Informe - Tpi 4

Asignatura: Instrumental de Laboratorio Clnico. Institucin: U.N.C.P.B.A., Faculta de Ingeniera. Carrera/Ao: Tcnico Universitario en Electromedicina/ 2012 Departamento/rea: Dpto.
Electromecnica/ Electrnica.
TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

1. Objeto.
Introducir al alumno en el conocimiento y aplicaciones de las tcnicas cromatogrficas, como as tambin en sus avances y combinaciones con otras tecnologas involucradas dentro de las actividades de un laboratorio de anlisis clnico.
2. Alcance y Campo de Aplicacin.

El presente trabajo prctico es aplicable nicamente a los alumnos inscriptos de manera regular a la cursada de Instrumental de Laboratorio Clnico. No ser vlido para alumnos que cursen la materia de manera libre.
3. Responsabilidades.
Es responsabilidad de los alumnos inscriptos en la materia, la de cumplimentar en tiempo y forma la entrega del Trabajo Integrador, segn los requerimientos que se detallan en esta presentacin. Es responsabilidad del docente a cargo, proceder en tiempo y forma con la correccin del mismo y brindar durante todo el desarrollo sus conocimientos y experiencia para la concrecin de la tarea por parte de los alumnos.
4. Introduccin.
El vnculo enseanza-aprendizaje de la materia y del desarrollo del presente trabajo prctico se basar en el anlisis de problemas y situaciones reales por parte del alumno. As mismo, se busca proyectar en el alumno, a partir de dichas situaciones, su insercin en el mercado laboral de forma ms natural y que pueda ejercer las competencias profesionales inherentes a sus incumbencias con solvencia y efectividad. Por otra parte, se busca incitar al alumno a la utilizacin del vocabulario tcnico-mdico en el ambiente laboral. El proceso de evaluacin ser continuo durante el perodo de enseanza de la materia, debiendo el alumno defender la base terica adquirida en un examen final, de tipo multiple-choise. Por otra parte, se evaluar el desempeo a la investigacin, conclusiones finales, ideas particulares y criticas pertinentes respecto de los temas explorados durante el tiempo de estudio.
5. Actividades y Acciones.
Responder al siguiente cuestionario con el mayor rigor cientfico y seguir, para su realizacin, el formato del formulario TPI.
BLOQUE CONCEPTUAL. A. En general, los mtodos para el anlisis qumico son, en el mejor de lo casos, selectivos; pocos, si es que los hay, son verdaderamente especficos. En consecuencia, la separacin del analito de las posibles interfaces a menudo es una etapa de vital importancia en los procedimientos analticos. Hasta mediados del siglo XX, las separaciones analticas se llevaban a cabo en su mayor parte por mtodos clsicos como precipitacin, destilacin y extraccin. Ahora, sin embargo, las separaciones analticas se realizan, en la mayora de los casos, por cromatografa y electroferesis, especialmente en el caso de mezclas complejas y multicomponentes. La cromatografa es un poderoso mtodo de separacin que tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. La cromatografa en columna fue inventada y denominada as, a
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Asignatura: Instrumental de Laboratorio Clnico. Institucin: U.N.C.P.B.A., Faculta de Ingeniera. Carrera/Ao: Tcnico Universitario en Electromedicina/ 2012 Departamento/rea: Dpto. Electromecnica/ Electrnica.

principios del siglo XX por el botnico ruso Mikhail Tsweet. l emple la tcnica para separar varios pigmentos vegetales, tales como clorofilas y xantofilas, haciendo pasar disoluciones de estos compuestos a travs de una columna de vidrio rellena con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadoras aparecan como bandas coloreadas en la columna, lo que justifica el nombre que eligi para el mtodo (del griego chroma que significa color y graphein que significa escribir). La tcnica cromatogrfica aparece en 1850, cuando el qumico F. F. Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgnicos se podan separar por migracin cuando se colocaba una solucin que los contena sobre un material poroso, como el papel. Las aplicaciones de la cromatografa han aumentado en gran manera en los ltimos cincuenta aos, debido, no slo al desarrollo de nuevos y diversos tipos de tcnicas cromatogrficas, sino tambin a las necesidades crecientes, por parte de los cientficos, de mejores mtodos para la caracterizacin de mezclas complejas. El tremendo impacto de stos mtodos en la ciencia se confirm al otorgarse el Premio Nobel de 1952 a J. P. Martin y R. L. M. Synge por sus descubrimientos en este campo. Ms impresionante es, quizs, la lista de doce Premios Nobel concedidos entre 1937 y 1972, los cuales se basaron en trabajos en los que la cromatografa tena un papel vital; hoy por hoy, esa lista ha aumentado. La cromatografa agrupa un conjunto importante y diverso de mtodos, que permite a los cientficos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. En todas las separaciones cromatogrficas, la muestra se desplaza con una fase mvil, que puede ser un gas, un lquido o un fluido supercrtico. Esta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionara con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie slida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionara. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario, los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Figura 1: Imagen Cromatogrfica


B. Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de ellos se basa en la forma en que las fases estacionaria y mvil se ponen en contacto. En la cromatografa en columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a travs de la cual hace pasar la fase mvil por presin. En la cromatografa en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso, la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad o gravedad. Sin embargo, es importante sealar aqu que los equilibrios en los que se basan los dos tipos de cromatografa se idnticos, y que la teora desarrollada para la cromatografa en columna se adapta tambin fcilmente a la cromatografa en plano. Una clasificacin ms fundamental de los mtodos cromatogrficos se basa en el tipo de fase mvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases. Las tres clases ms generales de cromatografa son: de lquidos, de gases y de fluos supercrticos. Como su nombre lo indica, las fases mviles en las tres tcnicas son, respectivamente, lquidos, gases y fluidos supercrticos. Es digno de mencionarse que solamente la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse a cabo en columnas o sobre superficies planas; por otra parte, tanto la cromatografa de gases como la de fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en columna, de tal manera que las paredes de la columna mantienen la fase mvil.
Figura 2: Clasificacin de Tcnicas Cromatogrficas
Resumiendo las distintas tcnicas cromatogrficas, se pueden dividir segn cmo est dispuesta la fase estacionaria:
Cromatografa Plana: La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son: o Cromatografa en papel. o Cromatografa en capa fina.
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Cromatografa en Columna: La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: o Cromatografa de lquidos. o Cromatografa de gases. o Cromatografa de fluidos supercrticos.
La cromatografa de gases es til para gases o para compuestos relativamente voltiles, lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos. En el caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de "derivatizacin", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilizen en las condiciones de anlisis. Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de carcter polar, y por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar. Una serie eluotrpica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan como fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.
C. A continuacin se describen los siguientes conceptos: 1. ELUSIN: La Figura 3 muestra esquemticamente cmo dos sustancias A y B se separan en una columna de por cromatografa de elucin con una fase mvil lquida. La elucin implica el transporte de una especie a travs de una columna por la adicin continuada de nueva fase mvil. Como se indica en la figura, una nica porcin de la muestra se introduce en la parte superior de la columna (tiempo t0) despus de lo cual los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos fases. La introduccin de fase mvil adicional (el eluyente) hace que la fase mvil que contiene una parte de la muestra avance por la columna, donde tiene lugar un posterior reparto entre la fase mvil y las porciones frescas de fase estacionaria a las que accede (tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribucin entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se ubicaba la muestra. Las sucesivas adiciones de la fase mvil hacen avanzar las molculas de soluto por la columna en una serie de continuas transferencias entre las fases estacionaria y mvil. Sin embargo, debido a que el movimiento de los solutos slo puede ocurrir en la fase mvil, la velocidad media a la que una zona de soluto migra en la columna depende de la fraccin de tiempo que reside en esa fase. Esta fraccin de tiempo es pequea para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria (compuesto B) y es grande cuando es ms probable la retencin en la fase mvil (componente A). En el mejor de los casos, las diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de la mezcla en bandas, o zonas, que se localizan a lo largo de la columna (tiempo t2). El aislamiento de las especies separadas se lleva a cabo haciendo pasar suficiente cantidad de fase mvil a travs de la columna hasta que las bandas individuales salen de ella, pudiendo as detectarse o recogerse (tiempos t3 y t4).
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Figura 3: Separacin de A y B por Cromatografa de Elucin en Columna
2. DILUSIN DEL ANALITO: La Figura 3 ilustra una importante caracterstica comn al proceso de separacin, a saber, dilucin del analito, y que acompaa casi siempre a las separaciones. As, el tamao de la banda original que contiene las analitos en la figura es notablemente ms pequeo que cualquiera de las dos zonas que llegan al detector, lo que significa que se produce una importante dilucin de los analitos mientras ellos estn siendo separados. Por tanto, los detectores empleados para los analitos separados deben ser, con frecuencia, ms sensibles que los que seran necesarios si el proceso de separacin no fuera imprescindible. 3. EFLUENTE: Se denomina as a la parte mvil que pasa a travs de la columna.
D. Si un detector que responde a la concentracin del soluto se coloca al final de la columna, y se registra su seal en funcin del tiempo (o del volumen de fase aadido), se obtienen una serie de picos como se muestra en la Figura 4. Este grfico denominado cromatograma, es til tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo. La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra; las reas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada componente.
Figura 4: Distintos Cromatogramas
Los parmetros bsicos que se determinan a partir de un cromatograma se pueden ver en las Figura 5.1 a Figura 5.4:
Figura 5.1
Figura 5.2
Figura 5.3
Figura 5.4
E. Existen muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos, segn su fase mvil se clasifica en Cromatografa de gases que puede ser a travs de dos sistemas, gas- lquido y gas-slido y Cromatografa lquida donde el efluente es un lquido y puede ser lquidoliquido, liquido-slido. Por el mecanismo de retencin-separacin, es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografa de reparto, de adsorcin y de exclusin. Segn la forma de contacto entre las fases se denomina de columna o superficie plana. Tambin se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y gradientes. En la Figura 2 se muestra una clasificacin de los tipos de mecanismos cromatogrficos. A continuacin, se detallan algunos de ellos: La Cromatografa en Papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar unos anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las

manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la eleccin del disolvente y la del papel de filtro. La Cromatografia en Capa Fina (CCF) ,TLC (Thin layer chromatography) es una tcnica cromatogrfica. La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. En cromatografa en capa fina se utiliza una placa cromarogrfica inmersa verticalmete en un eluyente apolar; La placa cromatogrfica consiste en una fase estacionaria polar (comunmente se utiliza slica gel) adherida a una superficie solida con algun agente cementante. El eluyente debe ser un compuesto liquido apolar, generalmente orgnico. Para realizar la CCF, se debe apoyar la placa cromatografica sobre algun recipiente o camara que contenga la fase lquida a aproximadamente 1 cm (la distancia entre el principio de la placa y la muestra que se desea analizar). La Cromatografa de Intercambio Inico (o cromatografa inica) es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares, basado en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad. La Cromatografa de Fluidos Supercrticos (SFC) es una tcnica hbrida entre la cromatografa de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas tcnicas. Esta tcnica es importante porque permite la separacin de mezclas en las que no es adecuada la aplicacin de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos no voltiles o trmicamente inestables que no pueden ser separados mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su deteccin en HPLC. En cromatografa, existen dos trminos (o conceptos) fundamentales. Los mismos son: A. FASE MOVIL: Es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un lquido (cromatografa de lquidos o CEC) un gas (cromatografa de gases) o un fluido supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). La fase mvil consiste en la muestra que est siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil se mueve a travs de la columna de cromatografa (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa. B. FASE ESTACIONARIA: Es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre partculas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna. Por ejemplo por polimerizacin in situ (entrecruzamiento qumico) tras un recubrimiento.
BLOQUE INSTRUMENTAL. F. Existen los siguientes tipos de cromatografas:


1) Cromatografa de Gases: Es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacta con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte. 2) Cromatografa Lquida: Tambin conocida como Cromatografa de lquidos, es una tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica cuantitativa o cualitativa de anlisis. Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la absorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de varios lquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser almina, slice o resinas de intercambio inico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores inicos son matrices slidas que contienen sitios activos (tambin llamados grupos ionognicos) con carga electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor fuerza sobre el soporte slido que otros, lo que provocar su separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo libres en la fase mvil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es el principio fundamental de la cromatografa. Un ejemplo notable es la cromatografa de intercambio inico. Las columnas ms utilizadas son las de slice. 3) Cromatografa Lquida de Alto Rendimiento: Es una Cromatografa de alta presin, es decir, se aplica el flujo a presin (entre 1500 a 2200 psi). El tamao de partcula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas, aumentando por tanto la resolucin. El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el lquido a la columna. Generalmente las columnas de slica requieren alta presin para que el flujo de lquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y el inyector permite la aplicacin de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorcin ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las molculas que eluyen de la columna, se requiere un colector. En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con estndares, que

permiten identificar los aminocidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea la curva del pico correspondiente. El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometra de masas.
Figura 6: Aplicaciones de la Cromatografa de Lquidos
G. Un cromatgrafo de gases consiste en varios mdulos bsicos ensamblados para: 1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase mvil), 2) permitir la introduccin de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4) mantener la columna a la temperatura apropiada

(o la secuencia del programa de temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6) proveer una seal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente. Los componentes fundamentales de un cromatgrafo de gases son: Fuente de Gas. Sistema de Inyeccin. Horno y Columna Cromatogrfica. Sistema de deteccin. Sistema de registro.
En la Figura 7 se muestra el esquema de un cromatgrafo de gases.
Figura 7: Esquema Cromatgrafo de Gases
En cromatografa de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un gas inerte, y a diferencia de la mayora de los tipos de cromatografia, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases: la cromatografa gas slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC). La cromatografa gas - lquido tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente como cromatografa de gases (GC). La cromatografa gas - slido se basa en una fase estacionaria slida en la cual se produce la retencin de los analitos como consecuencia de la adsorcin fsica. La cromatografia gas - slido ha tenido una aplicacin limitada debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elucin con colas (una consecuencia del carcter no lineal del proceso de adsorcin), de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. Es por ello que se trata slo brevemente en la final de este tema. La cromatografa gas - lquido se basa en la distribucin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte. El concepto de cromatografa gas - lquido fue enunciado por primera vez, en 1941, por Martin y Synge, quienes fueron tambin los responsables del desarrollo de la

