Revista de Cincias Farmacuticas Bsica e Aplicada

Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences

Rev Cinc Farm Bsica Apl., 2009;30(3):263-271 ISSN 1808-4532

Desenvolvimento de emulses leo de oliva/gua: avaliao da estabilidade fsica

Frange, R.C.C1; Garcia, M.T.J.1*
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Laboratrio de Tecnologia Farmacutica - Faculdade de Farmcia - Universidade de Uberaba - UNIUBE.

Recebido 03/02/2009 / Aceito 08/02/2010

RESUMO Emulses leo de oliva/gua, na presena de agentes emulsionantes no-inicos, foram avaliadas quanto estabilidade fsica. Assim, prepararam-se emulses fazendo uso de diferentes emulsionantes, sendo um hidroflico e o outro lipoflico, nas diferentes propores. s emulses mais estveis, adicionaram-se agentes auxiliares da emulsificao, visando otimizar a estabilidade; e estudos de estabilidade foram conduzidos, submetendo as amostras em condies e perodos diversos de armazenamento. Para caracterizao da estabilidade, as amostras foram examinadas macroscopicamente e submetidas s anlises de pH, centrifugao, viscosidade, potencial zeta e distribuio de tamanho de partcula. Os resultados demonstraram que as emulses leo de oliva/gua no apresentaram alterao, ou seja mantiveram-se estveis, quanto s propriedades organolpticas, bem como fsicoqumicas, quando armazenadas temperatura ambiente e protegidas da luz. Das emulses obtidas, as que apresentaram maior estabilidade provm da associao de agentes emulsionantes que resultaram em equilbrio hidroflico-lipoflico (EHL) equivalente a 12. As emulses provenientes da associao de agentes emulsionantes que possuem cadeias de cidos graxos insaturados similares ao leo de oliva produziram estabilidade mxima, demonstrando que a similaridade estrutural entre os componentes da fase oleosa e os agentes emulsionantes essencial para a estabilidade da emulso. Palavras-chave: Emulso O/A. Estabilidade. leo de Oliva. EHL. Emulsionante no-inico. INTRODUO As emulses so disperses de duas fases lquidas imiscveis entre si, usualmente gua e leo, estabilizadas pela presena de agentes emulsivos, localizados na interface leo/gua.

Autor correspondente: Maria Teresa Junqueira Garcia - Laboratrio de Tecnologia Farmacutica - Faculdade de Farmcia - Universidade de Uberaba UNIUBE Av. Nen Sabino, n 1801, Bairro Universitrio - CEP: 38055-550 - Uberaba Minas Gerais - Brasil - e-mail:mtjgarcia@yahoo.com

Os agentes emulsivos, com propriedade de diminuir a tenso interfacial entre o leo e a gua, tm papel fundamental na estabilizao de emulses. Entretanto estes compostos no conseguem diminuir a tenso interfacial a ponto de contrariar totalmente a energia livre de superfcie provocada pelo aumento da rea interfacial. Desta forma as emulses so sistemas termodinamicamente instveis e, no desenvolvimento tecnolgico, procura-se utilizar de meios que possam retardar pelo maior tempo possvel a separao das fases (Oliveira et al., 2004). Presume-se que a estabilidade destas preparaes depende do tipo de agente emulsionante utilizado e das caractersticas fsicas da pelcula interfacial formada. Esta pelcula deve ser rgida e compacta (Prista et al., 1995), possuir certo grau de elasticidade superficial e no deve romper-se quando pressionada pelas gotculas, mas ao romper-se, deve ser capaz de formar-se rapidamente (Gennaro, 1999), impedindo a aproximao e conseqente juno da fase dispersa. Por vezes, um nico emulsionante capaz de originar o tipo de emulso desejada, no entanto, emulses mais estveis so preparadas quando se utilizam misturas de emulsionantes, sendo um para a formao de emulses O/A e outro para a formao de emulses A/O (Prista et al., 1995; Gullapalli & Sheth,1999). Postulam-se que os agentes emulsivos hidroflicos e lipoflicos alinham-se um ao lado do outro, conferindo maior rigidez e resistncia ao filme emulsivo, atravs de pontes de hidrognio (Fox, 1986). De acordo com Schulman & Cockbain (1940), esses agentes emulsionantes so capazes de formar entre si complexos interfaciais na superfcie dos glbulos dispersos. Esses complexos promovem a formao e a estabilizao da emulso porque diminuem a tenso interfacial mais acentuadamente do que quando se emprega um s agente emulsionante, alm de originarem uma pelcula compacta, mas flexvel, na interface. Se o filme interfacial for eletricamente carregado, foras repulsivas, em consequncia da formao da dupla camada eltrica, contribuiro para estabilidade do sistema (Aulton, 2005). Para Gullapalli & Sheth (1997;1999), a estabilidade das emulses O/A pode ser obtida pela otimizao da mistura de emulsificantes hidroflicos e lipoflicos. Segundo os autores, a similaridade estrutural dos agentes emulsificantes com a fase dispersa essencial para a estabilidade da emulso; e a estabilidade pode ser favorecida pelo complexo formado entre o agente de viscosidade

