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LEVANTAMENTO DOS MTODOS DE DIAGNSTICO PARA A DOENA DE CHAGAS Bethnia Ribeiro de Almeida 1; Fabiano Costa Santiliano 2.

Professora Mestre do Curso de Farmcia. Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo CCA-UFES, Brasil. bethaniaralmeida@yahoo.com.br
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Mestre em Biocincias e Biotecnologia. CCA-UFES. fabianosantiliano@yahoo.com.br

Recebido em: 04/05/2012 Aprovado em: 15/06/2012 Publicado em: 30/06/2012

RESUMO Diversos mtodos so utilizados para o diagnstico laboratorial da doena de Chagas. Na fase aguda da doena, os tripomastigotas sanguneos podem ser detectados por meio de mtodos parasitolgicos diretos, nos quais os parasitas so identificados diretamente no sangue do paciente. Nesta fase tambm podem ser empregados mtodos parasitolgicos indiretos como xenodiagnstico e hemocultura, alm de mtodos moleculares como a PCR, que detectam o DNA do parasito. Os testes sorolgicos so utilizados rotineiramente no diagnstico da fase crnica e baseiam-se da deteco de imunoglobulinas especficas contra o T. cruzi, tais como os testes de fixao de complemento, hemaglutinao e imunofluorescncia. Este trabalho teve como objetivo realizar um levantamento das principais tcnicas utilizadas na rotina diagnstica da Doena de Chagas. PALAVRAS-CHAVE: Trypanosoma cruzi, Doena de Chagas, diagnstico

ASSESSMENT OF THE DIAGNOSTIC METHODS FOR CHAGAS DISEASE ABSTRACT Several methods are used for the laboratory diagnosis of Chagas disease. In the acute phase of illness, blood trypomastigotes can be detected by direct parasitological methods, in which parasites are identified directly in the patient's blood. This phase also can be used as indirect parasitological methods xenodiagnosis and blood culture, and molecular methods such as PCR, which detect the DNA of the parasite. Serological tests are used routinely in the diagnosis of chronic phase and are based on the detection of specific immunoglobulins against T. cruzi, such as tests complement fixation, hemagglutination and immunofluorescence. This study aimed to survey the main techniques used in routine diagnosis of Chagas disease. KEYWORDS: Trypanosoma cruzi, Chagas Disease, diagnose

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INTRODUO A tripanosomase americana ou Doena de Chagas foi descoberta pelo cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas em 1909, sendo descrito por este, a doena, o agente etiolgico, os transmissores e reservatrios domsticos e silvestres, parte da patogenia e sintomatologia (CHAGAS, 1911). A doena causada pelo hemoprotozorio Trypanosoma cruzi, com estimativas de que cerca de 10 milhes de pessoas estejam infectadas ao redor do mundo, a maioria na Amrica Latina onde a doena endmica. Mais de 25 milhes de pessoas vivem nas reas de risco e estima-se que 10.000 morreram em consequncia da doena em 2008 (WHO, 2008). Tem graves consequncias scioeconmicas, por se tratar de uma enfermidade crnica debilitante e incapacitante. Trypanosoma cruzi A espcie Trypanosoma cruzi faz parte do reino Protozoa, filo Euglenozoa, classe Kinetoplastidea, ordem Trypanosomatida, famlia Trypanosomatidae e gnero Trypanosoma. Apresenta grande diversidade biolgica e bioqumica, que caracteriza as diferentes cepas existentes. Pode ser encontrada em diferentes hempteros e animais silvestres e domsticos os mais variados. Os insetos vetores so da classe Hemiptera, famlia Reduvidae e subfamlia Triatominae. Todas as espcies de triatomneos so passveis infeco pelo T. cruzi por qualquer de seus estgios evolutivos, atravs da suco de sangue de mamferos infectados. A espcie Triatoma infestans um dos principais vetores de T. cruzi, especialmente no Brasil, em parte, por ser esta espcie extremamente domiciliada, vivendo no microclima das habitaes humanas. O ciclo evolutivo do T. cruzi envolve dois tipos de hospedeiros, um invertebrado e outro vertebrado, e trs formas evolutivas bem caractersticas, que so: a) amastigota, forma replicativa no hospedeiro vertebrado encontrado no interior das clulas infectadas; b) tripomastigota, forma infectiva encontrada no sangue circulante de vertebrados e nas fezes do vetor invertebrado, onde recebem o nome de tripomastigotas metacclicos; c) epimastigota, forma replicativa, encontrada nos intestinos mdio e posterior do vetor triatomneo contaminado (TOMLINSON et al., 1994), forma esta que no infectiva para o hospedeiro vertebrado. No hospedeiro vertebrado, o ciclo do T. cruzi inicia-se quando formas tripomastigotas metacclicas, eliminadas nas fezes e urina do inseto vetor, so inoculadas na pele ou mucosas do vertebrado, atravs de leses ou arranhaduras, onde sero potencialmente capazes de invadir qualquer tipo celular. Logo aps a penetrao na clula, a forma tripomastigota pode ser encontrada no interior de um vacolo parasitforo. Imediatamente, h a transformao para as formas amastigotas (BRENER, 1973), seguindo-se a ruptura do vacolo e contato dos amastigotas com as estruturas citoplasmticas celulares. Estas formas iniciam um processo de intensa multiplicao por diviso celular binria, aps o qual, sofrem uma nova transformao para a forma tripomastigota. Atravs de movimentos intensos dos tripomastigotas a clula sofre lise, havendo liberao dos tripomastigotas no espao intercelular, podendo cair na corrente sangunea. Estes podem infectar outros tipos celulares, gerando um novo ciclo de amastigotas, ou serem sugados pelo inseto vetor dando incio ao ciclo invertebrado. O ciclo no invertebrado tem incio quando o sangue de animais infectados contendo tripomastigotas ingerido aps o repasto sanguneo. Estas formas sofrem diferenciao no intestino mdio e posterior do inseto, onde assumem uma forma
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arredondada, denominada esferomastigota, e a forma de epimastigotas. Estas se aderem na mucosa do rgo onde se multiplicam por sucessivas divises binrias, aps as quais migram para o reto. Neste local os epimastigotas diferenciam-se em tripomastigotas metacclicos. Estas formas so liberadas nas fezes e urina do inseto (BRENER & ALVARENGA, 1976), penetrando no hospedeiro vertebrado, reiniciando assim o ciclo (Figura 1).