cromatografa de distribucin lquido - lquido. Ms de una dcada tuvo que pasar, sin embargo, antes de que la importancia de la cromatografa gas - lquido se demostrara experimentalmente. Tres aos ms tarde, en 1955, apareci en el mercado el primer aparato comercial para cromatografia gas - lquido. Desde entonces, las aplicaciones de esta tcnica han crecido de una forma espectacular. Se ha estimado que unos 200 000 cromatgrafos de gases estn actualmente en uso por todo el mundo. El modo estndar, adecuado para aproximadamente 95% de las aplicaciones de las columnas empacadas (o empaquetadas), es la inyeccin directa. La muestra es inyectada con una jeringa hipodrmica a travs de un sptum de goma (o hule) de silicona autosellante, a un alineador de vidrio (glass insert) contenido en un bloque metlico, donde es vaporizada y barrida hacia la columna (Fig. 3.2). El bloque se calienta a una temperatura que se fija en un valor suficientemente alto para convertir prcticamente en forma instantnea la muestra lquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada es del orden de L para lquidos y algo superior para gases. 1. Entre los gases portadores, que deben ser qumicamente inertes, se encuentran l helio, el nitrgeno y el hidrgeno. La eleccin de los gases est con frecuencia determinada por el tipo de detector que se utiliza. Con el suministro del gas se encuentran asociados los reguladores de presin, manmetros y medidores de caudal. Adems, el sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los gases potadores utilizados en cromatografa no afectan, en principio, no afectan a la separacin ya que no tienen ninguna influencia sobre los procesos de sorcin desorcin o de particin que se producen en la columna, por lo que no afectan a la selectividad de sta; de cualquier forma, los trminos de difusin en la fase mvil si dependen de la naturaleza del gas portador. 2. INYECTORES: El modo estndar, adecuado para aproximadamente 95% de las aplicaciones de las columnas empacadas (o empaquetadas), es la inyeccin directa. La muestra es inyectada con una jeringa hipodrmica a travs de un sptum de goma (o hule) de silicona autosellante, a un alineador de vidrio (glass insert) contenido en un bloque metlico, donde es vaporizada y barrida hacia la columna (Figura 8). El bloque se calienta a una temperatura que se fija en un valor suficientemente alto para convertir prcticamente en forma instantnea la muestra lquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada es del orden de L para lquidos y algo superior para gases. Es necesaria una reduccin del volumen de la muestra cuando se trabaja con columnas capilares. Esto se logra mediante un inyector divisor (inyeccin en split) , donde generalmente se inyecta una muestra de 1 L pero slo entra al capilar 0.01 L; el resto es desechado. Esta tcnica impide la sobrecarga de la columna, pero desperdicia una porcin significativa de la muestra, Cuando se realizan anlisis en cantidades pequeas de muestra con algunos componentes en concentraciones del orden de milsimos de parte por milln, se introducira muy poco material en la columna si para estas muestras se utiliza el divisor. Para ellas se requiere de solvente o inyeccin sin divisin (inyector en splitless). La muestra completa, incluyendo el disolvente, se inyecta en la columna tubular abierta, a travs de un vaporizador instantneo caliente. Se evita un coleo pronunciado del disolvente abriendo hacia la atmsfera el puerto de inyeccin despus de algn tiempo (quiz unos 30s), cuando la mayor parte del disolvente, y esencialmente toda la muestra, entraron en la columna. El tiempo apropiado antes de esa descarga es crtico; si es demasiado corto se produce la prdida de los componentes de la muestra, mientras que si es demasiado largo se produce

