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REVIEW ARTICLE The importance of proline residues in the structure, stability and susceptibility to proteolytic degradation of collagens Stephen

M. Krane Received: 16 November 2007 / Accepted: 7 February 2008 / Published online: 23 April 2008 _ Springer-Verlag 2008 Abstract Collagens are among proteins that undergo several post-translational modifications, such as prolyl hydroxylation, that occur during elongation of the nascent chains in the endoplasmic reticulum. The major structural collagens, types I, II and III, have large, uninterrupted triple helices, comprising three polyproline II-like chains supercoiled around a common axis. The structure has a requirement for glycine, as every third residue, and is stabilized by the high content of proline and 4-hydroxyproline residues. Action of prolyl hydroxylases is critical. Spontaneous or targeted genetic defects in prolyl hydroxylases can be lethal or result in severe osteogenesis imperfecta. Prolines, as determinants of substrate specificity and susceptibility, also play a role in degradation of collagen by collagenolytic matrix metalloproteinases (MMPs). Targeted mutations in mice in the collagenase cleavage domain have profound effects on collagen turnover and the function of connective tissues. Prolines are thus critical determinants of collagen structure and function. Keywords Prolylhydroxylases _ Collagen structure _ Osteogenesis imperfecta _ Collagenases _ Matrix metalloproteinases Introduction Collagens with uninterrupted triple helices, such as type I collagen, are characterized biochemically by distinctive amino acid composition, i.e., on a molar basis *33% glycine, *10% proline, *10% 4-hydroxyproline and *0.1% 3-hydroxyproline. This review will focus on the unique roles of prolines and modified prolines in determining the structure and biological stability as well as proteolytic degradation of type I collagen. Collagen structure, proline and 4-hydroxyproline The structure of the collagens reflects the amino acid composition. Thus, there is in the triple helical domain a requirement for glycine (Gly) as every third residue and the high content of prolines (Pro) stabilizes the polyprolineII-like helices characteristic of collagen sequences (Myllyharju and Kivirikko 2004). Hydroxylation of Pro in the 4-position (4-Hyp, i.e., 4(R)-hydroxl-L-proline (Schumacher et al. 2006) further stabilizes the helical structure. This 4-hydroxylation takes place during elongation of the nascent polypeptide chains in the endoplasmic reticulum. 4-Hyp was isolated and its structure determined at the turn of the last century (Fischer 1902). In an extraordinary paper published over four decades later (Stetten and Schoenheimer 1944), it was reasoned that, perhaps a part of the hydroxyproline is metabolized by

way of proline. They then synthesized l (-) Pro where the carbon skeleton was marked by stably bound deuterium and the amino group by N15 and they fed the doubly labeled Pro to rats and measured enrichment of the isotopes in Hyp from carcass proteins. They concluded that 4-Hyp is formed after incorporation of Pro into these proteins S. M. Krane (&) Department of Medicine, Harvard Medical School and the Massachusetts General Hospital, Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Building 149, 13th Street, Room 8301, Boston, MA 02129, USA e-mail: krane.stephen@mgh.harvard.edu Colgenos). Ahora sabemos de aminocidos y el gen secuenciacin de que la regin helicoidal de estos colgenos comprende repeticiones ininterrumpidas de Gly-XY tripptidos (Piez 1984; Myllyharju y Kivirikko 2004). Ha sido establecido por la secuenciacin de aminocidos que, mientras que es Pro encontrado en la opcin-X-o-Y-posicin de la Gly-XY repeticin tripptido, 4-Hyp slo se encuentra en la posicin-Y-. 4-Hyp es una modificacin abundante en los tipos I y II colgenos, con * 85-90 residues/1000 aminocidos (* 40% de los el total de Pro + 4-Hyp). Cualquier sustitucin de residuos de Gly que resultan de mutaciones en los tipos I, II, III o colgeno V genes producen una estructura inestable que resulta en enfermedades humanas que afectan principalmente colgeno de tipo I en el hueso (Formas de'''' enfermedad de los huesos quebradizos, es decir, la osteognesis imperfecta), colgeno de tipo II en la placa de crecimiento o el cartlago articular (Condrodisplasias) o tipo III o V colgenos de la piel y '' suaves'' otros tejidos conectivos (formas del sndrome de Ehlers-Danlos sndrome) (Myllyharju y