme Nomenclature (Elsevier Publishing Co., 1965). In the case of commercially obtained substances or reagents, when they are first mentioned in the text, the name and address of the manufacturer or supplier should be given as a footnote. Products (preparations etc.) with a registered trademark should be marked with . Bacterial names should be in accordance with the latest edition of Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (The Williams and Wilkins Co., Baltimore). Viruses are to be given the classification and names recommended by the International Committee on the Nomenclature of Viruses. Names of micro-organisms and zoological names will be printed in italics and should be underlined in the manuscript. 5.2. Structure All manuscripts submitted to Zoonoses and Public Health should include: On page one of the manuscript, please include the corresponding author, name of the institution, place where the work was carried out, title of the manuscript, names of the authors, the addresses of the authors and the e-mail address of the corresponding author. Each original article should be divided into Summary and Keywords, Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion and References. Summaries should not be longer than 300 words and up to six keywords should be provided. Please also include three bullet points, of around 100 words only, explaining the importance of the paper's findings for a non-specialist audience. These points will be published at the top of the article in a box entitled 'Impacts'. The manuscript comprises the text and a list of all figures and tables with their captions and titles in a separate file. We ask that you convey the essential information within the first 60 characters of the captions to accommodate the online edition. Each figure, table, and bibliographic entry must have a reference in the text. For all figures please include reproduceable artwork (marked with the author's name, short title, and figure number). Any corrections requested by the reviewer should already be integrated into the file. The data files must be PC/Windows-compatible. Please send the figures as separate files and do not import them into the text file. The text should be prepared using standard software (Microsoft Word, Word Perfect) or saved in rtf format; do not use automated or manual hyphenation. Please do not include footnotes. Optimizing Your Abstract for Search Engines Many students and researchers looking for information online will use search engines such as Google, Yahoo or similar. By optimizing your article for search engines, you will increase the chance of someone finding it. This in turn will make it more likely to be viewed and/or cited in another work. We have compiled these guidelines to enable you to maximize the web-friendliness of the most public part of your article.

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5.3. References
We recommend the use of a tool such as EndNote or Reference Manager for reference management and formatting.EndNote reference styles can be searched for here:http://www.endnote.com/support/enstyles.asp Reference Manager reference styles can be searched for here:http://www.refman.com/support/rmstyles.asp Each original paper should include bibliographical references which should be restricted to the necessary minimum. The name of the journal in which the paper cited appears should be listed in the form of the abbreviated title from the cover of the journal concerned, otherwise use the abbreviations contained in a Bibliographic Guide for Editors & Authors from Chemical Abstracts, which is available in all major libraries, or the World List of Scientific Periodicals, 4th ed., London 1963-65. Anonymous contributions should be placed at the beginning of the list of references. The list of references should be in alphabetical order of first authors' names. Please ensure that references in the text exactly match those in the manuscript's reference list. If editing sections of text please ensure that any references that are affected are amended accordingly in the reference list. Reference to personal communications and unpublished results should be in the text only i.e. (Animal Health Care Flanders, personal communication, 2006) or (Zhang, F., unpublished results). Examples: JournalCreus, E., J. F. Perez, B. Peralta, F. Baucells, and E. Mateu 2007: Effect of acidified feed on the prevalence of Salmonella in market-age pigs. Zoonoses Public Health 54, 314-319. On, S. L. W., and B. Holmes, 1992: Assessment of enzyme detection tests useful in identification of campylobacteria. J. Clin. Microbiol. 30, 746-749. BookZeveloff, S. I. 2002: Raccoons: A Natural History. Smithsonian Institution Press, Washington, D. C. Chapter in Edited BookEasterday, B. C., V. S. Hinshaw, and D. A. Halvorson, 1997: Influenza. In: Calnek, B.W., H. J. Barnes, C. W. Beard, L. R. McDougald, and Y. M. Saif (eds), Disease of Poultry, 10th Edn, pp. 583-606. Iowa State University Press. Ames, IA. ReportSealander, J. A., P. S. Gipson, M. E. Cartwright, and J. M. Pledger, 1975: Behaviour and Physiological Studies of Relationships between White-tailed Deer and Dogs in Arkansas. Final Report to Arkansas Game and Fish Commission. Department of Zoology, University of Arkansas, Fayetteville. WebpageUSDA-APHIS, 2004: Cooperative Rabies Management Program National Report 2004. Available at: http://www.aphis.usda.gov/ws/rabies/annual_report/NationalReport_2004.pdf (accessed on 30 April 2008). References in the text to literature in the Reference List should be given by placing in parenthesis the name(s) of the author(s), adding the year of publication (e.g.: Popoff and Le Minor, 1992). The editor and publisher recommend that citation of online published papers and other material should be done via a DOI (digital object identifier), which all reputable online published material should have - see www.doi.org/ for more information. If an author cites anything which does not have a DOI they run the risk of the cited material not being traceable.