un pico del disolvente ms grande del necesario, que puede sepultar algunos de los picos de inters.
Figura 8: Esquema de un Inyector
HORNO CROMATOGRFICO: La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo preciso ha de regularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerido. En la prctica, con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullicin promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elucin razonables (2 a 30 min). Para muestras con un amplio intervalo de ebullicin, a menudo es conveniente emplear una programacin de temperatura, con lo que se aumenta la temperatura de la columna bien de forma continua bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separacin. Las columnas cromatogrficas se enrollan y sujetan en una canasta que se monta en el interior de un horno. El horno de la columna debe poder ser calentado y enfriado rpidamente. Esto requiere de un sistema de flujo de aire adecuado y bien diseado. En la mayora de los diseos el chorro de aire pasa a travs de las resistencias de calentamiento, despus por medio de deflectores que conforman la pared interior del horno, pasan por la columna y de vuelta al ventilador para recalentarse y recircular. Los hornos se construyen usualmente con acero inoxidable delgado. Para la programacin de temperatura es deseable disponer de un intervalo de velocidades de programacin desde 0. 1 hasta 50C/min. Debe ser posible sostener la temperatura en cualquier momento dentro del programa durante un tiempo.
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En general, la resolucin ptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la consecuencia de una reduccin de temperatura es un aumento en el tiempo de elucin, y por tanto del tiempo que se necesita para completar un anlisis. Las temperaturas iniciales subambientales son tiles cuando se trabaja con columnas capilares. Las temperaturas se deben mantener alrededor de la temperatura deseada con precisin de 1C en el caso de trabajo isotrmico y de 2C. durante la programacin de temperatura. 3. En cromatografa de gases, un detector ideal tiene las siguientes caractersticas: 1. Adecuada sensibilidad. Lo que constituye una adecuada sensibilidad no se puede evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se van a describir difieren por un factor de 107. Aunque todos se utilizan extensamente y son adecuados en ciertos casos; sin embargo, en algunas aplicaciones los menos sensibles no resultan convenientes. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de analito/s. 2. Buena estabilidad y reproducibilidad. 3. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios rdenes de magnitud. 4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400C. 5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal. 6. Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos. 7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o ms clases de analitos. 8. No destructivo de la muestra. De hecho, no hay detector que rena todas esas caractersticas, y tampoco parece probable que pueda llegar a disearse nunca. Detector de ionizacin de llama (FID): En cromatografa de gases, el detector de ionizacin de llama (FID) es uno de los detectores ms extensamente utilizado y, por lo general, uno de los ms aplicables. En un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrgeno y con aire para luego encenderse elctricamente. La mayora de los compuestos orgnicos, cuando se pirolizan a la temperatura de una llama de hidrgeno/aire, producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a travs de la llama. Entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama, se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de voltios, y para la medicin de la corriente que resulta (de unos 10-12A) se utiliza un amplificador operacional de alta impedancia. La ionizacin en la llama de los compuestos que contienen carbono no es un proceso bien establecido, aunque se observa que el nmero de iones que se produce es aproximadamente igual al de tomos de carbono transformados en la llama. El detector de ionizacin de llama debido a que es un detector que responde al nmero de tomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo, es un detector sensible a la masa, ms que un sistema sensible a la concentracin. Detector de conductividad trmica (TCD): Uno de los primeros detectores que se utilizaron en cromatografa de gases, y uno de los que todava tiene una gran aplicacin, se basa en los cambios en la conductividad trmica de la corriente de gas ocasionados por la

presencia de las molculas de analito. Este dispositivo se denomina a veces un catarmetro. El sensor de un catarmetro consiste en un elemento calentado elctricamente cuya temperatura, a una potencia elctrica constante, depende de la conductividad trmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro o tungsteno, o tambin, un termistor semiconductor. La resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad trmica del gas. Para la configuracin de los componentes del detector se emplean dos pares de elementos, uno de los pares se coloca en el flujo del efluente de la columna, y el otro en la corriente de gas previo a la cmara de inyeccin de la muestra. Alternativamente, la corriente de gas se puede dividir en dos corrientes una de las cuales atraviesa el inyector y la otra no. En cualquier caso, el efecto de la conductividad trmica del gas portador se compensa, y se minimizan los efectos de la variacin de caudal, presin y potencia elctrica. Las resistencias de los pares de detectores gemelos se comparan entre s, incorporndolos en un circuito sencillo de puente de Wheatstone. Las conductividades trmicas del helio y del hidrgeno son aproximadamente de seis a diez veces mayores que las de la mayora de los compuestos orgnicos, de modo que, incluso en presencia de pequeas cantidades de materia orgnica, tiene lugar una disminucin relativamente grande de la conductividad trmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento en la temperatura. Las conductividades de los otros gases portadores son ms parecidas a las de los constituyentes orgnicos y por esta razn con un detector de conductividad trmica debe usarse hidrgeno o helio como gas portador. Las ventajas del detector de conductividad trmica son su simplicidad, su amplio rango dinmico lineal (aproximadamente 105), su respuesta universal tanto a especies orgnicas como a inorgnicas, y su carcter no destructivo, lo que permite recoger los solutos tras la deteccin. Una limitacin del catarmetro es su sensibilidad relativamente baja (aproximadamente 10-8 g de soluto/mL de gas portador). Otros detectores son de 104 a 107 veces ms sensibles. Debera subrayarse que la baja sensibilidad de los detectores de conductividad trmica, hace imposible con frecuencia su utilizacin con columnas capilares, debido al pequeo tamao de muestra con el que estas columnas operan. Detector termoinico de llama (FTD): El detector termoinico (FTD) es un detector selectivo de los compuestos orgnicos que contienen fsforo y nitrgeno. Su respuesta a un tomo de fsforo es aproximadamente 10 veces mayor que a un tomo de nitrgeno, y de 104 a 106 veces superior que a un tomo de carbono. En comparacin con el detector de ionizacin de llama, el detector termoinico es unas 500 veces ms sensible para los compuestos que contienen fsforo y unas 50 veces ms sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades hacen de la deteccin termoinica un sistema particularmente til para la deteccin y determinacin de muchos pesticidas que contienen fsforo. Un detector termoinico tiene una configuracn similar al detector de llama. El efluente de la columna se mezcla con hidrgeno, pasa a travs de la llama, y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una bola de slicato de rubidio calentada elctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800C. Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan inslitamente una gran cantidad de iones a partir de las molculas que contienen fsforo o nitrgeno, realmente no est bien establecido, pero el resultado es una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la determinacin de compuestos que contienen esos dos elementos.