Kivirikko 2004; Byers 2000). La estructura helicoidal triple de la fibrilla / formador de fibras colgenos tanto, refleja el alto contenido de Pro y Hyp-4 residuos con una repeticin regular e ininterrumpido de Gly-XY trillizos. La temperatura de desnaturalizacin (TD) de colgeno en solucin se mide generalmente como la temperatura de fusin transitition (Tm), y el TD de colgenos nativos, insolubles se mide generalmente como la temperatura de contraccin (Ts). En en general, la estabilidad de la estructura helicoidal est regulada por el contenido de Pro-Hyp ms 4. Estos nmeros tienen fisiolgico significado. Se ha demostrado (Piez 1984) que el Tm de colgenos animales diferentes es proporcional a el lmite superior de la temperatura ambiental a la que el animal o tejido se expone. Por ejemplo, la Tm de la piel colgeno de bacalao que vive en aguas fras es * 14? C, mientras que la Tm de colgeno porcino intestino y la cutcula colgeno del parsito, Ascaris, que habita en el cerdo lumen intestinal, es * 40? C. Adems, basndose en una anlisis detallado de estos y otros colgenos de diferente especies (Josse y Harrington 1964), los mejores correlacin con TD es con el contenido total de pirrolidina (Pro + 4-Hyp) y no con el contenido de cualquiera de los dos o Pro-Hyp 4 solo. Ms recientemente, se han efectuado anlisis de la replegamiento de modelo trmico similar al colgeno desnaturalizado pptidos que tienen Gly-XY repeticiones de tripletes con diferentes

residuos en el-X-e-Y-posiciones (Ackerman et al. 1999). Los resultados mostraron una fuerte dependencia de la tasa de plegado sobre la identidad del husped'''' triplete. Para ejemplo, todas las tripletas de la forma Gly-X-4-Hyp promovido plegado rpido de estos pptidos modelo, mientras que los tripletes de Gly-Pro-X y Gly-X-Y tena plegable mucho ms lento. In vivo, hay otros mecanismos que dirigen una asamblea de estas macromolculas complejas (Khoshnoodi et al. 2006). El componente de las cadenas tienen un no-colgeno (NC) dominios en su N-y C-terminales. El colgeno tipo I comprende dos cadenas a1 y una cadena a2 en la triple hlice; ahora se ha demostrado que el a1 C-NC dominio contiene informacin suficiente para dirigir homotrmero montaje, mientras que la a2 C-NC dominio es necesario para dirigir heterotrmero de montaje (Khoshnoodi et al. 2006). Formacin de enlaces disulfuro en la a2 C-NC dominio es crtico para este proceso. Antes de que las cadenas nacientes completamente plegar, la prolil residuos en la posicin-Y-son hidroxilados y el recin formadas 4-Hyp residuos sirven para estabilizar la hlice (Myllyharju y Kivirikko 2004). Las enzimas que catalizan la formacin de colgeno 4-Hyp son el colgeno prolil 4-hidroxilasas (P4Hs) miembros de una familia de 2-oxyglutarate y ferroso irondependent dioxigenasas (Myllyharju y Kivirikko 2004). Los P4Hs A2B2 son tetrmeros que se localizan en el retculo retculo; las subunidades A son los cataltica hidroxilasas mientras que el disulfuro de la protena chaperona, isomerasa (PDI), comprende las subunidades B. Hay tres isoformas de las subunidades A en seres humanos (Fig. 1). Espontneo mutaciones de colgeno prolil 4-hidroxilasas todava no han ha informado de una mutacin nula y dirigida de una isoforma en ratones es letal embrionaria (Myllyharju y Kivirikko 2004). El colgeno prolil 4-hidroxilasas todos requieren como sustratos desplegada cadenas de colgeno, oxgeno molecular, 2-oxyglutarate, hierro ferroso y ascorbato; afinidades sustrato variar con la isoforma de la enzima. Otros prolil 4-hidroxilasas funcin en la regulacin de las respuestas a la hipoxia por hidroxilacin clave residuos prolil en la secuencia de la hipoxia-inducible factor de transcripcin, hifa. El amino cido especificidad de secuencia que determina 4-hidroxilacin de residuos prolil en hifa es diferente de la de la colgeno P4Hs (Kaelin 2005). Los hidroxilasas hifa, sin embargo, tienen otros requisitos que son sustratos similares a las del colgeno prolil 4-hidroxilasas, aunque no hidroxilar Pro residuos en colgenos, tienen diferentes afinidades y no complejo con PDI b subunidades. Hidroxilacin prolil de hifa altera la unin a la von Hippel Lindau protena supresora de tumor (pVHL) y La figura. 1 prolil 4-hidroxilasas 704 Aminocidos (2008) 35:703-710 12312323thus regula su actividad (Kaelin 2005). Estas altamente especficas de 4 Pro hidroxilaciones de las protenas reguladoras como Hifa ilustran las importantes funciones biolgicas de la Pro componentes de las protenas, adems de otras protenas estructurales tales como colgenos.

