Introduo

O espermograma o foco central da avaliao laboratorial para o homem com queixa de infertilidade. Embora no seja um teste de funo espermtica, esse exame fornece informaes sobre a atividade germinativa, a atividade dos epiddimos e a atividade das glndulas sexuais acessrias. Os resultados do espermograma so frequentemente utilizados como marcadores da fecundidade masculina e das chances de se estabelecer uma gravidez. de fundamental importncia, portanto, que o exame seja executado por profissionais bem treinados e realizado num laboratrio de andrologia com rigoroso controle de qualidade (Figura 1). A acurcia e a reprodutibilidade dos resultados fornecidos pelo laboratrio facilitam ao clnico estabelecer a melhor linha diagnstica e teraputica2. Apesar disso, o valor prognstico das variveis seminais, como concentrao, motilidade e morfologia espermtica, como marcadores de fecundidade limitado. O potencial frtil do homem influenciado pela atividade sexual, pelo estado das glndulas sexuais acessrias e por fatores definidos, como estado de sade geral, uso de medicamentos, drogas ilcitas, tabagismo e lcool, alm de outros desconhecidos.

Figura 1. Visao geral do laboratorio de andrologia. O laboratrio deve possuir equipamentos e instrumentos especificos e em quantidade necessaria ao atendimento de sua demanda, manter manuais tecnico-operacionais referentes aos equipamentos e procedimentos realizados facilmente acessiveis aos funcionarios do setor, implementar e manter um programa de manutencao preventiva e corretiva, alem de manter os equipamentos calibrados.

Os valores de referncia para as variveis rotineiramente analisadas no smen foram recentemente atualizados pela Organizao Mundial da Sade (OMS)3. Na Tabela 1, encontram-se os valores de referncia publicados em edies anteriores consecutivas dos manuais da OMS3-6. Embora esses valores sejam largamente utilizados para diferenciar homens frteis e subfrteis, existe ampla variao de fertilidade mesmo nos homens com parmetros anormais. Os valores de referncia utilizados pelo manual da OMS publicado em 2010 foram estabelecidos com base em resultados de anlises seminais de um grupo de aproximadamente dois mil homens de oito pases, que foram capazes de engravidar suas parceiras

por via natural at um ano aps o trmino da contracepo7. Os valores dos parmetros espermticos desses homens foram distribudos em uma curva, gerando valores mdios e intervalos de confiana para diversos percentis. Estabeleceram-se como valores de referncia aqueles obtidos no percentil 5, ou seja, 95% dos indivduos considerados frteis possuam anlises seminais cujos parmetros espermticos eram maiores ou iguais aos observados nesse percentil (Tabela 1)3,7. Os valores de referncia indicados no novo manual da OMS no devem, portanto, ser utilizados para uma distino rgida entre homens frteis e infrteis, embora sirvam como um guia padronizado para auxiliar na avaliao das chances de concepo8. Valores abaixo dos limites estabelecidos podem sugerir a necessidade de tratamento, embora no tenham poder discriminatrio para determinar a natureza desse tratamento. Entre os parmetros espermticos, nenhum deles foi capaz de, isoladamente, distinguir entre os grupos de homens que obtiveram gravidez daqueles que no o fizeram, embora a morfologia espermtica tenha sido o parmetro mais representativo. Os resultados da anlise seminal de um paciente devem ser interpretados em conjunto com as informaes clnicas. Coleta do smen O local de coleta tem efeito direto sobre os parmetros seminais, especialmente sobre o volume ejaculado. Preferencialmente, a amostra seminal deve ser colhida em uma sala silenciosa, isolada, limpa, com banheiro anexo e prxima ao laboratrio onde ser realizada a anlise (Figura 2). A coleta domiciliar pode ser autorizada em casos especiais, desde que o material chegue ao laboratrio em no