5.4. Tables, Figures and Figure Legends

5.4 Illustrations and Tables Figures should be saved in a neutral data format such as TIFF or EPS. Powerpoint and Word graphics are unsuitable for reproduction. Please do not use any pixel-oriented programmes. Photographs or drawings submitted for publication with the manuscript must be of high quality, distinct and well-focused, if they are to be suitable for reproduction. Scanned figures (only in TIFF format) should have a resolution of 300 dpi (halftone) or 600 to 1200 dpi (line drawings) in relation to the reproduction size. Please submit the data for figures in black and white. Colour Figures Colour photos can be reproduced in black and white (with a possible loss of contrast). Figures printed in colour are subject to an added charge. In the event that an author is not able to cover the costs of reproducing colour figures in colour in the printed version of the journal, Zoonoses and Public Health offers authors the opportunity to reproduce colour figures in colour for free in the online version of the article (but they will still appear in black and white in the print version). Colour print charges are explained on the Colour Work Agreement Form. Colour graphics should be created using the CMYK colour palette (print colours), not RGB (monitor colours). There is a charge for alterations to figures when carried out by the publisher. Please note that figures will generally be reduced to fit within the column-width or the print area. This means that numbering and lettering must still be readable when reduced (e.g. maps) and that the scale might not correspond with the original (microscopic pictures), thereby invalidating references to scale in the text. If a figure is to be cropped, please mark the lines on a photocopy or tracing paper. Printouts should be made with a laserprinter at the highest resolution (> 600 dpi). If artwork is to be scanned, line drawings should only be contour drawings without halftones (shades of grey). Please do not use patterns; rough hatching is possible.

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Graphs with an x and y axis should not be enclosed in frames; only 2-dimensional representations. Do not forget the labels and units. Captions for the figures should give a precise description of the content and should not be repeated within the figure. Tables should be created using the table function. Further information can be obtained at Wiley-Blackwell http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp Publishing's guidelines for figures:

Check your electronic artwork before submitting it: www.blackwellpublishing.com/bauthor/eachecklist.asp Figure & Table Legends please ensure the essential information is within the first 60 characters of the captions to accommodate the online edition. Permissions: If all or parts of previously published illustrations are used, permission must be obtained from the copyright holder concerned. It is the author's responsibility to obtain these in writing and provide copies to the Publisher. 5.5. Supporting Information Publication in electronic formats has created opportunities for adding details or whole sections in the electronic version only. Authors need to work closely with the editors in developing or using such new publication formats. Supporting Information, such as data sets or additional figures or tables, that will not be published in the print edition of the journal, but which will be viewable via the online edition, can be submitted. It should be clearly stated at the time of submission that the Supporting Information is intended to be made available through the online edition. If the size or format of the Supporting Information is such that it cannot be accommodated on the Journal's website, the author agrees to make the Supporting Information available free of charge on a permanent website, to which links will be set up from the Journal's website. The author must advise Wiley-Blackwell Publishing if the URL of the website where the Supporting Information is located changes. The content of the Supporting Information must not be altered after the paper has been accepted for publication. The availability of Supporting Information should be indicated in the main manuscript by a paragraph, to appear after the References, headed 'Supporting Information' and providing titles of figures, tables, etc. In order to protect reviewer anonymity, material posted on the author's website cannot be reviewed. The Supporting Information is an integral part of the article and will be reviewed accordingly. Extra issues: Larger papers or monographs may be published as additional issues (numbered as the ordinary issues), the full cost being paid by the author. Further information may be obtained from the editor.

