Qumica

Bioinorgnica 2012/2013

ESTUDO DA I NTERAO DA B SA C OM O C ATIO C OBRE ( II) NA AUSNCIA E P RESENA D E U M A NTIBITICO

Henrique Fernandes e Joo Rodrigues Data da realizao: 29 de abril de 2013; Data do relatrio 1 de maio de 2013

RESUMO
Estudo da afinidade de um antibitico da famlia das fluoroquinolonas, a lomefloxacina (lmx), com a protena albumina do soro bovino. Determinao da constante de afinidade do antibitico com a protena na presena e na ausncia de Cu2+ em soluo. O estudo foi feito por fluorescncia por irradiao das solues com radiao de 295 nm e deteco da radiao a 397,41 nm. O valor da constante obtido segundo o modelo de Sten-Volmer. A constante de associao da lmx com a BSA na ausncia de Cu2+, determinada experimentalmente, foi de (7,40,5)X104 L mol-1; enquanto que para o caso das solues com Cu2+, a constante assumiu o valor de (1,20,2)X105 L mol-1.

REAGENTES E INSTRUMENTAO REAGENTES

Utilizou-se soluo aquosa de BSA (Albumina do Soro Bovino) em tampo fosfato com a concentrao de 2,007X10-4 mol dm-3 a partir de Albumina de Soro Bovino liofilizada da Sigma-Aldrich e com um grau de pureza 96%; Soluo tampo de fosfato a pH 7,5, preparada a partir de 50 cm3 de KH2PO4 a 0,1 mol dm-3 e 40,3 cm3 de NaOH a 0,1 mol dm-3; Soluo de cobre (II) a 0,0010 mol dm-3 preparada por diluio de uma j existente de concentrao 0,0100 mol dm-3; Soluo de lomefloxacina com a concentrao de 2,001X10-4 mol dm-3.

Em relao ao protocolo original, foram feitas algumas adaptaes. As solues de cobre (II) usadas so de concentrao 0,0010 mol dm-3 em vez de 0,1000 mol dm-3, como indicado inicialmente. No se efetuou o estudo fluorimtrico da BSA na presena de concentrao crescentes de cobre (II). Em relao ao estudo fluorimtrico da BSA na presena de concentraes crescentes de fluoroquinolona, as solues foram preparas para bales volumtricos de 10,00 cm3 com base nos dados da tabela 1. Tabela 1 Valores para os volumes a medir de BSA e lomefloxacina (lmx) para a preparao das respetivas solues para um volume final de 10,00 cm3. |lmx| /mol dm-3 VBSA /cm3 4,0010-6 8,0010-6 1,2010-5 1,6010-5 2,0010-5 2,4010-5 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 Vlmx /cm3 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

EQUIPAMENTOS
Balana analtica AG204 Mettler Toledo com uma incerteza de o,1mg e um alcance de 210g; Espectrofotmetro de fluorescncia PerkinElmer FS 55 e respectivo software de recolha de dados por computador. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Henrique Fernandes e Joo Rodrigues

 2,8010-5 3,2010-5 0,50 0,50 1,40 1,60

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|lmx| /mol dm-3 |Cu2+| /mol dm-3 VCU /L 4,0010-6 8,0010-6 1,2010-5 1,6010-5 2,0010-5 2,4010-5 2,8010-5 3,2010-5 4,0010-6 8,0010-6 1,2010-5 1,6010-5 2,0010-5 2,4010-5 2,8010-5 3,2010-5 6,00 12,00 18,00 24,00 30,00 36,00 42,00 48,00

No estudo fluorimtrico da BSA na presena de concentraes crescentes da fluoroquinolona (lmx) e de Cu(II) em iguais quantidades estequiomtricas feita por adio de pequenos volumes de uma soluo de cobre (II) a 0,0010 mol dm-3 aos 1500 L de cada uma das solues acima que se encontra na cuvete de fluorescncia. Assim, aps o estudo fluorimtrico da soluo de BSA na presena de concentraes crescentes de lmx, procedeu- se adio dos volumes apresentados na tabela 2. Homogeneizou-se a soluo na cuvete e repetiu-se o procedimento. Tabela 2 Volumes da soluo de Cu2+ a adicionar a 1500L da soluo de BSA e lmx descriminada na tabela 1. As concentraes desprezam o efeito de diluio que resulta das adies da soluo de Cu2+.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS
A partir da soluo inicial da soluo de BSA com a concentrao de 2,007X10-4 mol dm-3 preparou-se uma outra com concentrao de 2,007X10-5 mol dm-3. Este soluo ento estudada fluorimetricamente de modo a determinar o comprimento de onda de mxima emisso (mx). O espectro obtido encontra-se na figura 1 e o valor do comprimento para a mxima emisso situa-se nos 397,41nm.

