Separacin de poblaciones celulares

Diferenciacin de las clulas sanguneas a partir de clulas madre de mdula sea

Clulas del sistema inmune

Poblaciones celulares en sangre entera

Leucocitos
No granulosos

Clulas nucleadas Se producen en medula sea (humanos a un ritmo de 80 millones por minuto) Se pueden reconocer por sus propiedades de tincin y su estructura interna Linfocito Heterogeneidad morfologica, 6-10um. Citoplasma basfilo muy escaso. Puede tener granulaciones escasas Nucleo redondo, oval o ligeramente escotado, se tie de color violeta y estructura compacta. Monocito Citoplasma basfilo. Tiene numerosas granulaciones pequeas y distribuidas regularmente (no se ven con aumentos bajos) Nucleo lobulado en forma de herradura, violeta claro, no compacto

Leucocitos

polimorfonucleares

Tienen una vida media de 2-3 dias En humanos constituyen el 60-70% de los leucocitos totales de la sangre. No muestran ninguna especificidad para los antgenos pero desempean un Importante papel en la inflamacin aguda Neutrfilo Citoplasma acidfilo color rosa plido (con eosina cida se tie de amarillo). Tiene granulaciones neutroflicas chicas , regularmente distribuidas, abundantes; pueden ser primarios o secundarios Nucleo multilobulado 10-20um de diametro Eosinfilo Citoplasma acidfilo con granulaciones acidfilas grandes, menos nmerosas que en neutrofilos, distribucin regular y muy refringentes Ncleo bilobulado en forma de anteojos, violeta oscuro y compacto. Basfilo Citoplasma acidfilo o antfilo (no toma colorante) granulaciones basfilas grandes,poco nmerosas, distribucin irregular de color azul violeta intensos. Ncleo lobulado, puede ser bisegmentado, violeta oscuro y compacto

Basfilo

Tincin de leucocitos en frotis

Extendido de sangre en portaobjeto, dejar secar

Coloracin ideal:

May Grunwald (azul de metileno/eosina)

Ti citoplasma y granulaciones Giemsa (azul de metileno/eosina y azur)

Ti el ncleo

Tipos celulares
Neutrfilos Eosinfilos
Basfilos

Puncin cardaca

Sangre perifrica

Frotis

Linfocitos

Monocitos

Frmula leucocitaria (en humanos)

Neonatos Neutrfilos en banda 9% 600-3000 3% 1ao 50-700 2 -8 % Adultos 1800-7000

Neutrfilos
Eosinfilos Basfilos Linfocitos Monocitos

52%
2% 0% 31 % 6%

3300-17000
20-850 0-640 2000-11000 400-3100

28%
3% 0% 61 % 6%

1800-4600
50-700 0-200 4000-10500 50-1100

46 - 66 %
1-5% 0 -1 % 20 - 40 % 2 - 10 %

0-700
0-450 0-200 1000-4800 100-800

En rata, el % de linfocitos es mayor al de neutrfilos (la relacin se invierte)

Frmula leucocitaria
1. Para determinar el porcentaje de los diferentes tipos celulares se cuenta un nmero fijo de clulas por frotis (por ejemplo 100), diferenciando los tipos celulares siguientes: linfocito, macrfago y granulocitos. 2. La diferenciacin celular se basa en la relacin del tamao ncleo/citoplasma, la morfologa del ncleo y la coloracin que adquiere el citoplasma. 3. Barrer el preparado en guarda griega porque las clulas no se distribuyen homogneamente: linfocitos en franja central, monocitos y polimorfos nucleares en el borde. 4. Las proporciones de la frmula leucocitaria varan segn: * Edad *especie (humanos predominan los neutrfilos, rata predominan los linfocitos)

Obtencin de clulas de rganos linfoides

Ganglios linfticos rganos linfoides secundarios. Linfocitos T 77 % Linfocitos B 18 % Bazo rgano linfoide secundario. Linfocitos T 35 % Linfocitos B 38 % Ganglios axilares Sangre Linfocitos T 70 % Linfocitos B 24 %

Timo
rgano linfoide primario. Linfocitos T 97 % Linfocitos B 1 %

Timo Bazo

Ganglios mesentricos Placas de Peyer

Ganglios inguinales

Mdula sea

Mdula sea rgano linfoide primario. Generacin de clulas del SI. Capacidad hematopoytica

Preparacin de suspensiones celulares

Obtencin de M.O.
RPMI 1640

Centrifugar Resuspender en medio de cultivo Contar

Obtencin de clulas linfoides Timo

Bazo Ganglios

Recuento de clulas

Determinacin de la concentracin de clulas en una suspensin

cmara de Neubauer
n
N de clulas/ml= 4

X 10 x dil

Separacin de poblaciones celulares

Un mtodo eficiente debe reunir : Buena recuperacin Alta pureza Mantenimiento de la funcionalidad celular

Sirven para: enriquecer o depletar una poblacin de clulas

Mtodos basados en tamao y densidad

Velocidad de sedimentacin a 1 x g Ley de Stokes:
Fuerza de friccin experimentada por objetos esfricos movindose en un fluido viscoso en un rgimen laminar de bajo nmero de Reynolds (Re< 2000).