FIGURA 1. Ciclo biolgico do Trypanosoma cruzi. Formas tripomastigotas metacclicas so liberadas junto com as fezes e urina do inseto vetor (1), penetrando na pele do hospedeiro vertebrado atravs de arranhaduras (2), uma vez na corrente sangunea estas formas infectam diversos tipos celulares, onde h diferenciao para as formas amastigotas (3). Estas diferenciam-se em tripomastigotas podendo infectar novas clulas (4) ou serem sugadas pelo vetor (5), diferenciando-se em seu intestino para epimastigotas, onde multiplicam-se e diferenciam-se na forma tripomastigota fechando o ciclo. Fonte:(Modificado de http://www. who.int/tdr/diseases/chagas.htm, 2002).

A infeco pode ser adquirida por distintas vias de transmisso, destacando-se: a) via vetorial, atravs do inseto vetor triatomneo, que corresponde a 80-90% dos casos; b) transfusional, compreendendo de 5 a 20%, e c) congnita, com 0,5 a 8% de incidncia(http://www.who.int/tdr/diseases/chagas/diseaseinfo.htm, 2002). Outras formas de transmisso como, por meio de acidentes laboratoriais e hospitalares, transplante de rgos, transmisso oral, sexual e atravs de vetores no triatomneos (DIAS & COURA, 1997; SOUZA et al., 2008), so excepcionais e no apresentam significativa importncia em sade pblica. A interao parasito-hospedeiro mostra-se bastante dinmica na doena de Chagas, como resultado de mltiplos fatores ligados ao parasito (cepa e virulncia), ao homem (idade e sexo) e ao ambiente. A infeco apresenta duas fases bem caractersticas: a fase aguda, que tem durao de um a dois meses, apresentando alta parasitemia. Nesta fase, que corresponde multiplicao do parasita, desenvolvem-se diversas reaes inflamatrias no local da inoculao, como reaes de hipersensibilidade tardia na mucosa dos olhos (Sinal de Romaa) e na pele (chagoma de inoculao), alm de reaes inflamatrias agudas caractersticas, como febre, esplenomegalia, entre
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outras. A deteco feita atravs de testes sorolgicos diretos, como a avaliao de ttulos de IgM anti-T. cruzi no soro. Aps esta fase, a infeco controlada gradualmente por mecanismos imunolgicos envolvendo o sistema complemento e anticorpos especficos (BRENER, 1980). O decrscimo nos nveis de IgM e aumento nos de IgG caracterizam a transio para a fase crnica da doena (DIAS, 1984). A maioria dos casos agudos no tratados evolui para a chamada forma crnica indeterminada. Esta consiste na presena da infeco, revelada por sorologia e/ou mtodos parasitolgicos indiretos, associada ausncia de sintomatologia e aos exames clnicos, eletrocardiogrficos e radiolgicos (corao, esfago e clon) normais, podendo permanecer por toda a vida, em 50% dos casos, de modo permanente, tendo muitas vezes sido chamada de forma laboratorial, subclnica ou assintomtica. O estgio crnico marcado por uma queda na parasitemia e, a ausncia de parasitas na corrente sangunea devido ao aumento no nvel de anticorpos IgG, especialmente da classe IgG2 (BRODSKYN et al., 1989). A remoo dos parasitas ocorre atravs de mecanismo fagoctico, dependente da poro Fc da imunoglobulina (UMEKITA et al., 1988), e de receptores de complemento dependente de fragmentos C3b ligados ao parasito (MOTA & UMEKITA, 1989). O diagnstico feito atravs de sorologia convencional, como imunofluorescncia indireta, ELISA, hemaglutinao e fixao de complemento, sendo necessrios mtodos indiretos para a amplificao do parasita, como xenodiagnstico, hemocultura e PCR (GOMES et al., 2009). RESPOSTA IMUNE A infeco pelo T. cruzi, semelhante ao que ocorre em outras infeces por micro-organismos patognicos intracelulares, mobiliza diversos mecanismos efetores do sistema imune, havendo a ativao de fatores relacionados imunidade inata e imunidade adquirida. Consequentemente, o parasita passa a ser continuamente combatido, e tem sua multiplicao reduzida nos tecidos do hospedeiro. No entanto, a persistncia indefinida do parasita, leva a uma atividade prolongada do sistema imune, culminando no aparecimento de leses teciduais e, eventualmente a alteraes funcionais musculares e nervosas, caractersticas da Doena de Chagas. As clulas e mecanismos efetores do sistema imune seriam ento responsveis, tanto pelo controle da multiplicao do parasita nos tecidos como pelas leses locais resultantes da atividade antiparasitria. O complexo ciclo de vida do T. cruzi envolve o surgimento de uma srie de caractersticas que permitem a sua sobrevivncia nos diversos microambientes no inseto vetor e no hospedeiro vertebrado. As formas infectantes para o hospedeiro vertebrado desenvolveram diversos mecanismos que permitissem a sua sobrevivncia no meio hostil, representado pelas clulas e pela corrente sangunea do hospedeiro, como a expresso de molculas em sua superfcie com capacidade de interferir na ativao das vias clssica e alternativa do Sistema Complemento (ANSA-ADDO & INAL, 2010). Outros mecanismos de evaso utilizados so a renovao de molculas de superfcie atravs de vias endocticas que auxiliam o parasito a livrar-se de anticorpos ligados sua membrana (TEIXEIRA & SANTANA, 1989), e a liberao de imunocomplexos ligados membrana mediada por clivagem de glicoprotenas ancoradas atravs de ncoras de glicosil fosfatidil inositol (GPI), mediada por fosfolipases (ALMEIDA et al., 1994).

