EFECTOS MORFOLGICOS Y COMPORTAMENTALES EN LARVAS DE EngystomopspustulosusEXPUESTAS A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ZnCl2 MORPHOLOGICAL AND BEHAVIORAL EFFECTS INEngystomopspustulosus LARVAE EXPOSED

TO DIFFERENT CONCENTRATIONS OF ZnCl2 Barros E, Lara L, Linares K, Palmera K, Polo F &Ropain E Programa de biologa, Universidad del Magdalena, Carrera 32 No 22 08, Santa Marta, Magdalena, Colombia, 2013. freddy.biologo@gmail.com.

RESUMEN Durante este estudio se observaron los cambios morfolgicos y comportamentales en larvas de Engystomopspustulosus sometidos a distintas concentraciones de ZnCl2, los tratamientos usados partieron de una solucin madre de 20 mg/L considerndola como el tratamiento Control (T1). Posteriormente se consiguieron las dems concentraciones aforando con agua destilada hasta obtener concentraciones de 0.001 mg/L (T2), 0.1 mg/L (T3), 1 mg/L (T4) y 4 mg/L (T5). De cada tratamiento se hicieron tres replicas y en cada una de ellas se depositaron 20 renacuajos en estado de desarrollo 23 segn la clasificacin de Gosner (1960). Las observaciones se realizaron a 12, 24, 43, 67 y 94 horas despus del montaje inicial, mientras que los recambios se solucin se hicieron cada 24 horas. Se logro observar una baja respuesta al tacto por parte de las larvas sometidas al Tratamiento 4 y 5 luego de 94 horas de exposicin al metal. Tambin se observ despigmentacin de los individuos a las 43 horas en las larvas del Tratamiento 5. En cuanto a los efectos comportamentales se aprecio un nado errtico considerado como un movimiento sin direccin. De igual forma se present canibalismo entre algunos ejemplares. Solo un individuo muri probablemente por efectos de un mal trato a la hora de manipularlos, mas no por efectos directos del ZnCl2. Palabras clave: errtico, despigmentacin, larvas, metales, canibalismo. ABSTRACT During this study, the morphological changes were observed in larvae and behavioral Engystomopspustulosus under different concentrations of ZnCl2, the treatments used starting from a solution of 20 mg / L regarding it as the control treatment (T1). Subsequently the other concentrations achieved with distilled water to concentrations of 0.001 mg / L (T2), 0.1 mg / L (T3), 1 mg / L (T4) and 4 mg / L (T5). In each treatment there were three replicates and each was placed 20 tadpoles in developmental stage 23 according to the classification of Gosner (1960). Observations were made at 12, 24, 43, 67 and 94 hours after initial assembly, while the parts are made solution every 24 hours. We achieved a low response observed to the touch by the larvae exposed to Treatment 4 and 5 after 94 hours of exposure to the metal. Also we observed depigmentation in the larvae 43 hours of Treatment 5. For the behavioral effects we appreciate a erratic swimming motion without direction. Similarly cannibalism was presented in some specimens. Only one larvae died probably as the result of a bad deal when it comes to handling, but not by direct effects of ZnCl2. Key words: erratic, depigmentation, larvae, metals, cannibalism.

INTRODUCCIN Engystomopspustulosus, es una especie que tiene una amplia distribucin, se encuentran en sabanas de tierras bajas y entornos abiertos, como bosque seco tropical y bosques montaosos, hmedo natural y perturbado, alrededor de charcas de agua naturales o causados por el hombre. Los machos flotan en el agua mientras llaman en la noche a la hembra. Se reproduce en piscinas temporales y permanentes. Las hembras de esta especie prefieren anidar comunalmente cuando han encontrado al macho en la misma zona (Santos-Barrera, et al. 2010).Ponen los huevos en estanques de agua y el nido est conformado de espuma, que evita la desecacin en pocas de sequa, los huevos estn bajo esta cubierta de espuma para evitar la depredacin (Ryan, 1985; Tarano 1998). En la actualidad, el medio ambiente es continuamente contaminado por tanto factores naturales y las actividades humanas tales como la industrializacin, procesos mineros, el intenso cultivo tierras, etc. (Alloway, 1990). Los metales pesados son un problema importante porque son txicos y tienden a acumularse en los organismos vivos. Los ambientes acuticos reciben contaminantes no slo desde el aire, sino tambin de la tierra, y por lo tanto son altas las probabilidades de estar ms contaminado que la tierra, este ltimo de vez en cuando recibe contaminantes de las fuentes de agua. Los ambientes acuticos tambin reciben las aguas residuales e industriales, como resultado de muchos puertos de pases industrializados estn muy contaminados con tanto contaminantes orgnicos e inorgnicos (McCarthy y Shugart, 1990). La evidencia obtenida en investigaciones nos muestra que muchas de las poblaciones de anfibios estn disminuyendo drsticamente e incluso que la extincin se ha producido en unas pocas poblaciones (Carey y Bryant, 1995). En algunos casos, un cambio antropognico en el medio ambiente est implicado como la causa directa de muerte y en otros casos la extincin de anfibios por contaminaciones antropognicas y cambios que incluyen la destruccin del hbitat, los vertidos de diversas sustancias txicas en el medio ambiente en el que el anfibios viven o el aumento de la radiacin UV-B debido al agotamiento de la capa de ozono(Blaustein et al., 1994). La contaminacin metlica de agua dulce es una de las formas ms comunes y persistentes de contaminacin y puede provenir de muchas fuentes, como la agricultura, la minera y la industria. Igualmente importante, es el hecho de que el aumento de las concentraciones de un metal a menudo se relacionan con una mayor las concentraciones de otros (Tyler andBuckley, 2007). El cobre y el zinc son dos de los contaminantes metlicos encontrados ms comnmente en losaguas dulces y estudios previos han demostrado tanto aditiva (Cooper et al., 2009) y las interacciones antagnicas entrezinc y cobre (Santos et al., 2000).

