Mutaciones y Mutantes Bacterianas Una mutacin puede definirse como un cambio heredable en la secuencia de bases del DNA del

genoma de un organismo. La clula que experimenta ese cambio es una mutante. Segn sea la mutacin, sta puede expresarse o no, es decir, puede observarse o no una alteracin en el fenotipo. Una mutante diferir de la cepa progenitora no mutada, en el genotipo ( composicin en genes de su genoma), pero tambin pueden alterarse sus propiedades visibles ( fenotipo). Segn sea la mutacin, un mutante puede o no presentar alteraciones en su fenotipo. Por convencin, un gen en particular que forma parte del genotipo de un organismo, se designa con tres letras minsculas y una cuarta mayscula. Por ejemplo, el gen hisC del E. coli codifica la protena hisC, que participa en la va metablica que sintetiza el aminocido histidina. Las propiedades que caracterizan el fenotipo de una cepa bacteriana se designan con tres letras, la primera mayscula y las restantes minsculas, seguidas de un signo ms o menos que indica que la cepa posee o no esa propiedad. Una cepa de E. coli His+ indica que esa cepa es capaz de sintetizar histidina, mientras que una cepa His - carece de esa capacidad. Si una cepa bacteriana aislada de la naturaleza, no ha experimentado mutacin alguna, es una cepa salvaje. Pueden distinguirse dos clases de mutaciones: selectivas o no selectivas. Una mutante selectiva es aquella a la que la mutacin le otorg una determinada ventaja ( por ejemplo, la capacidad de resistir a un antibitico). Una mutacin no selectiva no confiere ventaja alguna, como ocurre por ejemplo entre dos cepas cuya pigmentacin se ha alterado por mutacin. La seleccin de las mutantes es un arma muy til en gentica, y debe permitir aislar una mutante en una poblacin de millones de organismos parentales. Existen numerosas mutantes, entre las que se pueden mencionar: -Mutantes inmviles: se pierde la capacidad de sintetizar flagelos, o bien, la funcionalidad de los mismos. -Mutantes morfolgicas: colonias de tipo lisa ( Colonias S, smooth) pueden mutar y convertirse en colonias rugosas ( R, rough) por cambios en la capa lipoproteica de la pared celular. -Mutantes sensibles al fro: la mutacin produce una alteracin en un protena esencial para la tolerancia a las bajas temperaturas. ( Mutante letal condicional: slo es letal a bajas temperaturas) -Mutantes auxotrofas: si una cepa salvaje es capaz de producir un aminocido que le es imprescindible para sobrevivir ( por ejemplo, alanina) es una cepa protrtrofa. Al perder por mutacin esta capacidad de sntesis de alanina, se convierte en auxtrofa, y la consecuencia es que no puede desarrollar en ausencia de este aminocido. ( Mutante letal condicional) Para que pueda desarrollar, es imprescindible agregar al medio de cultivo el aminocido. Bases moleculares de la mutacin Muchas mutaciones se originan espontneamente ( mutaciones espontneas) y otras se producen por el tratamiento de las clulas con agentes mutgenos ( mutaciones adquiridas). Para determinar el mecanismo que da lugar a una mutacin, se obtiene mucha informacin si se conoce el modo de accin de los agentes mutgenos . Las mutaciones espontneas pueden tener lugar durante la replicacin del DNA, debido a un apareamiento de bases errneo, errores que ocurren con una frecuencia de 10 -7 a 10-12 . Aquellas mutaciones que involucran un par de bases ( o unos pocos pares de bases), se llaman mutaciones puntuales. Este tipo de mutaciones puede surgir de substituciones en un par de bases, como tambin por inserciones o deleciones. La modificacin por alteracin en el marco de lectura puede deberse a una insercin o delecin de bases, ya que la secuencias de bases

