El lpulo contenido

en la cerveza, su efecto antioxidante en un grupo controlado de poblacin

Marzo 2007

Prof. Jess Romn Martnez lvarez Dra. Victoria Valls Bells Prof. Dr. Antonio Villarino Marn

Sociedad Espaola de Diettica y Ciencias de la Alimentacin (SEDCA). Facultad de Medicina. Universidad de Valencia.

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El lpulo contenido en la cerveza, su efecto antioxidante en un grupo controlado de poblacin

Este trabajo ha sido realizado por el siguiente grupo de investigacin: Prof. Jess Romn Martnez lvarez Prof. Dr. Antonio Villarino Marn Sociedad Espaola de Diettica y Ciencias de la Alimentacin Dra. Victoria Valls Bells Dra. Pilar Codoer Franch Ana Beln Lpez Jan Simn Yao Lee Facultad de Medicina. Universidad de Valencia M Carmen Ambrs Marigmez Hospital de Len

Agradecimientos: Los autores manifiestan su agradecimiento a las personas que con su colaboracin hicieron posible la realizacin de este Estudio: al Dr. Rafael Prez Vicente, jefe del servicio de anlisis clnicos del Hospital de Len, y a las Comunidades Cistercienses de los monasterios de San Miguel de las Dueas, de Santa Mara de Carrizo, en Carrizo de la Ribera, y de Santa Mara la Real en Gradefes (Len).

SUMARIO

INTRODUCCIN: CERVEZA, LPULO, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y SALUD ..........................................................6

1.1. Cerveza con alcohol y cerveza sin alcohol .............................................8 1.2. Lpulo ...........................................................................................9

RADICALES LIBRES Y ESTRS OXIDATIVO ..................................................16

2.1. El oxgeno y el dao oxidativo .............................................................16 2.2. Los radicales libres .............................................................................17 2.3. Origen de los radicales libres................................................................20 2.4. Dao oxidativo a las biomolculas ........................................................22 2.5. Procesos fisiopatolgicos relacionados con los radicales libres..................23 2.6. Sistemas de defensa ante el estrs oxidativo..........................................33 2.7. Alimentacin y estrs oxidativo ............................................................51

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OBJETIVOS DEL ESTUDIO .........................................................................59 MATERIALES Y MTODOS .........................................................................60

4.1. Material.............................................................................................60 4.2. Mtodos ............................................................................................61 4.3. Diseo experimental............................................................................68

RESULTADOS...........................................................................................70
5.1. Valoracin nutricional y energtica .......................................................70 5.2. Suplementacin diettica: cerveza sin alcohol ........................................72 5.3. Suplementacin diettica: lpulo..........................................................80 5.4. Estudio comparativo entre la suplementacin con cerveza sin alcohol y lpulo...........................................................88

DISCUSIN.............................................................................................90
6.1. Metabolismo oxidativo.........................................................................90 6.2. Metabolismo lipdico ...........................................................................93 6.3. Parmetros marcadores de inflamacin ..................................................95 6.4. Capacidad antioxidante comparada de la cerveza sin alcohol y del lpulo ........................................................97

CONCLUSIONES .............................................................................................99

BIBLIOGRAFA ..................................................................................101

o INTRODUCCIN: CERVEZA, LPULO, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y SALUD

La cerveza es una bebida fermentada tradicional que est presente en la dieta desde hace miles de aos. Es una bebida de baja graduacin alcohlica y se produce industrialmente a partir de ingredientes que apenas han cambiado en el transcurso de los siglos: agua, malta y lpulo. Su posible relacin con la salud no ha sido estudiada hasta tiempos muy recientes y sus efectos se achacan, sobre todo, a la presencia en la misma de sustancias antioxidantes como los polifenoles y las melanoidinas, adems de otras sustancias nutritivas (folatos, carbohidratos, magnesio, etc.) y no nutritivas (fibra). Dentro de las bebidas que contienen polifenoles destaca la cerveza, cuya actividad antioxidante global oscila entre unos valores mnimos y mximos comprendidos en el intervalo 2 - 56 mg segn la capacidad antioxidante equivalente de vitamina C (CEAC). Estos datos indican que se trata de una bebida con una capacidad antioxidante global significativa, ya que posee valores similares a otras bebidas alcohlicas, como el vino, y no alcohlicas, como el mosto. De los estudios realizados se desprende que el tipo de cerveza no influye en el poder antioxidante, ya que cervezas negras, rubias y sin alcohol presentan valores similares (Gonzlez San Jos et al., 2001). Los compuestos fenlicos protegen de la oxidacin a las lipoprotenas de baja densidad (LDL) desempeando un papel clave en la prevencin de la aterosclerosis. Tambin pueden prevenir la trombosis, inhibiendo la agregacin plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza, 2000). Este efecto se ha demostrado mediante experimentos con animales in vitro e in vivo. En muchos casos se inhibe la AMP cclico fosfodiesterasa y como resultado se incrementan los niveles de cAMP. Asimismo, se reduce el nivel de calcio, se inhibe el factor de activacin plaquetario, se promueve la captacin de los radicales libres y se reduce la liberacin de enzimas que favorecen la agregacin plaquetaria (Meltzer y Malterud, 1997; Craig, 1996). Los compuestos fenlicos tambin son considerados como reguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a la modulacin del

metabolismo del cido araquidnico, reduciendo los niveles de tromboxano. Tambin modulan la actividad enzimtica de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa, fosfolipasa A2, hialuronidasa, e inhiben la accin de la angiotensina convertasa, mieloperoxidasa (que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa (que produce los radicales superxido), entre otras. Dichos efectos les otorgan un amplio potencial para su utilizacin con fines mdicos (Craig, 1996). Son numerosos los estudios que han mostrado que este tipo de compuestos poseen propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidacin lipdica y captando radicales libres como hidroxilo, suproxido y alcoxi radical (Sichel et al., 1991). Igualmente se han descrito efectos antivricos, antibacterianos y antifngicos. Se ha observado in vitro el potencial de la epicatequina como agente antivrico y las antocianidinas pueden inhibir las enzimas que intervienen en la replicacin del rhinovirus y del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Hocman, 1989). Los efectos beneficiosos de la ingesta de un elevado nmero de alimentos ricos en compuestos fenlicos como cerveza, fresas, espinacas, vino tinto, etc. se pueden evaluar a corto plazo ya que aumentan la capacidad antioxidante en suero (Cao et al., 1998; Velioglu et al., 1998; Khknen et al., 1999), lo que avala el creciente inters por el consumo de alimentos ricos en estos compuestos (Hertog et al., 1995). Desde un punto de vista bioqumico, los compuestos fenlicos tambin tienen un especial inters debido a su potencial anticarcingeno, bien estimulando el bombeo de ciertos agentes cancergenos hacia el exterior de las clulas o bien mediante la induccin de enzimas de detoxificacin (Mazza, 2000). En la bibliografa cientfica son mltiples las referencias que demuestran que los flavonoides tienen efectos citostticos en varios sistemas in vitro y que son capaces de regular ciertos procesos importantes en el desarrollo del cncer. Los flavonoides tienen actividad antipromotora, efecto antiinvasivo, e inhiben enzimas como la tirosina proteinkinasa, la ornitin decarboxilasa ATP-dependiente y la DNA topoisomerasa. Numerosos tra-

bajos de investigacin demuestran que los isoflavonoides de la soja, especialmente la genistena, pueden tener efecto protector frente a diferentes tipos de cncer (mama, colon y piel). Este hecho, se ha relacionado con el efecto estrognico de los isoflavonoides, mediante diferentes mecanismos bioqumicos (Barnes, 1995; Herman et al.,1995). En lo que respecta al lpulo, existen numerosos estudios sobre su papel en diferentes patologas. As, segn los resultados obtenidos por Milligan (Milligan et al., 2002), se encuentra que la humulona del lpulo inhibe la resorcin sea, lo que produce una elevada proteccin frente a la osteoporosis, y posee una pronunciada actividad anti-inflamatoria. La humulona inhibe adems la angiognesis, es decir, reduce la formacin de nuevos vasos sanguneos, proceso clave en la proliferacin de tumores, as como en el crecimiento descontrolado de clulas endoteliales, un marcador de riesgo cardiovascular.

1.1. CERVEZA CON ALCOHOL Y CERVEZA SIN ALCOHOL

La cerveza es una bebida de baja graduacin alcohlica resultante de fermentar el mosto procedente de la malta (usualmente de cebada, aunque pueden participar minoritariamente otros cereales como el arroz, el trigo y el maz), slo o mezclado con otros productos amilceos transformables en azcares, por digestin enzimtica y su coccin. El mosto de la malta se aromatiza con flores de lpulo. En conclusin, los constituyentes de la cerveza y su valor nutritivo y no nutritivo provienen de sus tres principales ingredientes: malta, lpulo y agua. En el caso de la cerveza sin alcohol, por diferentes procedimientos tecnolgicos se elimina habitualmente a partir de cerveza completa- el contenido alcohlico. La cerveza sin alcohol es un producto relativamente nuevo en el mercado que satisface las necesidades adicionales de determinados consumidores que desea-

ban disfrutar de una bebida refrescante como es la cerveza sin contenido alcohlico. La legislacin espaola admite esta denominacin siempre que el contenido alcohlico sea inferior al 1% en volumen, aunque en el mercado existen actualmente cervezas de tipo Cero. 1.1.1. CONSUMO DE CERVEZA SIN ALCOHOL EN ESPAA El crecimiento de la cerveza sin alcohol en nuestro pas aumenta progresivamente cada ao y represent en 2006 ms del 10% del consumo total de cerveza. Espaa se consolida por tanto como el primer consumidor del mundo de cerveza sin alcohol, a gran distancia de Francia, segundo pas del mundo en consumo de cerveza sin alcohol.

1.2. LPULO
El lpulo (Humulus lupulus L.) se emplea para aromatizar la cerveza y obtener el caracterstico sabor amargo de la bebida. Pertenece a la familia de las cannabceas, plantas herbceas carentes de ltex, de flores menudas. Planta medicinal silvestre conocida ya en la Antigedad, unos 6.000 aos a. C., el lpulo se utiliza desde el siglo IX para la obtencin de lupulino, empleado en la fabricacin de cerveza. El lpulo, adems de contribuir a la estabilidad de la espuma, aromatiza y tiene propiedades antispticas. Las cervezas lupuladas son ms resistentes al deterioro microbiolgico. En el Diccionario de la Lengua Espaola de la Real Academia se define esta materia prima de la cerveza como una planta trepadora, muy comn en varias partes de Espaa, de la familia de las cannabceas, con tallos sarmentosos de tres a

cinco metros de largo, hojas parecidas a las de la vid, flores masculinas en racimo, y las femeninas en cabezuela, y fruto en forma de pia globosa cuyas escamas cubren dos aquenios rodeados de lupulino. Los frutos, desecados, se emplean para aromatizar y proporcionar el sabor amargo a la cerveza. La planta del lpulo tiene una serie de brotes, a partir de la cepa, que dan lugar a tallos trepadores o sarmientos, sobre los cuales, en cada nudo, se desarrollan dos hojas opuestas, pecioladas y con tres a siete lbulos, de una forma que recuerda a los pmpanos de la vid. La vida til de la planta es de diez a quince aos, al cabo de los cuales es conveniente arrancarla y sustituirla por otra nueva. El lpulo es una planta dioica, por lo que las flores masculinas y femeninas se producen en distintos pies. Generalmente, los productores de lpulo slo cultivan las plantas hembras. Las flores femeninas se agrupan en conos o pias, formando verdaderos racimos. En la base de las escamas que forman los conos se encuentra la lupulina, una sustancia amarillenta y amarga que contiene resinas, aceites esenciales y taninos utilizados en la industria cervecera. La lupulina se emplea tambin para usos mdicos e industriales, aunque su funcin principal es aromatizar la cerveza. Este producto, de aspecto y tacto de polvo, algo grasiento, tiene un aroma

Humulus lupulus, reproduccin de una lmina del Herborarium Blackwellianum de 1739

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caracterstico, ms o menos intenso y fino, al igual que los perfumes que combinan intensidad y finura de aroma. El lpulo florece en verano, y los conos se cogen entre finales de agosto y primeros de septiembre. 1.2.1. USOS TRADICIONALES Tradicionalmente, el lpulo se ha usado como hipntico, sedante y diurtico (FontQuer, 1983). En la Inglaterra medieval, se rellenaban las almohadas con conos de la planta como remedio contra el insomnio. Santa Hildegarda, le atribua virtudes contra la bilis negra o melancola. Sin embargo, en la medicina antigua se ignoraba su utilidad (no lo citan ni Galeno ni Dioscrides) aunque Plinio se refiere brevemente a ella considerndola una planta alimenticia (cuyo nombre era lupus). En algunas comarcas espaolas, los vstagos tiernos se han consumido de forma similar a la de los esprragos. En 1516 el duque bvaro Guillermo IV aprob la famosa "Reinheitsgebot" o "Ley de pureza" de la cerveza, que limitaba los ingredientes permitidos en su elaboracin a tres: cebada (o trigo), lpulo y agua. Esta ley continua an vigente, con escasas modificaciones, en toda Alemania; lo que nos da una idea de la importancia del lpulo en la elaboracin de la cerveza desde hace siglos. 1.2.2. USO INDUSTRIAL DEL LPULO Inicialmente, se utiliz el lpulo silvestre para la cervecera, pero su baja calidad y el volumen de esta industria conllevaron el comienzo del cultivo en Espaa. A estos efectos, el primer intento serio se realiz en La Corua a principios del siglo XX. Sin embargo, durante la posguerra espaola, y coincidiendo con la II Guerra Mundial, las fbricas de cerveza tuvieron grandes problemas de abastecimiento de lpulo,

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debido a la prctica paralizacin de las importaciones. En consecuencia, el gobierno espaol promulg el 23 de mayo de 1945 un decreto por el que se prev el fomento del cultivo a travs de una concesin administrativa que recae en la Sociedad Annima Espaola de Fomento del Lpulo, constituida por casi todas las fbricas de cerveza que existan en ese momento en el pas. 1.2.3. EL LPULO EN LA PRODUCCIN CERVECERA En el lpulo se han identificado ms de 1.000 sustancias entre las que se encuentran mltiples derivados isomricos (Verzele y Keukeleire, 1991). Todas ellas aportan al lpulo sus peculiares caractersticas que lo convierten en insustituible para la fabricacin de la cerveza. Son las resinas, almacenadas en glndulas de lupulina presentes en varias partes de la planta, pero fundamentalmente en los frutos producidos a partir de las flores femeninas. Estas resinas se clasifican en funcin de su diferente solubilidad y son una mezcla de compuestos qumicos anlogos que son los precursores de los alfa y beta cidos, los cuales al cocer con el mosto se isomerizan y se transforman en sustancias amargas. El contenido de estos alfa y beta cidos (medido como porcentaje en peso) es una caracterstica varietal, si bien pueden verse influidos de una manera importante por la climatologa y otros factores. Otros constituyentes importantes son los aceites esenciales (humuleno, farneseno, mirceno, etc.) y los taninos. Los primeros confieren al lpulo su aroma caracterstico. Tradicionalmente se ha hablado de variedades aromticas y de variedades amargas, precisamente en funcin del nivel de alfa cidos y de aceites esenciales. 1.2.4. COMPONENTES DEL LPULO Las flores de la planta del lpulo (tambin llamadas conos o pias) contienen en su interior unas glndulas de color amarillo. Estas glndulas estn llenas de una

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resina llamada lupulina, que es el principio activo que los cerveceros buscan en el lpulo. La lupulina aporta: 1.2.4.1. COMPONENTES AMARGOS Los cidos amargos representan entre el 5% y el 20% aproximadamente del peso del lpulo maduro segn su variedad (Verzele y Keukeleire, 1991). Estos cidos se clasifican como alfa cidos y beta cidos y son derivados del floroglucinol di o triprenilados. Los alfa cidos se extraen tras la adicin de acetato de plomo al extracto crudo, mientras que los beta cidos permanecen en solucin. La calidad del lpulo viene marcada sobre todo por los alfa cidos, especialmente por la humulona (35-70% del total de alfa cidos), la cohumulona (del 20-65%) y la adhumulona (del 10-15%). Los alfa cidos estn presentes en la cerveza en concentraciones de hasta los 4 mg/ml contribuyendo en la misma a la estabilidad de la espuma y aportando sus caractersticas antibacterianas y, por lo tanto, de mejora de la conservacin. El amargor del lpulo proporciona el contrapunto adecuado al dulzor de la malta y este sabor amargo se extrae durante la coccin. En ella, los alfa cidos insolubles se isomerizan en cidos iso-alfa ms solubles que, en la cerveza representan ms del 80% de los componentes del lpulo presentes en la misma. Se han conseguido aislar en el laboratorio cinco alfa cidos que estn presentes en el lpulo de forma natural, en diferentes proporciones que varan como hemos dicho segn la variedad:
I humulona I cohumulona I adhumulona I prehumulona I posthumulona

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Adems de alfa cidos, el lpulo tambin contiene beta cidos, los cuales tambin aaden amargor a la cerveza cuando se oxidan. Sin embargo, los cidos beta oxidados no son tan amargos como los cidos alfa isomerizados y contribuyen mucho menos al amargor final de la cerveza. Los alfa cidos son muy susceptibles a la oxidacin (sobre todo a temperaturas elevadas) y cuando esto ocurre ya no pueden ser isomerizados en cidos iso-alfa, lo cual merma significativamente su capacidad de amargor. Esta es una caracterstica que hace que su almacenamiento y conservacin sean muy delicados. Los cerveceros deben tener esto muy en cuenta y, por ello, tratan de conseguir lpulos lo ms frescos posibles y de guardarlos en fro y en condiciones anaerbicas. 1.2.4.2. COMPONENTES AROMTICOS Los investigadores no han sido capaces, hasta ahora, de reproducir la complejidad de aromas del lpulo aadiendo componentes qumicos sintticos. Ni tampoco utilizando otro tipo de plantas o especias. Existe un consenso generalizado sobre que son las sinergias que se producen entre los distintos componentes del lpulo las que le confieren su inimitable capacidad aromatizante. Mediante tcnicas cromatogrficas se han conseguido identificar ms de 250 aceites esenciales y todava existen otros muchos an desconocidos. 1.2.4.3. ACEITES ESENCIALES Son extremadamente voltiles y son una razn ms para conservar el lpulo en algn medio anaerbico, como en recipientes al vaco o en atmsferas modificadas de CO2 o nitrgeno. Tampoco soportan una coccin dilatada. Es por ello que los lpulos aromticos se suelen aadir en los ltimos minutos de coccin, mientras que los lpulos amargos se aaden antes para facilitar la isomerizacin de los ci-

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dos alfa. El aceite esencial de lpulo contiene alkanos, monoterpenos y sesquiterpenos, habindose detectado (Eri et al., 2000) doscientas ochenta y seis distintas sustancias en su aceite, ms de cien de las cuales ni siquiera han podido ser identificadas actualmente. Como constituyentes voltiles, se han identificado claramente al monoterpeno myrceno y a los sesquiterpenos beta-cariofileno y al humuleno, quienes representan entre el 57-82% del aceite esencial. Este aceite no parece ejercer un papel fitoestrognico. 1.2.4.4. FLAVONOIDES PRENILADOS Son una mezcla de chalconas, de las que hasta la fecha se han aislado treinta especies, secretadas por las glndulas lupulnicas junto con los cidos amargos y los aceites voltiles (Milligan et al., 1999). Tienen efecto fitoestrognico. La chalcona xantohumol es el ms abundante flavonoide prenilado en el producto en fresco y en el lpulo comercial, alcanzando concentraciones de 0.01-0.5% (Stevens et al., 1999). El estrgeno vegetal ms potente hoy conocido como 8-prenilnaringenina corresponde con el 1:1 racemato (+)-8-prenilnaringenina o hopena (segn la terminologa de Keukeleire et al., 2001).

