Innovateurs

Rhne-Poulenc Rorer : comment la recherche sattaque aux rsistances bactriennes

Ladaptation des germes face larsenal antibiotique et la multiplication des souches rsistantes posent un rel problme de sant publique. Quelles sont les stratgies possibles de la recherche pharmaceutique dans cette escalade ? Enqute auprs de trois chercheurs du groupe Rhne-Poulenc Rorer.
s AIM Aprs lexplosion des dcouvertes en antibiothrapie des annes 1940 au dbut des annes 1980, le danger reprsent par les bactries na-t-il pas t un peu oubli ? Cyrille Leperlier Cest exact. Beaucoup ont pu croire que les infections bactriennes ne constituaient plus une menace srieuse. Pourtant, les bactries ont ragi : moins de cinq ans aprs la mise sur le march de la pnicilline, on identifiait dj des souches de staphylocoques capables de neutraliser la molcule par production denzymes spcifiques, les bta-lactamases ! (1) Aujourdhui, nous devons constater lmergence de souches bactriennes multirsistantes,en ville et surtout lhpital, o lon connat lincidence des infections nosocomiales. Le nombre de familles dantibiotiques reste relativement faible. La dcouverte de la classe la plus rcente remonte plus de vingt ans ! De plus, en raison des phnomnes de rsistance, les molcules existantes ont une dure de vie limite. Il est maintenant vident que le seul moyen efficace dchapper aux rsistances croises et de prendre de vitesse les bactries est lidentification de nouvelles familles et/ou de nouvelles cibles bactriennes.
Cible dans la bactrie (serrure)

Laugmentation de frquence des patients immunodprims, permettant des bactries saprophytes de rejoindre les rangs des pathognes, lapparition de nouveaux concepts amenant sattaquer des germes hier ngligs, tel Helicobacter pylori, sont dautres lments qui ncessitent un renouvellement de larsenal antibactrien. s Quels sont, en 1995, les outils de la mise au point de nouvelles molcules ? Jean-Marc Paris La chimie constitue toujours la base de cette recherche. Mais les chimistes, qui ont longtemps travaill amliorer lactivit de molcules connues en modifiant de manire systmatique leur structure chimique, peuvent maintenant sorienter grce prcieuse des Mieux connatre laide analystes structuraux, les mcanismes des cristallographes et des spcialistes de mode rsistance dlisation molculaire.

Cyrille Leperlier

Jean-Marc Paris

Jean-Franois Desnottes DE LA RECHERCHE EMPIRIQUE A LA RECHERCHE RATIONNELLE Jusqu prsent, lorsquune molcule prsentait une activit antibactrienne, la structure de sa cible ntait pas connue (1). Les chimistes essayaient damliorer son activit par modifications chimiques systmatiques (2). Le rendement tait faible : la modification pouvait aboutir un gain defficacit (3), un changement de proprits,comme la solubilit par exemple (4), ou la perte de lactivit (5). Les nouvelles stratgies de recherche reposent sur la slection dune cible bactrienne grce la biologie molculaire, puis sur la recherche dun inhibiteur spcifique par modlisation molculaire. Pour ladversaire, lun des principaux mcanismes de rsistance est la mutation de la cible (6).

Molcule active (clef)

Source
Tmoignages de Cyrille Leperlier (directeur de la recherche clinique Rhne-Poulenc Rorer), Jean-Marc Paris (responsable du programme antibactrien RhnePoulenc Rorer) et Jean-Franois Desnottes (responsable du service Biologie-Antibactriens Rhne-Poulenc Rorer), recueillis lors des Ateliers de Communication Scientifique organiss par le groupe Rhne-Poulenc Rorer. N 17 1995 A.I.M.