6. AFTER ACCEPTANCE
Upon acceptance of a paper for publication, the manuscript will be forwarded to the Production Editor who is responsible for the production of the journal. 6.1 Proof Corrections The corresponding author will receive an e-mail alert containing a link to a website. A working e-mail address must therefore be provided for the corresponding author. The proof can be downloaded as a PDF (portable document format) file from this site. Acrobat Reader will be required in order to read this file. This software can be downloaded (free of charge) from the following website: www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html . This will enable the file to be opened, read on screen, and printed out in order for any corrections to be added. Further instructions will be sent with the proof. Hard copy proofs will be posted if no e-mail address is available; in your absence, please arrange for a colleague to access your e-mail to retrieve the proofs. Proofs must be returned to the Production Editor within three days of receipt. Proofs must be returned to the typesetter within three days of receipt. Please note that if you have registered for production tracking e-mail alerts in Author Services, there will be no e-mail for the proof corrections received stage. This will not affect e-mails alerts for any later production stages. As changes to proofs are costly, we ask that you only correct typesetting errors. Excessive changes made by the author in the proofs, excluding typesetting errors, will be charged separately. Other than in exceptional circumstances, all illustrations are retained by the publisher. Please note that the author is responsible for all statements made in their work, including changes made by the copy editor.

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6.2 EarlyView (Publication Prior to Print)

Zoonoses and Public Health is covered by Wiley-Blackwell's Publishing's EarlyView service. EarlyView articles are complete full-text articles published online in advance of their publication in a printed issue. EarlyView articles are complete and final. They have been fully reviewed, revised and edited for publication, and the authors' final corrections have been incorporated. Because they are in final form, no changes can be made after online publication. The nature of EarlyView articles means that they do not yet have volume, issue or page numbers, so EarlyView articles cannot be cited in the traditional way. They are therefore given a Digital Object Identifier (DOI), which allows the article to be cited and tracked before it is allocated to an issue. After print publication, the DOI remains valid and can continue to be used to cite and access the article.

6.3 Author Services

Online production tracking is available for your article through Wiley-Blackwell's Author Services. Author Services enables authors to track their article - once it has been accepted - through the production process to publication online and in print. Authors can check the status of their articles online and choose to receive automated e-mails at key stages of production. The author will receive an e-mail with a unique link that enables them to register and have their article automatically added to the system. Please ensure that a complete e-mail address is provided when submitting the manuscript. Visit http://authorservices.wiley.com/bauthor/ for more details on online production tracking and for a wealth of resources including FAQs and tips on article preparation, submission and more. For more substantial information on the services provided for authors, please see Wiley-Blackwell Publishing Author Services. 6.4 Author Material Archive Policy Please note that unless specifically requested, Wiley-Blackwell Publishing will dispose of all hardcopy or electronic material submitted two months after publication. If you require the return of any material submitted, please inform the editorial office or production editor as soon as possible. 6.5 Offprints and Extra Copies A PDF offprint of the online published article will be provided free of charge to the corresponding author, and may be distributed subject to the Publisher's terms and conditions. Additional paper offprints may be ordered online. Please click on the following link, fill in the necessary details and ensure that you type information in all of the required fields: offprint.cosprinters.com/cos/bw/main.jsp?SITE_ID=bw&FID=USER_HOME_PGIf you have queries about offprints please e-mail offprint@cosprinters.com 6.6 Note to NIH Grantees Pursuant to NIH mandate, Wiley-Blackwell will post the accepted version of contributions authored by NIH grantholders to PubMed Central upon acceptance. This accepted version will be made publicly available 12 months after publication. For further information, see www.wiley.com/go/nihmandate