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hidroflico e tensoativo hidroflico e pela interao do tensoativo hidroflico com a fase oleosa. Por outro lado, as emulses instveis se manifestam das seguintes formas (Silva & Soares, 1996): floculao, onde as gotculas se agregam em aglomerados frouxos, dentro da emulso, conservando sua identidade individual, mas cada aglomerado comporta-se fisicamente como uma unidade nica; coalescncia que caracterizada por uma larga distribuio de tamanho das gotculas, resultando na separao de fases de forma visvel ao olho nu; creaming onde a fase dispersa, conforme sua densidade relativa fase contnua, sobe at superfcie ou desce at o fundo da emulso, formando uma camada de emulso mais concentrada (Lieberman et al., 1988; 1989; Aulton, 2005); amadurecimento de Ostwald, onde as partculas maiores crescem de tamanho devido dissoluo das partculas menores (Welin-Berger & Bergensthl, 2000). medida que as emulses se tornam instveis, suas caractersticas fsico-qumicas variam. Assim, para verificar tais variaes pode-se determinar o valor do pH, viscosidade, a distribuio de tamanho de partcula, potencial zeta, entre outros (Brasil, 2004). Logo, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a estabilidade fsica de emulses leo de oliva/ gua, empregando a associao de diferentes agentes emulsionantes no-inicos, nas diferentes propores. MATERIAIS E MTODOS MATERIAIS leo de Oliva (Pharmaspecial) - ndice de acidez 1%, Monoleato de Polioxietilenossorbitano (Tween 80, EHL= 15)(Synth), lcool Cetoestearlico Etoxilado 20OE (EHL=15,4) (Pharmaspecial) , lcool Olelico Etoxilado 3OE (EHL= 6,6) (Becto Research Chemical), lcool Laurlico Etoxilado 2OE (EHL=6,2) (Chemistry), Glicerina (Galena), Metilparabeno (Pharmaspecial), Propilparabeno (Pharmaspecial), Carbopol 940 (Galena), Natrosol 250 HHR (Pharmaspecial), Butil Hidroxi Tolueno BHT (Pharmaspecial), Soluo de NaOH 20% (p/v) (Nuclear). MTODOS Determinao do Equilbrio-Hidroflico-Lipoflico (EHL) do leo de oliva Para o presente estudo, empregaram-se tensoativos com cadeias graxas e EHLs (Tween 80, EHL= 15; lcool Cetoestearlico Etoxilado 20 OE, EHL=15,4; lcool Olelico Etoxilado 3OE, EHL= 6,6; lcool Laurlico Etoxilado 2OE , EHL=6,2) distintos. Para a associao de tensoativos, teve-se como critrio a polaridade dos mesmos, empregando um com caractersticas hidroflicas e outro com caractersticas lipoflicas. Para determinar o EHL do leo de oliva, preparouse com ele uma srie de emulses contendo 5g de um par de emulsionantes (monooleato de polioxietilenossorbitano (Tween 80)/ lcool Olelico Etoxilado 3OE; monooleato de 264