Detector de captura de electrones (ECD): El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que un contador proporcional para la medida de radiacin X. En este caso el efluente de la columna pasa sobre un emisor , como nquel-63 o tritio (adsorbido sobre una lmina de platino o de titanio). Un electrn del emisor provoca la ionizacin del gas portador (con frecuencia se trata de nitrgeno) y la produccin de una rfaga de electrones. De este proceso de ionizacin, en ausencia de especies orgnicas, resulta una corriente constante entre un par de electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de molculas orgnicas que tiendan a capturar los electrones. La respuesta es poco lineal, a no ser que el potencial a travs del detector se aplique en forma de impulsos. El detector de captura de electrones es de respuesta selectiva, siendo muy sensible a las molculas que contienen grupos funcionales electronegativos tales como halgenos, perxidos, quinonas, y grupos nitro; en cambio, no es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e hidrocarburos. Una aplicacin importante del detector de captura de electrones es la deteccin y determinacin de insecticidas clorados. Los detectores de captura de electrones son altamente sensibles y tienen la ventaja de no alterar la muestra de manera significativa (a diferencia del detector de llama). Por otra parte, su intervalo lineal de respuesta normalmente se limita a unos dos rdenes de magnitud. Detector de emisin atmica (AED): El detector ms reciente, y ya disponible en el comercio, para cromatografa de gases, se basa en la emisin atmica. En este dispositivo, el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas, que se acopla a un espectrmetro de emisin con series de diodos. El plasma es suficientemente energtico como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y as obtener sus espectros de emisin caractersticos. Esos espectros son recogidos en un espectrmetro que utiliza una serie de diodos configurados en un plano mvil, que es capaz de detectar la radiacin emitida desde 170 a 780 nm. La serie de diodos movible es capaz de controlar simultneamente de dos a cuatro elementos en cada posicin. Otros tipos de detectores: Un espectrmetro de masas unido directamente al cromatgrafo es otro medio de llevar a cabo la deteccin de los compuestos separados cromatogrficamente. A esta forma de deteccin se le dedicar un tema posteriormente. El detector fotomtrico de llama se ha utilizado extensamente para el anlisis de contaminantes del aire y del agua como los pesticidas y los hidrocarburos. Se trata de un detector selectivo que sobre todo es sensible a los compuestos que contienen azufre y fsforo. En este detector, el eluyente se hace pasar a travs de una llama hidrgeno/aire a baja temperatura, la cual convierte parte del fsforo a una especie HPO que emite bandas de radiacin centradas alrededor de 510 y 526 nm. El azufre de la muestra se convierte simultneamente en S2, el cual emite una banda centrada en 394 nm. Para aislar esas bandas se emplean los filtros adecuados, y sus intensidades se registran fotomtricamente. Con la fotometra de llama se han detectado otros elementos entre los que se incluyen los halgenos, nitrgeno y diversos metales, como el estao, cromo, selenio y germanio. En el detector de fotoionizacin, el eluyente de la columna se irradia con un haz intenso de radiacin ultravioleta de energa variable desde 8.3 a 11.7 eV ( = 149 a 106 nm), la cual provoca la ionizacin de las molculas. Al aplicar un potencial a travs de una celda que contiene los iones producidos, se origina una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada.
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H. La Cromatografa lquida, tambin conocida como Cromatografa de lquidos, es una tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica cuantitativa o cualitativa de anlisis. Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la absorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de varios lquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser almina, slice o resinas de intercambio inico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores inicos son matrices slidas que contienen sitios activos (tambin llamados grupos ionognicos) con carga electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor fuerza sobre el soporte slido que otros, lo que provocar su separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo libre en la fase mvil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es el principio fundamental de la cromatografa. Un ejemplo notable es la cromatografa de intercambio inico. Las columnas ms utilizadas son las de slice. Los mtodos de la cromatografa lquida se resumen en el siguiente cuadro:
Figura 9: Cromatografa Clsica