Par ailleurs, la mise au point de molcules rellement innovantes implique lidentification de nouvelles cibles dans les bactries, donc une meilleure connaissance des mcanismes physiopathologiques de linfection. Nous tudions activement les moyens de dfense des bactries ainsi que leurs relations avec les cellules-htes et avec leur environnement. Rcemment, ltude des mcanismes de rsistance et celle du mode daction des nouveaux germes pathognes nous ont permis dimportants progrs. Les bactries sont trs opportunistes. Elles utilisent des techniques varies pour dvelopper des rsistances un antibiotique : mutation de la cible ou de la structure de leur enveloppe, mise en oeuvre de systmes defflux, production denzymes dgradant lantibiotique. Malheureusement, la plupart du temps, lorsquune rsistance est acquise pour une molcule, elle sapplique tous les membres de la mme Cible mute famille dantibiotiques. s Quelles sont les stratgies mises en uvre pour contrer ces phnomnes ?

J.-M. P. Lapproche classique

Mcanismes daction des antibiotiques

Certains antibiotiques (bta-lactamines, glycopeptides et fosfomycine) peuvent entraver lune des phases de la construction de la paroi bactrienne, notamment lagencement des peptidoglycanes. Les bactries ainsi traites ont des parois incompltes ; elles se dforment et finissent par clater. Cette action bactricide ne peut sexercer que sur des bactries jeunes.
q q Dautres antibiotiques agissent sur la membrane cytoplasmique, soit directement par action toxique, soit indirectement en inhibant sa synthse. Dans les deux cas, la membrane se rompt, le contenu bactrien se rpand et cest la mort cellulaire. Cest le mode daction des polymixines, actives sur les bacilles gram ngatives arobies (sauf Proteus et Serratia).

ADN (mtabolisme) : Sulfamides Trimthoprime ADN

ARN

Enzymes d'ADN : Quinolones

synthse protique peut tre perturbe de diverses faons. Les aminosides, en se fixant sur les ribosomes, gnent la lecture des messages transmis par lARNm, entranent la fabrication de protines non fonctionnelles, perturbent le mtabolisme et conduisent la mort bactrienne.Le chloramphnicol, les ttracyclines, les macrolides et lacide fusidique possdent quant eux une action bactriostatique. Ils inhibent la synthse protique en empchant soit la fixation des acides amins sur lARNt, soit leur libration de lARNt, soit leur assemblage au niveau du ribosome.
q Les antibiotiques peuvent galement exercer leurs effets au coeur mme de la cellule, sur les acides nucliques. En agissant sur lADN, ils provoquent une perturbation profonde de la structure gntique, donc la mort cellulaire. Cest le cas des quinolones. Sur lARN polymrase, ils entranent larrt de toutes les synthses protiques. Cest le cas de la rifamycine.

q La

ARN polymrase : Rifamicine Acide amin Ribosome (synthse des protines) : Aminosides Chloramphnicol Ttracyclines Macrolides Acide fucidique
q Dernire possibilit: le blocage de la synthse des folates. Contrairement aux mammifres, les bactries ralisent la synthse de lacide ttrahydrofolique, lui-mme indispensable la synthse des acides nucliques et des protines. Certains antibiotiques blo-

Membrane cytoplasmique : Polymyxines

Paroi : Bta-lactamines Vancomycine Fosfomycine

quent cette synthse en inhibant les enzymes qui lui sont ncessaires. Cette action, le plus souvent bactricide, est exerce par les sulfamides et le trimthoprime.

COMMENT LES BACTRIES RSISTENT AUX ANTIBIOTIQUES (1) La rsistance aux antibiotiques provient de trois mcanismes principaux. Linactivation de lantibiotique par une enzyme capable de le dgrader ou de le modifier. Cest le cas par exemple des btalactamines (pnicilline), dgrades par les btalactamases, ou des aminoglycosides (gentamycine), modifis. Linterdiction de laccs de lantibiotique sa cible par des modification de sa pntration ou de son limination : rduction de la permabilit ou excrtion acclre. Cest le cas par exemple pour les ttracyclines. La modification de la cible, qui nest plus reconnue par lantibiotique. Ceci a t observ par exemple pour la rsistance lrythromycine. Dans ce cas, la modification touche les structures ribosomales.

