LAS ENZIMAS II

CENTRO ACTIVO MECANISMO DE ACCION CLASIFICACIN CINETICA ENZIMATICA

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Enzimas II

Modelos de unin E-S

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PRUEBAS EXPERIMENTALES DE LA EXISTENCIA DEL CENTRO ACTIVO

1. 2.

Formacin de complejo ES se demuestra cinticamente Presencia de grupos prostticos que participan en la catlisis

3.

Fenmeno de la inhibicin competitiva por anlogos que participan en el estado de transicin Efecto de inhibidores irreversibles
Organofosforados - Serina activa

4.

Clorometilcetonas - Histidina activa

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PRUEBAS EXPERIMENTALES DE LA EXISTENCIA DEL CENTRO ACTIVO

5. Estudios filogenticos en secuencias de aminocidos de enzimas

Tripsina
Quimotripsina Elastasa Trombina Plasmina Pr. St. griseus
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CQGDSGGPV
CMGDSGGPL CQGDSGGPL CEGDSGGPF CQGDSGGSW CQGDSGGPV
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De la secuencia aminoacdica a la estructura

APRKFFVGGNWKMNGD KKSLGELIHTLNGAKL SADTEVVCGAPSIYLD FARQKLDAKIGVAAQN CYKVPKGAFTGEISPA MIKDIGAAWVILGHSE RRHVFGESDELIGQKV AHALAEGLGVIACIGE KLDEREAGITEKVVFE QTKAIADNVKDWSKVV LAYEPVWAIGTGKTAT PQQAQEVHEKLRGWLK SHVSDAVAQSTRIIYG GSVTGGNCKELASQHD VDGFLVGGASLKPEFV DIINAKH

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PRUEBAS EXPERIMENTALES DE LA EXISTENCIA DEL CENTRO ACTIVO

6. Estudios de fijacin de anlogos de substratos marcados 7. Estudios estructurales por cristalografa de rayos X de enzimas co-cristalizadas con su substrato 8. Otras tcnicas fsicas (RMN, polarizacin de fluorescencia, etc)

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ESTUDIO DE FIJACIN DE LIGANDOS

Consiste en incubar la enzima con un anlogo del substrato debidamente marcado (radioactivo, fluorescente, etc.) a diferentes concentraciones de Ligando.
Ligando libre y ligando unido pueden separarse por: - Dilisis de equilibrio - Ultrafiltracin

- Cromatografa de exclusin en gel

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Determinacin de aminocidos presentes en el centro activo de enzimas

Serina: enzimas inhibidas por organofosforados Histidina: enzimas inhibidas por clorometilcetonas Cistena: enzimas inhibidas por reactivos -SH Lisina: enzimas que forman bases de Schiff Aspartato y Glutamato: dependencia de pH

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MECANISMOS DE ACCIN ENZIMTICA

1. Efectos de proximidad y orientacin 2. Catlisis cido-base 3. Formacin de intermediarios covalentes 4. Otros efectos (efectos cunticos)

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ADH

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CLASIFICACIN Y NOMENCLATURA DE ENZIMAS

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Clasificacin de enzimas 1. Oxidorreductasas

2.
3. 4. 5. 6.
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Transferasas
Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas
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Grupo 1. Oxidoreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreduccin

Ared + Box

Aox + Bred

A: es el reductor o dador electrnico; se oxida (pierde electrones) B: es el oxidante o aceptor electrnico; se reduce (gana electrones) En las reacciones redox siempre esta presente aceptor y dador electrnico.
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NOMENCLATURA ALTERNATIVA EN OXIDORREDUCTASAS

1. Deshidrogenasas 2. Oxidasas 3. Peroxidasas 4. Oxigenasas 5. Hidroxilasas 6. Reductasas
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Piruvato COOC O CH3 NADH + H+ NAD+

L-Lactato

LDH

COOHO C H CH3

LDH: Lactato deshidrogenasa Utiliza como cofactor NADH, el cual sale de la reaccin oxidado a NAD+. La regeneracin de NADH requerira otra enzima.
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Grupo 2. Transferasas
Catalizan reacciones de transferencia de grupo:

A-X + B

A + B-X

Dador: Aceptor - Grupo transferido - transferasa

ATP: D-Hexosa fosfotransferasa

EC 2.7.1.1

Nombre comn: hexokinasa

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Nombre sistemtico:

Grupo transferido

ATP: hexosa fosfotransferasa

Donador Aceptor Grupo

Nmero sistemtico:
Enzyme Comission

Subgrupo

EC 2.7.1.1

Enzima Sub-subgrupo

Nombre comn: Hexoquinasa

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TRANSFERASAS
COO COO CH2 HC NH3+ CH2 CH2 COO CH2 O C O COO CH2 CH2

HC

NH3+

COO

COO

COO

COO

aspartate

-ketoglutarate

oxaloacetate

glutamate

Aminotransferase (Transaminase)

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CLASIFICACIN DE LAS TRANSFERASAS

2.1. Grupos monocarbonados 2.2. Grupos aldehido o ceto 2.3. Aciltransferasas 2.4. Glicosiltransferasas 2.5. Alquil- o Ariltransferasas 2.6. Grupos nitrogenados 2.7. Grupos fosfato 2.8. Grupos sulfato
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Grupo 3. Hidrolasas
Catalizan reacciones de hidrlisis

A-B + H2O

A-OH + H-B

No se suelen utilizar nombres sistemticos en las hidrolasas. Muchas de ellas conservan el nombre primitivo: tripsina, pepsina, papana, etc.