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s RADICALES LIBRES Y ESTRS OXIDATIVO

2.1. EL OXGENO

Y EL

DAO OXIDATIVO

El conocimiento de los efectos biolgicos de las especies oxignicas reactivas corre paralelo al estudio del metabolismo energtico de los seres vivos, proceso en el que la presencia de oxgeno es imprescindible. En efecto, hoy sabemos que el oxgeno (uno de los elementos gaseosos ms abundantes de la naturaleza) se presenta en forma de gas diatmico. El oxgeno molecular, a pesar de contener un nmero par de electrones, se presenta como una molcula paramagntica donde dos de sus electrones estn localizados en orbitales diferentes y girando en un mismo sentido con espines paralelos. Esto tiene un gran inters en relacin con su mecanismo de accin molecular y, especialmente, con su papel oxidativo. Tal vez una de las primeras referencias sobre la toxicidad del oxgeno se la debemos a Lavoisier, quien en 1785 ya sugiri que el exceso de la administracin de oxgeno podra ser tan peligroso como su defecto. Ms tarde, en el siglo XVIII, se descubrieron otros productos derivados del oxgeno como el H2O2 y el ozono (Bannister, 1986). 2.1.1. EVOLUCIN Y OXIDACIN La importancia evolutiva del oxgeno fue sealada por Irvin Fridovich en 1978, descubridor de la SOD, quien atribua a la presencia de oxgeno en la tierra la desaparicin de especies orgnicas incapaces de metabolizar y defenderse contra las acciones de aquella molcula y, ms concretamente, contra la accin de las especies oxignicas producidas mediante su oxidacin monovalente (Fridovich, 1974). De este modo, slo aquellos organismos capaces de desarrollar mecanismos enzimticos reactivos derivados fueron adaptndose paulatinamente a la progresiva oxigenacin de la atmsfera. De cualquier forma, independientemente de las teoras evolutivas y sus mecanismos de seleccin, es evidente que el oxgeno fue seleccionado por la

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naturaleza para actuar como aceptor terminal de las oxidaciones celulares, desempeando as, una funcin clave en su reaccin con la citocromo oxidasa, representando el ltimo eslabn de la cadena de transporte electrnico. Gracias a este mecanismo se produce ms del 90% del oxgeno consumido por las clulas de los animales superiores. Un tomo de oxgeno individual puede adquirir dos electrones para completar los ocho y convertirse en un in xido. Tambin pueden unirse dos tomos de oxgeno para compartir un par de electrones cada uno, formndose as la molcula de oxgeno diatmico. Finalmente, si una molcula de oxgeno adquiere un electrn extra en el curso de una reaccin, se transforma en otra especie paramagntica y mono. rradical cargada negativamente que se conoce como anin superxido (O -). ste
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es uno de los radicales libres o especies reactivas ms importantes en gran parte responsable de la toxicidad del oxgeno. Gracias a los experimentos de Fridovich, el radical superxido alcanza un enorme inters en el campo de la bioqumica (Fridovich y Handler, 1961) al demostrarse su produccin por enzimas celulares tales como la xantina oxidasa y, adicionalmente, al descubrirse la existencia de la enzima superxido dismutasa (SOD), capaz de transformar el in superxido en un producto de menor reactividad como es el H2O2, que a su vez es reducido a agua y oxgeno por la accin de otras enzimas. A partir de ese momento, estas especies (y otras que se iran descubriendo posteriormente) iran cobrando un papel protagonista en la explicacin de los mecanismos de accin citotxica del oxgeno mediante el estrs oxidativo.

2.2. LOS RADICALES LIBRES

Son especies moleculares activadas, dotadas de un electrn desapareado en un nivel energtico superior y, por lo tanto, dotadas de propiedades paramagnticas, lo que

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les confiere una alta e indiscriminada reactividad. Actualmente los radicales libres (RL) tambin son conocidos como especies reactivas oxignicas, EROs o ROS, as como especies reactivas del nitrgeno ERN o RNS. Cuando se combinan radicales libres procedentes del oxgeno y del nitrgeno se pueden convertir en otras especies reactivas no radicales tambin llamados ROM (Reactives Oxygen Metabolites) o metabolitos reactivos del oxgeno o AO (Active Oxygen). Las especies oxignicas reactivas ms destacadas se encuentran reflejadas en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen de las Especies Reactivas
Radicales ROS O EROs Superxido (O2- ) . Hidroxilo ( OH) Peroxilo (RO2) . Alkoxilo (RO ) Hidroperxilo (HO2) xido ntrico (NO) Dixido ntrico (NO2)
.

No Radicales Perxido de hidrgeno (H2O2) cido hipocloroso (HOCI) Ozono (O3) Oxgeno singlete (1O3) cido nitroso (HNO2) Tetrxido de dinitrgeno (N2O4) Trixido de dinitrgeno (N2O3) Peroxinitrito (ONOO-) cido peroxinitroso (ONOOH) Catin nitronio (NO2+) Peroxinitritos alkilos (ROONO)

RNS O ERN

Tanto ROS como RNS son trminos genricos (Halliwell, 1996) que incluyen radicales y algunos no radicales que actuan como agentes oxidantes del oxgeno y del nitrgeno, pudiendo convertirse fcilmente en radicales. Hay que aadir que algunas de estas sustancias pueden clasificarse en ambas categoras y que, adems, existen las denominadas especies reactivas del cloro. El trmino reactivo tal vez no sea un trmino del todo apropiado, ya que hay radicales y no radicales como H2O2, que pueden reaccionar con otras especies y formar otras mucho ms reacti. vas como el OH que presenta una alta reactividad.

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2.2.1. CARACTERSTICAS BSICAS Son muchas las especies oxgenas que actan como oxidantes biolgicos. La capacidad de cada radical (RL) o especie oxignica reactiva viene determinada, desde el punto de vista qumico, por cuatro caractersticas bsicas:
I Reactividad I Especificidad I Selectividad I Difusibilidad

. El O2 - es la sustancia reductora ms potente. Tras la simple adicin de un . protn, da lugar a la formacin de HO2 - convirtindose en un agente oxidante . muy activo, selectivo y especfico. El O2 - no es, sin embargo, especialmente reactivo con lpidos, glcidos o cidos nucleicos y exhibe una reactividad limi. tada con determinadas protenas. Sin embargo, el O - s reacciona con prote2

nas que contienen metales en su grupo prosttico. . El OH , sin embargo, reacciona con cualquier molcula que tenga cerca, sin especificidad alguna. El peligro de su efecto radica, por lo tanto, en la importancia funcional del compartimento celular en el que se origina, as como en la molcula a la que ataca. De este modo, si afectase al ADN podra producir graves efectos. Por el contrario, si la produccin del radical tiene lugar en un entorno como el plasma y la molcula daada es un enzima que se encuentra presente en gran cantidad, el dao biolgico real ser prcticamente imperceptible. Los . . tres componentes con mayor capacidad de difusin son O - < H O < OH , capa2 2 2

ces de reaccionar con molculas que se encuentran alejadas de su lugar de origen, incluso contando con capacidad de atravesar las membranas celulares (Figura 1).

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Figura 1. Reactividad de especies oxignicas . O2 - + H+ + e. . O2 - + HO2 . HO2 + HO2 + H+ . . O2 - + O2 - + H+ . O2 - + H2O2 HO2 H2O2 + O2 H2O2 + O2 H2O2 + O2 . OH + OH- + O2

La produccin de los radicales libres tiene que ser controlada continuamente y mantenida a muy bajas concentraciones por parte de los distintos mecanismos disponibles por las clulas obligadas a desarrollarse en ambientes aerbicos. Por esta razn, las especies oxignicas se producen en ambientes suficientemente circunscritos para impedir su difusin o, en su defecto, controlados por la accin de enzimas defensivas sintetizadas por las clulas aerbicas encargadas de su rpida conversin en especies ms estables o inofensivas.

2.3. ORIGEN

DE LOS

RADICALES LIBRES

Se sabe que los radicales libres se producen de forma natural como intermediarios o productos de numerosas reacciones oxidativas de las clulas, as como a travs de diversos procesos fsico-qumicos o de biotransformacin (Pryor, 1976). Tambin existen fuentes externas. Es decir, se ha de considerar el origen tanto endgeno como exgeno de las especies reactivas oxignicas y especies reactivas del nitrgeno. Las EROs pueden producirse a travs de la exposicin a oxidantes medioambientales, txicos y metales pesados, que pueden perturbar el equilibrio entre las reacciones de reduccin celular y las de oxidacin, alterando la normalidad de las funciones biolgicas.

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2.3.1. FUENTES ENDGENAS Las principales fuentes endgenas de radicales libres en la clula son:
I La cadena de transporte electrnico.

I El transporte electrnico microsomal (reacciones de hidroxilacin).

I Las clulas fagocitarias.

I La autooxidacin de compuestos de carbono reducido.

I La activacin calataltica de diversos enzimas del metabolismo intermediario:

hipoxantina, xantina oxidasa, aldehdo oxidasa, monoamina oxidasa, ciclooxigenasa y lipooxigenasa (Beckman y Ames, 1998; Lindsay y Astley, 2002). 2.3.2. FUENTES EXGENAS Como se ha citado con anterioridad, los EROs tambin pueden tener un origen exgeno. Estas fuentes exgenas pueden ser:
I Ambientales

Radiaciones electromagnticas, luz solar, ozono y tabaco. Los radicales libres se pueden producir en respuesta a radiaciones electromagnticas, como los rayos gamma, que pueden escindir el agua y producir radicales hidroxilo (Hallywell, 1996; Betteridge, 2000). Los xidos de nitrgeno presentes en el humo de los cigarrillos, causan la oxidacin de las macromolculas as como la reduccin de

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los niveles orgnicos de antioxidantes, lo que contribuye a la aparicin de diferentes patologas en el fumador como ciertos tipos de cncer, especialmente el de pulmn (Ames et al., 1990; Halliwell, 1994; Betteridge, 2000; Muiz et al., 2001).
I Farmacolgicas

Xenobiticos, drogas, etc. (Valls et al., 1994 ; Valls et al., 2004). ste es el caso de las antraciclinas, que interaccionan con el complejo I de la cadena de transporte electrnico e inducen la formacin de radicales libres.
I Nutricionales

Contaminantes, aditivos, etc. Las sales de hierro y de cobre promueven la formacin de radicales libres generando H2O2 (reacciones de Fenton). Cuando un individuo absorbe una cantidad significativa de hierro de la dieta debido a un defecto gentico (especialmente si se trata de hierro hemo), esto se convierte en un factor de riesgo adicional para contraer enfermedades cardiovasculares as como ciertos tipos de cncer en hombres sanos (Ames, 1990).

2.4. DAO OXIDATIVO

A LAS

BIOMOLCULAS

Aunque las EROs se han considerado perjudiciales para la clula, pueden sin embargo haber jugado un papel importante en el origen de la vida y en la evolucin biolgica. En los ltimos aos, se ha reconocido el papel de las EROs en la modulacin de la expresin gnica. De hecho, no es sencillo catalogar a las EROs como molculas definitivamente beneficiosas o dainas, dependiendo su efecto del proceso

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celular que se analice. Por ejemplo, la muerte celular por necrosis, seguida de isquemia-reperfusin, daa a los tejidos; en este proceso, se cataloga a las EROs como perjudiciales, mientras que en la muerte celular por apoptosis, este punto de vista puede variar dependiendo del sistema celular y del proceso que se est estudiando. Por otro lado, el papel de las EROs en los procesos de inflamacin tambin puede ser ambivalente, habindose calificado como beneficiosos en el aspecto proinflamatorio, ya que proporcionan una mejora en la respuesta inmune tras la infeccin, pero en otros trastornos, como la artritis reumatoide, la respuesta inflamatoria inapropiada generada por ellos es claramente perjudicial y debe ser restringida. En conclusin, las especies reactivas del oxgeno juegan un papel importante en la modulacin de la expresin gentica y de la funcin celular, pudiendo utilizar estos cambios como biomarcadores del estrs oxidativo. Las EROs pueden causar oxidacin a biomolculas como los lpidos poliinsaturados, las molculas de colesterol, los glcidos, protenas y cidos nucleicos que pueden verse afectadas in vivo por los radicales libres.

2.5. PROCESOS FISIOPATOLGICOS RELACIONADOS CON LOS RADICALES LIBRES

En la actualidad, son muchos los procesos relacionados con la produccin de radicales libres, tales como mutagnesis, transformacin celular, cncer, diabetes, aterosclerosis, infarto de miocardio, procesos de isquemia/reperfusin, enfermedad del neonato (retinopata neonatal), enfermedades inflamatorias (artritis reumatoide, lupus), desrdenes en el sistema nervioso central (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer), envejecimiento, etc. En numerosas patologas, se han observado niveles reducidos de las enzimas antioxidantes, o bien de antioxidantes totales.

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2.5.1. ESTRS OXIDATIVO Y PATOLOGA CARDIOVASCULAR Las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de morbimortalidad en los pases desarrollados. En el 2020, segn datos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), ser la primera causa de mortalidad en el mundo. La patologa cardiovascular es un proceso multifactorial donde estn implicados la obesidad, diabetes, hipertensin, gentica, dislipemia, radicales libres, estilo de vida (nutricin, tabaquismo, sedentarismo, etc.), etc., siendo la hiperlipemia uno de los mayores riesgos en los procesos aterosclerticos. La aterosclerosis es un proceso muy complejo en el que estn implicadas las LDL y la proliferacin celular en el endotelio (Celermajer et al., 1992). 2.5.1.1. HIPTESIS ATEROSCLEROSIS

DE LA

Existen diferentes hiptesis para explicar los procesos asociados al desarrollo de la aterosclerosis: a) Respuesta al dao. Esta hiptesis se basa en la propuesta de que el paso inicial sera la disfuncin endotelial produciendo un nmero de respuestas compensatorias que alteran las propiedades homeostticas vasculares normales. Sin embargo, ms recientemente se ha visto que una pared celular endotelial intacta puede desarrollar lesiones aterosclerticas. b) Respuesta a la retencin de LDL. Se basa en un aumento en la retencin de la LDL dentro de la pared arterial y su asociacin con los proteoglicanos. Junto a la unin a proteoglicanos parece jugar un papel importante las enzimas lipolticas y liposomales en la matriz extracelular.

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c) Modificacin oxidativa. Se basa en que la LDL atrapada en el espacio subendotelial, es susceptible a la modificacin oxidativa. La LDL oxidada estimula la quimiotasis monoctica y favorece la formacin de clulas espumosas a partir de los macrfagos. Una vez formada, la LDL oxidada tambin provoca la disfuncin endotelial y el dao celular. Las clulas espumosas tienden a la necrosis debido a la estimulacin de LDL oxidada originando fibrosis posterior (placa fibrosa), y favoreciendo la trombosis a consecuencia de la agregacin plaquetaria y del incremento de citoquinas proinflamatorias (Steinberg et al., 1989) (Figura 2 y 3). Figura 2. Oxidacin de las LDL
LDL nativas Monocitos circulantes

Clulas endoteliales

Macrfago

LDL modificadas mediante oxidacin Clula espumosa

Steinberg et al. N Engl J Med, 1989;320:915-24

En la actualidad, existen muchas evidencias que indican que en el proceso de iniciacin de la aterosclerosis estn implicados los radicales libres, la peroxidacin lipdica y la modificacin oxidativa de las LDL (Spiteller, 2005; Zmijewski et al., 2005), dando mayor validez a la ltima hiptesis descrita.

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2.5.1.2. OXIDACIN

DE LAS

LDL

En las lesiones aterosclerticas se ha observado la existencia de diferentes modificaciones oxidativas que tienen lugar sobre la lipoprotena, adems de la produccin de especies reactivas del oxgeno y del nitrgeno por las clulas vasculares. Por ello, la aterosclerosis se ha representado como un estado de elevado estrs oxidativo caracterizado por la oxidacin lipdica y proteica en la pared vascular. As pues, recientes estudios han establecido la presencia de lpidos oxidados (Carpenter et al., 1994; Heinecke, 2006) en dichas lesiones, como consecuencia de la oxidacin lipdica, obtenindose productos como perxidos, hidroperxidos, epxidos, etc. Del mismo modo, cuando las especies reactivas actan sobre las molculas de colesterol producen hidroperxidos de colesterol y oxisteroles. Adems, existen evidencias de la oxidacin proteica en tales lesiones (Fu et al., 1998; Heinecke, 1999; Heinecke, 2002). Se ha visto que la aterosclerosis y sus consecuencias anatomopatolgicas vasculares, se acentan con el estrs oxidativo. En los supuestos en que estos fenmenos de oxidacin acontecen sobre las lipoprotenas plasmticas (LDL), stas aumentan significativamente su poder aterognico, provocando que la LDL oxidada sea responsable de una serie de efectos como los que se describen a continuacin: Es captada con mayor facilidad por los macrfagos, lo que produce el enriquecimiento de stos en steres de colesterol y la formacin de clulas espumosas. Es quimiotctica para los monocitos y los T-linfocitos. Inhibe la motilidad de los macrfagos en la pared arterial. Altera la expresin gnica, induciendo la produccin de citokinas.