La cromatografa liquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase estacionaria. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad (Figura 9). Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones lo cual genero la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que la fase mvil fluya a velocidades razonables. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
I. En una primera etapa la cromatografia de lquidos se realizaba en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realiz Tswett sus trabajos originales. Para asegurar unos caudales razonables, el dimetro de las partculas de la fase estacionaria slida por lo general era de 150 a 200 m. Incluso as, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas dcimas de mililitro por minuto. En consecuencia, los tiempos de separacin eran largos -a menudo de varias horas-. Los intentos para acelerar el procedimiento clsico mediante la aplicacin de vaco, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima del mnimo caracterstico que se observa en las grficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia. En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se dieron cuenta de que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los aos sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para producir y utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnologa requiere una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografa de lquidos clsica. Para distinguir estos procedimientos ms nuevos de los mtodos bsicos, que todava se utilizan con fines preparativos, se emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC). Es incuestionable que la cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos esteroides, especies organometlicas y una cierta variedad de sustancias inorgnicas. El coeficiente de transferencia de masa de la fase mvil es funcin inversa del cuadrado del dimetro de las partculas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC debera mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamao de partcula. Por ejemplo una reduccin del tamao de partcula de 45 a 6 m origina una disminucin de diez o ms veces de la altura de plato. En cromatografa de lquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda extra columna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyeccin, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de

la diferente velocidad de flujo que hay entre las capas de lquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con ms rapidez que la periferia. En cromatografa de gases la difusin compensa la dispersin extra columna. Sin embargo, la difusin en los lquidos es significativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente. Cuando se utilizan columnas de pequeo dimetro, el ensanchamiento extra columna puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a la reduccin del radio de los tubos del sistema externos a la columna. Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. La Figura 10 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico. Cada uno de los componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin.
Figura 10: Esquema de un HPLC
Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes: Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos en general oxgeno y

nitrgeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 10, sistemas de difusin que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 4.2. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vaco a travs de un filtro de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la materia en suspensin. Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces ms) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo. Sistemas de bombeo: Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: (1) la generacin de presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo y (5) componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o tefln). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema slo supone una prdida de disolvente. Es evidente que esta prdida puede suponer un riesgo de incendio. Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante. Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente Amortiguadores de pulsos: Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la porcin superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energa de pulsacin. Cuando la bomba se rellena esta energa se libera para ayudar a suavizar la pulsacin de presin. Los amortiguadores electrnicos de pulsos proporcionan una carrera hacia delante corta y rpida del pistn, y enseguida la carrera

rpida de recarga de la bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a la presin del sistema. Control del caudal y sistemas de programacin: Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin a travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba. Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicin del disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada. 1. A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. El medio ms simple y antiguo para la introduccin de las muestras implicaba la inyeccin con una jeringa a travs de un elastmero (septum) que cierra hermeticamente. Con esta finalidad se utilizaron microjeringas capaces de resistir presiones de hasta 1500 psi. En las inyecciones a flujo detenido, el flujo del disolvente se detiene momentneamente, se retira el conector de la cabeza de la columna y la muestra se inyecta directamente en el relleno de la cabeza de la columna despus se retira el accesorio y el sistema se vuelve a presurizar. La ventaja de esta tcnica es su sencillez. Desafortunadamente, la reproducibilidad de la inyeccin con jeringa rara vez es mejor de un 2 o un 3 por ciento y con frecuencia es considerablemente peor. En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la Figura 11. Estos dispositivos estn normalmente integrados en el equipo cromatogrfico y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisin relativa de unas dcimas por ciento. Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con volmenes de 0,5 a 5 L.
Figura 11: Bucle para HPLC
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Figura 11.1
2. Los tipos de columnas en la cromatografa HPLC son: Precolumnas: En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la cada de presin. Columnas analticas: La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m. Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro. Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros. Termostatos: En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces