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DIAGNSTICO DA DOENA DE CHAGAS Na fase aguda da doena de Chagas, os tripomastigotas sanguneos podem ser detectados apenas atravs de mtodos parasitolgicos diretos, nos quais os parasitas so identificados diretamente no exame de sangue do paciente. Nesta fase tambm podem ser empregados mtodos parasitolgicos indiretos como xenodiagnstico, hemocultura e PCR (AVILA et al., 1993; GOMES et al., 2009). Os testes sorolgicos so utilizados rotineiramente no diagnstico da fase crnica e baseiam-se da deteco de imunoglobulinas especficas contra o T. cruzi, tais como os testes de fixao de complemento, hemaglutinao e imunofluorescncia. Estes ensaios detectam os chamados anticorpos da sorologia convencional (ASC) dirigidos contra componentes citoplasmticos ou de superfcie de T. cruzi. Anticorpos de reatividade distinta dos ASC foram identificados em camundongos experimentalmente infectados e denominados anticorpos lticos ou protetores (AL) (KRETTLI & BRENER 1982). Estes anticorpos apresentam as seguintes caractersticas: (a) so especficos contra tripomastigotas, reconhecendo e ligando-se apenas em tripomastigotas vivos; (b) induzem a lise mediada por complemento em tripomastigotas; (c) indicam a presena de infeco crnica ativa. O soro de pacientes chagsicos crnicos possui anticorpos lticos que reconhecem antgenos presentes somente na superfcie de tripomastigotas vivos. Tais anticorpos podem ser detectados por citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 1995) ou por teste de lise mediada por complemento (KRETTLI & BRENER, 1982). A seguir faz-se uma breve descrio dos principais mtodos parasitolgicos e imunolgicos utilizados no diagnstico da doena de Chagas. MTODOS PARASITOLGICOS DIRETOS Exame de sangue a fresco: um processo amplamente utilizado durante a fase aguda, na qual uma gota de sangue (geralmente da polpa digital) coletada e examinada em microscpio ptico com aumento de 400X. Todos os campos da lmina devem ser analisados, afim de que se possa evidenciar a presena do parasita (GOMES, 1996). Gota espessa: nesta tcnica a visualizao dos parasitas fica mais evidenciada em comparao ao exame de sangue a fresco. Duas ou trs gotas de sangue so depositadas em 1 cm3 de uma lmina, as hemcias so lisadas e a lmina corada pelo mtodo de Giemsa. A observao realizada com o auxlio da objetiva de imerso, procurando os parasitas por todos os campos da lmina (LUQUETTI & RASSI, 2000). Esfregao: devido baixa sensibilidade em comparao com os outros mtodos parasitolgicos, este mtodo tem sido pouco utilizado na rotina laboratorial. principalmente indicado para o estudo morfolgico dos tripanossomas encontrados no exame de sangue fresco e/ou gota espessa para identificao da espcie. Giemsa e Leishman so os corantes utilizados nesta tcnica (RASSI, 1992) (Figura 2).

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FIGURA 2. Formas tripomastigotas visualizadas em esfregao sanguneo. Fonte: Ministrio da Sade, 2005.