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Hidrolasa

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Clasificacin de las hidrolasas

3.1. Esterasas (carboxilesterasas, fosfoesterasas, sulfoesterasas) 3.2. Glicosidasas 3.3. ter hidrolasas 3.4. Pptido hidrolasas 3.5. Acil anhdrido hidrolasas, etc.
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Pptido hidrolasas: clasificacin comn

I. Segn la situacin del enlace atacado: - Exopeptidasas (en los extremos de la cadena) (Peptidasas) - Endopeptidasas (en el interior de la cadena) (Proteinasas)
II. Segn el mecanismo cataltico: - Serin proteinasas - Tiol proteinasas - Aspartil proteinasas - Metaloproteinasas
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Grupo 4. Liasas
Catalizan reacciones reversibles de adicin de un grupo a un doble enlace:

A=B + X
COOCH CH COOFumarato (trans-)
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AXB
H 2O COOHO CH
FUMARASA

CH2 COOL-Malato
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Algunas reacciones lisicas:

Descarboxilasas

Aldolasas
Anhidrasa carbnica

Adenilato ciclasa

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Grupo 5. Isomerasas
Catalizan reacciones de isomerizacin
Racemasas

Oxidorreductasas
intramoleculares

Mutasas o transferasas
intramoleculares

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Grupo 6. Ligasas
Catalizan la unin de dos grupos qumicos a expensas de la hidrlisis de un enlace de alta energa.

A + B + ATP
O bien

A-B + ADP + Pi

C + D + ATP
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C-D + AMP + PPi

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Algunas reacciones ligsicas:

Aminoacil-tRNA sintetasas

Glutamina sintetasa

Carboxilasas

PIRUVATO CARBOXILASA

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ISOENZIMAS
Difieren
en la secuencia de aminocidos, pero

catalizan la misma reaccin qumica. Diferentes

parmetros cinticos o propiedades de regulacin.

Permiten

la regulacin del metabolismo para

satisfacer las necesidades particulares de un

determinado tejido o etapa del desarrollo.

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Lactato deshidrogenasa (LDH)

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Creatina Kinasa (CK)

1) Creatina quinasa (EC: 2.7.3.2)
CK
ATP + creatine ADP + creatina fosfato

Importancia clnica:
Isoenzima CK-BB (CK-1) CK-MB (CK-2) CK-MM (CK-3)
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tejido rgano cerebro msculo cardico msculo

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% 98 20 96
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Actividad enzimtica
Cuntos moles de sustrato son convertidos en producto por unidad de tiempo?

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CINETICA ENZIMATICA
VELOCIDAD DE TRANSFORMACIN DE LOS SUSTRATOS EN PRODUCTOS EN EL TIEMPO

E + S? ES EP E + P?

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Disminucin de la energa de activacin

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Disminucin de la energa de activacin

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Cmo las enzimas disminuyen la energa de activacin?

Estado de transicin en forma de un
complejo enzima- sustrato E + S ES EP E + P Qu evidencias hay de la existencia del complejo ES?
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Evidencia #1:
Una reaccin catalizada por una enzima tiene una velocidad mxima

Catlisis mxima

Ninguna catlisis

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Evidencie #2:
Cristalografa de Rayos-X muestra la presencia del complejo ES

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Actividad enzimtica
Cuntos moles de sustrato son convertidos en producto por unidad de tiempo?
Para hacer este experimento se requiere utilizar la misma concentracin de enzima y diferentes concentraciones de sustrato

Una vez que la enzima llega a saturarse la velocidad de reaccin permanece constante.

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Actividad enzimtica
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E + S ES EP E + P

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FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Todos los agentes desnaturalizantes de las
protenas afectan las propiedades catalticas de las enzimas. Altas o bajas temperaturas, altos o bajos pH, altas o bajas concentraciones salinas, etc.

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PRINCIPALES FACTORES
1. Concentracin de enzima [E] 2. Concentracin de sustrato [S] 3. La temperatura

4. pH
5. Efectores (activadores e inhibidores)

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EFECTO DE LA TEMPERATURA
El fro disminuye las interacciones entre la enzima y el sustrato (disminuye la velocidad de reaccin). El calor incrementa la velocidad de interaccin entre enzima y sustrato a un punto que la enzima obtiene tanto calor que se desnaturaliza
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EFECTO DE LA TEMPERATURA V

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EFECTO DEL PH
Cambia la estructura terciara y su capacidad de fijar su sustrato (s) Tripsina pH 7.5 Pepsina pH 2.0

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Acetilcolinesterasa Enzyme activity

Pepsina

Amilasa

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Efecto del pH
v

pH
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NH COO CH2 CH2 COO+ +

Arg

H3N

NH CH

H3N

Lys
CH

Succinato y centro activo de SDH pH 7

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NH
+

COOH CH2 CH2 COOH

+

H 3N

NH CH

H 3N CH

Succinato y centro activo de SDH, pH 2

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NH C COOCH2 CH2 COOH2N CH

Succinato y centro activo de SDH, pH 13
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H2N

NH CH

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA [E]constante y [S] diferentes La velocidad de

reaccin permanece
constante cuando la enzima se satura
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ACTIVIDAD ENZIMTICA
UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA (U): mol de sustrato transformado en un minuto ACTIVIDAD ESPECIFICA: unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg protena o mol min-1 mg protena-1) CONSTANTE CATALITICA O NUMERO DE RECAMBIO (TURNOVER): unidades de actividad enzimtica por mol de enzima ( mol min-1 mol de enzima-1). Catalasa y alfa amilasa 5x106 y 1.9 x 104
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