GUIA LABORARORIO MICROBIOGA Titulo del Laboratorio: Tincin de Gram ,tcnicas de siembra Nombre de la carrera: Medicina Nivel del

curso: VI Nivel

Nombre de los docentes responsables: TM Mara Ester Aliaga Lpez TM Lina Castillo Cataln Fecha de ejecucin: 14-15 abril 2011 1.- Objetivo del laboratorio 2.- Introduccin 3.- Desarrollo de la actividad 4.- Tipo de evaluacin_ 4.1.- Quz de entrada: Objetivo: El alumno este informado de la teora para realizar la actividad. 4.2.- Informe de la actividad realizada a entregar en laboratorio siguiente Objetivo: Evaluar aprendizaje del laboratorio realizado el

1.- Objetivo del laboratorio: 1.1.-El alumno debe aprender los fundamentos de la coloracin de Gram y su aplicacin. 1.2.-Debe manejar diferentes tcnicas de siembra, para lograr aislamiento de los microorganismos. 2.- Introduccin: Fundamento de la tincin de Gram. *Clasificacin de bacterias segn el tipo de pared celular: -Gram positivas -Gram negativas -Acido-Alcohol resistentes -Otras (ej: arqueobacterias) -Sin pared (Micoplasmas: parsitos intracelulares) *Componentes de la pared celular: . Peptidoglicanos . Protenas . Polisacridos . Lipopolisacaridos(solo en bacterias Gram negativas) . Ac. Teicoicos y c. Lipoteicoicos (solo en bacterias Gram positivas) Sin embrago los componentes tipicos de la pared celular son los peptidoglicanos, los lipopolisacaridos y los c. Teicoicos y c. Lipoteicoicos. *-Gram positivas Pared celular formada casi exclusivamente por unidades repetidas compuestas de peptidoglicanos y atravesada por c teicoicos y lipoteicoicos. Al teirlas con la tincin de Gram se tien de azul *-Gram negativas Pared celular mas compleja, formada por una capa fina de peptidoglicanos sobre la membrana citoplasmtica que esta situada en un espacio virtual que es el Espacio Periplasma(#), y sobre este espacio existe una especie de segunda membrana plasmtica que es la Membrana Externa* de la pared celular bacteriana, la cual es exclusiva de las bacterias Gram negativas. Al hacer la tincin de Gram adquieren un color rojo Las bacterias se agrupan en base a su tincin por la tcnica de Gram.

 Gram positivos - Pared celular con grueso peptidoglicano que retiene un colorante especfico. No tienen membrana externa. Gram negativos - pared celular compleja, con membrana externa y un espacio entre membrana interna y externa -el periplasma- que contiene el saco de murena y abundantes enzimas. El peptidoglicano es fino, por lo que no retienen el colorante. Con esta tincin, las Gram positivas aparecen en color prpura, mientras que las Gram negativas presentan color rojo

Cocacea Gram +(Estafilococcus)

Bacilo Gram (-) E. coli

Tecnicas de siembra *Introduccion: Un microorganismo se puede sembrar en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. La principal diferencia entre un medio de cultivo slido y uno lquido es que el medio de cultivo slido contiene un 1,5-2% de agar-agar, mientras que el medio lquido no contiene agar-agar. Caracteristicas y requerimientos de los Microorganimos Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio. En este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la del tipo que se desea averiguar si est presente. Otras veces, el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser detectados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se puede identificar si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes. As, algunas bacterias con enzimas hemolticas (capaces de romper los glbulos rojos) producen hemlisis y cambios apreciables macroscpicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en un laboratorio de microbiologa de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias. Los cultivos suelen

usarse en medicina para determinar la presencia de agentes patgenos en fluidos corporales (como por ejemplo la sangre o la orina).

Condiciones requeridas de lo medios de cultivo Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables, deben cumplir con los siguientes requisitos: Disponibilidad de nutrientes. Consistencia adecuada del medio. Presencia o ausencia de oxgeno y otros gases. Condiciones adecuadas de humedad. Luz ambiental. pH adecuado. Temperatura. Esterilidad. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en: a) Su consistencia: Slidos, lquidos y semislidos b)Su utilizacin: Comunes (A. Nutritivo),Enriquecimiento (Thayer Martin),Selectivo (Salmonella-shiguella),Diferenciales (Mac Conckey), Identificacin (Citrato simons),Multiplicacin (infusin cerebro corazn), Coservacion (A.cepa), Transporte (Stuart) c) Su composicin: Medios complejos, Medios sintticos, Medios semisintticos d) Su origen: Naturales, sintticos y semisintticos. 3.- Desarrollo de la actividad:

PROCEDIMIENTO TINCIONDE GRAM

Procedimiento 1.-Cubrir el portaobjetos con una delgada capa de Cristal- Violeta por espacio de 1 minuto. Lave enseguida con agua, inclinando el portaobjetos para evitar el desprendimiento del frotis. 2.- Aplicar Lugol y djelo por 1 minuto, lave con agua. 3.- Agregue Alcohol-Acetona por espacio de 15 a 30 segundos gota a gota, con el portaobjetos inclinado. Tan pronto como ya no arrastre color lave con agua. 4.- Finalmente cubrir el portaobjetos con una delgada capa de Safranina por espacio de 30 segundos. Lave con agua. 5.- Dejar secar el frotis teido y observe al microscopio ptico con los objetivos de 100x. con aceite de inmersin