Mtodo de Strout: trata-se de uma tcnica que visa a concentrao de parasitas no sedimento e sua finalidade aumentar a sensibilidade para evidenciar o T. cruzi em amostras de sangue. Amostras de 10 mL de sangue so coletadas por puno venosa, deixado em repouso para que ocorra retrao do cogulo. Centrifuga-se a amostras por um perodo de trs minutos a 160 x g. O sobrenadante submetido a uma centrifugao de alta velocidade. Uma gota deste sedimento analisada diretamente no microscpio. Se comparado com outros mtodos de concentrao, este apresenta sensibilidade superior, com cerca de 96,2% de positividade em casos agudos humanos. Uma modificao do mtodo tem sido proposta pela Organizao Mundial de Sade, na qual o sangue coletado em tubo capilar, centrifugado e a interface entre as hemcias e a camada de leuccitos coletada e examinada ao microscpio ptico (LUQUETTI & RASSI, 2000). MTODOS PARASITOLGICOS INDIRETOS Na fase crnica da doena de Chagas o uso de mtodos parasitolgicos diretos pouco confivel, devido principalmente baixa parasitemia. Faz-se necessrio, portanto a utilizao de mtodos indiretos, como o xenodiagnstico e a hemocultura para que se estabelea a ocorrncia ou no dos parasitas. Xenodiagnstico: este mtodo consiste em investigar a presena de parasitas nas fezes e/ou contedo intestinal dos insetos vetores, mantidos em laboratrios, e alimentados com sangue de indivduos que sero testados. bastante utilizado para se verificar a infeco chagsica no somente em humanos, mas tambm em animais. Quatro caixas contendo 10 triatomneos cada, fechada em um de seus lados por uma fina rede so colocadas sobre a face ventral do antebrao do paciente por cerca de 30 minutos. Antes da realizao deste exame necessrio que os triatomneos sejam mantidos em jejum prvio por um perodo de duas semanas. Aps a alimentao com sangue do paciente, os insetos devem ser mantidos a uma temperatura entre 25 e 30 C e umida de relativa de aproximadamente 85% na ausncia de luz. O exame fecal ou do contedo intestinal ser feito aps 30-60 dias para pacientes em fase crnica e 10-30 dias para pacientes em fase aguda (BRITTO et al., 2001).
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Hemocultura: existe uma grande variedade de meios de cultura nos quais o T. cruzi pode multiplicar-se abundantemente, tais como os meios difsicos com base de gar sangue (NNN) e outros. Meios lquidos como o LIT (liver infusion tryotose), BHI (barin heart infusion) e o meio Warens so tambm empregados. Esta tcnica por vrios anos no foi rotineiramente utilizada, pois se tratava de um mtodo de baixa sensibilidade. Modificaes na tcnica tais como a coleta de maiores quantidades de sangue, enriquecimento do creme leucocitrio, prolongamento do tempo de cultivo e realizao de hemocultura seriada elevaram a sensibilidade para cerca de 94% (LUZ et al., 1994). Reao em Cadeia da Polimerase (PCR): este mtodo consiste em amplificar atravs da reao em cadeia da polimerase, sequncias de DNA especficas do parasita presente no sangue perifrico e/ou tecidos de indivduos ou animais infectados pelo T. cruzi (Figura 3). Aps a coleta do sangue, o DNA total extrado e amplificado utilizando-se iniciadores especficos previamente estabelecidos (SANCHEZ et al., 2005). Tambm a utilizada a tcnica de PCR em tempo real que permite a quantificao das sequncias de DNA do parasito amplificadas (DUFFY et al., 2009). A utilizao da tcnica da PCR tem se mostrado promissora na avaliao do nvel de parasitemia dos pacientes em fase crnica submetidos ao tratamento com medicamentos (BRITTO et al., 2001; ZALUNTAY et al., 2004; DUFFY et al., 2009).