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Induce la proliferacin de clulas musculares lisas. Es inmunognica y puede provocar la formacin de autoanticuerpos. Es ms susceptible a la agregacin, lo que estimula la captacin por parte de los macrfagos. Puede alterar de forma perjudicial los procesos de coagulacin, como es el caso de la alteracin de la agregacin plaquetaria. 2.5.1.3. PROGRESIN ATEROSCLEROSIS

DE LA

La progresin de la aterosclerosis se puede caracterizar en 6 tipos de lesiones, que reflejan las fases de inicio, desarrollo y maduracin de la enfermedad, que culminara en la ruptura de la placa de ateroma y la formacin de trombos. Los diferentes tipos son: Tipo I: Zona propensa a lesin, engrosamiento adaptativo de la intima. Tipo II: Acumulacin de lpidos en el macrfago formndose unas reas nodulares de deposicin de lpidos y dan lugar a clulas espumosas. Tipo III: La formacin continuada de clulas espumosas y necrosis de macrfagos produce este tipo de lesiones que contienen pequeos depsitos de lpidos extracelulares. Esto representara el ncleo de la lesin aterosclertica. Tipo IV: Se caracteriza por una separacin tisular fina del ncleo de lpidos del lumen arterial.

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Tipo V: Las lesiones muestran tejido fibroso, apareciendo un ncleo cubierto por cpsula fibrosa. Tipo VI: Se caracteriza por reas fibrosas calcificadas con visible fisura o rotura de la placa. Finalmente, se producira la formacin de un trombo, que no suele ocluir completamente la arteria, producindose una lesin ms fibrosa y estenosante. Las lesiones, posteriormente, siguen evolucionando con las consiguientes consecuencias cardiovasculares (Figura 3). Figura 3. Esquema de la progresin de la aterosclerosis
Tipo I (zona propensa a la lesin)
ROS LDL Monocitos Macrfago Media Clula espumosa ntima Macrfagos Clulas espumosas Pequeos depsitos de lpidos extracelulares

Tipo II

Tipo III (Preateroma)

Tipo IV (Ateroma)

Tipo V (Ateroma fibroso)

Tipo VI (Complicaciones de la lesin)

Ncleo de lpidos extracelulares

Tejido fibroso

Fisura y hematomas

Trombos

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2.5.2. ESTRS OXIDATIVO Y PROCESOS DE INFLAMACIN Desde tiempo atrs se ha manifestado un creciente inters por conocer el papel exacto que los procesos oxidantes juegan en la patognesis de la inflamacin, la artritis reumatoide, el asma, la psoriasis y la dermatitis de contacto entre otras enfermedades (Geronikaki y Gavalas, 2006), todas ellas con un posible vnculo comn con el estrs oxidativo. El conjunto de procesos asociados con la respuesta inflamatoria es muy complejo (Geronikaki y Gavalas, 2006) y a menudo conlleva la implicacin de las especies oxignicas reactivas. Se han descrito numerosos mediadores que podran amplificar la respuesta inflamatoria, como es el caso de la histamina, la serotonina, las citoquinas y el factor de necrosis tumoral. La inflamacin juega, en efecto, un papel importante en el desarrollo de numerosas patologas, entre las que podemos citar la diabetes tipo II, as como sus patologas asociadas como la obesidad (Browning y Jebb, 2006). De hecho, la relacin entre inflamacin, diabetes y dieta ha sido verificada en diferentes estudios realizados tanto en animales como en personas. As, los marcadores sanguneos de inflamacin, como es el caso de la protena C reactiva (PCR) y de la interleukina-6, se consideran, a menudo, parmetros predictivos de la diabetes. Un caso especfico, que nos ilustrar lo complicado de estos procesos, lo constituye la inflamacin prosttica que, como sabemos, puede contribuir a la aparicin de cncer en esta glndula, riesgo que disminuye tras la ingestin de drogas antiinflamatorias y de sustancias antioxidantes (Sugar, 2006). Segn algunos autores, los antioxidantes podran reducir la inflamacin de las vas areas y la reactividad aumentada que existe en los asmticos (Park y Lee, 2006; Lee et al., 2006). As, en algunos trabajos se ha demostrado cmo los antioxidantes pueden reducir la expresin de ciertos tipos de citoquinas (interleukina IL-18) en estos procesos asmticos, inhibiendo la actividad de NF-kappa B, lo que

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sugiere que las especies oxignicas reactivas podran regular la expresin de interleukinas (Lee et al., 2006). Existe, desde luego, un inters creciente sobre el papel de los antioxidantes en el control de otras enfermedades con una base inflamatoria, como por ejemplo la alergia. Segn se cree, el estatus antioxidante del individuo, est asociado con una respuesta inmune aumentada aunque no hay evidencia de que a niveles ms elevados de antioxidantes est asociada una menor respuesta a los alergenos (Dunstan et al., 2006). La posible accin de los antioxidantes sobre la funcin inmune tambin ha despertado el inters de los investigadores sobre su posible efecto en patologas ligadas a alteraciones inmunolgicas como podra ser el caso de la esclerosis mltiple (Carlson y Rose, 2006). A este respecto, se han propuesto numerosas sustancias nutritivas con un posible papel modulador de la inflamacin y, por lo tanto, del impacto global de ciertas patologas, como la diabetes, sobre el paciente. Asimismo, conocemos factores de la dieta como el cido oleico, el cido linolnico y otros antioxidantes (Basu et al., 2006), y su capacidad reductora de los marcadores de inflamacin. En esta misma lnea, ciertos hallazgos sugieren que la vitamina C tienen efectos antiinflamatorios, estando asociada con una menor disfuncin endotelial en varones que no tenan un historial previo de diabetes o de enfermedades cardiovasculares (Wannamethee et al., 2006) o que la quercetina y otros polifenoles antioxidantes tienen una relacin directa con la disminucin de la inflamacin, efecto que estara mediado por la inhibicin de las citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (Nair et al., 2006). De este modo, las estrategias dietticas que se han sealado corrientemente como dieta equilibrada (ingestin adecuada de cidos grasos omega-3, reduccin de grasa saturada y de cidos grasos trans y, en paralelo, un consumo elevado de frutas, hortalizas, frutos secos y cereales integrales), pueden asociarse con una disminucin de la inflamacin (Guigliano et al., 2006). En cualquier caso, es evi-

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dente que son necesarios estudios adicionales para poder cuantificar el papel preciso de cada una de las diferentes sustancias implicadas en estos procesos. 2.5.3. INFLAMACIN Y ATEROSCLEROSIS La inflamacin juega un papel fundamental en todas las fases de la enfermedad aterosclertica. El papel clave de la oxidacin, que liga lpidos e inflamacin a la aterosclerosis, es convincente y apoyado por numerosas evidencias experimentales (Tardif, 2006; Basu et al., 2006). Como conocemos, los factores de riesgo cardiovascular y el sndrome metablico estn tipificados por un cierto grado de inflamacin. Adicionalmente, la reduccin de peso hace menores (Basu et al., 2006) los marcadores de inflamacin (por ejemplo la protena C reactiva y la interleukina-6). El conocimiento cada vez ms profundo de las implicaciones metablicas y del papel que ejercen sustancias como las lipoprotenas, nos ha permitido un acercamiento ms eficaz a las distintas posibilidades preventivas. As, era perfectamente conocido cmo, en grandes poblaciones, los niveles de HDL colesterol estaban inversamente relacionados con el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares (Navab et al., 2006); sin embargo, el valor predictivo de estas cifras para un individuo concreto estaba lejos de ser perfecto. En consecuencia, se han investigado otros factores asociados a las HDL, entre los que se incluyen ciertos componentes de estas mismas lipoprotenas. Las HDL son realmente heterogneas y contienen diferentes sustancias antioxidantes y prooxidantes, lo cual lgicamente repercute en su misma funcin. As, diferentes estudios han indicado distintos papeles para las HDL como seran la capacidad de promover el transporte de colesterol y modular la inflamacin sistmica. En ausencia de inflamacin, las HDL interactuaran con las enzimas antioxidantes para mantener el estatus antiinflamatorio.

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En presencia de inflamacin sistmica, estas enzimas antioxidantes pueden verse inactivadas y las HDL podran acumular lpidos oxidados y protenas que las convertiran en proinflamatorias. En estas condiciones, la principal protena de la HDL, la apolipoprotena A-I, puede verse modificada a merced de la accin de las especies oxignicas reactivas. Esta modificacin inhabilita la capacidad de las HDL de vehicular el flujo de colesterol. En consecuencia, la medida de la calidad y de las funciones de las HDL-c puede proporcionar una mejor identificacin de aquellas personas con un riesgo aumentado de enfermedad cardiovascular. 2.5.4. RELACIN ENTRE ENVEJECIMIENTO E INFLAMACIN Y PROCESOS CARDIOVASCULARES El envejecimiento es consustancial al ser humano y, sin embargo, an son poco conocidos los complejos mecanismos por los que se produce. Se han elaborado al respecto diversas teoras que intentan explicar los mecanismos involucrados en el proceso de envejecer, siendo una de las ms aceptadas la teora de los radicales libres o del estrs oxidativo. Se basa en un fenmeno comn que se produce en nuestras clulas ante la presencia de oxgeno, lo que conlleva reacciones de oxidacin que, a su vez, estn en el origen de los llamados radicales libres. La consecuencia es que estos agentes oxidantes producen deterioro celular, lo que se traduce en una mayor incidencia de diabetes, alteraciones cardiovasculares, cnceres, etc. Este problema es creciente en una sociedad como la nuestra donde la esperanza de vida es cada vez mayor y, por lo tanto, la trascendencia no slo sanitaria, sino tambin econmica, de las patologas ligadas al envejecimiento es enorme. Adems de las grandes causas de mortalidad ya citadas, otras muchas patologas pueden tener su origen, o su mecanismo iniciador, en un desequilibrio en el estatus antioxidante del sujeto: cataratas, enfermedades neurodege-

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nerativas, patologas visuales, etc. Dado que uno de los mecanismos ms sencillos y accesibles para mejorar nuestra defensa antioxidante es seguir una dieta adecuada, parece lgico seguir profundizando en el conocimiento de aquellas sustancias presentes en los alimentos que puedan beneficiarnos en este sentido. Tericamente, unos estilos de vida saludables donde se incorporen unos hbitos dietticos correctos podran beneficiar nuestra longevidad y la calidad de vida de estos aos vividos. Atendiendo a los datos citados con anterioridad, es comprensible que algunos autores sugieran que la mejora de la funcin leucocitaria y la restauracin del balance redox tras el consumo de niveles adecuados de antioxidantes en adultos, pudiera ser til para conseguir un envejecimiento ms saludable (Alvarado et al., 2006). En cualquier caso, y como conclusin, es evidente que se necesitan investigaciones adicionales para definir el papel de los factores dietticos sobre los marcadores de inflamacin (Basu et al., 2006).

2.6. SISTEMAS

DE

DEFENSA

ANTE EL

ESTRS OXIDATIVO

Frente a la accin txica de los radicales libres, los organismos han desarrollado mecanismos de defensa que permiten su eliminacin o transformacin en molculas estables (Davies, 1995). Todos los sistemas biolgicos estn en un estado de equilibrio aproximado entre las fuerzas prooxidantes y la capacidad antioxidante (Sies, 1985), siendo el desequilibrio a favor de la accin prooxidante lo que se conoce como estrs oxidativo. De hecho, el dao oxidativo solamente se produce cuando los mecanismos oxidantes superan la capacidad de los sistemas de defensa. Por lo tanto, la supervivencia de las clulas aerbicas precisa de mecanismos que contrarresten los efectos negativos de los radicales libres, permitiendo, los sistemas antio-

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xidantes, el mantenimiento de un balance favorable entre los productos deletreos y los antioxidantes celulares. Segn Halliwell y Gutteridge (1989), antioxidante es cualquier sustancia que en presencia del sustrato oxidable retrasa considerablemente o inhibe la oxidacin de tal sustrato. Un buen antioxidante se caracteriza por su alta efectividad, su variabilidad operativa y su versatilidad para combinarse con una importante variedad de especies oxgenas reactivas. As pues, entre los sistemas antioxidantes cabe destacar: a) A nivel fisiolgico: El sistema microvascular, cuya funcin es mantener los niveles tisulares de O2, siempre dentro de presiones parciales relativamente bajas. b) A nivel bioqumico: La defensa antioxidante puede ser enzimtica y no enzimtica. 2.6.1. SISTEMA ENZIMTICO ANTIOXIDANTE El principal sistema de defensa contra los radicales libres lo constituyen protenas antioxidantes enzimticas (Figura 4) que incluyen la enzima superxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutation peroxidasa (GPx), (Betteridge, 2000). La eficacia de esta trada enzimtica reside en una triple accin defensiva al disminuir la produccin de estas especies oxignicas e impedir la interaccin de stas entre s, para dar lugar a especies ms estables de menor reactividad y evitar la peroxidacin de las macromolculas. Hay otros enzimas importantes que tambin participan en el sistema de defensa, incluidos en las reacciones de la regeneracin del Glutation (GSH), como la GSH reductasa, o la NADPH-quinona oxidoreductasa (DT diaforasa).

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2.6.2. SISTEMA NO ENZIMTICO ANTIOXIDANTE O SCAVENGERS DE RADICALES LIBRES En el sistema antioxidante de defensa no debemos olvidar a las molculas antioxidantes hidroflicas o lipoflicas. Como el beta-caroteno, la ferritina, la ceruloplasmina, el selenio, el manganeso, la ubiquinona, el zinc, el cido rico. De entre las molculas hidroflicas cabe destacar la vitamina C, la vitamina E, el GSH, los flavonoides y las melanoidinas, entre otras. Figura 4. Sistema enzimtico antioxidante . (1) 2 O2 - + 2 H+ (2) 2 H2O2 (3) H2O2 + 2 GSH
SOD Catalasa GPx

2 H2O2 + O2 2 H2O + O 2 GSSH + 2 H2O

NADPH GR NADP

2 GSH . (4) Q + 2e - + 2 H+ 2.6.2.1. GLUTATION REDUCIDO (GSH) Entre las endgenas destacaremos el Glutation (g-Glu-CysH-Gly) es el mayor componente antioxidante intracelular. Es un tripptido compuesto de cistena, cido glutmico y glicina. Su distribucin es universal al estar presente tanto en tejidos de plantas como de animales y juega un papel principal en la proteccin celular contra los efectos dainos de los radicales libres. Est presente en las clulas principalmente en su forma reducida y gran parte de sus funciones se deben a la preDT-diaforasa

QH2

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sencia del grupo tilico reducido que le confiere la cistena y que promueve su estabilidad intracelular. En la defensa celular contra los radicales libres tiene un papel importante como antioxidante al ser capaz de interaccionar y estabilizar radicales hidroxilo, superxido y perxidos, adems de participar en la reduccin de otros antioxidantes (tales como el -tocoferol) y de donar hidrgenos para reparar el ADN daado. Por otro lado puede actuar como cosustrato de enzimas antioxidantes como la glutation peroxidasa, como ya hemos mencionado. Del glutation reducido podemos destacar las siguientes caractersticas: 1. El GSH es un antioxidante exgeno y endgeno. El GSH de la dieta puede ser absorbido en el intestino delgado y puede ser sintetizado de nuevo. 2. Aunque el radical glutation formado por la oxidacin del GSH es un radical prooxidante, este puede reaccionar con otro radical GSH (GS) y dar como resultado GS-SG que es reducido a GSH por la enzima glutation reductasa dependiente del NADPH. 3. El GSH puede reaccionar con componentes electroflicos de algunos xenobiticos en la reaccin catalizada por la glutation-S-transferasa. 4. El GSH capta las EROs. 5. El GSH puede conjugarse con NO, lo que tiene como consecuencia la formacin de GSH nitrosilado, que a travs de un sistema de tiol protenas liberar GSH y NO. 6. El GSH interacciona con ciertas protenas tilicas (glutaredoxina y thioredoxina) que pueden jugar un papel importante en la regulacin de la homeostasis del sistema de reduccin-oxidacin celular.

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La sntesis del GSH se produce a partir de glutamato, cistena y glicina en dos etapas: en la primera etapa, se une el cido glutmico y la cistena en una reaccin catalizada por la -glutamil cistena sintasa. Dicho paso est limitado por la disponibilidad de cistena. El GSH est unido a -glutamil cistena por la GSH sintasa que suma la glicina (Figura 5). El GSH total est regulado por una reaccin de retroalimentacin de la -glutamil cistena sintasa. La disponibilidad diettica de los aminocidos azufrados puede tener influencia en las concentraciones del GSH celular. Figura 5. Sntesis de GSH
O S O

SH O O
N N -glutamil cistena sintasa

cistena N Glutamato N
ATP

glutation sintasa

O C CH2 CH2 C COONH3+ NH C

CH2 C O

H N C COO-

ADP + Pi

ATP

ADP + Pi

Entre las exgenas y debido a que se encuentran presentes en la cerveza destacaremos los polifenoles y las melanoidinas. 2.6.2.2. COMPUESTOS

FENLICOS

Estos compuestos, denominados frecuentemente polifenoles, se encuentran muy extendidos por todo el reino vegetal. En los alimentos de este origen, son especialmente abundantes en frutas y verduras, adems de en productos como el t, el caf, el cacao, la cerveza, el vino y los zumos.

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Una de las razones por las cuales han adquirido gran inters dichos compuestos en los ltimos aos es debido a su actividad antioxidante. As pues, su ingestin podra ser de inters en la prevencin de los procesos patolgicos y fisiopatolgicos en los cuales estn implicados las especies oxignicas reactivas (EROs o ROS), como las enfermedades cardiovasculares, cncer, envejecimiento, enfermedades degenerativas, cataratas, procesos inflamatorios, etc. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los polifenoles tambin pueden tener un efecto prooxidante y, en consecuencia, acabar produciendo daos a las macromolculas. Figura 6. Estructuras qumicas de los diferentes cidos fenlicos y compuestos polifenlicos de los alimentos.
cidos Hidroxibenzicos (cido galico)
R1 O R2 OH R3 R3 OH R2 O H OH H H O OH OH OH

cidos Hidroxicinmicos (cido cafenico y felrico)

R1 OH O

cido clorognico
OH O

Estilbenos (Resveratrol)
R1 R2 OH R3 CH3O

Lignanos
OCH3 OCH3 OH A R3 OCH3 OH R5

Flavonoides

R3

OR4 O C R3 R4 B R5
.