Colgeno 3-hidroxiprolina Lo menos abundante cido imino hidroxilado en colgenos con ininterrumpidas triples hlices es 3-hidroxiprolina (3-Hyp, es decir, 3 (S)-hydroxl-L-prolina; Schumacher et al. 2006; Ogle et al. 1962; Irreverre et al. 1962). En el tipo I colgeno, hay slo 1 residuo de amino 3-Hyp/1000 cidos, * 1% que del 4-Hyp, y el nico del 3 Hyp-se encuentra slo en la posicin X de un triplete Gly-XY con la secuencia Gly-3-Hyp-4-Hyp, en el residuo 986 en la humana a1 (I) de la cadena. Los posibles funciones biolgicas y el metabolismo de 3-Hyp no fueron exploradas hasta un prolil 3-hidroxilasa (P3H) fue aislado, clonado y caracterizado polluelo los embriones y los denominados P3H1 (Vranka et al. 2004). Otro los posibles miembros de la familia fueron posteriormente P3H identificado (Fig. 2). La estructura de la chica indicada P3H1 que es el ortlogo de un endoplsmico se ha descrito previamente retculo protena llamada leprecan (WassenhoveMcCarthy y McCarthy, 1999). El cDNA Leprecan clonado a partir del ratn codifica una protena con estructural caractersticas en comn con las otras hidroxilasas colgeno suficiente para considerar otro miembro de la familia de 2-oxyglutarate-y hierro ferroso-dependientes dioxygenases (Vranka et al. 2004). Adems, se demostr por Vranka et al. (2004) que se une especficamente a P3H1 colgeno desnaturalizado en un complejo que contiene por lo menos dos otras protenas, ciclofilina B (CYPB) y una protena previamente aislado como una'' cartlago asociada a la protena o'' CRTAP (Tonachini et al, 1999;. Morello et al, 1999.). Aunque CRTAP tambin podra ser un miembro de la P3H familia, que carece del dominio cataltico y dioxigenasa por lo tanto, no puede funcionar como un colgeno enzimticamente prolil 3-hidroxilasa. Curiosamente, ni CYPB ni CRTAP son necesarios para la completa prolil 3-hidroxilasa actividad de P3H (Vranka et al. 2004). Las observaciones clnicas han sido fundamentales para seguir elucidacin de la biologa de 3-Hyp. Enfermedad de los huesos frgiles o osteognesis imperfecta (OI) es clnica, bioqumica y genticamente heterogneo (Byers 2000; Marini et al. 2007b; Morello et al. 2006). La mayora de las formas de OI son predominantemente heredado y causada por mutaciones en los genes que codifican el colgeno tipo I (COL1A1 y COL1A2). Ward et al. (2002) demostraron que una variante clnica de la OI, denominado tipo VII, sin embargo, no se asignan a COL1A1 o COL1A2 y tena un recesivo en lugar de una herencia dominante. Posteriormente, elucidacin del papel de la P3H1/CRTAP/CYBP complejo de colgeno en la biologa comenz con la asignacin de un emparentado con OI tipo VII en un locus en el cromosoma 3p22.3 (Ward et al. 2002). Morello et al. (2006) argument que mutaciones en CRTAP, incluido en esta regin en el cromosoma 3p22.3, podra ser una causa de OI tipo VII en vista de su la unin a colgeno tipo I desnaturalizado y su papel potencial en proly3-hidroxilacin (Vranka et al. 2004). Una mutacin Se identific a continuacin, en CRTAP en un sitio de empalme que podra potencialmente conducir a CRTAP mRNA inestable y disminuir Protena CRTAP (Morello et al. 2006). ADN fue tambin