FIGURA 3. Esquema representativo da amplificao do DNA na PCR. Fonte: <http://acccn.net/Bio/book/BearFlag45/Bio logy1A/LectureNotes/lec24.html>

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Mtodos Imunolgicos Os mtodos imunolgicos so de extrema importncia para o diagnstico clnico da doena de Chagas, especialmente na fase crnica da doena. Os testes imunolgicos oferecem facilidade de execuo e resultados em curtos prazos de tempo, diferentemente dos mtodos parasitolgicos mencionados. Estes testes baseiam-se principalmente na presena de IgG e IgM especficos, que comeam a surgir na segunda ou terceira semana aps a infeco e permanecem detectveis durante toda a fase crnica. Embora os testes imunolgicos exibam alta sensibilidade, comum a observao de problemas de especificidade devido s reaes cruzadas com antgenos de outros parasitas, principalmente com os do gnero Leishmania. Por esta razo critrio da Organizao Mundial de Sade a obrigatoriedade de concordncia em pelo menos dois de trs testes imunolgicos realizados nas mesmas amostras para definir a presena de anticorpos anti- T. cruzi. Outro questionamento com relao aos testes sorolgicos o fato destes detectarem somente a presena de anticorpos e no a presena do prprio parasita. Esta uma importante considerao particularmente na escolha de testes de monitoramento de pacientes submetidos a tratamento quimioterpico. Reao de Fixao de Complemento (RFC): este ensaio baseia-se na interao entre antgenos de T. cruzi e anticorpos do soro de pacientes chagsicos, seguida pela fixao do terceiro componente do sistema complemento (C3), levando formao da C3 convertase (C3Bb). O soro a ser testado inativado por temperatura, diludo em srie e adicionado a uma placa de microtitulao previamente sensibilizada com antgenos de T. cruzi. Se houver anticorpos presentes no soro, ocorrer a formao de imunocomplexos. A seguir adicionada em cada poo uma fonte de Complemento geralmente proveniente de cobaia ou coelho. O passo seguinte a adio em conjunto de hemcias de carneiro e anticorpos contra estas clulas (sistema indicador ou hemoltico). Se houver Complemento livre no meio, as hemcias sero lisadas, mas se o Complemento estiver ligado aos imunocomplexos no ocorrer hemlise e a reao ser considerada como positiva para T. cruzi (Figura 4). Trata-se de uma tcnica bastante dispendiosa, envolvendo vrias etapas, baixos ndices de especificidade e sensibilidade em relao a outros testes sorolgicos, no sendo mais utilizada de 1995 (GADELHA et al., 2003).

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FIGURA 4. Representao esquemtica da Reao de Fixao do Complemento. Fonte: < http://www1.fccj.org/rpegg/mcb2010c/Cowan_HTML/chapter_17_ ppt_rev1_files/frame.htm#slide0082.htm>

Hemaglutinao: consiste numa reao muito simples, mais rpida e sensvel que o teste de fixao de complemento, na deteco de anticorpos anti- T. cruzi no soro de indivduos infectados. Baseia-se na aglutinao de hemcias de carneiro, recobertas com antgenos citoplasmticos de T. cruzi em presena de soro que contenham anticorpos para este parasita (FUCHS et al., 1980). Havendo anticorpos anti-antgenos de T. cruzi, os mesmos formaro ligaes entre as hemcias, interagindo com os antgenos na sua superfcie. Assim visualmente ocorrer a formao de um manto nas placas de microtitulao (Figura 5). Em virtude do baixo custo, nitidez dos resultados e simplicidade de execuo tem sido amplamente utilizada em situaes de rotina. Entretanto, apesar deste teste apresentar alta positividade, reaes cruzadas com outras parasitoses, principalmente leishmaniose so observadas. Geralmente mais comum se encontrar ttulos altos (superiores a 128), nos meses iniciais da infeco, podendo permanecer nestes nveis por anos. Em casos de infeces muito recentes (30-45 dias), a hemaglutinao pode gerar resultados negativos (GADELHA et al., 2003).