OH

Los polifenoles en los alimentos se clasifican en diferentes familias (Manach et al., 2004) ordenadas segn su estructura qumica, especialmente segn los anillos fenlicos y los sustituyentes de dichos anillos. En consecuencia, se pueden clasificar (Figura 6) como:

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1. cidos fenlicos. Entre los que cabe destacar: cido clorognico, cidos hidroxibenzoicos y cidos hidroxicinmicos. Dichos cidos se encuentran en cantidades muy pequeas en el reino vegetal, con excepcin de ciertas frutas rojas y en las cebollas. El t es, asimismo, una fuente importante de cido glico (4,5 g/Kg) de t fresco). El cido hidroxibenzoico forma parte de complejas estructuras en las frutas rojas. El cido hidroxicinmico se encuentra en forma libre en los alimentos, pero si stos sufren procesos como la congelacin, la esterilizacin o la fermentacin se pueden encontrar en su forma glicosilada. 2. Estilbenos. Los estilbenos, se encuentran mayoritariamente en el vino, siendo uno de los ms importantes el resveratrol. El vino tinto contiene 0,3 a 7 mg/L de resveratrol en forma libre y 15 mg/L en forma glicosilada (Vitral et al., 2002). 3. Lignanos. Los lignanos estn formados por dos unidades de fenilpropano. Se encuentran mayoritariamente en el aceite de linaza y en menor cantidad, en los cereales y las frutas. 4. Flavonoides. Son un grupo de polifenoles muy abundantes en la naturaleza, habindose localizado hasta el momento ms de 5000 especies diferentes de flavonoides en frutas, verduras, semillas, tallos, cereales y cerveza, siendo, por lo tanto, unos integrantes significativos de la dieta humana. Dentro los flavonoides ms importantes cabe destacar: 4.1. Los flavonoles son los ms comunes en las frutas y verduras. Estos compuestos se encuentran en los alimentos en forma glicosilada, como

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ms representativos cabe destacar la quercitina y kaempferol. Las cebollas contienen aproximadamente 1200 mg/kg, el vino tinto y el t contienen 45 mg/L. Las frutas contienen entre 5 y 10 flavonoles glicosilados diferentes y su concentracin esta en funcin de factores ambientales, tales como la luz solar (Manach et al., 2004). 4.2. Las flavonas se encuentran en cantidades menores que los flavonoles en las frutas y verduras, tambin se encuentran en forma glicosilada, siendo las principales la luteolina y apigenina, que se encuentran en el perejil. Los ctricos contienen grandes cantidades de flavonas polimetoxiladas tales como: tangeritina, nobiletina y sinensetina, siendo stas las ms hidrofbicas. La mandarina contiene hasta 6500 mg/L (TomasBarberan y Clifford, 2000). 4.3. Las flavanonas se encuentra generalmente en forma glicosilada por un disacrido en posicin 7. Las podemos encontrar en cantidades considerables en el tomate, en los ctricos y ciertas plantas aromticas, tales como la menta. El zumo de naranja contiene entre 200 y 600 mg de hespiridina/L y de 15 a 85 mg de narirutina/L. Un vaso de zumo de naranja puede contener entre 40 y 140 mg de flavanonas glicosiladas. El contenido mayor de flavanonas en la naranja y mandarina se encuentra en la parte del albedo y las membranas internas de la naranja y mandarina (Tomas-Barberan y Clifford, 2000). 4.4. Los flavanoles se encuentran en forma de monmeros (catequina y epicatequina) y en forma de polmeros (proantocianidinas). stos en los alimentos no se encuentran en forma glicosilada. Las catequinas estn mayoritariamente presentes en las frutas, en el vino tinto (hasta 300

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mg/L), en el t, un vaso de t verde contiene hasta 200 mg de catequinas (Lakenbrink et al., 2000) y en la cerveza con/sin alcohol 401 y 343 mg/L respectivamente (Valls y Belles et al., 2005). Las proantocianidinas forman complejos con protenas de la saliva los cuales son responsables del carcter astringente de las frutas. Es difcil la cuantificacin de las procianidinas en los alimentos ya que segn el estado de maduracin podemos encontrar diferentes estados de polimerizacin. 4.5. Las isoflavonas se encuentran principalmente en las plantas leguminosas, siendo la soja la de mayor contenido, podemos encontrar genistena, daidzena y glicitena en una proporcin de 1:1:0,2, encontrndose en cuatro formas qumicas diferentes: aglicona, 7-O-glicosido, 6-O-acetil-7-O-glicosido y 6-O-malonil-7-O-glicosido. La semilla de soja contiene entre 580 y 3800 mg de isoflavones/kg. Son sensibles al calor y en los procesos industriales son hidrolizados a glicosidos tal como ocurre en la produccin de la leche de soja, la cual contiene de 30 a 175 mg/L (Cassidy et al., 2000). 4.6. Las procianidinas (Figura 7) son pigmentos que podemos encontrar en el vino tinto, en los cereales y mayoritariamente en las frutas, especialmente en la piel de estas ltimas. Adems pueden existir bajo diferentes formas qumicas, siendo la cianidina la ms comn. El contenido en los alimentos est en funcin de la intensidad del color. Puede llegar hasta 2000-4000 mg/kg en las grosellas y fresas. Estos valores aumentan con el proceso de la maduracin. El vino tinto contiene entre 200350 mg de antocianinas/L, las cuales se transforman en complejas estructuras con la edad del vino (Clifford, 2000).

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Figura 7. Estructura qumica de las procianidinas

OH OH O OH OH OH OH O OH OH OH OH O OH OH OH OH OH

2.6.2.2.1. FLAVONOIDES

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Estructuralmente, los flavonoides son derivados benzo- -pirenos, su estructura bsica est constituida por dos anillos bencnicos unidos a travs de un anillo pirona o pirano heterocclico (Bravo, 1998) (Figura 6). La estructura qumica de los compuestos fenlicos es precisamente la que les confiere su capacidad para actuar como captadores de radicales libres (Heim et al., 2002). Esta actividad antioxidante viene marcada por el tipo de compuesto, su grado de metoxilacin y el nmero de grupos hidroxilo. As, los compuestos con mayor actividad (Rice-Evans et al., 1996) son aqullos que presentan dos grupos hidroxilo en posicin orto en el anillo B, lo que confiere una alta estabilidad al radical que se forma despus de la reaccin de captura del radical libre. Contienen un doble enlace 2,3 en conjugacin con el 4-oxo (C=O) en el anillo C y aquellos compuestos que tienen grupos OH- en 3 y 5 y el grupo oxo (C=O) en 4 anillos A y C. As pues:

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Pueden actuar directamente como "scavenger" de radicales libres, oxidndose y dando lugar a otros compuestos ms estables (Figura 8). Pueden estabilizar compuestos obtenidos a partir de radicales libres. Pueden tener un efecto aditivo a la defensa antioxidante endgena, aumentando o manteniendo dicha defensa antioxidante. La hidrofobicidad de los flavonoides es intermedia entre la vitamina C (altamente hidroflica) y la vitamina E (altamente hidrofbica). Por lo tanto, actuarn en la interfase agua-lpido, siendo los ms hidrofbicos los glucuronizados y sulfatados. Asimismo, tienen capacidad de quelar iones metlicos (Fe, Cu), . impidiendo la formacin del radical hidroxilo (OH ) (Middleton et al., 2000; Ozgova et al., 2003) e inhibiendo determinadas enzimas como ciclooxigenasa (Laughton et al., 1991), lipoxigenasa (Van Hoorn et al., 2002), NADPH oxidasa (Varga et al., 2004), etc. Los efectos de los polifenoles dependen de la cantidad y su biodisponibilidad. Los polifenoles tambin pueden tener efecto prooxidante (Figura 8). As, en estudios in vitro, en ciertos flavonoides como los flavanoles con una di-hidroxilacin en el anillo B, tienen la habilidad de oxidarse en condiciones concretas (Chan et al., 2003) dando lugar a la formacin de derivados semiquinnicos, que en presencia de in superxido, dan lugar a la formacin de perxido de hidrgeno. En presencia de metales de transicin, tales como el Fe y Cu, este per. xido formar el radical hidroxilo (OH ). Por otra parte, la semiquinona puede oxidarse a quinona y daar a las macromolculas (protenas, lpidos, DNA, RNA, etc.) (Spencer et al., 2004; Galati y Obrien, 2004).

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Figura 8. Actividad antioxidante y prooxidante de los polifenoles

Flavonoide OH Flavonoide OH O OH Antioxidantes (Vitamina C)

O2.HO.

H2O2 H2O

Flavonoide semiquinnico OH O

. O

R5. OH

R5. OH

OH

OH

O2 O2.O Flavonoide quinnico Dao celular Derivados quinnicos -2e + 2H+ OH O O

R5. OH

OH

El mecanismo a travs del cual los flavonoides ejercen sus acciones beneficiosas o txicas aun est sin esclarecer. Sin embargo, estudios recientes han especulado que la actividad clsica como antioxidantes de donadores de hidrgenos difiere de la explicacin bsica para los efectos celulares. Actualmente, se est estudiando la posibilidad de un nuevo mecanismo de actuacin no antioxidante y de proteccin como sera la unin a receptores, funcionando como molculas seal, as como la modulacin de la expresin de genes (Rice-Evans, 2003). Los flavonoides se combinan con azcares para formar glicsidos, siendo sta la forma ms habitual en la que se encuentran en la naturaleza. Sin embargo,

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PROOXIDANTES

ANTIOXIDANTES

O-

se ha visto que las agliconas pueden mostrar incluso una actividad antioxidante superior a sus correspondientes glicsidos. 2.6.2.2.2. BIODISPONIBILIDAD DE LOS POLIFENOLES Los mecanismos de absorcin gastrointestinal de los polifenoles no estn totalmente esclarecidos. Por su naturaleza hidroflica se piensa que tienen que estar implicados los transportadores de membrana que faciliten su transporte, aunque en la actualidad solamente ha sido identificado un transporte activo dependiente de Na+ en el transporte de cidos fenlicos (Ader et al., 1996). En el caso de los flavonoides, stos (con excepcin de los flavanoles) se encuentran en forma glicosilada y esta glicosilacin influye de forma importante en su absorcin. Las agliconas pueden ser absorbidas desde el intestino delgado (Hollman y Katan, 1999) y los glicsidos que resisten la hidrlisis del estmago, no pueden ser absorbidos en su forma nativa por lo que deben de ser hidrolizados por las enzimas intestinales o por la microflora del colon para ser absorbidos (Day et al., 2000). En muchos casos, cuando la flora est implicada, la eficiencia de absorcin puede verse reducida porque tiene lugar una degradacin de las agliconas que son liberadas en forma de cidos aromticos. Una excepcin en cuanto a su absorcin son aquellos flavonoides conjugados con glucosa que pueden utilizar el sistema de transporte activo de la glucosa dependiente de Na+ (SGLT1) a nivel del enterocito para ser absorbidos, y posteriormente hidrolizados en el interior de las clulas por una -glucosidasa (Day et al., 1998). Otra va implicada en la hidrlisis de algunos glucsidos es a travs de una enzima glucosidasa que se encuentra en la membrana de las microvellosidades de las clulas intestinales, y cataliza la hidrlisis extracelular facilitando la difusin de las agliconas al interior de las clulas (Day et al., 2000). Las procianidinas difieren de la mayora de los otros polifenoles por su naturaleza polimrica y alto peso molecular, lo cual limita su absorcin a travs de la

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barrera gstrica donde los olgomeros de ms de tres unidades es improbable que sean absorbidos a nivel del intestino delgado en su forma nativa, (solo dmeros y trmeros son capaces de atravesar el epitelio intestinal). As, las procianidinas, las cuales son los polifenoles ms abundantes de la dieta, son muy pobremente absorbidas, pero pueden ejercer sus efectos localmente en el tracto gastrointestinal o mediar su actividad a travs de los cidos fenlicos producidos resultado de la degradacin microbial. Su accin local es muy importante al estar el intestino particularmente expuesto a agentes oxidantes. Los efectos de los otros componentes del alimento sobre la biodisponibilidad de los polifenoles no estn estudiados, aunque suponemos que pueden ocurrir interacciones entre los polifenoles y componentes como las protenas y los polisacridos que afecten a su absorcin. Otros efectos indirectos de la dieta son su efecto sobre el pH, la fermentacin intestinal, la excrecin biliar, etc. que pueden tener consecuencias sobre la absorcin final de los polifenoles. En cuanto al metabolismo de los antioxidantes procedentes de la dieta, ste es complejo y los antioxidantes pueden actuar como sustratos de diferentes enzimas. As, los compuestos polifenlicos son modificados por enzimas de biotransformacin de la fase I y los de la fase II que pueden cambiar considerablemente la funcin de un componente particular, modificndolo para su eliminacin posterior o generando compuestos ms bioactivos. La biotransformacin en el hgado por medio de reacciones de fase I introduce o expone grupos polares, y la que tiene lugar en el colon mediante reacciones de fase II, en las que los microorganismos degradan los flavonoides no absorbidos. Las reacciones de conjugacin de los grupos hidroxilo con el cido glucurnico, sulfato, glicina o metilacin son los pasos ms frecuentes en las metabolizacin de los flavonoides (Stahl et al., 2002) y algunas de estas reacciones afectan a la capacidad antioxidante in vivo. La metilacin en la posicin 3 de cianidina-3-glucosida y de la quercitina disminuye su capacidad antioxidante del metabolito. La conjugacin con glucu-

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rnido o sulfato puede afectar a la capacidad antioxidante dependiendo de la posicin en la que tenga lugar la conjugacin. La quercitina es posiblemente conjugada durante el proceso de absorcin, y parece retener su actividad antioxidante. El transporte de los polifenoles en plasma est asociado a protenas, no encontrandose libres en sangre, siendo la principal transportadora la albmina. La concentracin plasmtica de los polifenoles despus de un consumo elevado vara de acuerdo a la naturaleza y fuente de los polifenoles. Con respecto a la eliminacin de los metabolitos de los polifenoles, la excrecin puede seguir dos vas diferentes, la va biliar y la urinaria. Los metabolitos conjugados son principalmente eliminados por la bilis mientras que los monosulfatos lo hacen principalmente por orina. A consecuencia de su estructura, presentan importante actividad antioxidante con unos efectos metablicos importantes. Ya que su solubilidad es intermedia entre la vitamina C y la vitamina E, es de esperar que acten en la interfase agua/lpido y puedan estar implicadas en la regeneracin oxidativa de ambas vitaminas. La glucuronidacin y sulfatacin ocasiona polifenoles ms hidroflicos, lo que puede afectar su sitio de accin y su interaccin con otros antioxidantes. Tambin pueden mostrar efectos indirectos sobre la salud porque son metabolizados por la misma va que algunos xenobiticos u hormonas endgenas. Tras el consumo de flavonoides presentes en alimentos como la cebolla y el tomate (Boyle et al., 2000), se observa que glucsidos como la quercetina-glucosidada y isorhamnetina-glucosidada incrementan sus niveles en plasma; adems, este incremento se asoci con un incremento en la resistencia del ADN de los linfocitos a la escisin de cadena, y a una disminucin de los niveles de la base modificada 8-hidroxi 2-deoxiguanosina en orina despus de 4h de haber ingerido cebolla. En el mismo estudio, con una combinacin diettica de tomate y cebolla, se observ que la presencia del flavonoide quercetina en plasma tena

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relacin con una disminucin en la oxidacin de las bases endgenas, sin apreciarse cambios en los niveles de MDA en orina. Otros estudios llevados a cabo por Cao y colaboradores (Cao et al., 1998) en humanos, encontraron que despus de una comida con fresas, espinacas o vino desalcoholizado, todos ellos alimentos ricos en antioxidantes de naturaleza fenlica, existi un aumento en la capacidad antioxidante en suero utilizando 3 mtodos (ORAC, Trolox y la capacidad de reducir el hierro). Otro estudio (Nagyova et al., 1998) en vegetarianos demostr que los TBARS estaban reducidos y la capacidad antioxidante total en plasma incrementada. 2.6.2.3. MELANOIDINAS Las melanoidinas son unos polmeros formados principalmente partir de las interacciones entre carbohidratos y compuestos que poseen un grupo amino libre (aminocidos, pptidos y protenas) a travs de la reaccin de Maillard (que produce pigmentos marrones). Son un grupo de sustancias con actividad antioxidante que est presente de forma importante en determinados alimentos (caf, malta, bollera, cerveza, etc), siendo ingeridos en cantidades considerables en la dieta habitual, con una media de ingestin del orden de varios gramos al da. La reaccin de Maillard es una de las ms importantes en lo que respecta a los cambios qumicos experimentados por los componentes de los alimentos durante el procesado y almacenaje de los mismos (Friedman, 1996). Entre los distintos efectos fisiolgicos de las melanoidinas se han descrito los siguientes: capacidad antimicrobiana, antimutagnica, antitumoral, capacidad de actuar como antioxidantes y como prooxidantes, supresin del crecimiento celular tumoral e inhibicin de enzimas digestivos. Su papel como antioxidante in vivo no es conocido a fondo aunque distintos estudios in vitro apoyan su papel beneficioso como antioxidante de los radicales

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hidroxilo, superxido y peroxilo, actuando adems como quelantes de metales como el zinc y el cobre. As, algunos autores (Chuyen, 1988) observaron que los niveles de peroxidacin lipdica en hgado de ratas wistar alimentadas durante 6 semanas con alimentos ricos en melanoidinas (miso) eran inferiores a los del grupo control. En una lnea similar, nuestro grupo de investigacin (Valls et al., 2004), utilizando melanoidinas procedentes de sntesis, a partir de glucosa-glicina, encontr efecto como antioxidante frente a la toxicidad inducida en hepatocitos aislados de rata por el agente antitumoral adriamicina. Se observ una disminucin en los TBARS y en los niveles de LDH liberados al medio extracelular, a la vez que se produca un incremento en los niveles de ATP. Otros estudios mostraron el papel protector de los productos de Maillard, contra el dao oxidativo al ser capaz de inhibir la oxidacin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL) humanas in vitro (Dittrich et al., 2003). No se conoce demasiado sobre su biodisponibilidad, pero ciertos estudios en animales han permitido saber que se absorben a travs del tracto gastrointestinal. Con respecto a su biotransformacin, se cree que las enzimas de la fase II facilitan el trnsito metablico de las melanoidinas formadas en los alimentos (Faist y Erbersdobler, 2001). No es conocido el mecanismo por el que estos compuestos pueden ejercer sus efectos a nivel celular, aunque sabemos que los compuestos de la reaccin de Maillard se absorben por difusin y son captados en el hgado, rin, msculo y eliminados por la orina (Erbersdobler y Faist, 2001). Por otro lado, distintos trabajos apuntan a que el efecto de las melanoidinas en las clulas pueda estar mediado por los RAGE (receptor for advanced glycation end products), receptores que fueron originalmente identificados y caracterizados basndose en la capacidad de unir los productos de glicosilacin avanzada (AGEs).