se lee a partir de un extremo en bloques de tres. Cualquier delecin o insercin de bases, puede modificar el marco de lectura, y por ende, la traduccin. Las alteraciones que pueda producir una mutacin puntual dependen en parte del lugar donde ocurra la mutacin. Si causa la substitucin de un aminocido por otro, y esto no trae consecuencias ( la protena sintetizada con este aminocido cambiado no pierde su actividad ), la mutacin no se expresar, pero si esta substitucin altera la protena, puede llegarse a sintetizar una protena no funcional, o bien, no sintetizar protena alguna. Si la mutacin compromete muchos pares de bases, pueden ocurrir deleciones ( se elimina una parte del DNA), que, segn sea su importancia, pueden causar la prdida de la funcionalidad del gen afectado. Algunas deleciones son de tal longitud, que afectan varios genes. Las inserciones ocurren cuando se insertan nuevas bases en el DNA. Si se inserta un nmero reducido de bases, esto puede deberse a errores en la replicacin, pero cuando el nmero de bases es grande, , es el resultado de errores ocurridos en la recombinacin gentica. Modo de accin de agentes mutagnicos Una variedad de agentes mutgenos qumicos son anlogos de base ( bases que semejan las purinas y pirimidinas del DNA ) que tienen propiedades de apareamiento diferentes En algunas ocasiones se incorpora al DNA alguno de estos anlogos ( por errores de replicacin) y esta mutacin se expresa en la progenie, en la clula que contiene la hebra de DNA que se ha replicado en forma errnea. Por ejemplo, el 5-Bromo-Uracilo se incorpora como timina, pero ocasionalmente se aparea como si fuese citosina. El resultado es que el par AT se ha convertido en CG.Los anlogos de bases slo se incorporan durante la replicacin. El cido nitroso reacciona con el DNA , desaminando las bases adenina y citosina. Induce las substituciones de pares de bases(ATGC y GCAT) Las acridinas son molculas planares que pueden insertarse entre dos pares de bases del DNA y aumentar la distancia entre ellas. Durante la replicacin, puede insertarse una base extra en el DNA, con lo que se modifica el marco de lectura. Radiaciones Algunas formas de radiacin son altamente mutgenas. Las radiaciones pueden ser ionizantes y no-ionizantes y estas ltimas son de mayor aplicacin como agentes mutagnicos. El efecto ms difundido de la radiacin UV sobre el DNA es la formacin de dmeros de pirimidina. Estos dmeros se forman como consecuencia de uniones covalentes entre bases pirimidnicas del DNA, por lo que, al replicarse el DNA, se aumenta la probabilidad de insercin de bases errneas en el lugar del dmero. Como fuente de luz UV se utiliza una lmpara germicida que emite radiaciones en la regin de 260 nm. Al aplicar esta radiacin a una poblacin bacteriana, se produce la muerte de 90 a 95% de la misma, y las mutantes se hallan entre las que sobreviven. Respuesta SOS Algunas mutaciones se originan como consecuencia de reparaciones errneas de alteraciones provocadas en el DNA por determinados agentes mutagnicos. Debido al dao sufrido por el DNA se pone en marcha un mecanismo de reparacin conocido como sistema regulador SOS. El dao causado en el cido nucleico acta como alarma sobre la clula. Esta alarma se manifiesta en la de-represin de coordinada de ciertas funciones celulares, como el sistema SOS. Este sistema percibe el dao causado en la clula y activa mecanismos reparadores que incluyen escisin de la zona del DNA afectada, insercin de las bases correctas y posterior

unin de esas bases en el DNA. Cuando el dao ha sido reparado, el sistema SOS deja de actuar. Este sistema tiende a producir errores, por lo que durante la reparacin, se originan muchas mutaciones. Aunque el mecanismo de accin de muchos agentes mutagnicos es conocido, no puede predecirse el efecto de un mutgeno en un gen especfico, o el efecto sobre un proceso complejo, como puede ser la sntesis de un metabolito secundario. Deben tenerse en cuenta varios factores: 1- La aparicin de mutaciones depende de la secuencia de bases del gen que va a ser mutado. Las mutaciones no se distribuyen homogneamente en el genoma, ya que existen reas con mayor frecuencia de mutagnesis. 2- Si la clula posee mecanismos de reparacin poco efectivos, puede perder viabilidad, de forma que los mutgenios no ejerzan su accin. 