polioxietilenossorbitano (Tween 80)/lcool cetoestearlico 20OE; monooleato de polioxietilenossorbitano (Tween 80)/lcool laurlico etoxilado 2OE; lcool cetoestearlico etoxilado 20OE/lcool laurlico etoxilado 2OE), misturados em propores variveis, de modo a originarem valores definidos, mas escalonados de EHL; 10g de leo de oliva e gua at completar 100g (Prista et al., 1996). As emulses foram preparadas aquecendo separadamente a fase aquosa e oleosa em banho-maria (Tecnal TE 057) 70C. Aps o aquecimento, a fase aquosa foi vertida na fase oleosa, e o sistema foi mantido sob agitao a 15000 rpm (Ultra-TurraxT25) por cinco minutos. Aps agitao, as emulses foram envasadas e acondicionadas em temperatura ambiente. Decorridas 24 horas, procedeu-se ao exame de todas as emulses, tomando-se como ponto de referncia aquela que apresentou-se mais estvel, isto , que no tinha aspecto grumoso nem separao de fases e com alto ndice de cremeao. Segundo Krishna et al., 1998, a estabilidade pode ser mensurada pelo porcentual de cremeao. O ndice de cremeao foi determinado pela seguinte equao: C = 100 x (Vs/Vt), onde Vt corresponde ao volume total da amostra; Vs corresponde ao volume da fase emulsionada. De acordo com a equao, quanto maior o valor de C, maior a estabilidade do sistema. Preparao das emulses As emulses em estudo foram feitas empregando leo de oliva (10% p/p), BHT (0,1% p/p) como antioxidante, lcool olelico etoxilado 3EO (1,8% p/p) e Tween 80 (3,2% p/p) como emulsionantes, Carbopol 940 (0,4% p/p) e hidroxietilcelulose (0,2% p/p) como agentes de viscosidade e promotores da estabilidade, metilparabeno (0,18% p/p) e propilparabeno 0,02% (p/p) como conservantes microbiolgicos. As emulses foram preparadas aquecendo-se as fases separadamente temperatura no superior a 70C. Na fase aquosa solubilizou-se a glicerina, metilparabeno, Tween 80. Dipersou-se ainda nesta fase o Hidroxietilcelulose e o Carbopol 940, seguido do ajuste do pH (pH 5,5) com 0,5 mL de uma soluo de NaOH 20% p/v. A este sistema verteu-se a fase oleosa, submetendo-o agitao a 15000 rpm (Ultra-Turrax T25) por 5 minutos. Estudo de estabilidade das emulses O estudo de estabilidade foi baseado no mtodo proposto no Guia de Estabilidade sugerido pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (Brasil, 2004), onde as amostras devem ser armazenadas em condies que acelerem mudanas passveis de ocorrer, permitindo, assim, obter informaes sobre a estabilidade do produto em menor tempo possvel. Estabilidade preliminar das emulses As amostras (triplicatas) foram acondicionadas em frascos plsticos com tampa, a fim de garantir boa vedao. O volume total do frasco no foi completado para permitir possveis trocas gasosas. A durao do estudo foi de 15 dias. As amostras foram submetidas ao aquecimento em estufa
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50 2C, ao resfriamento em refrigeradores -5 2C, ciclos alternados de resfriamento e aquecimento (ciclos de 24 horas 50 2C, e 24 horas -5 2C), exposio a luz solar e temperatura ambiente sob ao abrigo da luz. As amostras foram analisadas no tempo de 24 horas e aos 7 e 15 dias, quanto s caractersticas organolpticas (aspecto, cor e odor), ao pH, viscosidade, bem como separao de fase por centrifugao. Estabilidade acelerada das emulses As amostras foram acondicionadas nas condies descritas anteriormente. A durao do estudo foi de 90 dias. As amostras (triplicadas) foram submetidas ao aquecimento em estufa 50 2C, ao resfriamento em refrigeradores -5 2C, temperatura ambiente sob ao abrigo da luz. As amostras foram analisadas no tempo de 24 horas e aos 15, 60 e 90 dias. Os parmetros avaliados foram: caractersticas organolpticas (aspecto, cor e odor), separao de fase por centrifugao, pH, viscosidade, distribuio de tamanho de partcula e potencial zeta. Ensaios Organolpticos Observaram-se visualmente as caractersticas das amostras, verificando se ocorreram modificaes macroscpicas, tais como: separao de fase, formao de grumos, precipitados; bem como a cor e o odor em relao ao padro estabelecido. Ensaios Fsico-Qumicos Centrifugao Em tubo de ensaio cnico graduado para centrfuga (Fanem LtdaMod. 206 R, Excelsa BABY II440 watts) foi adicionado 1,0g de cada amostra, pesado em balana semianaltica (Gehaka, Mod. BG 4000) e submetido ao ciclo de 3500 rpm (863g) durante trinta minutos temperatura ambiente. Determinao de pH A determinao do pH foi baseada no mtodo proposto por Borghetti & Knorst (2006), utilizandose de amostras diludas em gua destilada (1:10 p/v), homogeneizadas e submetidas leitura, temperatura de 25C 1, em peagmetro (Micronal - modelo B 474), previamente calibrado com solues de pH 7,0 e 4,0. Os resultados correspondem a mdia de trs determinaes com os respectivos desvios padro. Determinao da viscosidade A viscosidade foi determinada utilizando-se o viscosmetro de Brookfield, srie LV. O spindle empregado foi o de n4. Para a realizao da leitura, as amostras foram acondicionadas em tubo de ensaio, tomando-se o cuidado

necessrio para que no houvesse incorporao de ar na amostra. O spindlle foi incorporado amostra de modo a evitar a formao de bolhas de ar em contato com a superfcie do mesmo, para no ocasionar erros na leitura. As leituras foram realizadas nas velocidades de rotaes de 0,3; 0,6; 1,5; 3,0; 6,0; 12,0; 30,0 e 60,0 rpm de modo crescente e decrescente temperatura de 25 1C. Os resultados correspondem mdia de trs leituras com os respectivos desvios padro. Determinao do potencial zeta O potencial zeta foi determinado pela mensurao da mobilidade eletrofortica da partcula dispersa em um campo eltrico. Cem miligramas das amostras em estudo foram diludos em 5 mL de gua de deionizada, homogeneizados at completa disperso e submetidos anlise para a determinao do potencial zeta (Malvern Nano ZS). Os resultados correspondem mdia de trs leituras com os respectivos desvios padro. Anlise da distribuio de tamanho de partcula A distribuio de tamanho de partcula foi determinada pela tcnica de diperso de luz laser, em que cem miligramas das amostras em estudo foram diludos em 5 mL de gua de deionizada, homogeneizados at completa disperso e submetidos anlise para a determinao da distribuio do tamanho de partculas (Beckman Coulter LS 13/320). Os resultados correspondem mdia de trs leituras. Anlise Estatstica Os resultados dos ensaios de estabilidade foram submetidos ao teste estatstico ANOVA Post test: Tukey. As anlises estatsticas foram realizadas com o programa GraphPad Instat, Version 3.01, 32 bit for Win95/NT. RESULTADOS Determinao do EHL

Os EHLs e os respectivos ndices de cremeao das emulses leo de oliva/gua na presena dos tensoativos lcool olelico etoxilado/Tween 80 encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1 Os EHLs e o respectivos ndices de cremeao (IC) das emulses leo de oliva/gua na presena dos tensoativos lcool olelico etoxilado/Tween 80, aps 24 hs da preparao.
EHL 8 9 10 11 12 13 14 15 IC 87% 96% 96% 96% 98% 83% 81% 80% EHL = Equilbrio hidroflico-lipoflico

As associaes de agentes emulsionantes, todos com o mesmo EHL (EHL 12), demostraram um ndice de cremeao equivalente 96%, 94% e 79% para as associaes Tween 80/lcool laurlico etoxilado 2OE, lcool cetoestearlico etoxilado 20OE/lcool olelico etoxilado 265