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2.6.3. SISTEMAS REPARADORES Su objetivo consiste en eliminar los posibles productos metablicos nocivos formados, lo que impedira su acumulacin indeseable. Para ello, se ponen en marcha mecanismos enzimticos de reparacin de ADN, as como enzimas proteolticas y lipolticas. En estos sistemas estn incluidos los siguientes subsistemas: a. Sistema reparador directo Acta por reduccin de los grupos (S-S) de los aminocidos azufrados de las protenas gracias a enzimas especficas como son la disulfuro reductasa y la sulfxido reductasa. Este grupo de enzimas reparadoras son las que catalizan la reduccin de grupos (S-S) oxidados en protenas por la accin de reductasas disulfuro en el interior de las clulas. Otro grupo de enzimas reparadoras son las proteasas y las fosfolipasas, que actan sobre protenas y fosfolpidos, una vez se produce el dao en la molcula y stas deben ser reemplazadas va sntesis de novo (Davies, 1995; Sartori y Jiricny, 2003). b. Sistema reparador indirecto Este sistema conlleva, en primer lugar, el reconocimiento del dao molecular (siendo ste eliminado o degradado) y, en segundo lugar, la sntesis de la parte eliminada. Esto ocurre en las protenas oxidadas y en los perxidos lipdicos de las cadenas carbonadas, como por ejemplo en las oxidaciones de ADN y ARN (Mataix, 2002). Los cidos nucleicos que han sido modificados como consecuencia del estrs oxidativo, son reparados principalmente por el sistema REB (reparacin por escisin de base) donde intervienen un grupo de enzimas como glicosilasas y endonucleasas AP, siendo el nucletido daado repuesto por las polimerasas (Demple y Harrison, 1994).

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2.7. ALIMENTACIN Y ESTRS OXIDATIVO

La composicin de la dieta juega, como hemos visto, un papel importante en el desarrollo del estrs oxidativo, ya que puede contribuir tanto sobre el dao oxidativo como sobre los mecanismos de defensa antioxidante, lo que explica, al menos en parte, la relacin entre la dieta y algunas enfermedades crnicas o degenerativas como la aterosclerosis y el cncer. En efecto, durante las ltimas dcadas, la preocupacin de las autoridades sanitarias por la importancia de las enfermedades crnicas y degenerativas ha sido creciente. En efecto, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) refleja en sus documentos cmo, de no actuar adecuadamente, en el ao 2.020 las enfermedades no transmisibles (patologas cardiovasculares, diabetes, hipertensin arterial y ciertos tipos de cncer) sern la causa del 73% de las defunciones y del 60% de la carga mundial de enfermedad (OMS, 2001). Simultneamente, la dieta mediterrnea es conocida desde hace tiempo como un modo de alimentarse saludablemente (Nestle, 1995). En efecto, la prevalencia de las citadas patologas en los pases cuya poblacin sigue la dieta mediterrnea es sensiblemente menor, habindose achacado este efecto a diferentes factores ambientales y, por supuesto, dietticos (Keys, 1995). La ventaja, en trminos de salud, que supone mantener un estilo de vida que contemple el seguimiento de la dieta mediterrnea, ha quedado suficientemente establecido, aunque las causas no estn an lo suficientemente claras: desde el perfil lipdico hasta el contenido en antioxidantes, pasando por la presencia de fibra y de otras sustancias, se han propuesto como fundamento de este vnculo entre la dieta y la salud (Willet, 2006). En los ltimos aos, el inters en ciertos antioxidantes, ampliamente distribuidos entre los alimentos de origen vegetal, se ha acentuado considerablemente dados los ltimos hallazgos clnicos y epidemiolgicos (Pitsavos et al., 2005)

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que vinculan la ingestin de alimentos de la dieta mediterrnea, ricos en estas sustancias, con la capacidad antioxidante total. Se destacan especialmente los polifenoles. 2.7.1. DIETA RICA EN ANTIOXIDANTES (POLIFENOLES) Y SALUD La ingestin, en el contexto de una dieta equilibrada, de alimentos ricos en antioxidantes y, entre ellos en polifenoles, parece guardar una estrecha relacin con una mejor salud. Referencias globales de este tipo se encuentran, por ejemplo, en el estudio epidemiolgico de Zutphen, realizado en 552 ancianos entre 50 y 69 aos durante un periodo de 5 aos, en el que se observ cmo la ingesta de flavonoides estaba inversamente correlacionada con la mortalidad producida por la patologa cardiovascular. De este modo, se observ un 60% menos de mortalidad entre la poblacin que ingera un mayor contenido de flavonoides en su dieta (Hertog et al., 1993). Con respecto a esta repercusin fisiolgica hay que destacar los siguientes puntos:
I Ingestin de polifenoles y capacidad antioxidante. Los efectos beneficio-

sos de la ingesta de un elevado nmero de alimentos ricos en compuestos fenlicos como fresas, espinacas, cerveza y vino tinto, se pueden evaluar a corto plazo ya que aumentan la capacidad antioxidante en suero (Cao et al., 1998; Velioglu et al., 1998; Khknen et al., 1999), lo que avala el creciente inters por el consumo de alimentos ricos en estos compuestos (Hertog et al., 1995). La relacin entre la capacidad antioxidante total de la dieta y los marcadores de inflamacin apenas ha sido estudiada in vivo. De entre los datos disponibles, sealamos que parece haber una relacin significativa inversa entre la protena C reactiva del plasma y los antioxidantes totales de la dieta inge-

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ridos. La relacin es ms estrecha precisamente en aquellos sujetos que padecen hipertensin. Adems, el valor antioxidante total de la dieta es significativamente mayor en aquellos sujetos que tienen cifras plasmticas de protena C reactiva bajas, en comparacin con los que las tienen ms altas. La conclusin de que la capacidad antioxidante total de la dieta est inversa e independientemente relacionada con las concentraciones plasmticas de protena C reactiva, que podra ser uno de los mecanismos que explicara el efecto protector frente a las enfermedades cardiovasculares de una dieta rica en antioxidantes. Esto, en definitiva, podra ser especialmente significativo para sujetos con hipertensin (Brighenti et al., 2005). En lo que respecta a la capacidad antioxidante total del suero (CAT) en diversas patologas, se ha visto que a menudo disminuye significativamente (por ejemplo, hasta un 24% en la anorexia nerviosa, un 20% en la encefalopata VIH, un 13% en la polineuropata diabtica y un 17% en la cardiomiopata). Sin embargo, en el suero de los pacientes afectados por enfermedades renales, la capacidad antioxidante est significativamente elevada. Los datos indican que un estrs oxidativo aumentado puede relacionarse con la patognesis o la progresin de la polineuropata diabtica as como de la cardiomiopata. La disminucin de la capacidad antioxidante del suero en pacientes con anorexia nerviosa o con encefalopata VIH se debe, probablemente, en primer lugar a la malnutricin y en segundo lugar a la insuficiencia inmune y a la disminucin de la capacidad antioxidante. En la enfermedad renal, sin embargo, la acumulacin de urea en plasma parece ser la responsable de esta alta capacidad antioxidante. En contraste, otros autores no han hallado cambios en el valor antioxidante del plasma en la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, en el sndrome depresivo ni en la esquizofrenia (Sofic et al., 2002).

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I Polifenoles y cncer. Desde un punto de vista bioqumico, los compuestos

fenlicos revisten un especial inters debido a su potencial anticarcingeno, bien por estimular el bombeo de ciertos agentes cancergenos hacia el exterior de las clulas o bien por actuar mediante la induccin de enzimas de detoxificacin (Mazza, 2000). En la bibliografa cientfica, son mltiples las referencias que demuestran que los flavonoides tienen efectos citostticos en varios sistemas in vitro y que son capaces de regular ciertos procesos importantes en el desarrollo del cncer. Los flavonoides tienen actividad antipromotora, efecto antiinvasivo, e inhiben enzimas como la tirosina proteinkinasa, la ornitin decarboxilasa ATP-dependiente y la DNA topoisomerasa. Numerosos trabajos de investigacin demuestran que los isoflavonoides de la soja, especialmente la genistena, pueden tener efecto protector frente a diferentes tipos de cncer (mama, colon y piel). Este hecho, se ha relacionado con el efecto estrognico de los isoflavonoides, mediante diferentes mecanismos bioqumicos (Barnes, 1995; Herman et al., 1995). En lo referente al cncer en aparato digestivo, es necesario tener en cuenta que el tracto gastrointestinal est continuamente expuesto a la accin de los radicales libres por diferentes vas: a. En el estmago: 1) Se producen mezclas de cido ascrbico con el hierro formando una combinacin prooxidante. 2) Las protenas hemo de la dieta, las cuales son potentes prooxidantes. 3) Perxidos lipdicos, aldehdos citotxicos e isoprostanos de la dieta. 4) El nitrito de la saliva y de los alimentos se convierte en HNO2 por el cido gstrico formando nitrogenados y especies desaminadas del DNA. 5) Aumento de la concentracin de H2O2 procedente de ciertas bebidas.

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b. En el intestino: 1) La presencia de cantidades de productos oxidables, prooxidantes y compuestos fenlicos tales como hidroxiquinonas. 2) La activacin de clulas inmunes presentes en el intestino por bacterias y toxinas de los alimentos. Estos compuestos y sus derivados producirn efectos sobre el tracto gastrointestinal. Por tanto, los polifenoles pueden actuar inmediatamente en el propio tracto gastrointestinal como scavengers de radicales libres, inhibiendo todos los efectos anteriormente mencionados. La absorcin del hierro no es completa en el intestino delgado, por tanto en colon y recto puede actuar como un prooxidante, por lo que podra ser el responsable de algunos tipos de cncer de colon y de recto. Sin embargo, los polifenoles de la dieta que no se absorben pueden quelar dicho metal y reducir as el efecto prooxidante, ejerciendo por lo tanto un efecto positivo que protegera frente a los cnceres gastrointestinales (Babbs et al., 1990; Middleton et al., 2000; Halliwell et al., 2005).
I Polifenoles y salud cardiovascular. Los compuestos fenlicos protegen de la

oxidacin a las lipoprotenas de baja densidad (LDL) desempeando un papel clave para prevenir la aterosclerosis. Tambin pueden prevenir la trombosis, inhibiendo la agregacin plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza, 2000). Este efecto se ha demostrado mediante experimentos con animales in vitro e in vivo. En muchos casos, se inhibe la AMP cclico fosfodiesterasa y como resultado se incrementan los niveles de cAMP. Asimismo, se reduce el nivel de calcio, se inhibe el factor de activacin plaquetario, la captacin de radicales libres y se reduce la liberacin de enzimas que favorecen la agregacin plaquetaria (Meltzer y Malterud, 1997; Craig et al., 1996).

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I Polifenoles e inmunidad. Los compuestos fenlicos tambin son considera-

dos como reguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a la modulacin del metabolismo del cido araquidnico, reduciendo los niveles de tromboxano. Tambin modulan la actividad enzimtica de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa, fosfolipasa A2, hialuronidasa, e inhiben la accin de la angiotensina convertasa, mieloperoxidasa (que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa (que produce los radicales superxido), entre otras. Dichos efectos les otorgan un amplio potencial para su utilizacin con fines mdicos (Craig et al., 1996). Son numerosos los estudios que han mostrado que este tipo de compuestos poseen propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidacin lipdica y captando radicales libres como hidroxilo, suproxido y alcoxi radical (Sichel et al., 1991).
I Polifenoles e infeccin. Tambin se han descrito efectos antivricos, anti-

bacterianos y antifngicos. Se ha observado in vitro el potencial de la epicatequina como agente antivrico y las antocianidinas pueden inhibir las enzimas que intervienen en la replicacin del rhinovirus y del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Hocman, 1989).
I Polifenoles y salud sea. Numerosos estudios sealan el papel protector de

los polifenoles frente a la osteopenia. As, se ha encontrado que la rutina inhibe la prdida de trabculas seas en ratas ovariectomizadas por diferentes causas: a) por reducir la resorcin sea y b) por aumentar la actividad osteoblstica (Horcajada-Molteni et al., 2000).
I Polifenoles y menopausia. Es conocida desde hace tiempo la probable pro-

teccin ante la aparicin de patologas postmenopasicas (ECV, osteoporosis) cuando se suplementa la dieta con fitoestrgenos (Keller et al., 1999).

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Estudios ms recientes apoyan la teora de que los fitoestrgenos (isoflavonas y lignanos, entre ellos) podran tener un papel en la prevencin de la osteoporosis tras la menopausia, especialmente en el caso de la soja, las semillas de lino y las ciruelas (Arjmandi, 2001). Estos fitoestrgenos son compuestos de origen vegetal (judas, coles, espinacas, soja, cereales, lpulo, etc.) con actividad estrognica o antiestrognica. Los principales componentes presentes en los alimentos y que tienen esta actividad son los isoflavonoides, los flavonoides y los lignanos. Sin embargo, actualmente no hay evidencias que sugieran beneficios consiguientes a la promocin de modificaciones dietticas en este sentido. Asimismo, cabe destacar que los fitoestrgenos han producido efectos secundarios negativos en animales de experimentacin, como por ejemplo sobre la diferenciacin cerebral durante el crecimiento. Tampoco conocemos las posibles dosis txicas cuando se ingieren por nios o por adultos. 2.7.2. PRESENCIA DE POLIFENOLES EN LA ALIMENTACIN HUMANA No se ha profundizado en estudios que reflejen el consumo real de estas sustancias en la dieta cotidiana. Por el contrario, s sealaremos algunos datos parciales disponibles en diferentes pases:
I En Australia (Lyons-Wall et al., 2004), la ingestin total de flavonoides en

mujeres es de 128 miligramos al da (+/- 19.9 mg/dl). En este grupo, las mayores fuentes dietticas de este polifenol fueron: cebolla, manzana, t, aceitunas y brcol en lo que respecta a los flavonoles. Para las flavonas, el perejil y el apio son las fuentes alimentarias, sindolo la naranja, el pomelo y sus zumos para las flavononas y el t, la manzana, el vino tinto, el chocolate negro y el cacao para las catequinas. La catequina es precisamente el tipo de flavonoides

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ms presente en este grupo de mujeres (representan el 59% del total), seguida por los flavonoles (un 20%) y las flavononas (un 18%) con una pequea contribucin de las flavonas (3%). Como seala el mismo autor, la ingestin media de catequina en otros pases es, a modo de ejemplo, de 14,1 mg en Finlandia, de 25,4 mg en EE.UU y de 72 mg diarios en Alemania.
I En Estados Unidos (Kuhnau, 1976), el consumo de flavonoides parece estar

alrededor de 1 g al da. En Holanda (Hertog et al., 1993), la ingestin de polifenoles se estim en 23 mg al da. En Dinamarca (Justesen et al., 1997), el valor obtenido fue de 28 mg al da de flavonoides.
I En el conjunto de los pases occidentales (Manach et al., 2004), el consumo

total de flavonoides se ha calculado en una cifra que oscilara entre los 100 y 150 mg diarios.

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t OBJETIVOS DEL ESTUDIO

El objetivo principal de este trabajo de investigacin ha consistido en estudiar el efecto de la suplementacin diettica de lpulo a travs de una bebida fermentada y de cpsulas o concentrados de lpulo, con el metabolismo oxidativo y su relacin con los marcadores de riesgo cardiovascular y de inflamacin en un colectivo de edad avanzada (monjas de clausura). Como objetivos parciales del estudio podemos enumerar el conocimiento de:
I Los hbitos alimentarios del grupo de poblacin seleccionado y el valor

nutritivo de su dieta.
I Estudiar el efecto de la ingestin de cerveza sin alcohol en el metabolis-

mo oxidativo y su relacin con el metabolismo lipdico y los procesos de inflamacin en un colectivo de edad avanzada (monjas de clausura).
I Estudiar el efecto de la ingestin de un suplemento de lpulo en el meta-

bolismo oxidativo y su relacin con el metabolismo lipdico y los procesos de inflamacin en un colectivo de edad avanzada (monjas de clausura).
I Comprobar el efecto antioxidante de la cerveza sin alcohol y del lpulo en

los procesos patolgicos relacionados con el envejecimiento en un colectivo de monjas de clausura.

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o MATERIALES Y MTODOS

4.1. MATERIAL
4.1.1. SUPLEMENTOS
I Lpulo. Inflorescencias femeninas de lpulo, encapsuladas en gelatina, propor-

cionadas por el laboratorio Dolisos (marca ElusanR). Cada cpsula conteniendo 200 mg.
I Cerveza sin alcohol. Se ha optado por esta modalidad al tratarse de un grupo

de edad avanzada. 4.1.2. REACTIVOS

I Los reactivos para soluciones tamponadas, enzimas, coenzimas, fueron propor-

cionados por Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) y Boehringer Mannheim (Alemania).
I Los disolventes y otros reactivos de ScharLau (Barcelona, Espaa) y Merck

(Darmstadt, Alemania).
I Tests enzimticos y kits para diferentes determinaciones:

Triglicridos: test enzimtico GPO-PAP, comercializado por Roche Diagnostics GMBH, D-68298 Mannheim (Alemania). Colesterol: test enzimtico CHOD-PAP, comercializado por Roche Diagnostics. HDL colesterol: enzimas modificadas por PEG (polietilenglicol) y sulfato de alfaciclodextrina y dextrano, comercializado por Roche Diagnostics.

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LDL oxidada: inmunoensayo enzimtico para la determinacin de anticuerpos frente a LDL oxidada en suero humano. Para esta determinacin, se utiliz el kit OLAB anti oxidised LDL de Biomdica. Interleukina 1: Kit ELISA, de Diaclone Research. Interleukina 6: Kit ELISA, de Diaclone Research. Factor de necrosis tumoral: Kit ELISA, de Diaclone Research.
I El agua utilizada en todas las determinaciones fue de grado Milli-Q (Millipore).

4.2. MTODOS
4.2.1. ANALTICAS SANGUNEAS Una vez recogidas las muestras de sangre, se trasladan en condiciones de refrigeracin al laboratorio para proceder a un tratamiento inicial de las muestras y a las correspondientes determinaciones. 4.2.1.1. PERFIL LIPDICO a. Determinacin de triglicridos. Para la determinacin de los triglicridos se utiliz el autoanalizador Modular EDDPP-ROCHE y el test enzimtico triglicridos GPO-PAP. Siendo el rango de normalidad para dicho test de 50-170 mg/dL. Principio del test: el mtodo se basa en las siguientes reacciones acopladas: los triglicridos se someten a la accin de la lipoprotein lipasa que pro-

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ud a o t s r

duce una hidrlisis rpida y completa a glicerol. Posteriormente, y tras fosfatacin, se produce dihidroxiacetonafosfato y perxido de hidrgeno, el cual en presencia de un cromgeno, 4aminofenazona y 4clorofenol formar un compuesto coloreado (4fenazona) que es directamente proporcional a la cantidad de triglicridos presentes en la muestra. b. Determinacin de colesterol total. Para la determinacin del colesterol total se utiliz el autoanalizador Modular EDDPP-ROCHE y el test enzimtico colesterol CHOD-PAP. Siendo el rango de normalidad para dicho test de 70-220 mg/dL. Principio del test: el mtodo est basado en la hidrlisis de los steres de colesterol presentes en la muestra por la colesterol esterasa dando lugar a colesterol libre y cidos grasos. Posteriormente, y tras oxidacin enzimtica con la colesterol oxidasa, se formar perxido de hidrgeno y colesterina. Finalmente, este perxido de hidrgeno se valora por la reaccin de Trinder, mediante un cromgeno, fenol y 4-aminofenazona, en presencia de peroxidasa, formando una benzoquinona, cuya coloracin es proporcional a la concentracin de colesterol presente en la muestra. c. Determinacin de HDL colesterol. La determinacin directa de colesterol HDL mediante el empleo de enzimas modificadas por PEG (polietilenglicol) y sulfato de alfa-ciclodextrina y dextrano. Se utiliz el autoanalizador Modular EDDPP-ROCHE, siendo el rango 35 60 mg/dl. Principio del test: PEG- colesterol esterasa rompe los esteres de colesterol-HDL en colesterol libre y cidos grasos, que tras oxidacin, formar perxido de hidrgeno, el cual por accin del cromgeno 4- aminofenazona y HSDA (N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina) formar un compuesto coloreado azul-violeta. Dicha coloracin es proporcional a la cantidad de HDL-c presente en la muestra.