examinado por miembros de una familia adicional padres clnicamente normales y cuatro nios, todos los afectados con una forma severa de OI considerado clnicamente como tipo II OI (Morello et al. 2006). Anlisis de secuencias en CRTAP este grupo de pacientes con OI mostr un nico homocigoto de base par supresin que caus una mutacin del marco de lectura en el exn 4, ambos padres eran portadores asintomticos de la mutacin. Anlisis de colgeno en medio condicionado por fibroblastos de las personas afectadas en los dos linajes con masa espectroscopia mostr Pro, pero no en 3-Hyp residuo 986, en El colgeno tipo I A1 (i) las cadenas, a pesar de que las observaciones CRTAP no es una prolil 3-hidroxilasa. Adems, varios caractersticas de la mutacin humana incluyendo la osteoporosis severa y la disminucin de proly3-hidroxilacin se encontraron en colgenos de CRTAP nulo ratones (Morello et al. 2006). Observaciones posteriores han ayudado a aclarar varios cuestiones. Los pacientes fueron identificados con OI grave previamente clasificados como OI II o III, generalmente mortal en el primer ao de vida, que tampoco se asignan a COL1A1 o COL1A2 (Barnes et al. 2006). Varios de estos pacientes tenan mutaciones en CRTAP con CRTAP ausente en Western blots y 3 Hypniveles (A1 (i) El residuo de cadena 986) de control de 0-20%, en consonancia con las observaciones anteriores de Morello et al. (2006). Importante para esta discusin es la demostracin ms tarde de mutaciones nulas en ambos alelos del P3H1/lepreca fibroblastos y disminuciones marcadas en a1 (I) cadena 3-Hyp contenido en los otros siete casos ndice (Cabral et al. 2007). Las personas afectadas con el P3H1/LEPRE1 mutaciones tenan OI grave, con extremidades cortas y marcadamente estructura sea distorsionada. Tanto el colgeno a1 (I) y a2 (I) cadenas sintetizadas por fibroblastos cultivados de afectada individuos con mutaciones en CRTAP o P3H1/LEPRE1 haba aumentado hidroxilacin y glicosilacin lisil indicando una retencin ms prolongada de cadenas nacientes durante la elongacin en el retculo endoplsmico. Estas observaciones son consistentes con un papel crtico para la prolil 3-hidroxilacin en colgeno formacin de la hlice o de la estabilizacin. Sobre la base de estudios por Jenkins et al. (2003) del modelo sinttico poliprolina-IIlike hlices, sin embargo, 3-Hyp desestabiliza la triple helicoidal estructura, mientras que los ms abundantes 4-Hyp residuos en la -Y-posiciones de las repeticiones de colgeno de triple hlice estabilizar la triple estructura helicoidal (Myllyharju y Kivirikko 2004; Kar et al. 2006). Otro estudio de pptidos de colgeno del modelo lleg a la conclusin de que la presencia de 3 (S) Hyp en la posicin X de la repeticin de triplete Gly-XY no conduce a la'' gran alteraciones estructurales'' en la hlice del colgeno de triple (Schumacher et al. 2006). Vranka et al. (2004) haba postulado que un complejo de protenas que comprenden P3H1, CYPB, CRTAP y posiblemente otros complejos ms grandes interactuar con todava desplegado procolgeno cadenas en vivo para conseguir un totalmente plegado y ensamblada molcula de colgeno dentro de la clula. CYPB-deficiencia, que an no ha sido reportado, tambin puede resultar en un fenotipo de OI severa con disminucin de colgeno prolil 3-hidroxilacin. Por lo tanto, la deficiencia de colgeno en 3-Hyp

podra ser simplemente un marcador para el complejo'''' disfuncional. 3-Hyp es ms abundante en otros colgenos de los tipos I, II, III y V, tales como el colgeno tipo IV, un componente principal de membrana basal y un determinante de su fisiolgico funcin. Es posible que la estructura de tipo IV colgenos tambin pueden verse afectados si el P3H1/CYPB / CRTAP complejo eran defectuosos. El producto de otra P3H gen podra ser necesario, sin embargo. Por lo tanto, la deficiencia en 3-Hyp en los colgenos de hueso podra ser un marcador para la deficiencia de P3H1, es decir, la lesin biolgica crtico es la defectuoso complejo chaperona que incluye P3H1 (La