UNIVERSIDAD DEL BIO-BIO FACULTAD DE CIENCIAS-DEPARTAMENTO DE QUMICA

ASIGNATURA PROCESOS BIOLGICOS Prof:. Claudia Oviedo S.

LABORATORIO MICROSCOPIA OPTICA DE CAMPO CLARO Introduccin

En 1665, Robert Hooke con una versin del primer microscopio compuesto que no era ms que un tubo con una lente en cada extremo- examin una lmina de corcho y report se compona de una masa de cmaras diminutas que denomin clulas (aunque lo que vio Hooke en realidad fueron slo lo que qued de las clulas vivas del corcho es decir, las paredes celulares de esas clulas vegetales) Posteriormente, Hooke y sus colaboradores lograron ver clulas vivas. Paralelamente, Antonio Van Loeuwenhoeck, trabaj en sencillsimos arreglos de lentes, que le permitieron descubrir un nuevo mundo de vida microscpico. En 1838 y 1839 Schleiden y Schwann respectivamente publicaron estudios sistemticos de tejido vegetal y animal con microscopio de luz, mostrando que las clulas son los constituyentes elementales de toda la materia viva. Ese trabajo y otros durante el sXIX cimentaron las bases de lo que conocemos como teora celular en que se establece que las clulas vivas provienen de clulas preexistentes, lo que fue corroborado con los experimentos en la dcada de1860s por Pasteur. Queda entonces manifiesta la enorme trascendencia que tuvo la creacin de un instrumento ptico como el microscopio para el desarrollo de las ciencias biolgicas. Una gran cantidad de seres vivos y las clulas que los componen son imperceptibles al ojo humano. La superacin de esta limitacin se logra con el uso de microscopio ptico de luz. El microscopio ptico nos permite amplificar el tamao de las clulas unas 1000 veces y resolver detalles del orden de 0,2 m. Bsicamente, se requiere de 3 cosas para visualizar clulas en estos microscopios A) Luz brillante incidente enfocada sobre el espcimen (tarea del condensador). B) Espcimen idneo, preparado para que permita el paso de la luz a travs del mismo. C) Un set de lentes apropiado (objetivo y ocular) dispuestos de manera que se enfoque una imagen del espcimen en el ojo. Ver Fig.1

Resulta til recordar y dominar algunas unidades tiles al trabajar en escala microscpica son: 1m=10 3

mm
La mayora de las clulas eucariotas miden entre 10 y 30 micrmetros (m) de dimetro, entre 3 y 10 veces menos que el poder de resolucin del ojo humano; las clulas procariotas son an ms pequeas. Para ver clulas individuales y ms an para distinguir las estructuras internas de ellas debemos usar instrumentos que permitan ver con mayor resolucin. El miscrospio electrnico inventado en la dcada de 1930s, rompe el lmite impuesto por la luz en cuanto a la resolucin (pues alcanza a resolver hasta 0.2 nanometros (nm)) y nos permite ampliar la posibilidad de ver detalles finos celulares. Para ello utiliza un haz de electrones incidente en vez de un haz de luz. El factor limitante para aumentar la resolucin de un Microscopio ptico es la longitud de onda de la luz visible que va desde 0,4 micrmetros (m) para la luz violeta hasta 0,7 micrmetros (m) para la luz roja. Con el microscopio ptico podemos distinguir las estructuras ms grandes dentro de las clulas eucariotas y tambin clulas procariotas individuales. Objetivos 1. Conocer el microscopio de luz y aprender la funcin de sus componentes. 2. Aprender a utilizar correctamente este instrumento. Presentacin del Microscopio ptico Compuesto o Fotnico Est constituido principalmente por dos lentes pticos: el ocular y objetivo, cuya combinacin permite obtener una imagen virtual de mayor tamao e invertida del objeto que se observa. Los sistemas que lo componen son: 1. Sistema mecnico 2. Sistema de iluminacin 3. Sistema ptico 1) Sistema mecnico : Corresponde al armazn metlico que sostiene al sistema ptico y al sistema de iluminacin, dndoles la posicin adecuada y
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=10 6 m =10 9 nm