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d. Determinacin de LDL colesterol. Para la determinacin de las LDL- colesterol se utiliz la fmula de Friedewald: permite derivar el valor de la concentracin de LDL-c a partir de la concentracin de colesterol total, la de triglicridos y la de HDL-colesterol, magnitudes todas ellas de ms fcil medida que el LDL-c. Frmula para la determinacin de LDL colesterol. LDL-c = Colesterol total HDl-colesterol VLDL-colesterol ( TG / 5 o TG / 2, 17) e. Determinacin de LDL oxidada. Inmunoensayo enzimtico para la determinacin de anticuerpos frente a las LDL oxidadas en suero humano. Para esta determinacin, se utiliz el kit OLAB anti oxidised LDL de Biomdica. Aadimos 200 L de tampn de ensayo en los pocillos de la placa incluyendo el blanco y 20 L de la pre-dilucin (1:5) de estndar/muestra/control en cada pocillo excepto el blanco. Cubrimos bien la placa e incubamos a 37 C durante 1,5 horas. Transcurrido el tiempo, lavamos los pocillos con tampn de lavado diluido y aadimos 100 L de conjugado en cada pocillo. Cubrimos bien la placa e incubamos a temperatura ambiente (18-26 C) durante 30 minutos. Lavamos y aadimos 100 L de sustrato en cada pocillo e incubamos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aadimos 50 L de solucin stop y finalmente medimos la absorbencia a 450 nm en un lector de placas. 4.2.1.2. PARMETROS MARCADORES DE INFLAMACIN a. Determinacin de protena C reactiva. Se utiliz la tcnica de inmunoanlisis turbidimtrico de aglutinacin. La muestra se coloca en una solucin tampn y se mezcla con una suspensin de anticuerpo monoclonal de CRP antihumano de ratn. La CRP se fija al anticuerpo unido al ltex y se aglutina. La can-

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tidad de la difusin de luz es proporcional a la concentracin de CRP presente en las muestras. Las medidas se realizaron con el autoanalizador: COBAS INTEGRA 800 de ROCHE. Rango de normalidad: 0-5 mg/dl. b. Determinacin de factores de complemento C3 y C4. Se utiliz la tcnica de nefelometra. Las protenas contenidas en el suero humano forman en una reaccin inmunoqumica con anticuerpos especficos, inmunocomplejos los cuales pueden dispersar un rayo de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada depende de la concentracin de la correspondiente protena de la muestra. La valoracin se hace por comparacin con un estndar de concentracin conocida. Las medidas se realizaron con el nefelmetro DADE-BEHRING. El rango de normalidad para el complejo C3 es de 75-140 mg/dL y para el C4 de 10-34 mg/dL. c. Determinacin de interleukinas IL-1. Kit Elisa, de Diaclone Research, para IL-1 humana. Identifica interleukina 1-beta en suero, plasma, soluciones tamponadas o cultivos celulares. El mtodo identifica interleukinas de origen natural (interleukinas pro y maduras) y recombinantes. Principios del mtodo. El kit est basado en un mtodo ELISA en sandwich en fase slida con un anticuerpo monoclonal especfico para la interleukina 1-beta. El proceso incluye una incubacin de la muestra a la que se aade, tras el lavado, la enzima streptavidin-peroxidasa, volvindose a incubar y lavar. La intensidad de la reaccin coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adicin del sustrato que acta sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a la concentracin de IL-1 presente en las muestras analizadas.

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IL-6. Kit ELISA, de Diaclone Research, para Interleukina-6 humana. Dicho kit permite identificar IL-6 en suero, plasma, soluciones tamponadas y cultivos celulares. El sistema reconoce IL-6 natural y recombinante. Principios del mtodo. El kit est basado en un mtodo ELISA en sandwich en fase slida con un anticuerpo monoclonal especfico para la interleukina 6. El proceso incluye una incubacin de la muestra a la que se aade, tras el lavado, la enzima streptavidin-peroxidasa, volvindose a incubar y lavar. La intensidad de la reaccin coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adicin del sustrato que acta sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a la concentracin de IL-6 presente en las muestras analizadas. d. Determinacin del factor de necrosis tumoral Kit ELISA, de Diaclone Research, para identificacin de factor de necrosis tumoral TNF- humano. Identifica TNF- en suero, plasma, soluciones tamponadas y cultivos celulares. El sistema reconoce TNF- natural y recombinante. Principios del mtodo. El kit est basado en un mtodo ELISA en sandwich en fase slida con un anticuerpo monoclonal especfico para TNF-. El proceso incluye una incubacin de la muestra a la que se aade, tras el lavado, la enzima streptavidin-HRP, volvindose a incubar y lavar. La intensidad de la reaccin coloreada que se produce finalmente, tras la correspondiente adicin del sustrato que acta sobre la enzima ligada, es directamente proporcional a la concentracin de TNF- presente en las muestras analizadas. La reaccin se termina mediante la adicin de cido (H2SO4) y la absorbancia se mide a 450 nm.

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4.2.1.3. PARMETROS

DEL

METABOLISMO OXIDATIVO

a. Determinacin del contenido de grupos carbonilo en protenas plasmticas. La oxidacin proteica se mide por la cuantificacin de los grupos carbonilo formados durante la incubacin con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH) en condiciones cidas, basndose en la reaccin equimolar entre ellos, segn procedimiento desarrollado por Levine et al. (1980) con algunas modificaciones de Tian et al. (1998). La DNFH unida a protenas se cuantifica colorimtricamente (373=21.10-3 M-1 cm-1 ) tras la separacin de las protenas derivatizadas por precipitacin con cido, lavado y posterior solubilizacin con guanidina. La cantidad de protena utilizada oscila entre 0,51 mg/mL, aadiendo tampn de conservacin de mitocondrias hasta 1 mL de volumen final. Centrifugamos a 13.600 rpm durante 10 minutos y al sobrenadante aadimos estreptomicina sulfato 10% con tampn Hepes 50 mM pH:7,2, en una proporcin de 1/9 v/v. Centrifugamos y cogemos 200 L del sobrenadante y aadimos 400 L de 2,4 dinitrofenilhidracina (DNFH)10 mM /ClH 2,5 M a las muestras y 400 L de ClH 2,5 M a los controles. Incubamos 1 hora a temperatura ambiente, con agitacin ocasional. Centrifugamos a 12.600 rpm durante 3 minutos y aadimos 1 mL de TCA al 20%. Centrifugamos de nuevo a 12.600 rpm durante 3 minutos. Recogemos el pellet y lo lavamos 3 veces con 1 mL de etanol: acetato de etilo (1:1 v/v). Centrifugamos otra vez a 12.600 rpm durante 3 minutos y recogemos el pellet. Finalmente aadimos 1 mL de guanidina 6 N a pH: 2,3, centrifugamos a 12600 rpm y medimos el sobrenadante a una = 366 nm frente a una solucin de guanidina. b. Determinacin de -Tocoferol en plasma. Se utliliz la tcnica de HPLC de Arnaud et al., 1991. Se toman 200 L de plasma y se mezclan con 100 L de etanol, se aaden 500 l de hexano, se centrifuga y se recoge la fase orgni-

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ca, la cual se lleva a secado con N2 seco y finalmente se resuspende con 200 L de fase movil (diclorometano/acetonitrilo/metanol, 20:70:10). Se mide a una de 291 nm. c. Tratamiento de la sangre para la determinacin de GSH y de hemoglobina en humanos. Se toma una alcuota de sangre heparinizada y se centrifuga a 3.000 rpm durante 10 minutos. Separamos el plasma y lo congelamos a -80 C. Las clulas se transfieren a un tubo cnico de vidrio, se le aade aproximadamente la misma cantidad de agua MiliQ (1.5 mL clulas + 1.5 mL agua). Posteriormente, dejamos a 4 C durante 2 h para que se hemolice (determinacin de Hemoglobina). A 1.88 mL del hemolizado se aade 0.8 mL de mezcla cloroformo: etanol (3:5 v/v) fro y 0.3 mL agua MiliQ. Se centrifuga a 4.000 rpm durante 10 minutos y del sobrenadante determinamos los niveles de GSH (Maral et al.,1977). Determinacin del GSH en sangre. La cuantificacin del GSH se llev a cabo mediante la tcnica de Brigelius et al. (1983), de la glutation-s-transferasa (GSHS-T). El complejo formado (GS-DNB) absorbe luz a una longitud de onda de 340 nm, siendo proporcional el cambio de extincin medido espectrofotomtricamente a la cantidad de GSH presente en la muestra. d. Determinacin de TBARS en plasma. La determinacin de las sustancias que reaccionan con el cido tiobarbitrico se realiz mediante la tcnica de Santos et al. (1980). Pipeteamos en cada tubo 0.1 ml de plasma, y al blanco 0.1 ml de agua miliQ. Aadimos 0.4 ml de suero salino al 0.9% a cada tubo seguido de 1 ml de TCA 100% en HCl 0,6 N y 0,2 ml de TBA 0,12 M en TRIS 0,26 M. Agitamos los tubos en el vrtex, se tapan y se ponen a hervir en un vaso de precipitados durante 30-45 minutos. Transcurrido el tiempo, se dejan enfriar durante 15-20 minutos. Aadimos 2 ml de agua miliQ. Agitamos en vrtex y se centrifugan a 3.000 rpm durante 10 minutos. Se mide la absorbancia a una = 532 nm.

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4.2.2. ANLISIS ESTADSTICO Las distintas repeticiones enunciadas en los respectivos apartados ponen de manifiesto que se obtuvieron datos suficientes como para poder aplicar distintos tratamientos estadsticos, los cuales se llevaron a cabo con el programa Statgraphcis Plus para Windows (Manugistics Inc, 1997).

4.3. DISEO EXPERIMENTAL

4.3.1. SELECCIN DE LA MUESTRA Se ha estudiado a una poblacin de cincuenta monjas de clausura pertenecientes a tres monasterios: San Miguel de las Dueas, Carrizo de la Ribera y Sta. Mara de Gradefes, todos ellos en la provincia de Len. La eleccin de este grupo de poblacin, institucionalizado y con una libertad de eleccin reducida en su estilo de vida, es un clsico en los estudios epidemiolgicos y de investigacin causa-efecto. En este caso, adems, la poblacin presenta unas caractersticas que la hacen especialmente interesante: su edad media es elevada (con lo que podemos encontrar una mayor prevalencia de determinadas enfermedades ligadas al proceso de envejecimiento y, por lo tanto, al estrs oxidativo) y su estilo de vida es ordenado, reglado y homogneo. En los resultados del estudio podremos ver cmo la muestra inicial qued reducida finalmente a 29 monjas, debido a las exclusiones y bajas producidas durante su elaboracin, en la fase cerveza y a veinticinco en la fase lpulo. Por el contrario, la muestra elegida ha sido difcil de seleccionar teniendo en cuenta el reducido nmero de colectivos religiosos existentes en la actualidad y de involucrar a este colectivo en un estudio dado su rechazo a recibir interven-

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ciones externas. Finalmente, tras una amplia bsqueda, se han elegido los tres conventos citados. 4.3.2. DESARROLLO DEL ESTUDIO Se ha procedido de acuerdo a las siguientes fases:
I Fase I o inicial. Se realiza el lavado de alcohol, eliminando el posible consumo

de bebidas alcohlicas por completo. Duracin: 30 das. Al concluir, se procede a la toma de muestras para realizar la analtica sangunea y se recopila una historia diettica de cada individuo.
I Fase II. La dieta normalizada del grupo se ha suplementado con una cantidad dia-

ria prefijada de cerveza sin alcohol (250 ml dos veces diarias), durante 45 das. Los pacientes del estudio siguen consumiendo la dieta habitual. Transcurrido el tiempo de suplementacin, se procede a una segunda toma de muestras para analtica sangunea.
I Fase III. Tras un periodo de seis meses sin consumir cerveza sin alcohol ni nin-

gn otro tipo de bebida alcohlica, las integrantes del estudio son sometidas a una nueva analtica de todos los parmetros del estudio.
I Fase IV. La dieta normalizada del grupo se ha suplementado con lpulo encapsu-

lado durante 30 das a razn de 2 cpsulas diarias de 200 mg cada una de ellas conteniendo inflorescencias femeninas. Al cesar la administracin de lpulo, se realiza una nueva toma de muestras sanguneas y a su correspondiente analtica.

69

o RESULTADOS

Previamente a estos estudios en humanos, nuestro grupo de investigacin ha realizado estudios in vitro con hepatocitos aislados de rata, sometidos a un estrs oxidativo con el antibitico antitumoral adriamicina en presencia y ausencia de la fraccin flavonoidea de la cerveza rubia y negra. Posteriormente, se han realizado estudios in vivo, se ha determinado la biodisponibilidad de los compuestos fenlicos y actividad antioxidante total en plasma de ratas tras la administracin de cerveza con y sin alcohol a diferentes tiempos. Asimismo, se sometieron las ratas a un estrs oxidativo con el antibitico antitumoral al mismo tiempo que se suplement su dieta con cerveza con y sin alcohol. En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la suplementacin de la cerveza y el lpulo, componente de la cerveza, en un colectivo dietticamente controlado y su relacin con el metabolismo oxidativo, parmetros indicadores de riesgo cardiovascular y de inflamacin, propios de la edad avanzada. Tras las correspondientes pruebas y determinaciones analticas, se han obtenido los resultados que se ofrecen a continuacin en las diferentes fases de suplementacin con cerveza sin alcohol y con lpulo. Los resultados se han realizado con muestras apareadas y expresados en porcentajes respecto a su control, estudiando los datos antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin.

5.1. VALORACIN NUTRICIONAL Y ENERGTICA

En el primer grupo (n = 14), la ingestin energtica media es de 2.126 Kcal./da, en el segundo grupo (n = 22) es de 1.601 Kcal./da y en el tercer grupo (n = 14) es de 1.750 Kcal./da. En el primer grupo, la ingestin de nutrientes cubre la recomendacin diettica (I.R.) de todos los nutrientes excepto de calcio (89%) y de retinol (61%). La dieta realizada es ligeramente hipercalrica.

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En el segundo grupo, la ingestin de nutrientes cubre la recomendacin diettica (I.R.) de todos los nutrientes excepto de calcio (88%), de hierro (69%), de retinol (76%) y de cido flico (89%). La dieta realizada resulta ser hipocalrica, cubriendo sta nicamente el 85% de las necesidades diarias. En el tercer grupo, la ingestin de nutrientes cubre la recomendacin diettica (I.R.) de todos los nutrientes excepto de retinol (68%). La dieta realizada es ligeramente hipocalrica. La ingestin media de todos los grupos (n=50) es de un 14% en protenas, de un 40,5% en lpidos y de un 45,5% en carbohidratos (Figura 9). Asimismo, se observa una insuficiente ingestin de fibra (14.5 g diarios de media), siendo el origen de la energa claramente desequilibrado con un exceso de lpidos. Figura 9. Dieta ingerida por los sujetos del estudio: valor medio de los tres grupos.
Origen de la energa diaria ingerida (Kcal. en %) 14,0% % kcal. prot

45,5% % kcal. H de C

40,5% % kcal. lip

Energa total = 1826 Kcal./da

71

5.2. SUPLEMENTACIN DIETTICA: CERVEZA SIN ALCOHOL

Los resultados se han obtenido en un colectivo de monjas de clausura a las que se les suplement diariamente su dieta con 500 ml de cerveza sin alcohol (de fabricacin espaola). Se realiz con cerveza sin debido a que este colectivo suele ser de edad avanzada que toma medicamentos en los que el alcohol est contraindicado. La suplementacin tuvo lugar durante un periodo de 45 das sin que se ordenara modificacin diettica alguna en paralelo. La dieta de las monjas de clausura era la que seguan motu propio de forma habitual. 5.2.1. METABOLISMO OXIDATIVO: DAO A MACROMOLCULAS En este estudio hemos valorado la capacidad del aporte suplementario de cerveza sin alcohol en un colectivo de humanos y hemos determinado los niveles de las sustancias que reaccionan con el cido tiobarbitrico (TBARS) y contenido en grupos carbonilo antes y despus de la suplementacin, puesto que es uno de los mejores indicadores de dao oxidativo. El dao oxidativo a lpidos se evalu mediante la produccin de TBARS en plasma, puesto que son productos formados directamente en la reaccin de peroxidacin lipdica, responsable de la mayora de los efectos fisiopatolgicos relacionados con el estrs oxidativo. En la tabla 2 podemos observar que los valores medios de TBARS antes de la suplementacin con cerveza sin alcohol (40,59 8,41) respecto a (33,34 6,20) despus de la suplementacin. Cuando expresamos los resultados en porcentajes respecto a su control se produce una disminucin significativa de un 16% (p<0,005) (Figura 10). Cuando determinamos el contenido en grupos carbonilo, observamos que los valores medios previos a la suplementacin son de 4,04 0,79 respecto a 3,32 0,66 despus del suplemento con cerveza sin alcohol (Tabla 2). Si expresamos los

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resultados en porcentaje se observa una diferencia significativa de un 18% con p<0,005 despus del periodo de suplementacin (Figura 10), resultados que ponen de manifiesto el efecto que est ejerciendo la cerveza sobre el dao inducido a lpidos y protenas. Tabla 2. Niveles medios de las sustancias que reaccionan con el cido tiobarbitrico procedentes de la peroxidacin lipdica (TBARS) y el contenido de grupos carbonilo (GC).
Parmetros Cerveza sin alcohol TBARS (nmol/mL plasma) Grupos Carbonilo (nmol/mg prot) Fase I 40,59 8,41 4,04 0,79 Valores medios Fase II 33,34 6,20 3,32 0,66

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con cerveza sin alcohol.

