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Captulo

Tcnicas de identificacin
J. L. Lpez-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert

1. Introduccin El propsito fundamental del diagnstico microbiolgico clnico es optimizar la asistencia que se presta al paciente. Para alcanzar este objetivo es esencial obtener y comunicar, lo antes posible, al mdico responsable del mismo resultados tiles para su manejo y tratamiento, usando eficientemente los recursos disponibles. Conjugar estos objetivos, con el mximo rigor cientfico y una creciente demanda asistencial, es lo que se persigue en los Servicios de Microbiologa Clnica. El diagnstico etiolgico directo de las enfermedades infecciosas pretende demostrar la presencia del microorganismo causal en productos patolgicos adecuados obtenidos del paciente e incluye, entre otros procedimientos, el cultivo, el cual persigue el aislamiento del microorganismo causante de la infeccin. Cuando es factible, el cultivo se considera el mtodo diagnstico de eleccin, porque permite la identificacin del microorganismo implicado, el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos apropiados y facilita la aplicacin de marcadores epidemiolgicos. Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identificacin, es decir, a clasificarlo dentro de un grupo o taxn ya establecido, con el que tenga la mayor semejanza. La complejidad de este proceso depende del nivel de precisin o discriminacin que se pretende conseguir. Aunque en los ltimos aos se ha asistido a un crecimiento importante en la oferta de mtodos genotpicos aplicados al diagnstico microbiolgico, en la mayor parte de los procesos de identificacin se siguen utilizando mtodos fenotpicos, puesto que su realizacin, lectura y coste los hacen ms asequibles. En este captulo se revisan las tcnicas de identificacin de las bacterias patgenas. Los mtodos clsicos para la tipificacin de las bacterias se basan en sus caractersticas morfolgicas y metablicas. Las pruebas diagnsticas se seleccionan en una base emprica, con el fin de proporcionar informacin sufi-

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ciente para hacer posible la discriminacin entre los gneros y especies. Adems, hoy en da, las tcnicas de biologa molecular (basadas en la caracterizacin de genes especficos o segmentos de ellos) son cada vez ms comunes y utilizadas en Microbiologa Clnica. 2.Objetivos Y utilidad DE LAS TCNICAS DE identificacin La identificacin de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infeccin es uno de los instrumentos principales del diagnstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas. Diferenciar un microorganismo patgeno per se, potencialmente patgeno o contaminante, y deducir sus posibles mecanismos de resistencia, facilita el tratamiento de la enfermedad infecciosa con la mayor eficiencia posible. Tambin permite realizar un seguimiento y control de las infecciones hospitalarias, detectar un posible brote infeccioso y establecer una poltica de antibiticos coherente y apropiada en concordancia con el centro hospitalario o el rea asistencial, lo que traer consigo una disminucin de las infecciones nosocomiales y/o comunitarias, y una menor generacin de resistencias en los microorganismos. Para poder ser clnicamente til, la identificacin de un microorganismo debe ser lo ms rpida posible. La economa y la prctica dictan el uso de un nmero mnimo de pruebas diagnsticas. Por necesidad, la identificacin en Microbiologa Clnica representar siempre un compromiso entre la exactitud y precisin, por una parte, y la rapidez y la economa por otra. Cmo se logra este compromiso es lo que determina la calidad diagnstica en Microbiologa. 3. Identificacin BACTERIANA La taxonoma bacteriana tiene como objetivo la construccin de sistemas que permitan clasificar a las bacterias. Dentro de la clasificacin taxonmica, las categoras y definiciones ms utilizadas son familia (un grupo de gneros relacionados entre s), gnero (un grupo de especies relacionadas entre s), especie (un grupo de cepas relacionadas entre s), tipo (grupos de cepas interrelacionados dentro de las especies; por ejemplo, biotipo, serotipo) y cepa (aislamiento concreto de una especie en particular). Uno de los factores clave para identificar a las bacterias como agentes patgenos depende de su aislamiento en cultivo puro. Una colonia en cultivo puro est compuesta por un solo tipo de microorganismo y procede de una sola clula original. Las pruebas de identificacin se deben hacer siempre con colonias nicas procedentes de cultivos puros.