enzima), as como CRTAP (la protena de ayuda; Marini et al. 2007a). Esta posibilidad podra abordarse como se sugiere previamente (Krane 2006) por los experimentos que implican knock-in de un P3h1 que carecen de la dioxigenasa cataltico secuencias, pero que retiene la capacidad para formar complejos con CYPB y CRTAP. Prolinas colgeno y la susceptibilidad a las colagenasas Aspectos de la estructura de colgenos determinados por la ubicacin de los residuos prolil y 4-hidroxiprolilo tambin influencia degradacin de estas macromolculas de la matriz extracelular por enzimas proteolticas. La llamada colagenasas son metaloproteinasas de la matriz (MMPs) (Nagase y Woessner 1999; Nagase et al. 2006, Puentes y Lpez-Ot'n 2004; Stamencovic 2003; Sternlicht y Werb 2001; Vu y Werb, 2000). En los seres humanos, cinco colagenasas han sido identificados y caracterizados: MMP1, MMP2, MMP8, MMP13 y MMP14. En ratones, MMP2, MMP8, MMP13 y MMP14 se expresa en diversas clulas y tejidos y su funcin se ha dilucidado, en parte, por mutagnesis dirigida. Un ortlogo de MMP1 en ratones tiene han clonado, pero se expresa slo a bajos niveles. La primera cuatro colagenasas son secretadas por las clulas como inactivo zimgenos (procolagenasas), mientras que MMP14 es una transmembrana proteinasa (tambin conocido como MT1-MMP) con la porcin de catalizador en una localizacin extracelular; MMP14 es activa intracelularmente. Cada una de estas colagenasas activados in vitro se unir nativos, que forman fibrillas de colgeno con ininterrumpidas triples hlices en un solo sitio correspondiente en el principal dominio de triple helicoidal de colgeno de tipo I, para los ejemplo, entre un Gly775 y Ile776 en las cadenas a1 y un Gly775 y Leu776 en la cadena a2. Hay varios Gly-Ile y Leu-Gly secuencias de todo el helicoidal triple porcin de colgeno de tipo I y slo aquellos en la 755/776 locus son atacados. Para explicar estas observaciones, que tena han propuesto tres dcadas atrs, que la triple hlice estructura en la regin alrededor del sitio de escisin de la colagenasa es menos estable, atribuible a'' la disposicin de la amino cidos prolina e hidroxiprolina'' (Brown et al. 1977). Todos de los sitios reportados en el colgeno tipo I donde ligandos conocidos bind han sido mapeados y tres grandes unin al ligandoregiones (MLBRs) han sido identificados (DiLullo et al 2002.; Marini et al. 2007). Uno de stos, MLBR2, se extiende desde 691-823 posicin helicoidal e incluye sitios de unin de A1B1 y A2B1 integrinas, fibronectina y oligomrica del cartlago

protena (COMP), as como el sitio importante para la escisin por MMP (Lauer-Campos et al 2000;. Lauer-Fields et al. 2001). Como puede verse en la figura. 3, los dos Gly-X-Y tros alrededor del sitio de escisin (775-776) en colgeno de tipo I cadenas a1 y a2 carecen de residuos Pro en la posicin-Y-. Las MMP pueden hidrolizar sustratos pequeos pptidos octapeptdicos con secuencias similares a las alrededor de la escisin La figura. 3 secuencias de aminocidos en la regin de la colllagenase sitios de escisin en el componente A las cadenas de colgeno tipo I. Amino cidos se numeran desde sitio en nativo de tipo I de colgeno (Fields et al. 1987). Sustitucin de Pro para Gln en el sitio P2 reduce marcadamente la tasa relativa de hidrlisis. Para entender la escisin de colgeno nativo triple hlice, hemos introducido varios mutaciones alrededor del sitio de escisin en grande, clonado fragmentos de Col1a1 genmico murino transfectadas y el clones mutantes en Mov13 fibroblastos que no expresan Col1a1 endgenas debido a una insercin retroviral (Wu et al. 1990). Mov13 fibroblastos, sin embargo, que siguen expreso COL1A2 y COL1A2 traducir mRNA, no obstante no secretan colgeno tipo I desde A2 (i) las cadenas no pueden formar homotrmeros (Khoshnoodi et al. 2006). Despus de la transfeccin Mov13 de fibroblastos con Col1a1 mutado, colgenos son secretados que comprenden uno endgeno a2 (I) cadena y dos cadenas mutadas A1 (I). El colgeno secretada a continuacin, puede ensayarse la susceptibilidad a la escisin por colagenasas (Wu et al. 1990). Como se muestra esquemticamente en la La figura. 4, colgeno de tipo I que contiene una sustitucin Ile776Pro en la A1 (I) cadenas en P1 0 no se escindi por MMP1. Adems, colgeno de tipo I que contiene un doble sustitucin de Gln774Pro (P2) y Ala777Pro (P2 0) dejando P1 0 intacto Tampoco se escinde proporcionando evidencia directa de la posible papel de la estructura helicoidal menos estable en este regin de colgeno natural en la determinacin de dnde y si el colgeno es susceptible a la proteolisis. Aprendimos a partir de estos estudios en cultivos celulares que la presencia de dos mutantes uncleavable A1 (i) las cadenas en el trmero impide la la escisin del peso a2 (I) de la cadena y que un peso desalineada a2 (I) de la cadena evita la escisin de la colagenasa de dos escindibles A1 (i) cadenas. A continuacin, introduce la mutacin que codifica el doble sustitucin de Gln774Pro (P2) y Ala777Pro (P2 0) (Fig. 4, Mutante IV y la figura. 5) en el gen COL1A1 endgeno por la orientacin de genes que permiten a los ratones a desarrollar y sobrevivir a [1 ao de edad. El collagenaseresistant homocigotos ratones (denominado Col1a1tm1 Jae o ratones r / r) hizo desarrollan fibrosis de la dermis y de algn deterioro posparto involucin del tero (Liu et al. 1995). Como predecir a partir de la anterior en los estudios in vitro (Wu et al. 1990), colgeno extrado de la piel y el hueso de r / r ratones fue completamente resistente a la proteolisis en el sitio helicoidal por todo

las colagenasas mamferos probado incluyendo MMP1, MMP2, MMP8, MMP13 y MMP14 y por una colagenasa de Xenopus laevis gen denominado 11 XCL3 (Jung et al. 2004). Tambin se extrajo el colgeno de la piel de heterocigotos (R / +) ratones que nos permiti demostrar que una sola mutante (r) a1 (I) en la cadena heterotrmero impide colagenasa la escisin del nico peso a1 (I) de la cadena y el peso a2 (I) (Chiusaroli et al. 2003). La colagenasa-resistencia mutacin tanto se comporta como dominante negativo. Importante entendimiento en el mecanismo de escisin de MMP de helicoidal colgeno han sido obtenidos por la demostracin de que colagenasas, a travs de su C-terminal llamado pexin dominios, se unen primero a nivel local y desenrollan la triple hlice estructura antes de la hidrlisis de los enlaces peptdicos (Chung et al. 2004). Para estos experimentos, un catalticamente inactivo mutante de MMP1 (Glu200Ala) se utiliz en combinacin con otras MMPs activas noncollagenolytic que por s mismos no cleave colgeno nativo. As, se podra predecir que el colgeno de las r / + o R / R ratones con la sustituciones de Gln774Pro y Ala777Pro en uno o dos A1 (i) cadenas sera resistente a este desenrollado y por lo tanto resistentes a la protelisis. Dr. H. P. Ba chinger del Portland OR Hospital Shriners amablemente mide la Tm de colgeno que se extrae de la piel o de la cola de r / r y peso ratones utilizando dicrosmo circular; no hubo diferencia en Tm de colgenos de los ratones r / r y peso. No podra ser as se muestra que la adicin de los dos residuos de Pro en la Y posicin en dos tripletes de dos A1 (i) cadenas alterado el La figura. 