Figura 10. Niveles de las sustancias que reaccionan con el cido tiobarbitrico procedentes de la peroxidacin lipdica (TBARS) y el contenido de grupos carbonilo de las protenas (GC) antes y despus de la suplementacin con cerveza sin alcohol.
TBARS (nmol/mL plasma) (84)**
120

GC (nmol/mL prot.) (82)**

% Respecto a su control

100

80

60

40

20

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. **P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

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5.2.2. DEFENSA ANTIOXIDANTE: NIVELES DE GLUTATION REDUCIDO Y -TOCOFEROL En primer lugar, determinamos los niveles de glutation eritrocitario antes y despus de la suplementacin. Su principal papel lo ejerce a travs de una accin como barredor (scavenger) de los radicales libres ya formados. Su disminucin, por lo tanto, nos indica una formacin excesiva de radicales oxignicos que precisan ser contrarrestados con el consiguiente aumento en el consumo orgnico de este antioxidante. En los resultados, podemos observar (Tabla 3) que los valores medios de glutation previos a la suplementacin son de 1,30 0,29 respecto a 1,71 0,18 obtenidos despus de la suplementacin. Cuando determinamos los porcentajes, observamos que se produce un aumento significativo de un 21%, p<0,005 respecto a su control (Figura 11). La vitamina E, en su forma de -tocoferol, es un antioxidante natural que acta en fase lipdica. Cuando observamos los resultados medios obtenidos en nuestro estudio, vemos como antes de la suplementacin la cifra era de 60,95 13,33, siendo finalmente de 66,94 11,69, lo que representa una variacin del 12% (Figura 11). Tabla 3. Niveles medios de glutation (GSH) y -tocoferol antes y despus de la suplementacin con cerveza sin alcohol.
Parmetros Cerveza sin alcohol GSH (mol/g Hb) -tocoferol (nmol/ml plasma) Fase I 1,30 0,29 60,95 13,33 Valores medios Fase II 1,71 0,18 66,94 11,69

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con cerveza sin alcohol.

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Figura 11. Niveles de glutatin y a-tocoferol antes y despus de la suplementacin con cerveza sin alcohol.
GSH (mol/g Hb) (121)**
160 140 120 100 80 60 40 20 0

-tocoferol (nmol/ml plasma) (112)**

% Respecto a su control

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. **P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

5.2.3. METABOLISMO LIPDICO Respecto al metabolismo lipdico, hemos determinado los niveles medios antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II) (Tabla 4) de los diferentes parmetros estudiados: triglicridos, colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol y LDL oxidada. Asimismo, hemos estudiado separadamente los datos del colesterol total de aquellos sujetos que eran superiores a los 240 mg/dL. En lo referente a los niveles de triglicridos, los resultados obtenidos nos permiten observar (Figura 12) cmo no se producen cambios significativos al final del periodo de suplementacin. Asimismo, tampoco se observan cambios en los niveles de colesterol total; sin embargo, cuando los niveles de colesterol en los sujetos del estudio eran superiores a 240 mg/dL, s que observamos una disminucin

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significativa (Figura 12) del colesterol total (un 6% con una p<0,05 y unos valores medios iniciales de 265,42 13,53 y de 251,83 19,57 al final del periodo) tras el periodo de suplementacin, lo que nos indicara que la cerveza sin alcohol est ejerciendo un efecto sobre la hipercolesterolemia. No se producen modificaciones significativas en las cifras de HDL-c (Figura 13) ni en las de LDL-c. Sin embargo, se observa una disminucin de un 8% (p< 0,05) en el caso de la LDL-c oxidada. Esto nos indica que la cerveza sin alcohol protege a las LDL de su oxidacin, lo que puede tener inters dado que se trata de un importante factor de riesgo en la patologa cardiovascular. Tabla 4. Suplementacin con cerveza sin alcohol: Niveles medios de triglicridos, colesterol total, HDL-c, LDl-c y LDL oxidada.
Parmetros Cerveza sin alcohol Triglicridos (mg/dL) Colesterol (mg/dL) Colesterol > 240 (mg/dL) HDL (mg/dL) LDL (mg/dL) LDLoxidada (mU/mL) Fase I 93,07 57,30 236,79 31,93 265,42 13,53 75,46 17,28 146,00 31,18 898,59 192,00 Valores medios Fase II 96,96 37,42 236,74 30,21 251,83 19,57 74,04 19,18 147,08 27,35 883,84 175,50

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con cerveza sin alcohol.

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Figura 12. Determinacin de los niveles de triglicridos, colesterol total y colesterol > 240 mg/dL antes y despus de la suplementacin con cerveza sin alcohol.
Col Total (mg/dL) Col Total > 240 (mg/dL) (100) (94)* % Respecto a su control
120 100 80 60 40 20 0

TG (mg/dL) (100)

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. *P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

Figura 13. Determinacin de los niveles de HDL colesterol, LDL colesterol y LDL oxidada antes y despus de la suplementacin con cerveza sin alcohol.
HDL (mg/dL) (98)

LDL (mg/dL)
(95)

LDLox (mU/mL) (92)*

% Respecto a su control

120 100 80 60 40 20 0

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. *P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

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5.2.4. PARMETROS DE INFLAMACIN Se ha procedido a determinar los parmetros correspondientes a los complementos C3 y C4, la protena C reactiva (PCR), las interleukinas 1- y 6 y el factor de necrosis tumoral (TNF-). Todos estos datos estn disponibles en la Tabla correspondiente (Tabla 5) as como en las figuras (Figuras 14, 15). Tabla 5. Valores medios de los complementos C3 y C4, la protena C reactiva (PCR), las interleukinas 1- y 6 y el factor de necrosis tumoral (TNF-)
Parmetros Cerveza sin alcohol C3 (mg/dl) C4 (mg/dL) PCR (mg/dL) IL-1- (pg/mL) IL-6_ (pg/mL) TNF- (pg/mL) Fase I 109,04 17,61 21,67 6,09 2,34 1,78 103,93 40,25 3,58 1,58 20,14 5,24 Valores medios Fase II 111,74 18,43 21,78 6,04 2,89 1,94 101,87 40,99 3,62 2,02 23,48 5,14

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 29 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con cerveza sin alcohol.

No se han encontrado modificaciones significativas, en las diferentes fases, de estos parmetros. nicamente cabra destacar el aumento (no significativo) de la interleukina 6 (un 17% para valores medios iniciales de 3,58 1,58 y de 3,62 2,02 tras la suplementacin) y del factor de necrosis tumoral (un 11% para valores iniciales de 20,14 5,24 y de 23,48 5,14 tras la suplementacin).

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Figura 14. Niveles de los factores C3, C4 del complemento y PCR antes y despus de la suplementacin con cerveza sin alcohol.
C3 (mg/dL) (101) % Respecto a su control
120 100 80 60 40 20 0

C4 (mg/dL) (99)

PCR (mg/dL) (102)

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas.

Figura 15. Niveles de las interleukinas 1-, 6 y TNF- antes y despus de la suplementacin con cerveza sin alcohol
IL-1 (pg/mL) (99) % Respecto a su control
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

IL6 (pg/mL)
(117)

TNF- (pg/mL) (111)

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 29 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas.

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5.3. SUPLEMENTACIN DIETTICA: LPULO

Los resultados se han obtenido en un colectivo de monjas de clausura a las que se les suplement diariamente su dieta con lpulo (dos cpsulas de 200 mg cada una conteniendo las inflorescencias femeninas). La suplementacin tuvo lugar durante un periodo de 30 das. Las correspondientes analticas sanguneas nos han permitido estudiar las posibles variaciones de parmetros relacionados con el metabolismo oxidativo, lipdico y parmetros de inflamacin. 5.3.1. METABOLISMO OXIDATIVO: DAO A MACROMOLCULAS Durante la realizacin de este trabajo, hemos valorado el efecto del aporte suplementario de lpulo en un colectivo de humanos, determinando para ello los niveles de las sustancias que reaccionan con el cido tiobarbitrico (TBARS) as como el contenido en grupos carbonilo antes y despus de la suplementacin, ya que se trata de uno de los mejores indicadores del dao oxidativo. El dao oxidativo a lpidos se evalu mediante la produccin de TBARS en plasma, puesto que son productos formados directamente en la reaccin de peroxidacin lipdica, responsable de la mayora de los efectos fisiopatolgicos relacionados con el estrs oxidativo. En la tabla 6 podemos observar que los valores de TBARS antes de la suplementacin con lpulo eran de 37,45 5,61 respecto a un valor de 31,29 5,61 despus de la suplementacin. Cuando expresamos los resultados en porcentajes respecto a su control, se produce una disminucin significativa de un 15% (p<0,005) (Figura 16). Cuando determinamos el contenido en grupos carbonilo, observamos que los valores medios previos a la suplementacin eran de 1,69 0,84 respecto a 1,42 0,53 despus del suplemento con cerveza sin alcohol (Tabla 6). Si expresamos los

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resultados en porcentaje, se observa una diferencia significativa de un 17% con p<0,005 despus del periodo de suplementacin (Figura 16). stos ponen de manifiesto el efecto que est ejerciendo el lpulo soble el dao inducido a lpidos y protenas. Tabla 6. Niveles medios de las sustancias que reaccionan con el cido tiobarbitrico procedentes de la peroxidacin lipdica (TBARS) y del contenido de grupos carbonilo (GC) antes y despus de la suplementacin con lpulo
Parmetros lpulo TBARS (nmol/mL plasma) GC (nmol/mg prot) Fase I 37,45 5,61 1,69 0,84 Valores medios Fase II 31,29 5,61 1,42 0,53

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con lpulo.

Figura 16. Niveles de las sustancias que reaccionan con el cido tiobarbitrico procedentes de la peroxidacin lipdica (TBARS) y el contenido de grupos carbonilo de las protenas (GC) antes y despus de la suplementacin con lpulo.
TBARS (nmol/mL plasma) (85)** GC (nmol/mg prot.) (83)**

120

% Respecto a su control

100 80 60 40 20 0

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. **P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

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5.3.2. DEFENSA ANTIOXIDANTE Hemos procedido a la determinacin de glutation eritrocitario antes y despus de la suplementacin. El papel principal lo ejerce a travs de su accin como scavenger de radicales libres. Consecuentemente, su disminucin nos indicar una formacin excesiva de radicales oxignicos con el consiguiente aumento del consumo de antioxidantes. Como podemos observar en los resultados, (Tabla 7) los valores medios previos a la suplementacin son de 1,51 0,31 respecto a 1,72 0,49 despus de la suplementacin. Expresado en porcentaje, comprobamos que se produce un aumento significativo de un 16%, p<0,005 respecto a su control (Figura 17). Respecto a los niveles plasmticos de -tocoferol observamos los resultados medios (Tabla 7), identificamos unas cifras iniciales de 56,97 10,05 con respecto a unas cifras finales de 63,25 10,48. En consecuencia, el cambio global es del 13% (p<0.005), lo que seala un ahorro en el consumo orgnico de sustancias antioxidantes como el -tocoferol (Figura 17). Tabla 7. Niveles medios de glutation (GSH) y -tocoferol antes y despus de la suplementacin con lpulo.
Parmetros lpulo GSH (mol/g Hb) -Tocoferol (nmol/ml plasma) Fase I 1,51 0,31 56,97 10,05 Valores medios Fase II 1,72 0,49 63,25 10,48

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con lpulo.

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Figura 17. Niveles de glutation y -tocoferol antes y despus de la suplementacin con lpulo.
GSH (mol/g Hb) (116)** -tocoferol (nmol/ml plasma) (113)**

140

% Respecto a su control

120 100 80 60 40 20 0

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. **P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

5.3.3. METABOLISMO LIPDICO Es factible consultar los niveles medios antes y despus de la suplementacin (Tabla 8) de todos los parmetros estudiados: triglicridos, colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol y LDL oxidada. En lo que respecta a los triglicridos (Figura 18), los valores iniciales medios (90,56 24,41 mg/dL) se convierten en 75,35 22,86 tras el periodo de suplementacin lo que representa una disminucin del 16% (p<0.005). En lo que respecta al colesterol total, las cifras iniciales (218,48 34,09) pasan a ser finalmente de 211,00 32,41, lo que significa una disminucin del 3% (p<0.05). Se modifican, asimismo, las cifras de HDL-c (Figura 19) (valores iniciales de 72,56 12,09 y finales de 70,96 12,97), lo que no conlleva una variacin significativa estadsticamente), de LDL-c (valores iniciales de 127,80 32,50 y finales de 124,97

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29,28), lo que conlleva una disminucin del 3% (p<0,05). Respecto a los niveles de anticuerpos frente a las LDL oxidadas, observamos unos valores medios iniciales 700 464 y finales de 602 406, lo que implica, cuando expresamos los resultados en muestras apareadas y porcentajes respecto a su control, una disminucin significativa de un 18% (p<0,005) (Figura 19). Tabla 8. Niveles medios de triglicridos, colesterol total, HDL-c, LDL-c y LDL oxidada antes y despus de la suplementacin con lpulo.
Parmetros lpulo Triglicridos (mg/dL) Colesterol (mg/dL) HDL (mg/dL) LDL (mg/dL) LDLoxidada (mU/mL) Fase I 90,56 24,41 218,48 34,09 72,56 12,09 127,80 32,50 700 464 Valores medios Fase II 75,35 22,86 211,00 32,41 70,96 12,97 124,97 29,28 602 406

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con lpulo.

Figura 18. Determinacin de los niveles de triglicridos y colesterol total antes y despus de la suplementacin con lpulo.
TG (mg/dL) (84)**
120

Col Total (mg/dL) (97)**

% Respecto a su control

100 80 60 40 20 0

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. **P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

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Figura 19. Determinacin de HDL colesterol, LDL colesterol y LDL oxidasa antes y despus de la suplementacin con lpulo.
HDL (mg/dL) (98)
120 100 80 60 40 20 0

LDL (mg/dL) (97)*

LDLox (mU/mL) (82)*

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. *P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

5.3.4. PARMETROS DE INFLAMACIN Se ha procedido a determinar como marcadores de inflamacin los complementos C3 y C4, la protena C reactiva (PCR), las interleukinas 1-a y 6 y el factor de necrosis tumoral (TNF-a). Los parmetros estudiados reflejan modificaciones en el caso de los factores de complemento C3 (con unos valores iniciales de 121,60 17,30 y unos valores finales de 106,44 13,40) y C4 (con unos valores iniciales de 19,00 7,50 y unos valores finales de 20,00 1,41),(Tabla 9). Cuando expresamos los resultados en porcentajes podemos observar una disminucin significativa de un 12%, no siendo significativa (p<0,005) para el C3, ni para el C4 (Figura 20).

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Destacamos como ms significativo lo ocurrido en el caso de la protena C reactiva (con unos valores iniciales de 3,83 2,63 y unos valores finales de 2,935 1,57), con una disminucin (Figura 20) de un 31% (p<0.005). La interleukina 6 (con unos valores iniciales de 2,91 0,85 y unos valores finales de 2,42 0,64) disminuye sus tasas (Figura 21) en un 13% (p<0.005). En el caso de la interleukina 1 (con unos valores iniciales de 77,02 16,28 y unos valores finales de 77,58 10,99) y del factor de necrosis tumoral (con unos valores iniciales de 21,29 9,4 y unos valores finales de 21,63 6,02), no se han producido cambios significativos (Figura 21). Tabla 9. Valores medios de los complementos C3 y C4, la protena C reactiva (PCR), interleukinas IL 1- e IL 6 y el factor de necrosis tumoral (TNF-) antes y despus de la suplementacin con lpulo.
Parmetros lpulo C3 (mg/dL) C4 (mg/dL) PCR (mg/dl) IL 1 - (pg/mL) IL-6 (pg/mL) TNF - (pg/mL) Fase I 121,60 17,30 19,00 7,50 3,83 2,63 77,02 16,28 2,91 0,85 21,29 9,4 Valores medios Fase II 106,44 13,40 20,00 1,41 2,935 1,57 77,58 10,99 2,42 0,64 21,63 6,02

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en media SD de 25 experimentos diferentes. Antes (Fase I) y despus (Fase II) de la suplementacin con lpulo.

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Figura 20. Niveles del factor C3, C4 del complemento y de la protena C reactiva antes y despus de la suplementacin con lpulo.
C3 (mg/dL) (88)**
120 100 80 60 40 20 0

C4 (mg/dL) (104)

PCR (mg/dL) (69)*

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. *P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II). **P<0.005 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

Figura 21. Niveles de interleukina 1- , interleukina 6 y TNF- antes y despus de la suplementacin con lpulo.
IL-1 (pg/mL) (99) IL-6 (pg/mL) (87)* TNF- (pg/mL) (104)

120 100 80 60 40 20 0

Fase I

Fase II

Diseo experimental en material y mtodos. Los resultados estn expresados en % respecto a su control (Fase I), de 25 experimentos diferentes. Para el clculo de la significancia estadstica se aplic el test de la t de Student para muestras apareadas. *P<0,05 Comparando el grupo control antes (Fase I) y despus de la suplementacin (Fase II).

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5.4. ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE LA SUPLEMENTACIN CON CERVEZA SIN ALCOHOL Y LPULO
En este estudio hemos puesto en evidencia el efecto de la cerveza sin alcohol y del lpulo sobre los diferentes parmetros medidos. Cuando hacemos la correlacin entre los resultados analticos obtenidos tras la suplementacin con cerveza sin alcohol y con lpulo (Tabla 10) observamos diferencias que son significativas en varios de los parmetros considerados. As ocurre en los niveles de triglicridos y en los parmetros marcadores de inflamacin. En el primer caso, la diferencia es claramente significativa (con una p<0,005). En lo que respecta a los datos de inflamacin, existen tambin diferencias en lo relativo al factor C3 del complemento (p<0,005) y a la protena C reactiva (p<0,005), siempre y en todos los casos de forma favorable al lpulo. Sin embargo, en lo que respecta a la posible aplicacin prctica de estos resultados, lo ms sencillo parece decantarse hacia el uso de la cerveza sin alcohol dada la facilidad de su consumo y el volumen que puede ingerirse de la misma sin incomodidad. Adems, no presenta prcticamente contraindicaciones en su ingestin por parte de adultos de todas las edades. Por el contrario, el lpulo nicamente podra formar parte de la dieta en su presentacin farmacutica (cpsulas, etc.) lo que restringira sin duda su uso. En cualquier caso, dada la cantidad de lpulo presente en la cerveza (y, por lo tanto, de sus principios activos), es probable que las consecuencias de la ingestin de esta bebida sobre la fisiologa se deban ms a componentes derivados de los cereales que a los del propio lpulo, aun siendo estos importantes. Esto no obsta para que sea posible y an recomendable aumentar la capacidad antioxidante de las cervezas recurriendo a diferentes tcnicas cerveceras y a lpulos especialmente seleccionados con este fin.

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Tabla 10. Estudio comparativo entre la cerveza sin alcohol y el lpulo.