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FIGURA 5. Representao esquemtica do teste de Hemaglutinao. Fonte:<http://www1.fccj.org/rpegg/mcb2010c/Cowan_HTML/chapter_17_ppt_rev1_files/fram e.htm#slide0082.htm>

Imunofluorescncia Indireta: h trs dcadas esta reao tem sido amplamente empregada no diagnstico laboratorial da doena de Chagas. O antgeno preparado com formas epimastigotas de T. cruzi, que so coletadas da cultura em meio LIT na fase exponencial de crescimento, lavados e fixados em soluo de formol, paraformadedo e/ou liofilizado. Os anticorpos do soro de pacientes so colocados sobre uma lmina contendo antgenos de T. cruzi. Os anticorpos anti- T. cruzi so revelados com o uso de anticorpos anti-imunoglobulina (Ig) humana conjugados a fluorescena, e observados ao microscpio de fluorescncia (Figura 6). O amplo uso deste mtodo se deve principalmente s seguintes vantagens: relativa facilidade de se obter reaes padronizadas, alta sensibilidade, regularidade dos resultados e a possibilidade de processamento simultneo de um grande nmero de amostras. A principal desvantagem que a leitura subjetiva nos casos de baixos nveis de anticorpos (em casos de ttulos muito baixos) havendo um pequeno percentual de reaes cruzadas em torno de 0,1-1% (FERREIRA & VILA, 2001).

FIGURA 6. Representao esquemtica do teste de Imunofluorescncia Indireta. Fonte: Adaptado de <http://www1.fccj.org/rpegg/mcb2010c/Cowan_HTML/chapter_17_ppt_ rev1_files/frame.htm#slide0082.htm>
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ELISA: esta tcnica consiste em detectar anticorpos contra o parasita atravs da utilizao de um segundo anticorpo (anti-imunoglobulina humana produzido em animais de laboratrio) conjugados a enzimas, que em presena de susbtratos especficos geram produtos coloridos, cuja quantificao feita espectrofotometricamente (VOLLER, 1975) (Figura 7). Este mtodo oferece alta sensibilidade, utilizao de baixas quantidades de soro, processamento simultneo de vrias amostras e finalmente fcil uso em trabalhos realizados em campo. Um dos principais problemas neste teste a presena de reaes falso-positivas, onde o valor da densidade ptica lida no espectrofotmetro fica muito prximo a linha de corte entre a amostra positiva e negativa (GADELHA et al., 2003).

FIGURA 7. Representao esquemtica do teste de ELISA. Fonte: <http://www.kabeveren.net/projecten/20040320/Scie ntists.htm>

Western Blot: nesta tcnica o antgeno de T. cruzi submetido eletroforese em gel de poliacrilamida, para resoluo das protenas segundo o critrio de massa molecular. Aps transferncia do material fracionado em gel para membranas de nitrocelulose (Figura 8), segue-se como no procedimento da reao antgenoanticorpo semelhante ao mtodo de ELISA. Os soros so colocados sobre as fitas de nitrocelulose e no caso de uma reao positiva haver o aparecimento de bandas caractersticas (MORGADO et al., 1989).

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FIGURA 8. Esquema representativo do teste de Western blot. Fonte: <http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/We sternblot.html>

Citometria de Fluxo: MARTINS-FILHO et al., (1995) prope a utilizao da tcnica para a deteco de anticorpos especficos do soro de pacientes chagsicos ligados antgenos de membrana de formas tripomastigotas vivas, a fim de que se pudesse avaliar a eficcia da quimioterapia nestes pacientes. O mtodo se mostrou bem mais sensvel e preciso em relao ao teste de lise mediada por complemento. Os resultados deste trabalho re-enfatizam a correlao entre a presena de anticorpos ligados membrana do parasita e a presena de infeco ativa. Algumas variaes mais modernas da tcnica so amplamente utilizadas no diagnstico da doena (MARTINS-FILHO et al., 2002). relevante informar que na fase crnica da doena o diagnstico parasitolgico direto torna-se comprometido em virtude da ausncia de parasitemia, neste caso, so indicados os mtodos parasitolgicos indiretos (xenodiagnstico ou hemocultura), todavia, apresentam baixa sensibilidade (20-50%). Assim, o diagnstico na fase crnica essencialmente sorolgico e deve ser realizado utilizando-se dois testes de princpios metodolgicos diferentes: um teste que apresenta elevada sensibilidade, como no caso do ELISA utilizando antgeno total ou fraes semi-purificadas do parasito ou a Imunofluorescncia, acompanhado de outro com elevada especificidade, como o teste de ELISA utilizando antgenos recombinantes especficos do T. cruzi, conforme descrito no fluxograma representado na Figura 9.