mximo uma hora e que cuidados sejam tomados durante seu transporte at o laboratrio9. Os parmetros seminais so influenciados por temperaturas abaixo de 25 C ou acima de 37 C. Quando isso ocorrer, os resultados obtidos podem no ser confiveis. O modo preferencial de coleta a masturbao. A coleta por coito interrompido no indicada, pois pode haver perda da primeira frao do ejaculado ou contaminao da flora vaginal. Em casos selecionados, pode-se autorizar a coleta pelo ato sexual utilizando preservativo atxico (ex.: Male-Factor Pak). Nos portadores de leso medular, a coleta pode ser realizada por vibroestimulao ou por eletroejaculao. Nos casos de ejaculao retrgrada, o paciente deve ser orientado quanto alcalinizao prvia da urina obtida pela ingesto oral de bicarbonato de sdio. O smen deve ser colhido utilizando-se um frasco estril, descartvel, composto de polipropileno, de boca larga (cerca de sete centmetros de dimetro) e com tampa de rosca. O laboratrio sempre deve fornecer o frasco coletor, cujo lote previamente testado quanto toxicidade do plstico sobre a motilidade espermtica (Figura 3).

Figura 2. Visao geral da sala utilizada para coleta de semen. De acordo com a Resolucao da Diretoria Colegiada no 23 da Anvisa, a sala de coleta de semen deve garantir o conforto e a privacidade do paciente e possuir um sanitario com acesso exclusivo.

Figura 3. Frasco coletor comumente utilizado para a coleta de semen. O frasco deve ser esteril, de boca larga e testado quanto a toxicidade do plastico para a motilidade espermatica.

Os parmetros espermticos avaliados rotineiramente so influenciados pelo tempo de abstinncia ejaculatria antes da coleta, pelo mtodo de coleta, pela

temperatura e pelo tempo entre a ejaculao e o incio da anlise. Em razo da variabilidade biolgica entre espermogramas de um mesmo paciente, pelo menos dois exames devem ser realizados antes de se estabelecer alguma concluso diagnstica2. O intervalo recomendado entre os exames arbitrrio, e geralmente se situa entre 7 e 15 dias. O tempo de abstinncia ejaculatria antes da coleta deve ser de dois a sete dias3. Anlise seminal O espermograma de rotina deve abranger: (a) caractersticas fsicas do smen, que incluem coagulao, liquefao, viscosidade, aspecto, cor e pH; (b) volume da amostra; (c) avaliao microscpica, espermtica que total inclui e a concentrao de

espermatozoides,

motilidade

progressiva,

vitalidade

espermtica, morfologia espermtica e quantificao do nmero de leuccitos. Avaliao macroscpica das caractersticas fsicas do smen Imediatamente aps a ejaculao, o smen normal forma um cogulo semelhante a um gel, em razo da presena de protenas secretadas pelas vesculas seminais (semenogelina, fibronectina e lactoferrina). A ausncia de coagulao indica a inexistncia ou a deficincia das protenas que formam o cogulo e pode ocorrer nos casos de obstruo dos dutos ejaculatrios, ausncia congnita ou disfuno das vesculas seminais. A liquefao do cogulo seminal um processo enzimtico e a principal enzima envolvida o antgeno prosttico especfico (PSA). Depois da observao da presena ou no do cogulo, o frasco com a amostra seminal pode ser colocado

em uma estufa, temperatura de 37 C, ou permanecer temperatura ambiente, para que ocorra a liquefao. O tempo mdio para a liquefao completa de 15 a 30 minutos. Caso ela no ocorra em at 60 minutos, classifica-se a liquefao como incompleta, podendo ter ocorrido alteraes prostticas. Amostras normalmente liquefeitas podem conter corpsculos gelatinosos que no se dissolvem; estes no apresentam nenhum significado clnico. A viscosidade do smen deve ser avaliada aps a liquefao, com o auxlio de uma pipeta sorolgica de 5 ml. A viscosidade considerada normal quando a amostra, ao sair da pipeta por ao somente da fora da gravidade, goteja ou forma um filamento com extenso inferior a 2 cm. Quando o filamento formado for superior a 2 cm, a viscosidade descrita como aumentada. O aspecto do smen modificado medida que os processos de coagulao e liquefao acontecem. Imediatamente aps a coleta, a amostra seminal tem aspecto heterogneo, espesso e gelatinoso, tornando-se opalescente, homogneo e mais fludo aps a liquefao. As coloraes branca ou acinzentada so consideradas normais. Alterao na cor pode indicar doenas locais ou sistmicas (infeco, hepatite) ou ainda uso de medicamentos (antibipticos, antisspticos urinrios ou vitaminas).