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La taxonoma bacteriana convencional permite la identificacin de gneros y especies mediante la aplicacin de diversos criterios, como los que se resumen a modo de ejemplo en la tabla 1. 3.1. Mtodos rpidos de identificacin bacteriana El trmino de mtodo rpido en microbiologa engloba una amplia variedad de procedimientos y tcnicas que permiten obtener resultados en menos tiempo que las pruebas diagnsticas convencionales. Existen mtodos rpidos aplicables a la microscopa, tcnicas de identificacin bioqumicas, pruebas de deteccin de antgenos y de anticuerpos. Incluso en las tcnicas de diagnstico molecular existe una gradacin de celeridad, siendo algunas de estas pruebas tan rpidas como la PCR a tiempo real . Los procedimientos microscpicos que utilizan tinciones estndar y/o anticuerpos fluorescentes para detectar microorganismos especficos se consideran mtodos rpidos y se utilizan para la diferenciacin inicial o la identificacin presuntiva de ciertos grupos de microorganismos. La identificacin rpida de los cultivos clnicos tambin incluye equipos de identificacin comerciales e instrumentos o sistemas robticos e informticos completamente automatizados. Los equipos comercializados son habitualmente sistemas de pruebas miniaturizadas que utilizan sustratos cromognicos o fluorognicos para estudiar las enzimas preformadas. Las reacciones buscadas pueden ser obtenidas en un Criterios y ejemplos metodolgicos aplicados a la identificacin bacteriana
Metodologa de ejemplo

Tabla 1.
Criterio

Observacin macroscpica Observacin e inspeccin de colonias: disposicin, tamaos, textura, formas, pigmentos, etctera Observacin microscpica Metabolismo Otras propiedades Tinciones: formas, agrupacin, esporas, cpsula, flagelos, etctera Bateras bioqumicas: uso de sustratos (oxidacin/fermentacin), produccin de metabolitos secundarios, etctera Resistencia a antibiticos: antibiograma y antibiotipos, ribotipos, fagotipos, estudio de las concentraciones mnimas inhibitorias, estudio de sinergias o antagonismos, etctera

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tiempo de 2 a 6 horas de incubacin, aunque algunas de ellas pudieran requerir una incubacin ampliada hasta el da siguiente. Las capacidades y prestaciones de estos equipos y sistemas son muy variables y suelen incorporar sistemas de lectura mecanizada y automatizada mediante espectrofotmetros, cdigos numricos y bases de datos computarizadas, realizando de forma secuencial la incubacin, lectura e interpretacin de los resultados de las pruebas. 3.2. Tinciones rpidas El examen de las muestras debe iniciarse con la inspeccin visual ordinaria y proceder al nivel de magnificacin necesario para visualizar el patgeno o determinar la ausencia del mismo. En la mayora de los Servicios de Microbiologa se realiza un examen macroscpico de la muestra mediante la inspeccin visual en el momento de realizar la extensin sobre el portaobjetos, la preparacin de los cultivos y, posteriormente, un examen microscpico mediante las tinciones elegidas (Tabla 2); por lo tanto, el microscopio es el instrumento ms necesario para un microbilogo, dado que permite la observacin de microorganismos que no pueden ser apreciados con detalle a simple vista. Las muestras pueden prepararse de diferentes formas para hacer a los microorganismos ms fcilmente visibles y mostrar sus caractersticas estructurales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos elementos, como motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, deteccin de parsitos o protozoos o visualizacin de estructuras fngicas; por otra parte, las tinciones microbiolgicas permiten observar a los microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener, o no, determinados colorantes (Tabla 3). Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos, siendo las ms usadas las tinciones diferenciales, que permiten distinguir a los microorganismos por alguna de sus caractersticas tintoriales peculiares: Tincin de Gram: es de gran importancia en Microbiologa, ya que permite hacer diferenciaciones taxonmicas, separando dos grandes grupos de bacterias (gram-positivas, de color violeta azulado, y gram-negativas, de color granate o rojo-rosado), segn se comporten ante esta tincin. Tincin cido-alcohol resistente: se basa en que ciertos microorganismos no pierden la coloracin por una mezcla de cido y alcohol si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos cido-alcohol resistentes. Otras: hematoxilina frrica, tricrmica, May Grunwald-Giemsa, Wright- Giemsa.