MATERIALES Y MTODOS Las larvas de Engystomopspustulosus fueron colectadas en un afluente de agua en horas de la maana, estas fueron depositadas en bolsas de plstico y una vez llevadas al laboratorio fueron transferidas a un Beaker con capacidad de 1000 ml el cual contena agua destilada para mantener vivas las larvas. Inicialmente se prepar una solucin madre a una concentracin de 20 mg/L de ZnCl 2, de la cual se tomaron 100 l y luego se afor hasta 200 ml con agua destilada para el obtener el tratamiento 2 con una concentracin de 0.001 g/ml y para la preparacin de los tratamientos 3, 4 y 5 se tomaron 750 l, 3.75 ml y 7.5 ml de la solucin madre, los cuales fueron colocados en 3 diferentes Erlenmeyers y se aforaron hasta 150 ml con agua destilada para obtener las concentraciones de 0.1 g/ml, 1 g/ml y 4 g/ml.

El control fue el tratamiento 1. Luego, se realizaron 3 rplicas con cajas Petri para cada tratamiento y posteriormente, se colocaron 20 renacuajos de E. pustulosusutilizando una pipeta para cada replica la cual contena 40 ml de solucin de cada tratamiento y que fueron adicionados previamente con una probeta de 50 ml, de igual manera se coloc un control con las mismas 3 rplicas en agua destilada (ver Figura 1). Finalizado el montaje inicial se hizo un cambio de individuos pequeos por individuos de mayor tamao en todos los tratamientos y luego el montaje fue colocado en un lugar seguro. Con ayuda de la tabla de Gosner, 1960 se identific el estado de las larvas con un estereoscopio Nikon SMZ 745. Se hicieron cinco observaciones a partir de 12, 24, 43, 67 y 94 horas despus de hacer el montaje de las larvas en las cajas Petri y se registraron los datos en las tablas correspondientes que contenan la siguiente informacin: Numero de la tabla, Fecha, Hora, Temperatura y Estado predominante; en cuanto al comportamiento nado errtico (NE) y nado normal (NN); entre los cambios fsicos y fisiolgicos, la dinmica (D) dinamica activa (A) y pasiva (P); forma de la cola atrofiada (CA) y cola normal (CN); eviscerados (ME) y no eviscerados (MN) y para individuos vivos (V) y muertos (M). Se registraron los datos en nmero o en letra dependiendo al tipo de informacin requerida por la tabla (ver Tablas en Anexos). Dichas muestras se mantuvieron a temperaturas entre 21.5 y 25.2 C en 16 horas de luz y 8 de oscuridad, teniendo en cuenta el horario en el cual funciona el laboratorio. El recambio de las diferentes soluciones de cada tratamiento se hizo a las 24 horas para recoger y eliminar los residuos orgnicos y de ah en adelante al momento de cada observacin. Los individuos muertos fueron depositaron en tubos eppendorf con agua destilada y posteriormente refrigerados.