Antibiotique

Enzymes Paroi bactrienne Priplasme Membrane Clivage ou modification enzymatique de l'antibiotique Rduction de permabilit ou excrtion de l'antibiotique Mutation de la cible
lactamines Chloramphnicol Gentamycine lactamines Fluoroquinolones Ttracyclines Rifampicine Vancomycine Macrolides

Bactrie sensible

consiste modifier la structure chimique du mdicament afin que la cl (lantibiotique) corresponde mieux la serrure (sa cible bactrienne). Malheureusement, ces modifications se sont longtemps faites laveuglette, car nous ne connaissions pas le structure tridimensionnelle des serrures en question ! Il fallait effectuer un criblage (screening) systmatique de nombreuses molcules diversement modifies pour rechercher celle qui apportait quelque chose. Nanmoins, cette mthode, relativement lente, a son actif quelques beaux succs. Citons les hmisynthses et les synthses de molcules rsistantes aux btalactamases, la recherche dinhibiteurs de ces enzymes, lassociation de molcules synergiques (sulfamide-trimthoprime, streptogramines), les hmisynthses de macrolides, la mise au point des fluoroquinolones Mais il est aujourdhui possible deffectuer un criblage spcifique de molcules modifies en fonction de cibles isoles connues. Cette technique devrait permettre didentifier de nouvelles pistes, les molcules les plus intressantes tant ensuite optimises par modificaIdentifier de tions chimiques. Une deuxime apnouvelles cibles proche, plus prometteuse mais aussi plus incertaine, consiste en lidentification dune nouvelle cible dont latteinte soit ltale pour la bactrie. Cette cible serait alors tudie pour dterminer sa structure tridimensionnelle, et
A.I.M. 1995 N 17

IMPERMEABILITE DES ENVELOPPES DES BACTERIES GRAM NEGATIF : DES SOLUTIONS POUR LAVENIR PLusieurs faons dinterdire laccs de lantibiotique sa cible, autant dobjectifs potentiels pour les chercheurs. Les lipopolysaccharides membranaires longs (dits smooth) tiennent lantibiotique loign de la paroi, au contraire des LPS courts, dits rough, des souches hypersensibles. Des composs peuvent les raccourcir. Les porines de la membrane externe se ferment lantibiotique. Des composs peuvent forcer leur ouverture. Dauters composs peuvent chlater ou dplacer les ions magnsium qui participent lquilibre de la membrane. Des pompes efflux peuvent rejeter lantibiotique hors de la bactrie. Des composs peuvent inhiber leur action. LPS "Rough" (souche hypersensible) Porine ouverte

Composs qui chlatent ou dplacent le Mg++ (quinolones, PMBN, dibromopropamidine)

LPS "Smooth" Composs qui raccourcissent les LPS

Mg++

Mg++

Membrane externe Peptidoglycane

Membrane cytoplasmique Composs modifiant les porines Efflux du principe actif Composs inhibant la pompe efflux

La modlisation molculaire permet de mieux orienter la mise au point dantibiotiques sur les cibles bactriennes.

LA STRATEGIE DU CHEVAL DE TROIE Les bactries ont besoin de fer pour se multiplier. Elles mettent des sidrophores pour extraire le fer du milieu extrieur et captent ensuite le complexe fer/sidrophore grce un rcepteur spcifique. Lattachement dune molcule antibiotique un sidrophore pourrait permettre une action sur les souches peu permables ou rsistantes par rduction de permation. Les premiers couplages raliss jusqu prsent nont donn de rsultats intressants que dans les tests in vitro, mais les activits observes sont bien dues une pntration utilisant le systme de transport des sidrophores.