permitiendo los movimientos necesarios para una correcta coordinacin entre ambos. Est formado por: Base o pie : da la sustentacin al microscopio. Columna : es el pilar que sostiene el tubo, platina, condensador y sobre el cual estn montados los tornillos focalizadores de macro y micromtrico. Platina : es un plataforma horizontal con un orificio central que permite el paso de los rayos luminosos sobre el cual se coloca el objeto a observar montado sobre un portaobjeto y cubierto mediante un cubreobjeto. Reconozca en la platina el sistema de sujetar la preparacin. Pinzas sostienen firmemente el portaobjeto que contiene la preparacin sobre la platina Tubo : es un cilindro metlico hueco con su superficie interna completamente negra para evitar la reflexin de la luz. En su extremo superior va el ocular y en su extremo inferior el revlver. Revlver o tambor : mecanismo situado en el extremo inferior del tubo que lleva los dos diferentes objetivos que posee el microscopio. Por simple rotacin en sentido antihorario del revlver se coloca en posicin el objetivo deseado. Tornillos focalizadores: la platina junto con parte del sistema de iluminacin se deslizan verticalmente por medio de dos tornillos adaptados sobre una cremallera, uno para movimientos rpidos o de enfoque aproximado (macromtrico) y el otro para movimientos destinados al enfoque de precisin (micromtrico). En muchos de los microscopios ambos tornillos van juntos. 2) Sistema de iluminacin : Se encuentra ubicado bajo la platina y consta de: Lmpara: est constituida por una fuente de luz (ampolleta), la cual es homogeneizada por un filtro mate (esmerilado). Diafragma - iris: est formado por una serie de lminas de acero imbricadas que se cruzan y que pueden moverse libre y simultneamente por un extremo, estando fijas por el otro. El movimiento se ejecuta por medio de una pequea palanca. El diafragma - iris est adosado al condensador y se mueve verticalmente junto con ste. Tiene por funcin
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regular el haz de luz ensanchndolo o disminuyndolo, por lo cual es una parte completamente indispensable del condensador. Anillo portafiltro: es un anillo ubicado bajo el diafragma que puede moverse lateralmente mediante una palanca y sobre el cual se colocan el o los filtros que se deben usar. Los filtros son vidrios coloreados. 3) Sistema ptico : Se encuentra montado en el tubo y est formado por el sistema de lentes que forman la imagen. El ocular est montado en el extremo superior del tubo y el objetivo en el extremo inferior. Objetivo: est constituido por asociaciones de lentes positivas o convergentes que van montadas en el revlver. Generalmente, el revlver lleva 3 o 4 objetivos. Estas asociaciones de lentes forman un sistema centrado que acta en su conjunto como si fuera una sola lente con determinada distancia focal y dems propiedades equivalentes a la de una lente. Ocular: son sistemas pticos centrados, colocados en el extremo superior del tubo al cual el observador aplica el ojo. Estn formados por dos lentes convexas: i) lente ocular propiamente tal ii) lente inferior o colectora de campo Entre ambas lentes hay discos perforados que suprimen los rayos marginales. La lente inferior o colectora de campo recibe la imagen real dada por el objetivo, la refracta y origina en el plano focal de la lente ocular la imagen libre de aberraciones. La lente ocular propiamente tal acta como una lupa y forma una imagen virtual y definitiva del objeto que en relacin a la anterior es mayor y derecha. Finalmente, la imagen del microscopio compuesto resulta mayor que el objeto e invertida. Condensador: es un sistema de lentes ubicado bajo la platina que puede moverse verticalmente mediante un tornillo. Este sistema de lentes concentra los rayos luminosos sobre la preparacin, por lo cual el trmino condensador es impropio ya que en realidad no se produce un sistema de condensacin.