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3OE e lcool cetoestearlico etoxilado 20OE/lcool laurlico etoxilado 2OE, respectivamente. Estudo de estabilidade preliminar A emulso com estabilidade mxima nos estudos de EHL, acrescida dos auxiliares de emulsificao, foi submetida aos estudos preliminares de estabilidade, por um perodo de 15 dias (Brasil, 2004). As amostras foram examinadas macroscopicamente e submetidas s anlises de pH, viscosidade e centrifugao. Os resultados encontramse na Tabela 2.
Tabela 2 - Resultados dos testes preliminares de estabilidade das emulses leo de oliva/gua com a associao de tensoativos no inicos (Tween 80/lcool olelico etoxilado 3OE).
Aspecto* pH 1 Dia Controle Estufa Ciclo Refrigerador Luz solar N N N N N 5,40(0,14) 5,33(0,05) 5,31(0,02) 5,38(0,04) 5,44(0,10) 15Dia 5,51(0,01) 5,45(0,05) 5,47(0,07) 5,42(0,07) 5,48(0,04) Viscosidade 1Dia 140333,30 (24090,11) 131333,30 (21197,48) 144333,30 (9712,53) 142666,70 (7023,77) 138666,70 (13428,82) 15Dia 130000,00 (12288,21) 166333,30 (16041,61) 148333,30 (9504,38) 131333,30 (8326,66) 137666,70 (3511,88) Centrifugao 1Dia N N N N N 15Dia N N N N N

Tabela 3 - Valores dos pHs das emulses leo de oliva/gua recentemente obtidas e armazenadas sob condies e perodos diversos.
1 dia Controle Estufa Refrigerador 5,490 (0,031) 15 dia 5,565 (0,015) 5,633 (0,040) 5,583(0,033) 60 dia 5,525(0,095) 5,520(0,240) 5,487(0,152) 90 dia 5,533(0,095) 5,220(0,028) 5,370(0,057)

Controle (armazenamento temperatura ambiente sob ao abrigo da luz; Estufa (armazenamento em estufa 50C); Refrigerador (armazenamento em refrigerador -5C).

Distribuio do tamanho de partculas O perfil de distribuio do tamanho de partculas das emulses recentemente obtidas e das emulses armazenadas sob condies e perodos diversos est representado na Figura 1.

Viscosidade referente tenso de cisalhamento de 0,025 s-1; Controle (amostras protegidas da luz e mantidas temperatura ambiente); Estufa (amostras mantidas temperatura de 50C); Ciclos (amostras submetidas por perodos alternados temperatura de -5C e 50C), Refrigerador (amostras mantidas temperatura de -5C), Luz solar (amostras expostas luz solar). * refere s propriedades organolpticas: cor, odor e aspecto. N- normal.

Estudo de estabilidade acelerada Diante da estabilidade apresentada nos estudos preliminares de estabilidade, a emulso foi submetida aos estudos de estabilidade acelerada, por uma perodo de 90 dias (Brasil, 2004). As amostras foram examinadas quanto ao aspecto, cor e odor; e submetidas s anlises de pH, centrifugao, viscosidade, potencial zeta e distribuio de tamanho de partcula. Ensaios Organolpticos As emulses submetidas aos ensaios de estabilidade demonstraram semelhana, no que se refere cor, odor e aparncia, em relao s emulses recentemente elaboradas, independente das condies e perodos de armazenamento. Centrifugao As emulses submetidas aos ensaios de estabilidade mantiveram-se estveis nos ensaios de centrifugao, no apresentando cremeao, to pouco separao de fase. Determinao do pH
O pH das emulses em estudo foi ajustado para o pH 5,49 0,03 e acompanhado durante os estudos de estabilidade. Os valores obtidos esto expressos na Tabela 3.
Figura 1 - Distribuio de tamanho de partculas das emulses leo de oliva/gua armazenadas sob condies e perodos diversos. Controle T0 = emulses recentemente obtidas. A. emulses armazenadas temperatura ambiente por 15, 60 e 90 dias. B. emulses armazenadas em estufa 50C por 15, 60 e 90 dias. C. emulses armazenadas em refrigerador -5C por 15, 60 e 90 dias.

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diferentes tenses de cisalhamento, o que permitiu a construo do reograma representado na Figura 2. A Tabela 4 apresenta os valores de viscosidade referente tenso de cisalhamento de 0,05 s-1 das emulses leo de oliva/ gua recentemente obtidas e armazenadas sob condies e perodos diversos. Potencial Zeta A Tabela 5 apresenta os valores do potencial zeta das emulses leo de oliva/gua recentemente obtidas e armazenadas sob condies e perodos diversos.
Tabela 5 - Valores do potencial zeta das emulses leo de oliva/ gua recentemente obtidas e armazenadas sob condies e perodos diversos.
1 dia Controle Estufa Refrigerador -36,40,4 mV 15 dia -40,20,8 mV 60 dia -52,12,8 mV -49,50,5 mV -51,72,9 mV 90 dia -49,60,6 mV -24,02,8 mV -22,80,7 mV

Controle (amostras protegidas da luz e mantidas temperatura ambiente); Estufa (amostras mantidas temperatura de 50C); Ciclos (amostras submetidas por perodos alternados temperatura de -5C e 50C), Refrigerador (amostras mantidas temperatura de -5C).