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AMOSTRAS DE SORO OU PLASMA TESTES ELISA, IFI ou HAI

02 Mtodos Diagnsticos

AMBOS REAGENTES

AMBOS NO REAGENTES

1 REAGENTE E 1 NO REAGENTE POSITIVO REPETIR OS TESTES NEGATIVO

QUADRO INDETERMINADO = RESULTADO INCONCLUSIVO

TESTE REAO EM CADEIA DA POLIMERASE / WESTERN BLOTTING


FIGURA 9. Fluxograma para a realizao de testes laboratoriais para a Doena de Chagas na fase crnica. Fonte:(Adaptado de BRASIL, 2005).

A DOENA DE CHAGAS NO EXAME PR-ADMISSIONAL Apesar do Brasil adotar medidas de combate ao Triatoma infestans, a doena de Chagas ainda de alta prevalncia, sendo importante causa de dias perdidos de trabalho, perda de produtividade por absentesmo e elevado custo de assistncia mdica no tratamento de suas complicaes (BONET et al., 2003). Atualmente, no pas, a posse em servio pblico depende da avaliao da aptido fsica e mental do candidato. Discute-se muito sobre o uso racional de exames complementares durante esse processo, dentre eles a solicitao de exames sorolgicos para diagnstico de doena de Chagas, referindo-se sobre a incapacidade laboral do portadores (SANTOS, 2006). Vale destacar que esta

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solicitao de exames varia conforme regio e reas endmicas para determinadas patologias. O brasileiro com diagnstico doena de Chagas na forma indeterminada (FI) frequentemente se encontra num limbo em relao ao mercado de trabalho e Previdncia Social, considerando que, por um lado, discriminado quando de sua admisso por exames sorolgicos positivos, e, por outro, onera a Previdncia reivindicando benefcios que a lei lhe garante, mas que o retornam base da pirmide social da qual tentava sair com sua fora de trabalho. Estudos realizados por LANNI & MADI (1997) demonstraram que a partir da anlise de 160 pacientes com FI durante 14 anos, submetidos a avaliaes clnicas frequentes, monitorados por meio de eletrocardiograma semestrais e ecocardiogramas anuais, 21% desenvolveram alteraes eletrocardiogrficas, sendo apenas 9% atribudas doena de Chagas, j que envolviam achados mais caractersticos da doena, como bloqueios de ramo, dentre outros. Em 9% foram observadas alteraes transitrias, com porcentagens superponveis populao no chagsica, principalmente no que se refere s arritmias supraventriculares e ventriculares. E, em relao frao de ejeo do ventrculo esquerdo ao ecocardiograma, observados anualmente e at mais frequentemente quando necessrio, manteve-se sempre dentro dos limites normais, no havendo diferena estatisticamente significativa entre os dados evolutivos, tanto no grupo sem alteraes eletrocardiogrficas como no grupo com alteraes eletrocardiogrficas, no mostrando diferena estatisticamente significativa. Estes estudos concluram portanto que esses pacientes no devem ser impedidos de levar uma vida normal em todos os sentidos, inclusive no laborativo. De acordo com a Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade (BRASIL, 2005), apesar da cardiopatia chagsica crnica constituir importante causa de incapacidade laborativa em algumas regies do Brasil, pela benignidade da forma indeterminada, no se justifica a prtica comum de solicitao de exames sorolgicos no pr-admissional. Pois, nos casos de forma cardaca da doena, o exame clnico minucioso, com especial ateno ao aparelho cardiovascular, referese ao componente bsico da avaliao funcional. Nestes casos, demais exames complementares, devem ser solicitados segundo as especificidades da atividade laboral que o indivduo ir exercer (SANTOS, 2006). Assim, o exame admissional que inclui as reaes sorolgicas para Doena de Chagas apresenta elementos sugestivos de discriminao (WANDERLEY, 1998), devendo esta prtica ser abolida. O fato das reaes sorolgicas serem positivas serve apenas como um alerta, no podendo impedir o indivduo de exercer plenamente sua atividade, quando apresentar eletrocardiograma e estudo radiolgico de trax normais (LANNI & MADI, 1997). Entretanto, em casos de cardiopatia, importante considerar as atribuies do cargo exercido, especialmente a necessidade de esforo fsico intenso ou continuado nessa atividade. Estudo realizado por WANDERLEY (1998) constatou a existncia de inadequao quanto a capacidade de trabalho dos portadores de doena de Chagas e a funo desempenhada. Fatores como a idade do candidato tambm so relevantes, tendo em vista que a possibilidade de evoluo da cardiopatia maior quanto mais novo for o indivduo e vice-versa. Portanto faz-se necessrio a adoo de estratgias de esclarecimento aos profissionais da rea de sade referente a capacidade de trabalho dos portadores de infeco pelo T.cruzi, bem como os peritos da Previdncia Social.