Metabolismo oxidativo TBARS ND Grupos carbonilo ND GSH ND -tocoferol ND Metabolismo lipdico Colesterol total ND Triglicridos P<0,005 HDL-c ND LDL-c ND LDLoxidada ND Parmetros de inflamacin C3 P<0,005 C4 ND PCR P<0,005 IL-1 ND IL-6 ND TNF- ND

Se reflejan en la Tabla lo significativo de la diferencia entre las determinaciones del Estudio tras la suplementacin con cerveza sin alcohol y lpulo. ND: diferencia no significativa.

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s DISCUSIN

En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la suplementacin de la dieta, tanto con cerveza sin alcohol como con cpsulas de lpulo (Elusan), en un colectivo dietticamente controlado, y su relacin con el metabolismo oxidativo, y con parmetros indicadores de riesgo cardiovascular y de inflamacin propios de la edad avanzada. De los resultados de nuestro trabajo se deduce un papel antioxidante in vivo de la cerveza sin alcohol y del lpulo. La primera consecuencia que se deriva de ello es que los posibles beneficios obtenidos del consumo moderado de ciertas bebidas alcohlicas fermentadas (cerveza, vino, sidra) que se han referido en estudios anteriores, no se deben exclusivamente a la presencia del alcohol en estas bebidas, si bien estn documentados los efectos especficos del alcohol sobre ciertos parmetros, como por ejemplo sobre los marcadores de inflamacin en adultos sanos (Mulkamal, 2004). Existen otros compuestos, como los polifenoles y las melanoidinas, en el caso de la cerveza, que son responsables, al menos, de una parte significativa de sus efectos. Es decir, el consumo moderado de las versiones sin alcohol de estas bebidas, en el contexto de una dieta variada y equilibrada, puede tener un efecto beneficioso ante el estrs oxidativo y patologas relacionadas. El envejecimiento es un proceso degenerativo, en el cual participan los radicales libres, y por ello relacionado con patologas tales como problemas cardiovasculares, trastornos neurolgicos, procesos inflamatorios, hipertensin, diabetes, cncer, etc., en las que tambin est implicado el estrs oxidativo (Dalle-Donne et al., 2006, Sarkar y Fisher, 2006).

6.1. METABOLISMO OXIDATIVO

En lo que respecta a los datos obtenidos en este estudio, tras la suplementacin con cerveza sin alcohol se produce una disminucin significativa en el dao indu-

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cido a macromolculas: lpidos y protenas, y un aumento significativo en la defensa antioxidante: niveles de glutation reducido (GHS) y alfa-tocoferol. Dichos resultados obtenidos en humanos estn corroborados por otros estudios realizados en nuestro grupo, en experimentacin animal, con suplementos de cerveza y extractos flavonoideos de la harina de la semilla de uva tras la induccin de un estrs oxidativo a consecuencia de la adriamicina (Gonzlez-SanJos et al., 2001; Valls et al., 2005) y a los obtenidos por otros autores (Navarro, 2003; Ameen, 2004; Sahin, 2004; Husain, 2005). Cuando suplementamos con lpulo obtenemos resultados similares a los de la cerveza, lo que nos indica que existen compuestos con actividad antioxidante que se encuentran especficamente en esta leguminosa. Hay evidencias de que, en animales, los flavonoides se localizan cerca de la superficie de la membrana lipdica para captar los radicales libres y por ello, previenen a sta de la peroxidacin lipdica a consecuencia de radicales oxignicos acuosos (Terao, 1994). Adems, parece demostrada la hiptesis (Verstraeten, 2003) de que las proantocianidinas, precisamente uno de los flavonoides ms abundante en la cerveza, podran ser absorbidas por las membranas celulares, crendose as un medio que limitara el acceso a las especies radicales a la membrana as como su consiguiente propagacin. Esta relacin entre el consumo de alimentos o bebidas ricas en polifenoles y el aumento significativo de la capacidad antioxidante del plasma y del contenido de polifenoles en el mismo (Serafini, 1998; Wang, 2000; Rechner, 2002) ha sido previamente documentado por diversos autores, incluyendo su capacidad de inhibir la peroxidacin lipdica y de captar radicales libres como el radical hidroxilo, in suproxido y radical alcoxilo (Sichel y col., 1991). De hecho, los efectos de la ingestin de alimentos ricos en compuestos fenlicos, como fresas, espinacas, vino tinto, cerveza, etc., se pueden evaluar a corto plazo ya que aumentan de forma evidente la capacidad antioxidante del suero (Cao y col., 1998; Velioglu y col., 1998; Khknen y col., 1999), lo que explica en definitiva el creciente inters cientfico por el papel

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diettico de alimentos y bebidas ricos en estos compuestos (Hertog y col., 1995). Dentro de las bebidas que contienen polifenoles hay que destacar la cerveza, cuya actividad antioxidante global oscila entre unos valores mnimos y mximos comprendidos en el intervalo 2-56 mg segn la capacidad antioxidante equivalente a la vitamina C (CEAC). Estos resultados indican que se trata de una bebida con una capacidad antioxidante global significativa, ya que posee valores similares a otras bebidas alcohlicas, como el vino, y no alcohlicas, como el mosto. De los estudios realizados se desprende que el tipo de cerveza no influye en el poder antioxidante, ya que cervezas negras, rubias y sin alcohol presentan valores similares (Gonzlez San Jos et al., 2001). Cuando nos referimos a la capacidad antioxidante de los polifenoles de la cerveza sin alcohol, es habitual referirse al problema de su biodisponibilidad. En nuestro caso, esta absorcin de los polifenoles viene corroborada por trabajos anteriores de nuestro mismo grupo y de otros realizados con cerveza con y sin alcohol. As, sabemos que los polifenoles junto con alcohol pasan ms rpidamente al plasma que cuando proceden de un producto sin alcohol (Lee, 1995; Unno, 1996; Hollman y Katan, 1998; Kivits, 1997; Aziz, 1998; Williamson, 2000). Evaluando la capacidad antioxidante total del plasma en diferentes tiempos (30, 60 y 90 minutos) tras la suplementacin con un concentrado de cerveza a animales de experimentacin (Valls et al., 2004), se observaba que la actividad antioxidante total era significativamente mayor a los 90 minutos de la ingestin de la cerveza. Estos datos estn en concordancia con los datos aportados por Miyagi y colaboradores y Giselli y colaboradores los cuales han demostrado que la cerveza sin alcohol muestra una ligera tendencia a incrementar la actividad antioxidante a los 90 minutos. Sin embargo, durante los primeros 30 minutos, al igual, que ocurre en otros estudios, no existen diferencias entre cerveza con alcohol o sin alcohol. A los 60 minutos hay un menor aumento para la actividad cuando la cerveza es sin alcohol, pero la actividad se recupera e, incluso, aumenta a partir de los 90 minu-

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tos (Miyagi, 1997; Ghiselli, 2000; Gorinstein, 2004). Nardini et al. encontraron que esta absorcin de cidos fenlicos se realiza mediante conjugacin, dependiendo su grado de la forma qumica de estos polifenoles: los monohidroxiderivados requieren una conjugacin menos intensa que los dehidroxiderivados (Nardini et al., 2006).

6.2. METABOLISMO LIPDICO

La consecuencia clnica del aumento de lpidos en sangre est relacionada con la posibilidad de desarrollo de lesin vascular. De hecho, el dao vascular puede tener un profundo impacto sobre distintas funciones orgnicas y acabar produciendo numerosas patologas vinculadas a la edad (diabetes, aterosclerosis, hipertensin, etc.). Las clulas endoteliales de los vasos, debido a su localizacin, son especialmente vulnerables a las sustancias circulantes agresivas como, por ejemplo, las macromolculas oxidadas y las citoquinas proinflamatorias. La disfuncin endotelial puede aumentar cuando el estrs oxidativo reduce la disponibilidad de xido ntrico (NO), siendo este un factor esencial para el adecuado tono vascular. En nuestro estudio, observamos que en los niveles de triglicridos no se producen cambios significativos tras el periodo de suplementacin con cerveza sin alcohol. Tampoco se observaron cambios en los niveles de colesterol total, excepto cuando los niveles de colesterol en los sujetos eran superiores a 240 mg/dL, s podamos observar una disminucin significativa de un 6%, lo que nos indicara que la cerveza sin alcohol est ejerciendo un efecto sobre la hipercolesterolemia. Resultados que vienen corroborados por otros estudios (Gasowski et al., 2004, Winkler et al., 2006). Para algunos autores, su efecto sera incluso similar al del vino tinto (Kondo, 2004).

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En este punto hay que sealar que Degrace et al., en 2006, afirma que dosis moderadas de cerveza ingeridas de forma continuada poda tener un efecto beneficioso frente al desarrollo de la aterosclerosis (Degrace et al., 2006). Adicionalmente a los niveles elevados de colesterol sanguneo, la presencia de LDL oxidada se ha revelado como la clave del desarrollo de la aterosclerosis (Podrez et al., 2000). Las lipoprotenas oxidadas se han vinculado con la formacin de superxidos. Respecto a los niveles de LDL oxidada, s que se observaba con la suplementacin con cerveza sin alcohol una disminucin de un 8% respecto a su control (p<0,05). Esto nos podra indicar que la cerveza sin alcohol protege a las LDL de su oxidacin, lo que puede tener inters dado que esta lipoprotena es un importante factor de riesgo en la patologa cardiovascular. No conviene olvidar que la capacidad antioxidante de la cerveza sobre las lipoprotenas es mayor que cuando se estudia este efecto con polifenoles extrados de la cerveza, lo que sugiere una posible sinergia entre las sustancias naturalmente presentes en la bebida, como podran ser el caso de los folatos (Vinson et al., 2003). Cuando suplementamos con lpulo, pudimos observar una disminucin significativa (p<0,005) en los niveles de triglicridos y en el colesterol total (p<0,05). Este hallazgo ha sido confirmado por otros autores, como Shimura, que realizaron estudios utilizando animales de experimentacin y comprobando en ellos cmo el lpulo reduca los niveles de triglicridos plasmticos (Shimura et al., 2005), sugiriendo incluso que este efecto podra deberse a la accin reguladora del lpulo sobre la expresin de genes implicados en la oxidacin heptica de los lpidos. Las lipoprotenas HDL-c no experimentaban modificaciones significativas, pero s es cierto que en lo que respecta a las LDL-c hay una disminucin significativa (p<0,05) del 3% que llega hasta el 18% cuando se considera a la LDL oxidada (p<0,005). En experimentacin animal, este efecto no se ha confirmado por otros autores que s lo han hecho en relacin con el efecto sobre las HDL-c incremen-

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tando sus concentraciones (Miura et al., 2005) o, ms genricamente, mejorando el metabolismo lipdico (Kondo, 2004). A este respecto, recordemos que es conocida la habilidad de los polifenoles para reducir la sensibilidad de los lpidos a la oxidacin. As, la ingestin de zumo de uva ha demostrado que reduce la susceptibilidad de la LDL a oxidarse en pacientes con enfermedad coronaria (Stein et al., 1999). Tambin hay evidencias concluyentes, in vitro, del efecto del extracto de vino tinto, vino blanco, mosto y cerveza sobre la inhibicin de la oxidacin de la LDL-c (Puddey et al., 1998), una inhibicin que es proporcional al contenido de polifenoles de las bebidas citadas y que coincide con la hallada por otros autores que detallaron la inhibicin de la oxidacin de la LDL por el resveratrol (Frankel et al., 1993). Hemos hallado referencias al posible efecto positivo de diferentes tipos de cerveza, incluyendo las cervezas sin alcohol, sobre ciertos parmetros del metabolismo lipdico (Winkler et al., 2006). Tambin en este caso se plantean discordancias al haberse publicado estudios donde no se observaban modificaciones en la oxidacin de la LDL pese a la ingestin de polifenoles (Zenebe et al., 2003). Esto nos hace suponer que el efecto de los polifenoles sobre la oxidacin de la LDL puede variar en funcin de su estructura, el tipo de dieta, la dosis ingerida y otros factores an no bien conocidos. A este respecto, los estudios epidemiolgicos han mostrado una correlacin inversa entre el contenido en polifenoles de la dieta y un menor riesgo de enfermedades cardiovasculares (Ulbricht y Southgate, 1991; Curin y Andriantsitohaina, 2005).

6.3. PARMETROS MARCADORES

DE INFLAMACIN

En personas de edad avanzada se han observado, en plasma, concentraciones ms elevadas de sustancias como las interleukinas (IL-1, IL-6) y el factor de

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necrosis tumoral (TNF) que en el de personas ms jvenes (Pedersen et al., 2000). En nuestro trabajo, observamos que no se producen cambios significativos en los factores de complemento (C3 y C4), protena C reactiva (PCR), interleukinas 1- y 6 y factor de necrosis tumoral (TNF-), tras la suplementacin con cerveza sin alcohol. Cuando la suplementacin la realizamos con lpulo, los parmetros estudiados reflejan modificaciones en el caso de los factores de complemento C3 y C4, significativamente (p<0,005) en el caso del C3, con una disminucin del 12%, y no significativamente en el C4. Ms significativo an es lo ocurrido en el caso de la protena C reactiva, la cual disminuye en un 31% (p<0,005). La interleukina 6 disminuye sus tasas en un 13% (p<0,005) sin que haya cambios apreciables en el resto de los parmetros. Los polifenoles pueden disminuir algunos marcadores de inflamacin como son TNF-, IL-1 e IL-6 (Eugui et al., 1993) o aumentar los antagonistas de ciertos receptores como los de IL-1 (Waters et al., 1993). Tambin que la suplementacin mediante extractos vegetales ricos en polifenoles pueden inhibir la formacin de TNF- (Yuan et al., 2006; Zi et al., 1997). En relacin con todo esto, sabemos desde tiempo atrs que la presencia en la dieta de ciertos antioxidantes, entre ellos los polifenoles, puede tener una actividad antiinflamatoria (Manthey et al., 2001), tal vez al modular la produccin de xido ntrico a partir del endotelio vascular as como por interferir en los mecanismos de inflamacin que conduciran a la disfuncin endotelial (Curin y Andriantsitohaina, 2005). De hecho, tanto la ciclooxigenasa (COX) como la lipooxigenasa estn implicadas en la liberacin de cido araquidnico, el cual es responsable de la produccin, por parte de clulas inflamatorias como los neutrfilos, de citoquinas como la IL-1. Algunos polifenoles, como la quercetina, han demostrado que son capaces de inhibir la ciclooxigenasa y lipooxigenasa

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(Kim et al., 1998). Otro polifenol, como el resveratrol, pueden tener una accin antiinflamatoria al inhibir la sntesis de prostaglandinas (Martnez y Moreno, 2000). En lo que respecta al posible papel de la cerveza sobre los parmetros de inflamacin, algunos autores afirman haber encontrado en sus estudios evidencias suficientes (Winkler et al. en 2006 y Gasowski et al. en 2004) de su actuacin. Para Levitan et al., el efecto sobre la PCR (en forma de U en su representacin grfica de la correlacin inversa que se dara entre ingestin de alcohol y PCR) se debera exclusivamente a la presencia de alcohol en la dieta, siendo adems este efecto independiente del tipo de bebida (Levitan et al., 2005). Es la misma conclusin a la que lleg Imhof en 2004 al estudiar los marcadores de inflamacin en tres diferentes regiones europeas dentro del estudio MONICA (Imhof et al., 2004). Los datos de nuestro trabajo ponen de manifiesto que otros compuestos, diferentes al alcohol, ejercen un papel significativo sobre los marcadores de inflamacin, estando estos compuestos, principalmente contenidos en el lpulo.

6.4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE COMPARADA DE LA CERVEZA SIN ALCOHOL Y DEL LPULO

Si comparamos ambos resultados, observamos como la suplementacin con cerveza sin alcohol modifica los parmetros marcadores del metabolismo oxidativo y lipdico (LDL oxidada), mientras que tras la suplementacin con lpulo se modifican, adems, otros parmetros del metabolismo lipdico (triglicridos, colesterol total y LDL), y parmetros de inflamacin, tales como: factor de complemento C3, protena C reactiva, interleukina 6. Cuando se correlacionan ambos resultados (Tabla 10), se comprueba que la diferencia entre ambos modos es significativa, a favor del lpulo, nicamente en

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lo que respecta a los resultados de triglicridos, protena C reactiva y factor C3 del complemento. Dichos resultados nos indican que en el caso del lpulo, materia prima de la cerveza, existen componentes que no se extraen en el transcurso del proceso tecnolgico de produccin cervecera. Estas sustancias pueden jugar un papel importante en determinadas patologas. En cualquier caso, las diferencias existentes entre cerveza y lpulo no son finalmente tan considerables, teniendo en cuenta adems que se trata de un proceso de extraccin, y que, por otra parte, la cerveza es una bebida de un gran consumo y de ms fcil ingestin que el lpulo.

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s CONCLUSIONES

Basndonos en los datos obtenidos en este estudio estadstico llegamos a las conclusiones que se enumeran a continuacin: 1. En las condiciones de nuestra investigacin, tanto la ingestin de cerveza sin alcohol como la de lpulo conllevan beneficios sobre el metabolismo oxidativo, aumentando las concentraciones de GSH y -tocoferol y disminuyendo el dao inducido a lpidos y protenas. 2. Respecto al metabolismo lipdico, la ingestin de cerveza sin alcohol disminuye los niveles de colesterol total (en aquellos sujetos que tenan tasas de colesterol, al inicio, superiores a 240 mg/dL) as como los niveles de LDL oxidada. Por su parte, el lpulo disminuye, adems, los niveles de triglicridos, colesterol total y de las LDL colesterol. 3. En lo que se refiere a los parmetros de inflamacin, la ingestin de cerveza sin alcohol no produce ningn efecto. En cambio, la suplementacin con lpulo conlleva beneficios sobre ciertos parmetros marcadores de inflamacin, disminuyendo las concentraciones de la fraccin C3 del complemento, la protena C reactiva y la interleukina 6. 4. El consumo regular, en el contexto de una dieta equilibrada, de cerveza sin alcohol puede ser beneficioso al disminuir alguno de los factores de riesgo cardiovascular (LDL-oxidadas). Este beneficio puede manifestarse tanto en el mbito de la prevencin como al incorporarse en la dieta de los pacientes dislipmicos.

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5. El efecto beneficioso sobre la salud atribuido a las bebidas tradicionales fermentadas, y en este caso a la cerveza, no se debe nicamente a la presencia de alcohol sino, fundamentalmente, a su contenido en antioxidantes. 6. Para mejorar la capacidad antioxidante de la cerveza sin alcohol, los fabricantes deberan controlar los procesos tecnolgicos para obtener una mejor extraccin de estos compuestos, con actividad oxidante, procedentes del lpulo. 7. En una dieta adecuada, el consumo de cerveza sin alcohol por parte de adultos sanos puede contribuir a la reduccin de patologas asociadas con la edad y, por lo tanto, conseguir un envejecimiento ms saludable.

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El Centro de Informacin Cerveza y Salud recomienda en todo momento un consumo responsable de cerveza