DISCUSSO Emulses fisicamente estveis so melhores preparadas por meio da presena de uma camada condensada de emulsionante na interface leo/gua; e, os filmes interfaciais complexos, obtidos mediante a mistura de um agente emulsionante solvel em gua com outro solvel em leo, permitem obter emulses com resultados mais satisfatrios (Aulton, 2005). O mtodo de equilbrio hidroflico-lipoflico (EHL) tem se tornado uma ferramenta til na escolha do agente emulsionante para uma determinada fase oleosa. O mtodo parte do princpio que a emulsificao adequada se d quando o agente emulsificante possui EHL igual ao da fase oleosa a ser emulsificada. Assim, preparou-se uma srie de emulses contendo 85% (p/p) de fase aquosa, 10% (p/p) de leo de oliva e 5% (p/p) de uma mistura de tensoativos (Tween 80/lcool olelico etoxilado 3OE; Tween 80/lcool laurlico etoxilado 2OE; lcool cetoestearlico etoxilado 20 OE/lcool olelico etoxilado 3OE; lcool cetoestearlico etoxilado 20OE/lcool laurlico etoxilado 2OE). Os

Figura 2 - Reogramas das emulses leo de oliva/gua armazenadas sob condies e perodos diversos. Controle T0 = emulses recentemente obtidas. A. emulses armazenadas temperatura ambiente por 15, 60 e 90 dias. B. emulses armazenadas em estufa 50C por 15, 60 e 90 dias. C. emulses armazenadas em refrigerador -5C por 15, 60 e 90 dias.

Determinao da Viscosidade Determinou-se a viscosidade das amostras armazenadas sob condies e perodos diversos em

Tabela 4 Valores de viscosidade (mPa.s) das emulses leo de oliva/gua recentemente obtidas e armazenadas e condies e perodos diversos.
T0 Mdia Controle ida volta Estufa ida volta Refrigerador ida volta 72000,00 72666,67 70500,00 69833,33 74000,00 67333,33 DP 8000,00 8020,80 2179,44 1607,27 5656,85 12583,05 T15 Mdia 66500,00 67500,00 142666,67 138666,67 74833,33 73666,67 DP 6363,96 5656,85 13428,82 17953,64 6525,59 9305,016 T60 Mdia 64666,67 66166,67 159500,00 159666,67 71000,00 69666,67 DP 5965,17 6601,76 14256,57 13530,82 5267,82 5131,60 T90 Mdia 71500,00 88500,00 157666,67 157000,00 69666,67 68000,00 DP 4596,19 13332,29 38135,72 39281,03 8519,58 7549,83

Viscosidade referente tenso de cisalhamento de 0,05 s-1; Controle (amostras protegidas da luz e mantidas temperatura ambiente); Estufa (amostras mantidas temperatura de 50C); Ciclos (amostras submetidas por perodos alternados temperatura de -5C e 50C), Refrigerador (amostras mantidas temperatura de -5C). T0, T15, T60 e T90 correspondem ao 1, 15, 60 e 90 dia de armazenamento, respectivamente. Os resultados correspondem mdia de trs leituras com os respectivos desvios padro.

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tensoativos foram associados em propores variveis, de modo a originarem valores definidos, mas escalonados de EHL (Prista et al., 1995). Os resultados (Tabela 1) demonstram que a emulso (a base de leo de oliva) mais estvel corresponde ao ndice de cremeao de 98%, cujo EHL igual a 12. O valor de EHL do presente estudo se diferencia do obtido por Gullapppali & Sheth (1999), os quais apresentam um valor igual a 10. Segundo Gennaro (1999), a presena ou ausncia de qualquer polaridade no material a ser emulsificado pode afetar a polaridade exigida do agente emulsificante. O leo de oliva contitudos por triglicerdeos. A hidrlise destes compostos pode ocasionar a formao de cidos graxos livres (Driscoll et al., 2001), conferindo acidez ao leo; modificando, consequentemente, as propriedades fsico-qumicas do mesmo. Considerando que o ndice de acidez do leo de oliva empregado no presente estudo de 1%, logo a polaridade do presente leo requer emulsificantes com polaridades especficas, justificando, assim, os distintos valores de EHLs observados. Entretanto, os resultados obtidos esto condizentes com a literatura, no que se refere ao EHL da famlia dos leos vegetais, que est compreendido entre 7 e 12 (Prista et al., 1995). As associaes de agentes emulsionantes, todos com o mesmo EHL, resultam em emulses com estabilidades distintas. As misturas, que contm ao menos um emulsificante com cadeia de cido graxo insaturado similar ao leo de oliva (o qual possui em sua constituio principalmente cido olico (75%), bem como, cido linolico, cido esterico, cido palmtico) produziram emulses mais estveis, demonstrando que a similaridade estrutural entre os componentes da fase oleosa e os agentes emulsificantes essencial para a estabilidade da emulso (Petrowski, 1976; Garti & Remon, 1984; Gullapalli & Sheth, 1999; Aulton, 2005). Os colides hidroflicos tm sido freqentemente utilizados como auxiliares de emulsificao em emulses O/A, pois formam camadas multimoleculares ao redor das gotculas dispersas, bem como aumentam a viscosidade da fase contnua, retardando a separao gravitacional da fase dispersa, promovendo, assim, a estabilidade (Klinkesorn et al., 2004; Aulton, 2005). A estabilidade pode ser tambm favorecida pelo complexo formado entre o agente de viscosidade hidroflico e tensoativo hidroflico e pela interao do tensoativo hidroflico com a fase oleosa. Segundo Gullapalli & Sheth (1997), a metilcelulose melhora a estabilidade de emulses de leos polares de forma mais efetiva que leos apolares, em consequncia da complexao da metilcelulose com o tensoativo hidroflico no inico e da interao entre o leo polar com a cadeia apolar do tensoativo hidroflico no inico. Assim, visando otimizar a estabilidade dos sistemas, incorporou-se emulso com estabilidade mxima (monoleato de polioxietilenossorbitano (Tween 80) e lcool olelico etoxilado 3OE), os colides hidroflicos constitudos de polmeros do cido carboxivinlico (Carbopol 940) e de derivados da celulose (hidroxietilcelulose), como auxiliares de emulsificao. A adio de base inorgnica (soluo de NaOH 20% p/v) disperso aquosa dos polmeros, at a obteno de pH 5,5, otimizou o potencial de viscosidade do polmero do cido carboxivinlico. De acordo com a literatura, em uma emulso estvel as gotculas dispersas mantm suas caractersticas iniciais, 268