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Tabla 2.
Ojo humano Lupa o gafa-lupa

Sistemas de observacin de los microorganismos patgenos

Magnificacin (x) Aplicacin

Herramienta

0 5 2,5-30

Examen visual ordinario Examen visual ordinario con precisin Examen y manipulacin visual precisa y detallada Clulas teidas Clulas no fcilmente teidas para visua lizacin en campo claro Clulas vivas y/o no teidas Preparaciones usando tinciones con fluo rocromos, los cuales pueden teir direc tamente las clulas o pueden acoplarse a anticuerpos que se fijan a las clulas Determina la ultraestructura de los org nulos celulares Determina las formas y estructuras de la superficie celular

Microscopio de diseccin Microscopio ptico: De campo claro De campo oscuro Contraste de fases Microscopio de fluorescencia Microscopio electrnico: De transmisin De barrido

100-1.000 100-400 100-400 100-1.000

150 a 100 millones 20-10.000

La tincin ms utilizada en microbiologa es, sin lugar a dudas, la tincin de Gram, que proporciona informacin sobre los siguientes aspectos:  Taxonmico: permite la clasificacin inicial de las bacterias usando criterios morfolgicos (tamao, forma, agrupacin, carcter tintorial).  Clnico: permite un diagnstico presuntivo de bacteriuria significativa, tambin un diagnstico etiolgico orientativo del lquido cefalorraqudeo (LCR) de un paciente con sospecha de meningitis, etctera.  Control de calidad y validez de la muestra remitida para cultivo, como sucede con los esputos y otras muestras del tracto respiratorio.  Gua para el procesamiento de la muestra: orienta sobre la eleccin de los medios de cultivo, temperaturas y atmsferas de incubacin, requerimientos nutricionales adicionales, etc. ms apropiados segn los microorganismos observados en la tincin.

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Tabla 3.
Aplicacin Resultados esperados Comentarios

Tinciones y mtodos microscpicos para la deteccin rpida de microorganismos en muestras y materiales  infectados

Tincin o mtodo

Wright-Giemsa

LBA, preparaciones de Tzanck, muestras Morfologa general de las estructuras Permite visualizar bacterias, levaduras, con fondo celular complejo ce lulares parsitos e inclusiones virales Corynebacterium diphteriae

Azul de metileno

Grnulos metacromticos de corinebac Morfologa general y seleccionada terias

Gram

Permite hacer diagnstico presuntivo, Deteccin de leucocitos, reconocimiento Requiere experiencia para valoracin sobre todo, en neumona y meningitis de la morfologa de bacterias comunes adecuada; no incluye otros agentes in bacteriana fecciosos, pero puede diferenciar leva duras Los microorganismos AAR muestran un Las micobacterias son ba cilos rectos, color rojo granate, contrastado sobre cortos o largos y las nocardias, bacilos un fondo azulado; permite detectar arboriformes y ramificados tambin parsitos como Cryptosporidium y Cyclospora Requiere experiencia

Tinciones de muestras (esputos, LBA, LCR, orina, etc.) para identificar bacterias Ziehl-Neelsen, Kinyoun cido-alcohol resistentes (AAR) y para diferenciacin de micobacterias y algunos actinomicetales aerobios (AAR parcial)

Microscopa de campo oscuro

Examen directo de lesiones con sospecha Se ven espiroquetas mviles de sfilis primaria