4 Las mutaciones codificados en COL1A1 clones genmicos expresado en Mov13 fibroblastos. Mov13 fibroblastos se transfectaron con genmico COL1A1 clones con mutaciones como se indica. El colgeno tipo I en medio que contiene protenas de peso o mutantes A1 (i) las cadenas se prepar mediante digestin limitada de protenas medianas con pepsina despus de la marcacin clulas con [3H] prolina. Para probar la susceptibilidad de los colgenos etiquetados a digestin con colagenasa, los colgenos marcadas se incubaron a 20? C durante 18-24 h con purific activado colagenasa sinovial reumatoide (MMP1) y productos resueltas por SDS-PAGE y se analizaron por fluorografa (Wu et al. 1990) La figura. 5 secuencias alrededor del sitio de escisin de la colagenasa de tipo salvaje y colagenasa resistente a colgeno tipo I basado en el nucletido secuencia del clon genmico Co1ia1 mutado. Los residuos Pro en 774 y 777 sera al menos parcialmente hidroxilado a 4-Hyp in vivo Aminocidos (2008estructura general helicoidal de las molculas de colgeno mutado, aunque los Pro (4-Hyp) sustituciones todava podra alterar el local de la estabilidad helicoidal (no medible por este anlisis) en la regin del sitio de escisin de la colagenasa. Otros estudios de los ratones r / r revel otras caractersticas del fenotipo anormal, en particular en el esqueleto. Por ejemplo, hubo evidencia de disminucin de la generacin de los osteoclastos funcionales (resorcin sea-clulas) con disminucin de la resorcin sea (Zhao et al. 1999). Adems, No hubo diferencias sorprendentes observ en el nmero de lagunas de osteocitos vaco en calotas y los huesos largos de r / r en comparacin con el peso de los ratones de tan slo 4 semanas de

edad, y aument an ms ya que los animales mayores (Zhao et al. 2000). En este estudio, el nmero de persistir Osteocitos TUNEL-positivas (apoptosis), as como peristica clulas en el calotas de r / r ratones tambin aument. Los osteocitos de peso de los ratones normalmente liberar colagenasa que actan sobre la matriz extracelular circundante, evidenciado por tincin con Mab 9A4, que reconoce un eptopo crptico en el N-terminal ms grande collagenasecleavage fragmento de colgeno tipo I (Zhao et al. 2000). La tincin con el anticuerpo monoclonal no se detect en la periferia de osteocitos en calotas de r / r ratones. Por lo tanto, la colagenasa normalmente escinde el colgeno tipo I en el locus helicoidal in vivo, pero no escinde colagenasa r / r en colgeno este locus in vivo. Paradjicamente, los incrementos en el grosor de calota fueron primero seal en R / R ratones de 4-6 semanas de edad y los 12 meses de edad, fueron * dos veces que en + / + ratones. El patrn de in vivo etiquetado con calcena, un marcador fluorescente que se localiza superficies seas mineralizadas recientemente, era coherente con aumento de la formacin sea (Zhao et al. 2000). En el largo huesos de ratones control, superficies endoseos eran lisas con deposicin de hueso poco endosteal nuevo, pero, en r / r ratones, superficies endoseos contena abundante endocortical nuevo, hueso trabecular circundante espacios activos de mdula. En r / r ratones, calcena etiquetado se observ tanto en periosteal y superficies endoseos con la mayor parte de la fluorescencia en la nueva hueso en las superficies endoseos, en peso de los ratones slo limitado y etiquetado dispersos se encuentran en las superficies endoseos. En vista de estas observaciones, se postula que normalmente osteocitos (As como los osteoblastos y sus clulas precursoras) utilizar seales generadas