Propiedades de Microscopio Fotnico

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A continuacin usted podr conocer las propiedades del microscopio que permiten obtener una imagen de calidad. 1. Poder de Aumento : es la capacidad del microscopio que expresa la razn entre el tamao de la imagen que produce el microscopio y el tamao del objeto observado. Como el microscopio tiene dos sistemas pticos, cada uno de ellos es capaz de agrandar la imagen, el aumento total es igual al producto de los aumentos dados por el ocular y el objetivo. Aumento = tamao aparente/ tamao real Aumento del instrumento = aumento del ocular x el aumento del objetivo 2. Poder de Resolucin : es la capacidad del instrumento de dar imgenes bien definidas de puntos situados muy prximos entre s.. 3. Lmite de Resolucin : es la distancia mnima que puede existir entre dos puntos para que puedan ser definidos como tales. Por lo tanto, a mayor resolucin, menor es el lmite de resolucin. 4. Poder de Definicin : consiste en la capacidad del microscopio de dar imgenes claras de contornos precisos. Reside en la correccin de las aberraciones propias de las lentes. 5. Poder de Penetracin : permite ver detalles que estn a niveles distintos de profundidad de la preparacin con un mismo enfoque.

Cuidados que debe tener con el microscopio (compuesto bien el estero microscopio) 1. Cuando tenga que trasladar el instrumento sujtelo siempre por la columna con una mano y con la otra sstengalo por su base. (Cercirese que los cables estn bien dispuestos y no estn enredados) 2. Llvelo en posicin vertical y sin oscilaciones. Si lo inclina pueden caer los oculares. 3. Mantenga las lentes limpias , (evite uso de mscara de pestaas o cualquier otra sustancia que pueda ensuciar el ocular) nunca toque las lentes con los dedos. 4. No deje el microscopio en el borde de su mesn. Ubquelo en una superficie limpia y lisa 5. Una vez ubicado, no lo mueva del lugar. 6. No saque los oculares . 7. No mueva piezas que desconoce su funcin. 8. No coloque mecheros encendidos cerca del microscopio. 9. Evite mojar el instrumento , si lo hace squelo inmediatamente con un pao adecuado. 10. Coloque las preparaciones sobre la platina con el cubreobjeto hacia arriba. 11. Para cambiar de aumento objetivo siempre mueva el revlver con movimientos suaves 12. Los movimientos de enfoque deben ser suaves , especialmente con el micromtrico. 13. Al realizar las observaciones, evite golpear el mesn de trabajo pues cualquier vibracin alterar el enfoque suyo y/ el de sus compaeros. Algunos defectos en el manejo pueden ser debidos a factores tales como: Defectos en la iluminacin, tales como: 1. Lmpara mal ajustada 2. Condensador bajo 3. Diafragma muy cerrado o lateralizado 4. Filtros inconvenientes o en exceso. Defectos por imgenes extraas 1. Corpsculos de polvo u otros elementos en el ocular, objetivos o cubreobjetos. 2. Burbujas de aire. 3. Gotas de grasa.

ACTIVIDADES PRCTICAS Al ingreso del laboratorio se aplicar un test de entrada y a su trmino un informe, ambos controles son de carcter individual I. Microscopio ptico