A colorao avermelhada, em razo da presena de hemcias, conhecida por hematospermia e pode resultar de um processo inflamatrio, obstruo ou cistos nos dutos ejaculatrios, neoplasias, anormalidades vasculares, entre outros9.

O pH seminal resultado da mistura das secrees das vesculas seminais (pH alcalino) e da prstata (pH cido). O valor normal do pH seminal 7,2. Aps a colheita, o frasco com a amostra seminal deve permanecer bem fechado para evitar evaporao do CO2 da amostra e alterao do sistema tampo. A determinao do pH rotineiramente realizada utilizando-se papel de indicador de pH. Volume O volume seminal depende primariamente das glndulas sexuais acessrias, sendo aproximadamente 60% proveniente das vesculas seminais, 30% da prstata, 5% de secrees do epiddimo, glndulas de Cowper e de Littr, e 5% de elementos figurados (espermatozoides, clulas germinativas, leuccitos etc.). De acordo com a mais recente verso do manual da OMS3, o volume seminal deve ser avaliado pela sua densidade. Assim, o frasco coletor pesado antes e depois da coleta. Sabendo-se que a densidade do smen de 1 g por ml, calcula-se o volume pela diferena entre as pesagens. Para simplificar, o volume seminal pode ser medido com auxlio de uma pipeta sorolgica graduada de 5 ml, com intervalo de 0,1 ml, aspirando-se toda amostra colhida aps a liquefao. A diminuio do volume seminal (hipospermia) pode estar relacionada obstruo dos dutos ejaculatrios ou ausncia congnita das vesculas seminais, obstruo das vesculas seminais, ejaculao retrgrada, disfuno das glndulas sexuais acessrias e ao hipogonadismo1,2.

Outros fatores, tais como perda de parte da amostra durante a coleta, ejaculao parcial em razo de orgasmo incompleto, perodo de abstinncia inadequado e estresse, tambm podem diminuir o volume do ejaculado colhido.

Avaliao microscpica das caractersticas do smen Agregao e aglutinao Aps a anlise macroscpica, realiza-se a avaliao microscpica inicial quanto presena de agregao e de aglutinao. Para isso, 20 L do smen liquefeito so colocados sobre uma lmina de microscopia e recobertos com lamnula. Avalia-se a alquota sob microscopia ptica com contraste de fase utilizando magnificao de quatrocentas vezes. Existem dois tipos de aglutinao: (i) inespecfica (tambm conhecida como agregao, em que se observam espermatozoides imveis aderidos a clulas ou debris celulares); (ii) especfica (espermatozoides aderidos uns aos outros). Esta ltima sugestiva da presena de anticorpos antiespermatozoides10. Motilidade espermtica A motilidade definida como o movimento espontneo dos espermatozoides. A determinao do percentual de espermatozoides mveis e sua progresso realizada manualmente ou por meio da utilizao de sistemas computadorizados. Na avaliao manual, uma alquota do smen liquefeito avaliada sob microscopia ptica, com contraste de fase, utilizando-se aumento de duzentas ou quatrocentas vezes, e, preferencialmente, sob condies controladas de temperatura, a 37 C (placa aquecedora acoplada ao microscpio).

Os espermatozoides podem ser classificados de acordo com trs padres de motilidade (OMS, 2010), a saber: . motilidade progressiva; . motilidade no progressiva; . imveis. Idealmente, a avaliao da motilidade espermtica deve ser realizada com a utilizao de cmaras apropriadas, que possuem profundidade conhecida (ex.: Makler, Horwell, Microcell) e permitem a livre movimentao dos