Tcnicas de Inoculacin (siembra) Las tcnicas para inocular las muestras en los diferentes medios de cultivo varan, dependiendo del objetivo. Esterilizacin del Asa Bacteriolgica Las asas bacteriolgicas bsicamente son alambres unidos a un mango que permite manipularlas. El alambre puede ser de diferente material, (fierro nquel, nicromo, platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.,) dependiendo de la necesidad. Para su esterilizacin se utiliza calor seco (llama), y se procede as: - Prender el mechero - Tomar el asa bacteriolgica por el mango y colocarla en posicin vertical, sobre la llama del mechero, hasta que el alambre quede al rojo vivo. - Dejar enfriar o enfriar dentro del medio de cultivo, antes de tomar las colonias. Inoculacin en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo 1. Siembra en Medio Lquido (Caldo) - Obtener la muestra con asa bacteriolgica o torula

- Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotacin. 2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta) - Obtener la muestra con asa - Hacer estras en la superficie del medio 3. Siembra en Agar semislido (Mio) - Obtener la muestra con asa recta - Hacer una picadura por el centro, hasta la mitad del medio Medios en Placa de Petr Siembra por agotamiento: El objetivo de esta tcnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificacin y sensibilidad a los antimicrobianos. 1. Obtener la muestra con torula o asa y suspenderla en un extremo de la placa de agar, haciendo estras (lneas) de un extremo a otro (primer cuadrante) 2. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante primero y extenderlas hasta el cuadrante dos 3. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante dos y extenderlas hasta el cuadrante tres 4. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro. Siembra en cuadrcula: El objetivo de esta tcnica es hacer recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) 1. Obtener la muestra con asa calibrada que dispense una cantidad exacta y distribuirla con el asa en lnea recta por todo el centro 2. Hacer estras de extremo a extremo en sentido contrario a la lnea de inculo Diferencia entre aislar y extender

Tcnica siembra para aislamiento (G modificada)

de

Inoculacin en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo 1. Siembra en Medio Lquido (Caldo) - Obtener la muestra con asa bacteriolgica o escobilln - Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotacin

2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta) - Obtener la muestra con asa - Hacer estras en la superficie del medio

3. Siembra en Agar semislido (taco) - Obtener la muestra con asa recta - Hacer una picadura por el centro, hasta la mitad del medio

Medios en Placa de Petr: Siembra por agotamiento: El objetivo de esta tcnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificacin y sensibilidad a los antimicrobianos. 1 Obtener la muestra con torula o asa y suspenderla en un extremo de la placa de agar, haciendo estras (lneas) de un extremo a otro (primer cuadrante) 2 Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciarestras desde el cuadrante primero y extenderlas hasta el cuadrante dos. 3 Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante dos y extenderlas hasta el cuadrante tres. 4 Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro.

Tcnica G modificada Procedimiento 1. Conocer, ordenar y describir cada uno de los medios de cultivo que va a sembrar 2. Marcar en la base (nunca en la tapa) adecuadamente cada uno de los medios. La etiqueta debe contener: Nombre del paciente Registro de laboratorio, que debe incluir la fecha y consecutivo del Laboratorio Tipo de muestra :

Juan Perez F. Faringeo 425 14/ 4/11

3. Siembra en Caldo de cultivo 3.1. Coger con la mano izquierda el tubo que contiene la cepa , 3.2 Coger el asa con la mano derecha y esterilizarla 3.3 Retirar la tapa (o algodn) del tubo con el dedo meique de la mano derecha y mantenerla ah (no colocar sobre el mesn, para evitar contaminacin) 3.4. Flamear la boca del tubo 3.5. Introducir el asa estril y tomar una asada 3.6. Flamear nuevamente la boca del tubo y colocar la tapa (o algodn) 3.7. Coger el tubo que contiene el caldo con la mano izquierda, y con el meique de la derecha retirar la tapa, flamear la boca del tubo 3.8. Introducir el asa en el caldo y dar movimientos de rotacin 3.9. Retirar el asa, flamear y tapar el tubo 3.10. Esterilizar el asa 4. Siembra en Agar Inclinado: Seguir los mismos pasos descritos en siembra en caldo de cultivo, pero al sembrar hacer estras sobre la superficie del agar 5. Siembra en Agar semislido: Seguir los mismos pasos descritos en siembra en caldo de cultivo pero al sembrar, utilizar el asa recta e inocular en lnea recta por el centro y hasta la mitad del agar. 6. Siembra en Agar, en Placas de Petr: Sembrar por agotamiento -Tomar la base de la caja por los bordes, con el ndice y pulgar de la mano izquierda y voltear la mano para que la superficie del agar quede hacia arriba -Descargar el inculo en el primer cuadrante haciendo estras de lado a lado, como lo indica la figura (ver arriba, siembra por agotamiento); flamear el asa y enfriarla en un extremo del agar - Girar la caja e iniciar las estras partiendo del primer cuadrante, flamear el asa, y enfriarla en el extremo del agar

- Girar nuevamente la caja y repetir una vez ms el mismo procedimiento. Parte 2 : Incubacin Colocar las placas en estufa de cultivo a 36 1 C por 24 hrs. Aerobios directamente a la estufa - Microaerfilos en jarra con CO2 - Anaerobio en Jarra de anaerobiosis Colocar tubos con medios lquidos, semislidas, en gradillas. Observacion El informe de Laboratorio debe entregarse en la actividad de la semana siguiente, en el formato entregado. La no entrega significa un punto menos, de la nota obtenida.