Tinta china

Examen directo de la extensin de LCR, Los criptococos poseen una cpsula de Tincin inversa, la cpsula no se tie; sangre y orina para Cryptococcus polisacridos que aparece como un halo requiere experiencia para diferenciar sobre un fondo oscuro leucocitos de levaduras Digiere las protenas de las muestras y facilita la visualizacin

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KOH 10%

Examen directo de las extensiones de piel, Visualiza elementos fngicos pelos y uas para ver dermatofitos

Tabla 3.
Aplicacin Resultados esperados Comentarios

Tinciones y mtodos microscpicos para la deteccin rpida de microorganismos en muestras y materiales  infectados (continuacin)

Tcnicas de identificacin

Tincin o mtodo

Naranja de acridina

Es eficaz para diferenciar verdaderos mi - Tincin de fluorocromo fijada a los Requiere el uso de microscopio de fluo cro organismos de artefactos, especialmen- n cleos de las bacterias, que muestran rescencia te en hemocultivos fluorescencia naranja sobre un fondo oscuro; fluorescen tanto bacterias viables como no viables

Blanco calcoflor

Examen directo de LCR, LBA y otros Las levaduras y mohos muestran una Tincin fluorescente que se fija a la pared lquidos corporales para detectar estruc- fluorescencia blanquecina suave celular de hongos y levaduras, pero no turas fngicas y algunos quistes parasi a bacterias o clulas inflamatorias; se tarios prefiere a la tinta china y a preparaciones de KOH Requiere el uso de microscopio de fluo rescencia

Auramina-rodamina

Es til para bsqueda de AAR en una Extensiones concentradas de sedimentos variedad de muestras clnicas, especial de micobacterias mente, las ms contaminadas con flora normal

Tincin preferida para microorganismos AAR, por su rendimiento en el cribado de gran nmero de muestras Requiere el uso de microscopio de fluo rescencia

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 Puede indicar la conveniencia de aplicar otras tcnicas de diagnstico rpido (deteccin de antgenos o de anticuerpos, tcnicas de biologa molecular).  Gua la calidad del proceso que exige concordancia entre los microorganismos que se observan en la visin directa y los que se obtienen, recuperan o aislan por cultivo.  Puede proporcionar ayuda para orientar la asistencia, tanto en pautas teraputicas empricas de antimicrobianos, como en la adopcin precoz de medidas preventivas y de control epidemiolgico. El aspecto de las bacterias en el microscopio permite plantear las siguientes cuestiones clave para el diagnstico microbiolgico: Qu caractersticas tintoriales presentan las imgenes o elementos visualizados en las preparaciones?: se trata de bacterias gram-positivas o gram-negativas?, son bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR), o no, o slo parcialmente? Cul es la morfologa de las clulas bacterianas visualizadas?: bastones o bacilos, cocos, cocobacilos, difteromorfos o corinebacteriformes, espirales o helicoidales, pleomrficas (forma variable), Cul es su disposicin y estructura individual o integrada?, aparecen las clulas en forma separada o configurando cadenas, parejas, ttradas, racimos, agrupamientos ordenados o desordenados, etc.? y De qu tamao son las clulas?: grandes, pequeas, de dimensiones bacterianas o de aspecto fngico (levaduriforme o filamentoso micelial)? 3.3. Identificacin presuntiva por la morfologa de las colonias Gracias al cultivo microbiolgico se obtiene informacin adicional que es muy valiosa para aislar e identificar a los microorganismos. Los medios de cultivo slidos pueden clasificarse en: 1.  Medios no selectivos (agar sangre y agar chocolate): posibilitan el crecimiento de muchas especies diferentes de bacterias, pero no permiten el aislamiento de una sola especie bacteriana a partir de muestras propensas a la contaminacin con un gran nmero de microorganismos comensales. 2. Medios selectivos: ayudan en el aislamiento de especies de importancia mdica en presencia de especies comensales, mediante la adicin de sustancias inhibidoras, sistemas indicadores y tampones que ayudan a la