espermatozoides (Figura 4). Pelo menos duzentas clulas so avaliadas, e o clculo final expresso em termos percentuais. De maneira alternativa, pode-se avaliar a motilidade com o uso de lmina e lamnula. Para tanto, deposita-se cerca de 10 L de smen liquefeito sobre lmina de microscopia, aquecida a 37 C, e cobre-se com lamnula. Inicialmente, contam-se os espermatozoides que exibem motilidade progressiva em um campo aleatrio. A seguir, contam-se os que exibem motilidade no progressiva, bem como os imveis, no mesmo campo visual. O processo realizado em duplicata e, ao final, a mdia utilizada para estabelecer o percentual de espermatozoides mveis (motilidade total) e daqueles com motilidade progressiva. Concentrao espermtica A concentrao espermtica definida como o nmero de espermatozoides em milhes por mililitro de smen (x106 por ml), devendo ser determinada pela diluio volumtrica associada hematocitometria. A contagem dos

espermatozoides deve ser realizada por meio de uma cmara de Neubauer

modificada, que apresenta, na verdade, duas cmaras, uma superior e outra inferior. Cada uma possui 0,100 mm de profundidade e um retculo central contendo 25 quadrados grandes, cada um com 16 quadrados menores (Figura 5). Para se determinar a concentrao espermtica, conta-se o nmero de espermatozoides presentes nos 25 quadrados grandes (cinco fileiras) de ambas as cmaras, obtendo-se a mdia entre as duas contagens. Utiliza-se microscopia ptica comum com magnificao de duzentas vezes para a observao dos espermatozoides. Para que os resultados sejam validados, a diferena entre as contagens das duas cmaras no deve exceder 1/20 da sua soma. Caso isso ocorra, necessrio homogeneizar novamente a diluio e repetir o procedimento. A concentrao de espermatozoides em milhes por mililitro resultante da mdia daqueles contados pelo fator de diluio da cmara (Tabela 2). A contagem total (do ejaculado) obtida multiplicando-se o valor da concentrao de espermatozoides pelo volume da amostra seminal, e o resultado expresso em milhes de espermatozoides por ejaculado. Morfologia espermtica A morfologia definida pela forma e pelo aspecto dos espermatozoides. Entre os vrios sistemas de classificao morfolgica, o recomendado pelo manual da OMS3 o critrio estrito de Tygerberg, descrito em 1986 por Kruger et al., que emprega a anlise morfomtrica para a determinao do padro de normalidade: segmento ceflico com forma oval e lisa (possuindo de 5 m a 6 m de comprimento e de 2,5 m a 3,5 m de largura, quando corados pela colorao do Diff-Quick ou panptico), com acrossomo compreendendo de 40% a 70% do segmento ceflico.

A pea intermediria deve ser delgada, com menos de 1 m de largura, comprimento aproximado de 1,5 vez o tamanho do segmento ceflico e no apresentar nenhum defeito. A cauda deve ser uniforme, levemente mais fina que a pea intermediria, com comprimento aproximado de 45 m, sem defeito, como cauda enrolada, quebrada ou curta. Pelo critrio de Kruger, as formas limtrofes so consideradas anormais (Figura 6).

Figura 4. Camaras de contagem utilizadas para analise da motilidade espermatica: (a) camara de Makler; (b) Microcell; (c) Horwell.

Figura 5. Camara de Neubauer modificada (a esquerda). No centro, ilustracao representando seu reticulo central, que contem 25 quadrados subdivididos em 16 quadrados menores. A direita, fotomicrografia mostrando um dos 25 quadrados do reticulo central da camara, delimitado por linhas triplas e contendo 16 quadrados menores, nos quais se observam os espermatozoides.