si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder controlar con precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un bao a temperatura constante.
J. Un problema fundamental del acoplamiento de la cromatografa de lquidos con la espectrometra de masas es el enorme contraste que existe entre los volmenes relativamente grandes de disolvente en la primera y los requerimientos de vaco en la ltima. Para resolver este problema se han desarrollado diversas interfaces. En una de ellas, que est comercializada, el efluente de la columna se divide, y slo una minscula fraccin se introduce directamente en el espectrmetro de masas. Los sistemas de introduccin directa de lquido parecen tener un futuro prometedor cuando se utilizan combinados con las columnas micro capilares, las cuales tienen unos caudales caractersticos de 10 a 50 L/min. En un segundo tipo de interfase, que tambin se puede adquirir comercialmente, el efluente de la columna se deposita sobre un cinta o alambre que se mueve continuamente y que transporta el disolvente y el analito hacia una cmara calorfica para la eliminacin del primero por volatilizacin. Tras una evaporacin del disolvente, los residuos del analito sobre la cinta o el alambre pasan a la zona de la fuente de ionizacin, donde tiene lugar la desorcin ionizacin. Una nueva y prometedora interfase, tambin comercializada, se denomina termovaporizador. La misma permite la introduccin directa de todo el efluente de una columna con caudales de hasta 2 L/min. Con esta interfase, el lquido se vaporiza al pasar por un tubo capilar de acero inoxidable calentado y se forma un chorro de aerosol constituido por las molculas del disolvente y el analito. En el aerosol, el analito se ioniza por un mecanismo de intercambio de carga con una sal, como el acetato de amonio, que se incorpora al eluyente. As, el termovaporizador no slo es una interfase, sino tambin una fuente de ionizacin. Los espectros que resultan son lo general simples, y proporcionan los datos de la masa molecular, pero falta el detalle que tiene con los espectros de impacto electrnico que resulta de gran utilidad para la identificacin de analitos. Por otra parte, la interfase de termovaporizacin slo se puede aplicar a molculas de analitos polares a fases mviles polares que disuelven bien sales como acetato de amonio. Con estas limitaciones, la interfase de termovaporizacin proporciona espectros para una amplia gama de compuestos termoestables y no voltiles como los pptidos y los nucletidos. Recientemente, se ha introducido en el mercado una nueva interfase que permite obtener espectros tanto de impacto electrnico como de ionizacin qumica. En este dispositivo, la nebulizacin trmica y la desolvatacin ocurren simultneamente y producen una mezcla de partculas del soluto en suspensin y molculas gaseosas de la fase mvil. Este aerosol se acelera a travs de una boquilla de inyeccin hacia una zona de vaco donde las molculas de la fase mvil se bombean hacia el exterior. En este caso, la separacin se consigue mediante un separador de momentos lineales. Las molculas de analito en suspensin se ionizan luego con un haz de electrones o qumicamente. Con los detectores de espectrometra de masas, en general, se emplea el control y el almacenamiento de datos por ordenador. Se pueden obtener tanto los cromatogramas en tiempo real como los reconstruidos por ordenador, y tambin los espectros de los picos eluidos. Hasta ahora, para HPLC/MS no estn tan desarrollados como los instrumentos para GC/MS.

6. Conclusin.
Debido a los distintos tipos de tcnicas cromatogrficas, es posible determinar cualquier tipo de componente presente en cualquier sustancia; sea tanto para un anlisis de laboratorio como para una industria de procesos. Sus cualidades para la deteccin hacen de sta tcnica un sistema muy verstil a la hora de obtener resultados, apoyado de la informtica y los avances en la tecnologa de procesamiento de datos. Combinados, permiten desarrollar equipos de alta eficiencia y capaces de dar resultados inmediatos. En contrapartida, lo complejo de estos aparatos no permiten todava una estructura ms compacta, lo que permitira utilizarlos de manera mvil en lugares especficos. Permitiendo utilizar estructuras modulares para la recoleccin de datos y posterior anlisis de los mismos. La complejidad de los conocimientos necesarios y las tcnicas cromatogrficas desarrolladas permiten un conocimiento ms profundo de estos estudios, lo que llevan a involucrarse no solamente en la cuestin tcnica, sino tambin en la del rea en cuestin. Tambin la hace interesante la estructura de los equipos, a fin de elaborar los planes de mantenimiento correspondientes y la intervencin de dichos componentes.
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Asignatura: Instrumental de Laboratorio Clnico. Institucin: U.N.C.P.B.A., Faculta de Ingeniera. Carrera/Ao: Tcnico Universitario en Electromedicina/ 2012 Departamento/rea: Dpto.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

2. Alcance y Campo de Aplicacin.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 1: Imagen Cromatogrfica

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 2: Clasificacin de Tcnicas Cromatogrficas

Preparado por: Franco E. Dber

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Preparado por: Franco E. Dber

Revisado por: Pedro P. Escobar

Realizado por: Pablo LACHERRE

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 3: Separacin de A y B por Cromatografa de Elucin en Columna

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 4: Distintos Cromatogramas

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

BLOQUE INSTRUMENTAL. F. Existen los siguientes tipos de cromatografas:

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 6: Aplicaciones de la Cromatografa de Lquidos

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

En la Figura 7 se muestra el esquema de un cromatgrafo de gases.

Figura 7: Esquema Cromatgrafo de Gases

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 8: Esquema de un Inyector

Preparado por: Franco E. Dber

Revisado por: Pedro P. Escobar

Realizado por: Pablo LACHERRE

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Preparado por: Franco E. Dber

Revisado por: Pedro P. Escobar

Realizado por: Pablo LACHERRE

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 9: Cromatografa Clsica

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 10: Esquema de un HPLC

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Figura 11: Bucle para HPLC

Preparado por: Franco E. Dber

Revisado por: Pedro P. Escobar

Realizado por: Pablo LACHERRE

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

TRABAJO INTEGRADOR N 4: CROMATOGRAFA.

Preparado por: Franco E. Dber

Revisado por: Pedro P. Escobar

Realizado por: Pablo LACHERRE

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