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deteccin diferencial (agar MacConkey, agar CLED, agar XLD, agar VCAT o VCN). Se utilizan para sembrar diferentes tipos de muestras contaminadas (intraabdominales, heces, orina o exudados genitourinarios). Es posible hacer una identificacin preliminar de muchas bacterias importantes en la clnica, basndose en unas pocas y sencillas caractersticas macroscpicas de las clulas apreciables en su disposicin en forma de colonias sobre los medios de cultivos en que crecen y se aislan. La interpretacin de los cultivos primarios, despus de 24-48 h de incubacin, requiere una evaluacin de las colonias con una sistemtica bien estructurada. Caractersticas macroscpicas de las colonias: Despus de un examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar, se deben apreciar las principales caractersticas de las colonias: tamao (en general, las bacterias gram-positivas producen colonias algo ms pequeas que las gram-negativas), forma, grado de elevacin, borde, color, superficie, densidad, consistencia y olor. Reacciones en el medio de agar usadas para la identificacin de bacterias: 1. Tipo de hemlisis en el medio de agar sangre. La hemlisis es una reaccin observada en el medio circundante o subyacente a la colonia; sirve de ayuda para la identificacin presuntiva, particularmente, de los estreptococos, y debe valorarse frontalmente y por transiluminacin. a-hemlisis: eliminacin parcial de la sangre en torno a la colonia, originando una decoloracin verduzca en el medio (ej.: S. pneumoniae, estreptococos del grupo viridans). b-hemlisis: eliminacin completa de la sangre circundante o subyacente a las colonias por lisis completa de los hemates (ej.: Streptococcus pyo genes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes). 2. Produccin de pigmentos en medio de agar: es una de las caractersticas inherentes de cada microorganismo especfico y pueden estar confinados a la propia colonia o colorear el medio: verde, a veces, con brillo metlico (P.aeruginosa), rojo-rosado (Serratia marcescens), azul (Kluyvera spp.), prpura (Chromobacterium violaceum) o marrn negruzco (Prevotella melanino ge nica). Cambios en medios diferenciales: en los medios de cultivo diferenciales se incluyen diversos colorantes, indicadores de pH y otros componentes meta-

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blicos, que actan como indicadores de las actividades enzimticas y ayudan a identificar a las bacterias aisladas, muy tiles en determinados tipos de muestras, como los coprocultivos y urocultivos. Crecimiento en medios lquidos: hay claves importantes para la identificacin de los microorganismos que pueden ser detectadas observando el crecimiento en los medios lquidos, especialmente, en el caldo de tioglicolato o en otros como el Brain-Heart-Infusion (BHI). La capacidad de la morfologa colonial para hacer una identificacin presuntiva permite:  Realizar un diagnstico presuntivo rpido en un momento de necesidad crtica basado en el juicio razonado del microbilogo.  Incrementar la calidad de los cuidados del paciente a travs de la comunicacin rpida de los resultados, aumentando el coste-efectividad de las pruebas microbiolgicas (diferenciacin de patgenos potenciales de la flora normal).  Tener un papel significativo en el control de calidad, especialmente, de los procedimientos automatizados y de otros sistemas de identificacin comercial disponibles (evitar interpretaciones errneas, debidas a inculos mixtos que alteraran la identificacin), valorando la correlacin de los resultados generados con la identificacin esperada. 3.4. Pruebas bioqumicas rpidas Existen varias pruebas bioqumicas de realizacin fcil y rpida sobre colonias aisladas a partir de medios de cultivo que permiten la diferenciacin presuntiva rpida entre grupos de microorganismos o entre especies bacterianas. Adems, estas pruebas pueden orientar sobre las tcnicas adicionales necesarias para hacer una identificacin definitiva. En la tabla 4 se resumen los principios, los modos de accin y las aplicaciones de algunos de estos procedimientos. 3.5.Bateras y pruebas adicionales En la prctica, la identificacin bacteriana se puede realizar con mtodos convencionales o con mtodos semi o totalmente automatizados. Los mtodos convencionales se suelen llevar a cabo en forma de cascada decisoria, con un algoritmo de identificacin consensuado o estandarizado (Fig. 1) o usando una batera de pruebas simultneas que permita la identificacin aproximada o defi-

