APNDICE 1

Preparacin del Medio de Cultivo Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) El DMEM es una modificacin del medio basal medium Eagle (BME), contiene una mayor concentracin de aminocidos y vitaminas, as como la adicin de antibiticos y la suplementacin con suero fetal bovino. Reactivos DMEM (GIBCO CAS. 12100-061) L-arginina. HCl (SIGMA A-5131) L-asparagina anhidro (SIGMA A-4159) NaHCO3 (SIGMA S-5761) Piruvato de sodio (Biowhittaker Walkersville, CAS 13-115E) L-glutamina (Biowhittaker Walkersville, CAS17-605E HEPES (SIGMA-ALDRICH. H-3784) Penicilina/ estreptomicina - mercaptoetanol (Merck. 4213005)

Aparatos Bscula digital (Sartorius) Bomba de vaco Sistema de filtracin (sterile aseptic system, Millipore corporation, Bredford, MA 01730) Campana de flujo laminarn(Purifer classII Biosafety cabinet, delta series, LABCONCO) Pipetor Micropipetas de volumen variable Bao de agua (Isotemp 220 Fisher Scientific)
104

Incubador de CO2 (Isotemp, Fisher Scientific. USA) Equipo Auxiliar

Pipetas serolgicas de 10 mL Esptulas Filtro Millipore de 0.45 m Vaso de precipitados de 1L Agua desionizada Frascos de vidrio de 500 y 1000 mL Probeta de 1000 mL Matraz Kitazato de 1L Puntas para micropipeta Procedimiento

1. Para preparar un litro de medio, verter aproximadamente 300 mL de agua deionizada en un vaso de precipitados de 1L,posteriormente llevar a cabo las mediciones que se enlistan a continuacin:

Sustancia DMEM L-arginina HCl L-asparagina anhidro NaHCO3 HEPES - mercaptoetanol Piruvato de sodio L- glutamina Penicilina

Cantidad 13.37g 0.116g 0.036 g 2.0 g 2.38 g 3.5 L 10.0 mL (100 mM) 7.5 mL (200 mM) 1.0 mL (1000 X)

105

2. Los reactivos se agregan al vaso de precipitados con agua al momento de medirlos excepto los que se sealan en la tabla con itlicas, pues estos deben de aadirse en la campana una vez que el resto de los reactivos se encuentren disueltos en un volumen final de 1L. 3. Posteriormente se prepara el sistema de filtracin conteniendo una membrana de 0.45m y se conecta a un matraz Kitazato de una salida, en la cual se coloca la manguera del sistema de vaco. 4. Una vez que se filtra todo el medio se deposita en un frasco estril de 1L y se etiqueta debidamente (Indicando el contenido, nombre de quien lo elaboro y la fecha). 5. Se realiza una prueba de esterilidad colocando aproximadamente 5 mL del medio de cultivo en un tubo falcn estril, el cual se incuba por 48 horas bajo condiciones similares a las de los cultivos celulares. Se revisa que el tiempo sealado no se presente evidencia de contaminacin. 6. Mantener el medio de cultivo bajo refrigeracin a 4C hasta su uso. Suplementacin del medio DMEM con 5% de suero fetal bovino (D5F). Depositar 95 mL del medio de cultivo en un frasco estril de vidrio y agregar 5 mL de suero fetal bovino previamente decomplementado mediante calentamiento a 56C durante 45 minutos en un bao de agua.

106

APNDICE 2

Preparacin de Reveladores Especficos Para Grupos de Metabolitos

Cloruro Frrico 5g 100 mL

Cloruro frrico Agua destilada

Reactivo de Dragendorff 5g 25 g 12 mL 100 mL

Carbonato de bismuto Ioduro de potasio cido clorhdrico concentrado Agua destilada

En un bao de hielo, disolver e carbonato de bismuto en 50 mL de agua, adicionando cuidadosamente el cido; posteriormente agregar gradualmente el ioduro de potasio; despus de la completa disolucin, completar el volumen para 100 mL con agua.

Reactivo de Liebermann-Burchard cido sulfrico concentrado Anhdrido actico 0.1 mL 5 mL

107