e permanecem uniformemente distribudas por toda a fase contnua. Entretanto, podem ocorrer vrios tipos de desvios deste comportamento, levando cremeao, floculao ou separao. Logo, um estudo aprofundado da estabilidade das emulses foi conduzido, objetivando antever possveis alteraes das amostras ao armazen-las em condies que acelerem mudanas passveis de ocorrer; permitindo, assim, obter informaes sobre a estabilidade do produto em menor tempo possvel (Brasil, 2004). A literatura apresenta diferentes mtodos objetivando caracterizao da estabilidade das emulses, dentro os quais podemos citar: exame macroscpico, pH, tamanho de partcula, centrifugao, viscosidade, potencial zeta e armazenamento sob condies adversas; que podem mostrar uma indicao rpida do grau de instabilidade. A emulso com estabilidade mxima nos estudos de EHL, acrescida dos auxiliares de emulsificao, foi submetida aos estudos preliminares de estabilidade, por um perodo de 15 dias (Brasil, 2004). Para caracterizao da estabilidade, as amostras foram examinadas macroscopicamente e submetidas s anlises de pH, viscosidade e centrifugao. Os resultados (Tabela 2) no demonstam alteraes nos parametros avaliados. Diante da estabilidade demonstrada nos estudos preliminares de estabilidade, a emulso foi submetida aos estudos de estabilidade acelerada, por uma perodo de 90 dias (Brasil, 2004). Para caracterizao da estabilidade, as amostras foram examinadas quanto ao aspecto, cor e odor; e submetidas s anlises de pH, centrifugao, viscosidade, potencial zeta e distribuio de tamanho de partcula. Os ensaios organolpticos permitiram avaliar, de imediato, o estado em que se encontravam as amostras em estudo por meio de anlises comparativas, com objetivo de verificar alteraes (Brasil, 2004), no que se refere cor, odor e aparncia; constatando semelhanas das emulses submetidas aos ensaios de estabilidade em relao s emulses recentemente elaboradas, independente das condies e perodos de armazenamento. Os ensaios de centrifugao das emulses armazenadas em condies e perodos diversos, objetivando verificar possveis instabilidade, como: separao de fase, coalescncia, entre outras, pelo aumento da mobilidade das partculas em consequncia do aumento da fora da gravidade (Brasil, 2004); demonstraram estveis, no apresentando cremeao, to pouco separao de fase. O pH de uma formulao deve garantir a estabilidade dos ingredientes da formulao, sua eficcia e segurana (Brasil, 2004), bem como ser compatvel com os fluidos biolgicos de acordo com a via de administrao pretendida. A maior estabilidade dos sistemas d-se quando estes so mantidos dentro de uma pequena variao de pH. Desta forma, a diminuio progressiva da estabilidade d-se quando o pH se afasta de seu limite timo (Gennaro,1999). O pH das emulses em estudo foi ajustado, com hidrxido de sdio 20% p/v, para o pH 5,49 0,03, visando adequar o produto via de administrao, bem como otimizar a viscosidade do polmero derivado do cido carboxivinlico; e acompanhado durante os estudos de estabilidade. Os resultados (Tabela 3) demonstram que as emulses armazenadas em perodos (15, 60 e 90 dias) e em condies diversas de temperatura (ambiente,
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Este tipo de comportamento desejado em formulaes farmacuticas. necessrio ter uma viscosidade aparente elevada a baixas tenses de cisalhamento para impedir a mobilidade da fase dispersa, sendo importante que apresentem fluxo livre quando agitados, apresentando baixa viscosidade frente a altas tenses de cisalhamento, sendo essas alteraes reversveis aps certo tempo de repouso, retardando a coalescncia ou a cremeao (Aulton, 2005).