A anlise da morfologia realizada preparando-se um esfregao com 5 l de smen liquefeito. A lmina de microscopia utilizada para a confeco do esfregao deve ser previamente limpa com lcool 70%, e, aps a fixao e colorao (Figura 7), no mnimo duzentos espermatozoides so contados e classificados como normais e anormais. Para a anlise morfomtrica, avaliam-se as dimenses e o aspecto dos espermatozoides sob magnificao de mil vezes (imerso), com o auxlio de um micrmetro acoplado ocular do microscpio ptico. O resultado expresso em porcentagem de formas ovais normais (Figura 8). Em relao s formas anormais, recomenda-se calcular o percentual de espermatozoides exibindo defeitos no segmento ceflico, na pea intermediria e na cauda, bem como aqueles com excesso de citoplasma residual (Figuras 9, 10 e 11)3. Vitalidade espermtica O teste rotineiramente empregado para a avaliao da vitalidade espermtica utiliza o corante supravital eosina. Espermatozoides vivos apresentam membrana plasmtica ntegra e no permitem a passagem da eosina para o interior da clula (espermatozoide no corado). O mesmo no ocorre com espermatozoides mortos, cujas membranas no esto intactas (espermatozoide corado de rosa). Pelo menos duzentos espermatozoides so avaliados utilizando-se microscopia ptica com objetiva de imerso (magnificao de mil vezes) (Figura 12). De acordo com o manual da OMS3, a determinao da vitalidade espermtica deve ser realizada apenas quan do a porcentagem de espermatozoides imveis for superior a 60%.

Figura 6. Desenho esquematico do espermatozoide humano visto a microscopia optica, com as medidas utilizadas na avaliacao morfometrica, segundo o criterio estrito de Tygerberg (quadro a esquerda). No centro e a direita, ilustracoes representando os defeitos morfologicos mais comuns.

Concentrao de clulas redondas e leuccitos Normalmente, a amostra seminal possui outros elementos celulares alm dos espermatozoides, como clulas epiteliais do trato geniturinrio, clulas prostticas superficiais ou colunares, clulas germinativas imaturas como espermatcitos e espermtides , alm de leuccitos. A determinao da concentrao desse grupo de clulas referidas como redondas realizada empregando-se a mesma metodologia descrita para a determinao da concentrao de espermatozoides. Do ponto de vista clnico, entretanto, o mais importante diferenciar os leuccitos das outras clulas redondas, pois a ocorrncia de um nmero elevado de

leuccitos no smen pode indicar infeco genital clnica ou subclnica, nveis elevados de radicais livres de oxignio, ttulos elevados de anticorpos antiespermatozoides, funo espermtica deficiente e, consequentemente,

diminuir a fertilidade2,9. Entre as diversas tcnicas existentes para a identificao dos leuccitos no smen, a mais simples o teste de Endtz, ou teste da peroxidase. Esse teste permite identificar os neutrfilos polimorfonucleares, que so os de maior importncia clnica e geralmente provm do epiddimo. Os neutrfilos tambm so chamados de granulcitos, pois possuem grnulos contendo uma enzima chamada peroxidase.

Figura 6. Desenho esquematico do espermatozoide humano visto a microscopia optica, com as medidas utilizadas na avaliacao morfometrica, segundo o criterio estrito de Tygerberg (quadro a esquerda). No centro e a direita, ilustracoes representando os defeitos morfologicos mais comuns.

Figura 7. Coloracao pelo metodo panotico da morfologia espermatica. Inicialmente, mergulha-se a lamina de microscopia com o esfregao de semen (seco) na solucao fixadora. O processo e repetido cinco vezes, mantendo-se o esfregaco por um segundo dentro da solucao, com intervalo de um segundo entre os mergulhos. E necessario deixar a lamina secar completamente antes de prosseguir para o prximo passo (aproximadamente 15 minutos). Depois, mergulha-se a lamina seca na solucao I do kit panotico, seguindo-se o mesmo mtodo descrito para a etapa anterior. Deve-se permitir que o excesso do corante escorra, mas a lamina nao deve secar completamente. A ultima etapa consiste em mergulhar a lamina na solucao II do kit panotico, processo que deve ser repetido duas vezes, seguindo-se a mesma sistematica ja descrita. O excesso do corante e removido enxaguando-se a lamina gentilmente em agua destilada, e finalmente se deixa a lamina secar por completo a temperatura ambiente antes de realizar a leitura.

Figura 8. Fotomicrografias de espermatozoides normais corados pelo metodo panotico. Os espermatozoides foram avaliados pelo critrio estrito de Tygerberg (Kruger). As setas indicam a visao geral de espermatozoides normais (esquerda). A direita, detalhes da cabeca e da peca intermediaria de espermatozoides normais.

Figura

9.