por escisin de colgeno para mantener su viabilidad y, si tales seales no son inducidos, se someterse a la apoptosis y su lagunas vacas. El aumento de deposicin sea en no tratados r / r ratones posiblemente representaban por la prdida normal de seales negativas de los osteocitos (Zhao et al. 2000). Un buen candidato para tal negativa seal derivada de osteocitos se esclerostina tambin conocido como SOST que desde entonces ha sido identificado (Van Bezooijen et al. 2004). Posteriormente, en estudios usando tincin Bodian, se Era evidente que la red canalicular a travs del cual osteocitos se comunican entre s y con el hueso clulas que forman en las superficies seas son sorprendentemente interrumpido en los ratones r / r e imitan hallazgos en MMP2 nulo ratones (Inoue et al. 2006). Remodelacin anormal del tejido blando tambin fue encontrado en la resistentes a la colagenasa-ratones. La cicatrizacin de heridas se ve afectada (Beare et al. 2003). En otros estudios, el colgeno ms acumula en aterosclertica inducida experimentalmente placas en r / r ratones (Fukumoto et al. 2004) y la recuperacin de fibrosis heptica inducida por CCl4 se retrasa en r / r ratones con fibrosis persistente y alteracin del patrn de la componente clulas (Issa et al. 2003). Si dicha patologa es debido a la ausencia de resorcin de colgeno y / o alteracin de una patrn de deposicin de colgeno no se ha establecido. En varios de estos ejemplos, la proliferacin celular alterado

y la migracin fueron evidentes en los ratones R / R que sugieren que el fracaso a reabsorberse colgeno puede explicar slo una parte del fenotipo. De hecho, algunas clulas se pueden utilizar colagenasas no slo al colgeno se reabsorben en el entorno matriz extracelular, sino tambin a una cadena de nick para revelar una sitio crptico de unin esencial para un evento de sealizacin tal como una seal de supervivencia celular. En este sentido, se ha ha demostrado que los queratinocitos humanos (clulas HCAT) puede migrar en un tipo normal que en una matriz de colgeno proceso que implica la unin de clulas a la matriz y induccin de la expresin de MMP1 (Pilcher et al. 1997). Esta migracin de las clulas HCAT sea anulada por sinttico Inhibidores de MMP y no tiene lugar en un sustrato de r / r colgeno. Conclusiones y perspectivas de futuro La estructura de los colgenos requiere un residuo de glicina en cada tercer residuo (Gly-XY tripletes) de los polipptidos que comprenden el triple hlice y sustituciones de glicina interrumpir la estructura y provocar la enfermedad, tales como la osteognesis imperfecta. Prolinas y 4 hydroxyprolines-, abundantes aminocidos en colgenos, desempean papeles como estabilizadores de la presente colgeno estructura helicoidal. El colgeno prolil 4-hidroxilasas actuar en prolinas en el crecimiento an no se pliega naciente cadenas en el retculo endoplsmico rugoso primera anclado a travs de sus C terminales no colgenas dominios para formar trmeros. El principal prolil 3-hidroxilasa resulta ser un componente crtico de un complejo de las chaperonas moleculares, que en funcin de mover el colgeno sintetizado de nuevo a travs del retculo endoplasmtico rugoso. La posicin de prolinas y 4 hydroxyprolines-en los tripletes de colgeno tambin determina la susceptibilidad de colgenos a la escisin en un locus nico por las colagenasas. Mutagnesis dirigida en ratones que altera la posicin de prolina y crtico 4-hidroxiprolina residuos da lugar a fenotipos interesantes. Es esencial para elucidar los mecanismos moleculares que subyacen a estos fenotipos.) 35:703-710 707 123