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Tabla 4.
Prueba

Principios, modos de accin y aplicaciones de algunas pruebas bioqumicas rpidas

Enzima bacteriana Aplicaciones

Indol ONPG

Triptofanasa b-galactosidasa

Reaccin positiva (color rojo) identifica a E. coli, Proteus vulgaris Determina la fermentacin de lactosa (color amarillo) en fermentadores lentos de la lactosa. Diferencia, por ej., Neisseria lactamica de especies patgenas de Neisseria

Oxidasa

Citocromo C oxi Diferenciacin entre los no-fermentadores dasa (reaccin +, color azul-morado); tambin ayuda a la identificacin de Neisseria, Aeromonas, Vibrio y Campylobacter Catalasa Diferenciacin de estafilococos (reaccin + con burbujeo) de estreptococos (reaccin -) y de Listeria de los estreptococos Identificacin presuntiva de Streptococcus pneumoniae (colonias lisadas) en cultivos de esputo, sangre o LCR

Catalasa

Solubilidad en bilis

PYR (L-pirrolidonil-B- L- pirroglutamil- Identificacin de estreptococos del grupo A de naftilamida) amino-peptidasa Lancefield. Diferencia Enterococcus de los es treptococos del grupo D (reaccin +, color rojo brillante) Ureasa (rpida) Ureasa Prueba de cribado (positiva, color rojo) para Cryptococcus, Proteus, Klebsiella y Yersinia ente rocolitica Especiacin de Streptococcus agalactiae, Campy lobacter jejuni y Listeria Diferencia S. aureus de estafilococos coagulasa negativos

Hipurato (rpido) Plasmocoagulasa

nitiva. Siempre se parte de una identificacin preliminar (basada en la tincin de Gram, morfologa colonial, etc.) que permite simplificar la batera a un mnimo de pruebas necesarias y apropiadas.

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Gram y morfologa Coco gram-positivo Catalasa Negativa Positiva Coagulasa Negativa ECN Positiva Staphylococcus aureus No coco gram-positivo

Figura 1. Ejemplo de identificacin por algoritmo en cascada. ECN: estafilococos negativos para la coagulasa.

Para la identificacin de los bacilos gram-negativos (BGN) aerobios, del tipo de las enterobacterias, se realiza una batera de pruebas bioqumicas con la que se identifica a los que se aslan ms frecuentemente en nuestro medio. Adems, conocer el fenotipo de sensibilidad antibitica de una determinada especie ayuda de forma determinante a la identificacin final. En la identificacin de los cocos gram-positivos catalasa positivos es muy importante diferenciar a Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de los estafilococos coagulasa negativos (ECN). Por otra parte, para la identificacin de los cocos gram-positivos catalasa negativos, la identificacin preliminar es esencial, ya que existe una gran variedad de gneros. Por ello, se aconseja una identificacin en cascada con unas pocas pruebas convencionales, que permitan identificar el gnero, y en algn caso, la especie (patrn hemoltico, crecimiento en forma de satlite con una cepa de S. aureus hemoltica, piracinamidasa, hidrlisis del hipurato, prueba del CAMP, solubilidad en bilis y optocina). Si interesa la identificacin de la especie, lo ms habitual es utilizar galeras comerciales (API rapid ID 32 STREP, Vitek2, MicroScan Walk-Away, Phoenix o Wider).