Fotomicrografias

de

espermatozoides

apresentando

defeitos

morfologicos na cabeca: (A) macrocefalico; (B) microcefalico; (C) fusiforme; (D) piriforme; (E) redondo; (F) e (G) amorfo; (H) vacuolado (com mais de dois vacuolos ou mais de 20% da area da cabeca ocupada por vacuolos). Os

esfregacos foram corados pelo metodo panotico, e os espermatozoides foram avaliados pelo criterio estrito de Tygerberg (Kruger).

Figura

10.

Fotomicrografia

de

espermatozoides

apresentando

defeitos

morfologicos na peca intermediaria: (A) insercao anomala da peca; (B) peca espessa; (C) peca fina; (D) peca dobrada; (E) com excesso de citoplasma residual (1/3 ou mais em relacao ao tamanho da cabeca; esse defeito normalmente vem acompanhado de outros defeitos na peca intermediaria. Gotas citoplasmaticas sao vesculas pequenas aderidas a peca intermediaria e representam elementos normais de espermatozoides funcionais; normalmente, se perdem durante o processo de coloracao ou aparecem como distensoes da peca intermediaria com tamanho inferior a 1/3 da cabeca). Os esfregaos foram corados pelo metodo panotico, e os espermatozoides foram avaliados pelo criterio estrito de Tygerberg (Kruger).

Figura 11. Fotomicrografia de espermatozoides apresentando defeitos na cauda: (A) cauda curta; (B) cauda enrolada; (C) cauda dobrada; (D) cauda dupla. Os esfregacos foram corados pelo metodo panotico, e os espermatozoides foram avaliados pelo criterio estrito de Tygerberg (Kruger).

Figura 12. Avaliacao da vitalidade espermatica pelo metodo da eosina. Espermatozoides com a cabeca corada em rosa sao considerados mortos (membrana plasmatica nao intacta, que permite a entrada do corante supravital), e os nao corados (cabeca branca) sao considerados vivos, pois possuem a membrana integra, que nao permite a entrada do corante. Nesse teste, uma alquota de smen liquefeito incubada com um reagente contendo gua oxigenada, que reage com a peroxidase presente nos grnulos dos neutrfilos.

A peroxidase pertence ao grupo de enzimas com capacidade de oxidar substratos orgnicos, usando o perxido de hidrognio como aceptor de eltrons na reao. Como resultado, obtm-se uma reao colorimtrica: os neutrfilos coram-se de marrom e so facilmente identificados microscopia ptica, ao passo que as clulas peroxidase negativas no se coram (Figura 13). Estas ltimas podem representar clulas germinativas imaturas ou outros tipos de leuccitos, como os moncitos, os linfcitos e os macrfagos. Depois do ensaio, pelo menos duzentas clulas so analisadas, e o resultado expresso em porcentagem de clulas peroxidase positivas. A concentrao de neutrfilos calculada multiplicando-se a concentrao de clulas redondas (x106 por ml) pela porcentagem de neutrfilos (clulas peroxidase positivas).

Figura 13. Diferenciacao das celulas redondas presentes no semen, utilizando o teste de Endtz. A esquerda: celula redonda peroxidase negativa (seta larga) e granulocito peroxidase-positivo (P+). A direita: visao geral de uma lamina contendo varios granulocitos peroxidase-positivos.

Referncias 1. Esteves SC. Infertilidade masculina. In: Rhoden, EL ed. Urologia no consultrio. Porto Alegre: Artmed; 2009, p. 470-80. 2. Esteves SC, Miyaoka R, Agarwal A. An update on the clinical assessment of the infertile male. Clinics (So Paulo). 2011; 66(4):691-700. 3. World Health Organization: WHO Laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5th ed. Geneva, WHO press, 2010, 287 p. 4. World Health Organization: WHO Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 2nd ed. Cambridge, Cambridge University Press, 1987, 80 p. 5. World Health Organization: WHO Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical muus interaction, 3rd ed. Cambridge, Cambridge University Press, 1992, 107 p. 6. World Health Organization: WHO Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 4th ed. Cambridge, Cambridge University Press, 1999, 128 p.