50 e -5C), no apresentam variao significativa de pH, quando comparadas com o pH das emulses recentemente obtidas (p>0,05). Entretanto, observa-se uma ligeira diminuio do pH dos sistemas armazenados em estufas e em refrigeradores, sendo indicativos de instabilidade. Segundo Masmoudi et al. (2005), a diminuio do pH pode representar uma oxidao da fase oleosa com formao de hidroperxidos ou mesmo a hidrlise de triglicerdeos levando formao de cidos graxos (Masmoudi et al., 2005; Driscoll et al., 2001). Segundo Aulton (2005), a instabilidade de uma emulso resulta de qualquer processo que cause um progressivo aumento do tamanho das partculas, e um alargamento na distribuio de tamanhos, de forma que, por fim as partculas dispersas podem tornar-se to grandes a ponto de separar-se como lquido livre. Logo, um mtodo preciso para a determinao da estabilidade avaliar o tamanho dos glbulos com tempo. A anlise do perfil de distribuio do tamanho de partculas das emulses recentemente obtidas demonstra uma distribuio monomodal, sugerindo uma distribuio uniforme de partculas (Figura 1). Comportamento semelhante apresentam as amostras armazenadas temperatura ambiente e protegidas da luz por 60 e 90 dias. Entretanto, as amostras armazenadas por 60 e 90 dias em estufa 50 ou em refrigerador -5C apresentam distribuio bimodal, caracterizando instabilidade destas emulses sob estas condies de armazenamento. A avaliao da viscosidade ajuda a determinar se um produto apresenta a consistncia ou fluidez apropriada e pode indicar se a estabilidade adequada, ou seja, fornece indicao do comportamento do produto ao longo do tempo (Brasil, 2004). A reologia da emulso uma manifestao direta da interao das foras que ocorrem no sistema. As instabilidades provenientes da variao no tamanho e no nmero de partculas e na orientao ou migrao do emulsionante durante um perodo de tempo podem ser detectadas por meio de alteraes na viscosidade aparente do produto (Logaraj et al., 2008; Mostefa et al., 2006; Aulton, 2005; Tadros,1999; 2004). A avaliao do comportamento reolgico em funo da temperatura fundamental para obter informaes da estabilidade fsica e consistncia do produto. Segundo Aulton, (2005), a solubilidade de emulsionantes no-inicos muda com o aumento da temperatura e temperaturas acima de 70C destri a maioria das emulses. Por outro lado, o gelo formado a baixas temperaturas provoca a quebra das emulses por romper o filme interfacial. As Figuras (Figura 2) representadas demonstram que as amostras em estudo apresentam fluxo pseudoplstico, com a viscosidade diminuindo com o aumento da tenso de cisalhamento aplicada.

Os estudos reolgicos das emulses, que foram submetidas s condies e perodos diversos de armazenamento, demonstram que o comportamento reolgico pseudoplstico no se modifica. Entretanto, observa-se que a viscosidade se altera dependendo destas condies de armazenamento (Tabela 4). As amostras armazenadas por 15, 60 ou 90 dias temperatura ambiente ao abrigo da luz, ou sob refrigerao -5C, no apresentam alteraes significativas em relao s recentemente,obtidas. Entretanto, as emulses em estudo apresentam variaes representativas da viscosidade quando armazenadas temperatura de 50C. A viscosidade das amostras aumenta quando armazenadas sob estas condies. Observouse um aumento da viscosidade (referente viscosidade de ida), em relao s emulses recentemente obtidas, de aproximadamente 2,0 (p<0,01), 2,2 (p<0,001) e 2,2 (p<0,001) vezes, para a tenso de cisalhamento de 0,05 s-1, das amostras armazenadas 50C por 15, 60 e 90 dias, respectivamente. Aumento semelhante da viscosidade foi observado por Leonardi et al. (2000) e Guaratini et al.(2006), os quais atriburam tal observao evaporao da gua das formulaes. Os agentes emulsionantes atuam como uma barreira alterando a razo de coalescncia da fase dispersa, ou criam um filme interfacial que produz foras eletrostticas repulsivas entre as fases dispersas. Com o uso de agentes emulsionantes inico, uma monocamada adsorve em volta da fase dispersa. A carga da superfcie influncia a distribuio de ons no meio aquoso. ons de carga oposta superfcie so atrados em direo superfcie (denominados contraons), e ons de carga de mesmo sinal so repelidos para longe da superfcie (denominados co-ons), resultando na formao de uma dupla camada eltrica em volta da fase dispersa. A dupla camada consiste da superfcie carregada e de um excesso de neutralizante de contra-ons sobre coons, distribudos de uma maneira difusa no meio aquoso. Se a concentrao do contra-on baixa, a espessura da dupla camada larga, a fora repulsiva alta, fazendo com que as fases dispersas se repelem entre si. Logo, o potencial produzido pela dupla camada ocasiona um efeito repulsivo entre as gotculas da fase dispersa, evitando a coalescncia (Aulton, 2005; Lieberman et al., 1988; 1989). A diferena de potencial entre a camada de ons prxima superfcie da partcula e a regio eletroneutra da soluo denominada potencial zeta e pode ser mensurada por microeletroforese. Quando o potencial zeta alto, as foras repulsivas predominam em relao s atrativas de London, fazendo com as gotculas fiquem dispersas no sistema. Por outro lado, quando o potencial zeta baixo, as foras atrativas predominam em relao s repulsivas, favorecendo a aproximao das partculas, podendo resultar em instabilidade da preparao (Aulton, 2005; Lieberman et al., 1988; 1989). O uso de tensoativo no inico resulta tambm na formao da dupla camada eltrica ao redor da gotcula dispersa. Segunda a literatura, tal observao se deve ao pH e fora inica da fase aquosa (Ahmad et al.,1996; Ho & Ahmad, 1999; Hsu & Nacu, 2003). A carga eltrica mensurada em emulses estabilizadas com tensoativos no inicos tem sido atribuda adsoro dos ons H3O+ (em pH baixo) ou OH- (em pH alto) da gua (Ho & Ahmad,1999).