Usted recibir un microscopio en ptimas condiciones. Para familiarizarse con este equipo identifique las partes que se indican en esta gua. Actividad 1: Reconocimiento del microscopio y forma de uso. Pauta a seguir: Revise el aumento de los oculares y el aumento de los objetivos. Identifique en qu posicin utilizar el aumento menor, mediano, mayor y de inmersin, anote los aumentos que producen cada uno de ellos. Ajuste la distancia interpupilar segn sus requerimientos. Observe con los dos ojos. Identifique la platina, los tornillos de la platina y la forma en que se dispone la muestra. prepare una muestra con papel de diario: moje el papel y adhiralo al portaobjetos. Luego coloque suavemente el cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas. Cuide que no quede excedente agua en el exterior del permetro del cubreobjeto para evitar ensuciar los objetivos. Coloque la muestra sobre la platina cuidando que la lectura del diario se lea correctamente (de izquierda a derecha y no invertida). Observe la preparacin con aumento menor. Enfoque y describa lo que observa en cuanto a amplitud del campo ocular (relacione en % el tamao del papel y el sector que puede ver por el microscopio). Al observar la muestra, se lee correctamente o est invertida? Utilice los tornillos de la platina para desplazar la muestra en sentido horizontal y vertical. Observe cmo se mueve la platina y cmo lo hace la imagen. Una vez terminada esta accin, observe con aumento mediano y repita lo anterior. Finalmente observe con aumento mayor y describa en su informe lo que observa. Aplique los conceptos de poder de resolucin y poder de definicin a la muestra que observa. Infrmelo. Saque la muestra, bote el papel y lave el porta y cubreobjetos.

METDICA PARA GUARDAR EL MICROSCOPIO Desconecte el microscopio y enrolle el cable. Deje limpio los objetivos y oculares. Deje limpia la platina Deje el microscopio en posicin de reposo, la cual consiste en: Objetivo menor en posicin de enfoque Diafragma abierto y condensador en el tope superior
SE DEBE REGISTRAR EN EL INFORME EL NMERO DE MICROSCOPIO CON QUE SE TRABAJ EN CADA CASO.

IMPORTNTANTE DURANTE EL PRCTICO SE EVALUAR Y CALIFICAR EL USO QUE USTED HACE DEL MATERIAL OPTICO.

USO DEL MICROSCOPIO DE DISECCIN ESTEREOMICROSCOPIO

Hay varias diferencias entre usar un microscopio compuesto y usar un microscopio de diseccin, tambin designado a veces un estreo-microscopio porque es como dos microscopios fijados al foco en un punto que proporciona una vista de 3 dimensiones o estereoscpica del espcimen. Muchos de los microscopios de diseccin no tienen una perilla del ajuste fino. La fuente de luz (iluminador) puede estar separada y se puede montar en el brazo, debajo de la placa de diseccin , o en el nivel de la placa de diseccin . Muchos microscopios de diseccin no tienen objetivos separados para aumentar la ampliacin sino que tienen una perilla de magnificacin que puede girarse para a la ampliar o disminuir el aumento. Nota: Algunos microscopios de diseccin tambin tienen una lente auxiliar o suplemental en el fondo de la cubierta objetivo. Si
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esta lente est presente, debe ser incluida en la determinacin de la ampliacin. Las muestras se colocan en la placa de diseccin y se mueven generalmente con la ayuda de pinzas apropiadas o bien a mano segn sea el caso. La luz se puede transmitir a travs de la placa por el espejo debajo de la muestra o la muestra se puede ver con la luz que viene de arriba. Cuando se ve la muestra con la luz que viene desde debajo es factible que se necesite ajustar el espejo para ajustar la luz correctamente para la visin correcta. Inspeccione bajo el microscopio estereoscpico los diversos especimenes a su disposicin para tal efecto, anote y dibuje sus observaciones. Pregunta: Hay diferencias con lo observado anteriormente con el microscopio compuesto? Si es as cules son ellas? Comentar ventajas y desventajas de uno y otro microscopio NOTA: Despus de usar el microscopio, debe ponerse atencin y cuidado en su correcto almacenamiento. Cerciorarse de que los objetivos estn limpios y las portaobjetos removidos. Dejarlo en posicin de reposo Apagar todas las luces. Posteriormente, desenchufar los cables elctricos y envolverlos libremente alrededor de la base. Quitar las luces que se asocian a los microscopios de diseccin. Poner todos los microscopios y sus accesorios en su lugar de almacenamiento original.