cette structure servirait ensuite au criblage de nouveaux produits correspondants, labors par modlisation molculaire. s Certains antibiotiques sont inefficaces parce quils ne passent pas lenveloppe bactrienne ou parce quils sont relargus par la bactrie dans le milieu extrieur par des systmes defflux. Comment franchir cet obstacle ou viter cette expulsion ? Jean-Franois Desnottes Il existe plusieurs faons de dstabiliser la membrane externe de la bactrie. On peut chlater ou dplacer les cations divalents de surface, dont le rle est de stabiliser les lipopolysaccharides membranaires. Cela a t fait pour les ions Magnsium de la paroi des Pseudomonas. On peut aussi agir au niveau des canaux protiques (porines) ncessaires lentre dans la bactrie de molcules hydrophiles. Ces canaux sont trs souvent ferms, mais on peut imaginer de les faire ouvrir pour permettre aux antibiotiques de pntrer dans la cellule. Enfin, une connaissance prcise des systmes defflux pourrait galement aboutir dans lavenir au dveloppement dinhibiteurs de ce mcanisme de rsistance des bactries. s Mais comment sattaquer aux bactries qui sopposent lentre des antibiotiques en changeant la composition de leur enveloppe ?
N 17 1995 A.I.M.

J.M. P. Par la stratgie du cheval de Troie ! Il sagit de faire pntrer dans la bactrie des antibiotiques connus, et qui se heurtent normalement aux dfenses bactriennes, en utilisant un systme de transport essentiel pour le germe : les sidrophores. Ces molcules sont mises par la bactrie dans le milieu extrieur pour capter les ions ferriques dont elle a besoin pour faire fonctionner ses enzymes. Il est possible dy accrocher certains antibiotiques, qui sont ainsi intgrs dans la bactrie. Une telle stratgie nous permet de berner certaines bactries qui sopposent lentre des antibiotiques en changeant la composition de leur enveloppe. Elle est actuellement ltude dans plusieurs laboratoires. s Les bactries peuvent avoir diffrents types de relation avec leur hte. Peut-on agir ce niveau ? J.F. D. Jusqu prsent, on stait surtout intress au blocage de la multiplication bactrienne (bactriostase) et/ou linduction de la mort bactrienne (bactricidie). Or, certains germes sont capables de se fixer aux cellules pour co-

Rcepteur du complexe Fer/sidrophore Sidrophore

Fe3+

Antibiotique

Lien

La streptogramine injectable : un exemple dadaptation chimique

La streptogramine injectable est lun des produits innovants dcouverts et mis au point par les chercheurs de RP-R. Antibactrien dorigine naturelle, la streptogramine injectable est ce jour lunique antibiotique ne prsentant pas de rsistances croises avec les antibiotiques actuellement commercialiss. Elle est compose de deux molcules produites par Streptomyces pristinaespiralis : la pristinamycine I et la pristinamycine II, dont laction est synergique. Malheureusement, insolubles dans leau sous leur forme premire, elles taient inutisables en milieu hospitalier. Afin de les rendre solubles, les chimistes ont d y ajouter une chane spcifique. Loin de diminuer leurs activits propres sur lensemble des germes, cette opration a, au contraire, accru leur puissance in vivo et leur efficacit antibactrienne. Actuellement en cours dessais cliniques, en Europe et aux Etats-Unis, la streptogramine injectable a t dveloppe volontairement dans des indications extrmement cibles afin de limiter lmergence de souches rsistantes observe avec les glycopeptides. Seule famille dantibiotiques jusqu prsent actifs sur les germes Gram + rencontrs lhpital, cette famille des glycopeptides est menace aujourdhui par lapparition de souches de Staphylocoques et dEntrocoques devenues rsistantes.