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CONSIDERAES FINAIS Apesar de se tratar de uma doena que pode ser adquirida por distintas vias de transmisso (vetorial, transfusional, congnita, acidentes laboratoriais e hospitalares, transplante de rgos, transmisso oral, sexual e vetores no triatomneos), o ambiente com a presena do hospedeiro intermedirio ainda demonstra-se como a principal causa de infeco pelo Trypanosoma cruzi no Brasil. Diversos so os mtodos diretos e indiretos utilizados para o diagnstico e acompanhamento da doena de Chagas, seja na fase crnica ou aguda da patologia. Atualmente, o diagnstico sorolgico da infeco chagsica ainda apresenta limitaes no que diz respeito presena de resultados inconclusivos e falso-positivos (devido a reaes cruzadas com outras parasitoses). O xenodiagnstico e a hemocultura so considerados como padro no diagnstico, particularmente quando as provas sorolgicas so inconclusivas, em pacientes imunodeprimidos e no controle ps-teraputico. As tcnicas de PCR empregam reagentes e aparelhagem dispendiosa e exigem treinamento especializado apresentando-se, no entanto, como uma alternativa no controle ps-teraputico pela sua maior sensibilidade frente s provas parasitolgicas indiretas por essas terem baixa sensibilidade com resultados negativos e por vezes inconclusivos aps tratamento. Dada a sua elevada sensibilidade, para fins de estudos epidemiolgicos, assim como para diagnstico, a imunofluorescncia indireta continua a ser usada at o presente, simultaneamente com a hemaglutinao indireta a ELISA, sendo que os trs so considerados testes convencionais, com os quais h grande experincia em todos os pases da Amrica Latina. Assim, fatores como custo-benefcio, material disponvel, agilidade no diagnstico e a necessidade de busca do tratamento mais eficaz so essenciais na escolha do melhor mtodo a ser aplicado. Alm disso, a solicitao de reaes sorolgicas para Doena de Chagas em rotinas de exames admissionais so discriminativas, devendo esta prtica ser abolida, considerando que um minucioso exame clnico comparado atividade laboral so suficientes. REFERNCIAS ALMEIDA, I. C.; FERGUSON, M. A. J.; SCHENKMAN, S.; TRAVASSOS, L. R. Lytic anti--galactosyl antibodies from patients with chronic Chagas' disease recognize novel O-linked oligossaccharides on mucin-like glycosyl-phosphatidylinositol anchored glycoproteins of Trypanosoma cruzi. Biochemical Journal, v. 304, p. 793-802, 1994. ANSA-ADDO, E.; INAL, J. T. cruzi interference with host cell membrane integrity triggers the release of Plasma Membrane-derived Vesicles: A mechanism for entry into mammalian cells. The Journal of Immunology, v. 184, 137.1, 2010. AVILA, H.; BORGES-PEREIRA, J.; THIEMANN, O.; DE PAIVA, E.; DEGRAVE, W.; MOREL, C. M.; SIMPSON, L. Detection of Trypanosoma cruzi in blood specimens of chronic chagasic patients by polymerase chain reaction amplification of kinetoplast minicircle DNA: comparison with serology and xenodiagnosis. Journal of Clinical Microbiology, v. 31, p. 2421-2426, 1993. BONET, C.; BRANCO, T. P.; LARRUBIA, A. F. G.; TEIXEIRA, C. O.;TEIXEIRA, M. A. B; CARVALHAL, S. S. Correlao Anatomoclnica: caso 1/03 - Homem, 27 anos, com sorologia reagente para doena de Chagas e antecedente de febre reumtica

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