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A fim de caracterizar o grau de repulso das gotculas dispersas, as emulses de leo de oliva/gua estabilizadas com a associao de tensoativos no inicos (Tween 80/ lcool olelico etoxilado 3OE) foram analisadas quanto ao potencial zeta. Os resultados apresentados na Tabela 5 mostram que as emulses armazenadas em condies diversas apresentam diferenas absolutas do potencial zeta maiores que 10 mV. De acordo com Roland et al. (2003), quando a diferena absoluta do potencial zeta for ao menos de 10 mV, pode-se predizer que amostras apresentam estabilidades distintas. Os resultados demonstram, ainda, que houve uma reduo da magnitude do potencial zeta nas emulses armazenadas em estufa 50C ou sob refrigerao -5C por 90 dias, em relao s recentemente obtidas. Segundo a literatura, os sistemas so considerados estveis quando possuem um valor absoluto maior que 25 mV (Lieberman et al., 1989). Assim, quando o potencial zeta relativamente alto, maior que 25 mV (valor absoluto), as foras repulsivas predominam em relao s atrativas de London, logo o sistema est disperso. Quando o potencial zeta relativamente baixo, menor que 25 mV (valor absoluto), as foras atrativas predominam em relao s repulsivas, as partculas se aproximam, floculando (Lieberman et al., 1989), podendo levar separao de fases. Logo, as emulses armazenadas em estufa 50C ou sob refrigerao -5C por 90 dias apresentam valores de potencial zeta fora dos limites considerados estveis. Segundo a literatura, o pH, bem como a fora inica podem interferir no potencial zeta (Ahmad et al.,1996; Ho & Ahmad, 1999; Hsu & Nacu, 2003). Como previamente mencionado, os pHs dos sistemas foram ajustados para 5,490 (0,031), antes dos estudos de estabilidade, empregando 0,5 mL da soluo de hidrxido de sdio a 20% p/v. Entretanto os resultados demonstram que os pHs dos sistemas submetidos ao aquecimento em estufa 50C ou a refrigerao -5C sofreram uma ligeira reduo, possivelmente decorrente da degradao de algum componente da formulao, justificando, assim, a reduo do potencial zeta. Alia-se reduo do potencial zeta, a diminuio da viscosidade aparente e o aumento da motilidade cintica nos sistemas armazenados sob aquecimento; e cristalizao de compostos da formulao nos sistemas armazenados sob aquecimento e refrigerao. O aumento da temperatura leva diminuio da viscosidade aparente e ao aumento da motilidade cintica, tanto da fase dispersa, quanto do prprio agente emulsionante na interface leo/gua, fazendo com que a barreira energtica seja facilmente vencida, aumentado, assim, o nmero de colises entre as gotculas (Aulton, 2005). A cristalizao de componentes da formulao, em conseqncia da refrigerao, ou da volatilizao do solvente do sistema, exerce presses anmalas sobre a fase dispersa e sobre a camada emulsionante, ou ainda leva concentrao de eletrlitos dissolvidos, afetando a densidade de cargas das gotculas (Aulton, 2005; Cortes-Munz & Chevalier-Lucia; Dumay, 2009). Estes efeitos podem levar desestruturao do meio, conduzindo instabilidade das preparaes, que pode ser observada pela distribuio bimodal de tamanho da partcula.

Por outro lado, os sistemas armazenados temperatura ambiente em perodos diversos e protegidos da luz, no demonstram variao de pH e apresentam um potencial zeta favorvel (menor que -25 mV) , embora varivel, possivelmente oriundo da acomodao dos sistemas at o estabelecimento do equilbrio, caracterstica, esta, que pode ser evidenciada pela distribuio de tamanho de partcula. Diante resultados de estabilidade apresentados, pode-se concluir que as emulses leo de oliva/gua mantm-se estveis quando armazenadas temperatura ambiente e protegidas da luz, empregando a associao de monooleato de polioxietilenossorbitano e lcool olelico etoxilado 3OE (EHL 12), como agentes emulsivos, que possuem similaridade estrutural com a fase oleosa, e carbopol 940 e hidroxietilcelulose, como agentes de viscosidade e auxiliares da emulsificao.
AGRADECIMENTOS Universidade de Uberaba - UNIUBE e Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, em especial Profa. Dra. Maria Vitria Lopes Badra Bentley e ao Farmacutico Jos Orestes Del Ciampo pelo consentimento e a realizao, respectivamente, das anlises de potencial zeta e tamanho de partcula. ABSTRACT Development of olive oil-in-water emulsions: assessment of physical stability

Olive oil-in-water emulsions, developed with non-ionic emulsifiers, were assessed with regard to physical stability. Emulsions were prepared with two different emulsifiers, one of which was hydrophilic and the other lipophilic, in various proportions. To improve emulsion stability, auxiliary emulsifiers were added to the stablest emulsions and stability studies were carried out, in which the samples were stored for different periods and under various conditions. To test emulsion stability, the samples were examined macroscopically and various physicochemical properties, such as pH, centrifugation, viscosity, zeta potential and particle size distribution, were assessed. The results showed that olive oil-in-water emulsions are organoleptically and physicochemically stable, when stored at room temperature and protected from the light. Out of the emulsions developed, the most stable was based on an emulsifier blend that resulted in a hydrophilic-lipophilic balance (HLB) of 12. A blend of emulsifiers with unsaturated fatty acids of similar chain length to that of olive oil produced the stablest emulsions, showing that structural similarity between the hydrocarbon moieties of the oil phase and the surfactant is essential to successful emulsion stabilization. Keywords: O/W emulsion. Stability. Olive oil. HLB. Nonionic emulsifier.

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