Chanes spcifiques solubilisantes

N O N HN O O HO N NH O OO O NH O N O S N N O SO2 N N H O H N O O OH O O N

Pristinamycine I

Pristinamycine II

Streptogramine injectable

loniser les tissus. Dautres peuvent sinternaliser dans les cellules, sy dvelopper et sy multiplier. Dans lavenir, il va donc falloir tenir compte non seulement des bactries en croissance mais aussi des bactries intracellulaires difficilement accessibles, des bactries qui ne se dveloppent pas (micro-organismes quiescents) ou encore de celles qui adhrent un support, que ce support soit cellulaire ou inerte. s Dune faon plus globale, peut-on envisager dagir sur les relations entre la bactrie et son environnement ? J.F. D. De nombreuses bactries sont Certaines capables, grce un bactries systme impliquant des dtecteurs de surface prennent le associs des protines contrle de leur transductrices, danaenvironnement lyser le milieu extrieur, et de moduler en fonction de celui-ci leur comportement nutritionnel, leur mtabolisme ou leur virulence. Il a ainsi t dmontr rcemment que certains gnes de virulence ne sexpriment quin vivo. Mais faute de moyens dtude directe des bactries dans ces conditions, il est impossible aujourdhui de savoir pourquoi et comment. Certaines bactries vont encore plus loin : elles prennent le contrle de leur environnement et dtournent les activits des cellules-htes leur profit, voire mme provoquent lapoptose ( suicide cellulaire, voir AIM 11). Ces aspects physiopathologiques ne sont tudis que depuis peu de temps. Nanmoins, ils pourraient dboucher moyen terme sur des molcules ayant pour cible les systmes bactriens de contrle de lenvironnement.

s La dcouverte et le dveloppement de nouvelles molcules nous laissent donc envisager une rponse au dfi des rsistances bactriennes ? C. L. On peut lesprer. Mais dans limmdiat, il faut nanmoins rappeler quil existe dautres solutions pour ne pas revenir lre pr-antibiotique . Il sagit par exemple de dfinir de nouvelles stratgies dutilisation des antibiotiques existants et des ciblages adapts pour les nouvelles molcules. RhnePoulenc Rorer a dailleurs tmoign de cette prise de conscience lors du dveloppement de deux nouvelles molcules, la sparfloxacine et la streptogramine injectable. Dans ces deux cas, nous avons dlibrement cibl les indications pour rpondre la fois aux besoins mdicaux, cologiques et conomiques. s Ne peut-on craindre de reproduire les mmes erreurs que par le pass dans lutilisation des nouveaux antibiotiques ? C. L. Il nous faut absolument tirer les leons du pass pour ne pas pnaliser lavenir. Une banalisation des nouveaux antibiotiques serait prjudiciable la fois sur le plan de lcologie bactrienne et dans le contexte conomique de la mdecine actuelle. Cette banalisation anantirait tous les efforts de recherche ! Elle ne peut plus se concevoir aujourdhui.Si lon veut lutter efficacement contre les maladies infectieuses en 1995, il est indispensable de promouvoir une politique de bon usage des nouveaux antibiotiques, cest--dire exiger le respect des indications, des posologies et des dures de traitement. Propos recueillis par Lise Delacroix

Rhne-Poulenc Rorer : une longue tradition en antibiothrapie

Chloroquine : 1947 - Antiparasitaire. Produit de rfrence pour le traitement prventif et curatif du paludisme. Mtronidazole : 1959 - Nitro-imidazol. Antiparasitaire et antibactrien de rfrence pour le traitement des amibiases, des trichomonases et des infections germes anarobies. Spiramycine : 1971 - Macrolide de rfrence. Prescrite dans les infections courantes des voies respiratoires hautes et basses. Pristinamycine : 1972 - Synergistine. Streptogramine naturelle, traitement majeur des infections ORL, des infections respiratoires basses et des infections cutanes. Josamycine : 1979 - Macrolide. Antibiotique oral, utilis dans les infections courantes des voies respiratoires hautes et basses de lenfant et de ladulte. Pfloxacine : 1984 - Fluoroquinolone. Premire fluoroquinolone systmique orale et injectable, prescrite pour le traitement des infections svres en milieu hospitalier. Cfixime : 1988 - Cphalosporine. Premire cphalosporine orale de 3e gnration. Pentamidine : 1989 - Antiparasitaire. Traitement prophylactique en arosol de la pneumopathie Pneumocystis carinii. Sparfloxacine : 1994 - Fluoroquinolone. Premire fluoroquinolone orale active sur les principaux germes responsables dinfections respiratoires communautaires svres de ladulte.

Une recherche innovante continue, tourne vers lavenir

Quinupristine/Dalfopristine - Synergistine. Actuellement en phase III, une alternative thrapeutique nouvelle dans le traitement des infections staphylocoques et entrocoques rsistants.

(1) Voir AIM 13, Gros plan sur la rsistance aux antibiotiques. A.I.M. 1995 N 17