Figura 1 Espectro de emisso para a soluo de BSA com a concentrao de 2,007X10-5 mol dm-3. A reta a verde intercepta o espectro no ponto que corresponde ao comprimento de onda de mxima emisso. A intensidade mxima de 666,42 ocorre aos 397,41nm. O valor de 397,41nm foi o comprimento de onda para o qual foram medidas as intensidades de emisso por fluorescncia das solues preparadas. Contudo este valor est afetado de um erro de cerca de 40nm devido ao erro sistemtico associado m calibrao do fluormetro. Isto faz com que o valor real para a mxima emisso das solues analisadas fosse prximo dos 345nm. Assim os resultados obtidos para a intensidade da radiao emitida pelas amostras no comprimento de onda de mxima emisso (397,41nm) encontram-se sumariados na

Henrique Fernandes e Joo Rodrigues

 tabela 3, tanto para as solues sem e com Cu2+.1 Tabela 3 Valores da intensidade a radiao emitida pelas solues a 397,41nm em funo da concentrao de lmx (I) e em funo da concentrao de lmx e Cu2+ (ICu). |lmx| /mol dm-3 4,0010-6 8,0010-6 1,2010-5 1,6010-5 2,0010-5 2,4010-5 2,8010-5 4,0010-6 I 592,44 357,15 282,20 257,70 236,24 228,21 209,57 192,90 |Cu2+| /mol dm-3 4,0010-6 8,0010-6 1,2010-5 1,6010-5 2,0010-5 2,4010-5 2,8010-5 4,0010-6 ICu 574,56 354,21 255,67 253,29 227,71 201,29 156,52 137,27

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observado, face ao que seria de esperar. J o declive das retas correspondem ao valor de Kq para o lmx. Este valor corresponde constante de formao do complexo formado entre a BSA e o lmx. As constante de formao para o complexo BSA-lmx esto sumariadas na tabela 4.

De forma a determinar a constante de Sten- Volmer para o agente desactivador (lmx) na presena e ausncia de Cu2+, recorre-se equao 1.
!! !

= 1 + ! | |

(1)

onde I0 a intensidade da fluorescncia na ausncia de lmx e ser sempre igual a 666,42; I a intensidade de fluorescncia para cada soluo com diferentes concentraes de lmx; ICu corresponde intensidade de fluorescncia de cada soluo com diferentes concentraes de lmx e Cu2+; |Q| a concentrao de quecher, ou seja, a concentrao de lmx; e Kq a constante de Sten-Volmer para o lmx. Os valores de I, ICu e |Q| esto apresentados na tabela 3, enquanto que a representao grfica dos pontos obtidos para o modelo definido pela equao 1, est apresentado na figura 2. Segundo o modelo, as ordenadas na origem de ambas as equaes obtidas deveria ser 1, sendo que as diferenas obtidas do-nos uma indicao do afastamento do comportamento 1 Por aconselhamento da professora, no foram guardados os espectros de fluorescncia para cada uma das solues, sendo apenas registados os valores da intensidade para o comprimento de onda apresentado. Henrique Fernandes e Joo Rodrigues 3

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5,0000 4,5000 4,0000 3,5000 I0/I 3,0000 2,5000 2,0000 1,5000 1,0000 0,00E+00 1,00E-05 2,00E-05 |lmx|/mol dm-3 Na ausncia de Cu(II) Na presena de Cu(II)
Figura 2 Representao grfica de I0/I em funo da concentrao de lmx para as solues na ausncia e presena de Cu2+. Respectivas regresses lineares e equaes das retas. Tabela 4 Valores para as constantes de Sten-Volmer ou constantes de formao/associao da BSA com o lmx na presena e ausncia de Cu2+. Ausncia de Cu2+ (7,40,5)X104 Presena de Cu2+ (1,20,2)X105 onde kq a constante bimolecular de quenching. [1]. No foram encontrados valores na literatura para Kq no ensaio entre a BSA e o lmx, contudo em ensaio anlogo com HSA, verifica-se que a presena de Cu2+ aumenta para perto do dobro o valor da constante de Sten-Volmer, pelo que se verifica o mesmo efeito com a BSA. Para alm disso, os desvios em relao unidade para os valores das ordenadas na origem so tambm descritos na literatura.

I0/ICu = 119506 |lmx| + 0,8025 R = 0,95638

I0/I = 73780 |lmx| + 1,2112 R = 0,92359

3,00E-05

Kq /L mol-1

CONCLUSO
Os resultados obtidos evidenciam que o fenmeno de quenching mais evidente na presena de Cu2+, dado que o valor de Kq na presena de Cu2+ ser sensivelmente o dobro do valor na ausncia de cobre (II). Isto pode ser explicado por interaes entre os ies de cobre (II) e o antibitico (lmx) que se encontra ligado protena (BSA). Isto prolonga o tempo de vida da espcie (0) que faz com que o valor de Kq aumente, dado que Kq pode ser obtido a partir da equao 2. ! = ! . ! (2)

BIBLIOGRAFIA
[1] Fen, J., Jian-Quan, L., Xing-Wang, Z., Ting- Quan, S. Chin. J. Chem. 2007, 25, 1675-1680. [2] Zhang, H., Liu, R., Chi, Z., Gao, C. Spectrochim. Acta.2011, 523-527. [3] Lakowicz R J. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Spinger science, 2006, 278-304.

Henrique Fernandes e Joo Rodrigues