Una clula que sedimenta obedeciendo la Ley de Stokes (en general es vlida para partculas pequeas movindose a velocidades bajas), llega a una velocidad terminal dada por:

Densidad de la clula

Densidad del medio

V=
Constante gravitacional

2 g ( - ) r2

Radio de la clula Viscosidad del medio

La temperatura puede modificar la velocidad de sedimentacin alterando la viscosidad

10 9 8 7 6 5 4 3 2 6 7 8 9 10 11 12

Velocidad de sedimentacin (mm/h)

Densidad celular
1,09 1,08 1,07 1,06

Dimetro ()

El dimetro influye ms que la densidad de la clula en la determinacin de la velocidad de sedimentacin

Separacin en base al tamao principalmente (medio de baja densidad)

Ventajas: Buena reproducibilidad Buena recuperacin Puede separar una gran cantidad de clulas

Desventaja:

Tiempo requerido para la separacin

Separacin en base a la densidad

Centrifugacin en gradiente de densidad: utiliza un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. el gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar puede ser suspendida permite separar los componentes de una muestra realizar medidas analticas Dos variantes:

Centrifugacin zonal: la muestra se deposita en la parte superior de un gradiente

de densidad preformado. Bajo fuerza centrifuga las partculas sedimentan movindose a diferentes velocidades dependiendo de su masa. Centrifugacin isopcnica : la muestra se disuelve en una sn en donde est el soluto formador del gradiente. Durante la centrifugacin el soluto se distribuye en el tubo y las particulas de la muestra se reorientan de acuerdo a su densidad. (sedimentacin a altas g a travs de un medio cada vez ms denso)

Cuando la densidad del medio y de las clulas son iguales, entonces v = 0 y la clula flota en una posicin de equilibrio.

Las clulas muy densas llegan al fondo del tubo y pueden morir por compresin.
Las clulas muertas tambin son muy densas y llegan al fondo del tubo. Se utilizan altas g para alcanzar ms rpido el equilibrio y evitar mezclas por efectos de difusin. Cuanto mayor es la relacin ncleo : citoplasma, mayor es la densidad de la clula Medio hipotnoico: clulas menos densas; medio hipertnico: clulas ms densas Se utilizan gradientes de BSA lineales o discontinuos y slica gel coloidal, Percoll.

Separacin en base a tamao y densidad (Hypaque-Ficoll)

Separacin de una suspensin celular a travs de un medio de alta densidad por centrifugacin a baja velocidad
Ficoll. Se trata de un polisacrido sinttico de alto peso molecular (400 kDa). Presenta un alto contenido en grupos hidroxilo por lo que tiene una buena solubilidad en medios acuosos. Adems no presenta grupos ionizables que puedan servir de unin a las muestras. Es estable a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin degradarse. Su viscosidad es menor que la de la sacarosa, aunque sigue siendo algo elevada, lo que supone un inconveniente y no altera la presin osmtica del medio. Debido a sus propiedades, el ficoll se ha utilizado para la separacin de clulas y partculas subcelulares mediante centrifugacin zonal.

Densidad del medio para clulas

humanas : 1,075 g/cm3 ratn : 1,09 g/cm3 rata: 1,089 g/cm3

Ficoll

Hypaque

Polmero sinttico de sacarosa y epiclorhidrina (C12H22O11)n.(C3H5ClO)n PM: 400.000

Hypaque sdico (diatrizoato sdico)

sodio 3,5-diacetamido-2, 4, 6triiodobenzoate (C11H8I3N2NaO4) contiene 59.87 % de Iodo

Obtencin de clulas mononucleares de sangre perifrica por Ficoll- Hypaque

Antes de centrifugar

Despus de centrifugar

Sangre diluida

Centrifugacin
400 g 30 temp amb

Plasma y plaquetas
Mononucleares Ficoll Hypaque Polimorfonucleares + Glbulos rojos

Ficoll Hypaque

Mononucleares: Linfocitos + monocitos

Purificacin de PMN provenientes de Ficoll-Hypaque

Por sedimentacin sobre dextran 6 %

Agitacin por inversin y sedimentacin por 30

Dextran

PMN + GR
Lisis con H2O (1) Llevar a isotonicidad
*

PMN + GR + SF

GR

El dextran es un polisacrido complejo y ramificado formado por muchas molculas de glucosa unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones glucosdicas 1->6 entre molculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en uniones 1->4 (en algunos casos tambin en uniones 1->2 y 1->3). El dextrano es sintetizado a partir de la sacarosa por ciertas bacterias cido-lcticas( Leuconostoc mesenteroides y Streptococcus mutans).