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Para la identificacin de los bacilos gram-positivos de los gneros Coryne bacterium y Bacillus, la diferenciacin preliminar debe hacerse por la morfologa de la colonia, color, hemlisis, caractersticas al microscopio, presencia de esporas, etc. Aunque para una mayor seguridad en la identificacin se puede utilizar tambin un sistema de galeras para los bacilos corineformes (API Coryne), o el API 50 CHB para el gnero Bacillus o mediante mtodos automticos, como el sistema Phoenix. Para la identificacin de bacterias anaerobias es importante realizar una identificacin preliminar, que permite, en algunos casos, conocer el gnero, en funcin de la morfologa, tincin de Gram, disposicin y patrn de hemlisis. Una identificacin definitiva se puede realizar con galera de pruebas como el API rapid ID 32 A. 3.6. Mtodos semi o completamente automatizados En el mercado existen varios mtodos de identificacin semiautomticos y automticos que superan a los mtodos convencionales por su fcil realizacin y el menor tiempo que requieren para alcanzar una identificacin definitiva de la especie. Adems, muchos de estos sistemas permiten realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos al mismo tiempo. En general, los mtodos auto mticos se deberan utilizar para la identificacin sistemtica en el laboratorio de microbiologa; pero estos mtodos no permiten siempre la identificacin de todas las bacterias. Por lo tanto, el microbilogo debe comprobar que los resultados de los mtodos automticos se corresponden con los de otras pruebas y con su sospecha diagnstica; adems, estos sistemas requieren controles de calidad estrictos. Entre los mtodos de identificacin automticos comercializados se en cuen tran Vitek2 (bio-Mrieux), MicroScan Walk-Away (Dade), Phoenix (Becton-Dickinson) y Wider (Soria Melguizo). La principal caracterstica de estos mtodos es su fcil y cmoda realizacin, permitiendo conseguir la identificacin de la especie, dado que en su base de datos incluyen a la gran mayora de las bacterias clnicamente importantes. En general, identifican bien a los BGN del tipo de las enterobacterias y a los BGN no fermentadores, a los estreptococos beta-hemolticos, a los enterococos, a algunos estreptococos alfa-hemolticos y a los estafilococos. Algunos sistemas disponen de paneles especiales para Streptococcus pneumoniae, BGP (como los de los gneros Listeria, Corynebac terium y Bacillus) y levaduras. Todos los sistemas automticos actuales son parecidos en cuanto a rendimiento de porcentajes de identificacin. La diferencia fundamental se encuentra

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en las pruebas de sensibilidad y en el sistema experto que utilizan. Unos emplean simples reglas que aplican a los resultados y otros, como el Vitek2, utiliza el AES (sistema experto avanzado) que est basado en el reconocimiento fenotpico del mecanismo de resistencia de la bacteria deducido a partir de la CMI y aplicando la comparacin con una base de datos que incorpora los resultados de las CMI publicadas en la bibliografa, o en documentos de consenso, y que son actualizadas peridicamente. Resumen  El aislamiento, identificacin y anlisis de las bacterias que causan enfermedades en los seres humanos es una de las principales funciones del microbiolgo clnico. El conocimiento de la estructura, fisiologa y metabolismo bacteriano es muy importante, al menos, para tres de las reas fundamentales de la microbiologa mdica:  Cultivo de los microorganismos a partir de las muestras de los pacientes.  Clasificacin e identificacin de los microorganismos despus de haber sido aislados.  Prediccin e interpretacin de su posible papel patgeno, colonizante o contaminante, as como de sus fenotipos, patrones y mecanismos de resistencia.  El conocimiento de los requerimientos nutricionales de una bacteria concreta permite al microbilogo seleccionar los medios apropiados de cultivo primario y optimizar las posibilidades de aislamiento del patgeno.  La determinacin de las caractersticas tintoriales, basadas en las diferencias de la estructura de la pared celular, es el primer paso hacia la clasificacin taxonmica de la bacteria.  Las diferencias bioqumicas y metablicas entre microorganismos conforman la base de la mayora de los sistemas de identificacin bacteriana actualmente en uso.  La capacidad de las bacterias para cambiar rpidamente, adquirir nuevos genes y sufrir mutaciones plantea continuos retos diagnsticos al microbilogo en relacin con el aislamiento y caracterizacin de los microorganismos asociados a las infecciones en humanos.

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4.BIBLIOGRAFA
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