3- Las condiciones de tratamiento suelen ser crticas. Factores como pH,, tiempo de exposicin , concentracin del agente mutagnico, temperatura, fase de crecimiento del microorganismo a mutar, son variables que afectan la eficiencia de la mutacin. Ingeniera Gentica Los conceptos de biologa molecular han permitido el desarrollo de la ingeniera gentica. Existe una tecnologa de genes que abarca tcnicas de recombinacin in vitro, clonacin y manipulacin de genes e ingeniera gentica. Por estas tcnicas se introducen secuencias especficas de DNA en organismos procariticos o eucariticos. Una parte importante de la ingeniera gentica abarca los procedimientos mediante los cuales se modifican los sistemas genticos microbianos, de modo que la replicacin de un gen o la sntesis de un producto de un gen queden bajo el control del operador. La clonacin de genes consiste en: 1- Aislamiento de un gen determinado del DNA de un organismo y su posterior incorporacin en un vector de clonacin adecuado. 2- Incorporacin del DNA en un organismo receptor. 3- Deteccin de las clulas transformadas y aislamiento de un cultivo puro. 4- Produccin de grandes cantidades de clulas que contengan el fragmento de DNA clonado. De este modo, se han obtenido cepas bacterianas con un gen o grupo de genes provenientes de otro organismo. El trmino DNA recombinante se emplea para designar molculas que contienen fragmentos de DNA no emparentados. Para llevar a cabo esta tcnica se necesita: 1-Enzimas. Las endonucleasas de restriccin son enzimas altamente especficas que hidrolizan la doble cadena del DNA en secuencias que tienen una simetra doble alrededor de un punto determinado. (secuencias palindrmicas) Por ejemplo, la EcoRI, endonucleasa de restriccin del E. coli presenta la siguiente secuencia de reconocimiento: G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G Esta especificidad significa que si la misma secuencia se halla repetidas veces en el DNA de un organismo, la enzima de restriccin realizar rupturas bicatenarias, rupturas que no son sometidas a procesos de reparacin. Por la accin de estas enzimas, se obtienen fragmentos de DNA, que tienen extremos definidos ( extremos producidos por la accin hidrolizante de las enzimas de restriccin). 2-Vectores de clonacin: molcula capaz de llevar a cabo la replicacin de fragmentos de DNA extraos. Los vectores de clonacin deben cumplir los siguientes requisitos: a) replicarse en forma autnoma en el husped;2) su DNA debe poder separarse del DNA del husped para

purificarse; 3) contener regiones de DNA que no sean esenciales para su replicacin y que puedan, por lo tanto, ser substitudas por fragmentos de DNA extrao. Es conveniente que el DNA del vector sea pequeo, y capaz de introducirse en el husped, a fin de replicarse y permitir la obtencin de muchas copias. Debe ser estable en el husped, y capaz de expresar el gen insertado. Los vectores de clonacin son los fagos, los plsmidos y los csmidos (Hbridos artificiales fago-plsmido). 3- Vectores de expresin: no slo contienen el gen o genes deseados, sino tambin las secuencias reguladoras de su expresin. ( secuencias del operador y promotor) lo que asegura la eficiencia de su transcripcin. 4- Vectores para secuenciacin : son aquellos que contienen un nmero creciente de sitios de reconocimiento para enzimas de restriccin. Cuando el DNA extrao se incorpora a este tipo de vector, se producen y secuencian fragmentos de DNA de tamao variable. 5- Huspedes: las caractersticas principales de los huspedes son: a) crecimiento rpido; b) capacidad de proliferar en un medio de cultivo no costoso; c) no ser patgeno; d) ser estable. Casi todos los estudios de clonacin molecular se han realizado en Escherichia coli , pero presenta ciertas desventajas, debido a que se halla en el sistema digestivo humano, y y es un patgeno potencial. Adems, existen cepas de E. coli no patgenas que producen endotoxinas, que pueden contaminar los productos. Se postula actualmente al Bacillus subtilis , que, aunque no es patgeno, presenta algunas desventaja ( El DNA clonado puede perderse). La clonacin en organismos eucariotas se ha realizado principalmente en la levadura Saccharomyces cerevisiae , especialmente con la finalidad de producir protenas eucariticas.