Separacin de clulas sanguneas humanas por centrifugacin en gradiente de Percoll

Plasma Monocitos, NK

Gradiente de Percoll (50-70 %): Buena recuperacin y pureza mayor al 90 %

50 % (1065)
Mononucleares (linfocitos)

60 % (1077)
PMN

70 % (1083)
GR

Cuando la densidad del medio y de las clulas son iguales, entonces v = 0 y la clula flota en una posicin de equilibrio.

Percoll. Se trata de una suspensin de partculas (5.15 nm) de cido silcico revestidas de un derivado de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta prcticamente a la presin osmtica del medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y 10. Es soluble en solucin acuosa y estable en ellas siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato), especialmente a bajos pH. El compuesto puede ser utilizado para centrifugaciones zonales, preformando gradientes, o bien para centrifugacin isopcnica, ya que la centrifugacin de percoll en rotores angulares durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial del percoll.

Mtodos basados en adherencia

3 categoras: 1- Adherencia activa: Requiere del metabolismo celular y es temperatura dependiente (ej: macrfagos, polimorfonucleares) 2- Adherencia fsica: Se puede realizar a 4 C o a 37 C (ej: subsets de clulas B) 3- Adherencia de clulas muertas o daadas Sustancias empleadas: Sephadex G10: Quedan retenidas las clulas adherentes. La separacin se basa en adherencia y tamao. Polvo de hierro (Carbonyl iron powder): Las clulas que fagocitan o se adhieren a las partculas de hierro, son removidas con un imn. (ej: Remocin de linfocitos B) Lana de nylon: Se utiliza para obtener clulas T libres de clulas B. El rendimiento es bajo (15 a 25 %). Puede haber retencin diferencial de subpoblaciones T. Adherencia a superficies de vidrio o plstico

Mtodos basados en adherencia Rendimiento bajo (15-25 %) Alta pureza. Adherencia a lana de nylon Adherencia a superficies de vidrio o plstico

* Purificacin de linfocitos T

* Purificacin de macrfagos (clulas adherentes) * Separacin por agentes qumicos (quelante de calcio, EDTA o tripsina) o por rastrillado.

Mtodos basados en afinidad (Interaccin receptor-ligando)

*Rosetas
*Columnas con anticuerpos *Panning: superficies plsticas recubiertas con anticuerpo *Beads magnticas *Aglutinina de man: interacciona con residuos D-galactosa de timocitos inmaduros, aglutinando las clulas (las clulas maduras presentan stos residuos enmascarados por cido silico.

*Aglutinina de soja: aglutina clulas B pero no clulas T. *FACS

Mtodos basados en afinidad

(Interaccin receptor-ligando) A partir de interfase de Ficoll- Hypaque

Rosetas espontneas
CD 2

GRc

LT
(humanos)

GR c GRc

Ficoll-Hypaque
GRc

LT
GRc GRc

Monocitos + LB

Rosetas T

Roseta

Mtodos basados en afinidad

Panning

Beads magnticas

YYYYYYYYYY Y
superficies plsticas recubiertas con anticuerpos

CD 3 (Linfocito T)
CD 19 (Linfocito B) Utilizacin de pequeas beads recubiertas con anticuerpos monoclonales que se unen especficamente a los linfocitos T o B. Una vez hecha la unin las clulas se extraen con la ayuda de un separador magntico. La pureza es excelente. Se trabaja a temperatura ambiente

Seleccin positiva Seleccin negativa

Tcnicas inmunomagnticas

Receptor de la superficie celular que se combina con un ligando (basado en la especificidad de la interaccin) Antisuero + complemento: Eliminacin de una subpoblacin que lleva un antgeno de membrana especfico.

Otros mtodos de separacin Mtodo basado en filtracin por columna de bolitas de vidrio
53 a 65 de dimetro Las clulas ms grandes se retrasan con respecto a las ms pequeas. El vidrio debe estar siliconado

Metodo basado en carga elctrica neta

En roedores hay una distribucin bimodal de movilidades correspondiendo a clulas B y T. En humanos esa distribucin no se puede correlacionar con las poblaciones B y T

Mtodos basados en la separacin funcional por inactivacin de clulas proliferantes

1- Pulso de timidina marcada con radioistopos Linfocitos expuestos a Ag o mitgenos se dividen y la timidina se incorpora al ADN La desintegracin radioactiva mata las clulas proliferantes. (Reacciones mixtas de linfocitos, respuestas citotxicas mediadas por clulas).

La timidina se incorpora al ADN celular

2- Pulso de 5-Br-2-Deoxiuridina (BUdR) Se incorpora al ADN en clulas en divisin como anlogo de la timidina. Cuando se activa con luz UV, causa el dao del ADN.

3- Mitomicina C Causa cross-linking del ADN y las funciones que requieren divisin celular son abolidas 4- Irradiacin Rayos X, Cobalto (60Co), Cesio (137Cs), rayos gamma.