RESULTADOS A las 12 horas luego de haberse realizado el montaje, todos los individuos de los diferentes tratamientos incluyendo el control estaban vivos, presentando un estado de desarrollo 23 segn la clasificacin de Gosner,1960; cabe resaltar que pudo haber una modificacin en la concentracin inicial de la solucin de cada tratamiento ya que se hizo un recambio de individuos pequeos por individuos grandes y de esta manera los tratamientos se contaminaron con partculas de agua destilada (ver Tabla 2 en los Anexos). Luego de haber transcurrido 24 horas se realiz la segunda observacin y el primer recambio de las soluciones, no se present ningn individuo muerto y tampoco se observaron alteraciones morfolgicas ni en el comportamiento (ver Tabla 3en los Anexos). Luego de 43 horas de exposicin se realiz la tercera observacin y el segundo recambio, en las rplicas del tratamiento 5 se observa nado errtico con 11,9 y 13 individuos para las rplicas 5.1,5.2 y 5.3 respectivamente; tambin se observ una dinmica activa-pasiva por parte de los individuos como respuesta al tacto, en las rplicas 5.1, 5.2 y 53 se presenta despigmentacin en 12, 8 y 9 individuos respectivamente (ver Tabla 4en los Anexos). 67 horas despus se hizo la cuarta observacin y el tercer recambio, se comenz a observar el nado errtico en las rplicas 4.1, 4.2 y 4.3 con 8, 13 y 9 y para las rplicas 5.1, 5.2 y 5.3 con 16, 17 y 15 individuos respectivamente; los individuos presentaban en algunos casos baja respuesta al tacto pero tambin se encontr una dinmica activa en el movimiento sin direccin por parte de estos (ver Tabla 5 en los Anexos). Como resultados relevantes de la investigacin, se obtuvo que a las 94 Horas despus de haberse hecho el montaje y haberse recolectado los respectivos datos; los cuales estn descritos en las Tablas consignadas en los Anexos, la mayora de los individuos de lasrplicas de los tratamientos 4 y 5 presentaban nado errtico como alteracin en el comportamiento normal; con un total de 50 y 58

individuos para los tratamientos 4 y 5 respectivamente. Tambin se logr observar una pigmentacin clara o despigmentacin, siendo esta ltima alteracin morfolgica mayormente resaltada por los individuos de las rplicas del tratamiento 5, en donde se encontraron 55 individuos con la alteracin y el tratamiento 4 con 29 individuos en menor medida (ver Tabla 6 en los Anexos). Se present un individuo muerto en la rplica 3 del tratamiento 2 (ver Figura 2 en los Anexos), el cual puede estar asociado a maltrato fsico durante el recambio de la solucin en este tratamiento y no a la concentracin de la solucin. Posteriormente se observ canibalismo por parte de los individuos (verFigura3en los Anexos). La Tabla 1 contiene la informacin del montaje inicial (ver Anexos). Las figuras 4 y 5(ver en los Anexos)son imgenes un individuo sano (control) al inicio del montaje en el tratamiento 5 en la rplica 2 y un individuo con la despigmentacin o pigmentacin clara en el tratamiento 5 en la rplica 2 a las 94 horas.

DISCUSIN El zinc en su forma Zn+2 es la que verdaderamente posee capacidad txica respecto a los organismos acuticos, bloqueando la funcin cataltica del Ion Calcio y Magnesio sobre estructuras celulares, y al no haber un mecanismo de eliminacin natural, el zinc se acumula en estas estructuras; esto ocurre en aguas con poca dureza (Prez y Rodriguez, 2008) que generalmente poseen un pH inferior a 7. Segn Chapman (1996), valores de pH menores de 6,8 y mayores de 9,0 pueden ocasionar limitaciones en el desarrollo embrionario y fisiolgico de los organismos de hbitats acuticos. Tejeda y Fieques (2003) afirman en su estudio que renacuajos de Pelophylaxperezi (Rana perezi S. 1885) sometidos a aguas contaminadas con metales pesados (incluyendo el zinc) y con un pH inferior a 5.5 presentaron limitaciones en su capacidad natatoria, similar a lo ocurrido en el experimento. Sin embargo, las consecuencias que ocasiona la acumulacin de zinc en tejidos de anfibios parecen tener menor efecto etolgico y teratolgico respecto a otros metales pesados como el Mercurio (Muoz y Palacio, 2010), Plomo, Cadmio, y compuestos orgnicos insecticidas o herbicidas como el glifosato (Lajmanovichet al. 2003; Lajmanovichet al. 2005; Lajmanovichet al. 2009; Rileyet al. 2011), adems de no presentar letalidad segn las concentraciones empleadas.

BIBLIOGRAFA Alloway, B.J., 1990. Cadmium. In: Alloway, B.J. (Ed.), Heavy Metals in Soils. Wiley, New York, pp. 100-124. Blaustein, A.R., Ho man, P.D., Hokit, D.G., Kiesecker, J.M., Walls, S.C., Hays, J.B., 1994. UV repair and resistance to solar UV-B in amphibian eggs: a link to population declines? Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 91, 17911795. Carey, C., Bryant, C.J., 1995. Possible interrelations among environmental toxicants, amphibian development, and decline of amphibian populations.Environ. Healthperspect. 103, 1317. Chapman (1996) en: Prez, A. y Rodrguez, A. (2008) Indice fisicoqumico de la calidad de agua para el manejo de lagunas tropicales de inundacin. Rev biol trop 56(4). pp 1905-1918. [online]

http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77442008000400026&script=sci_arttext&tlng=en Gosner, K.L., 1960. A simplified Table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification.Herpetolgica. 16: 183-190. Cooper, N.L.,Bidwell,J.R.,Kumar,A.,2009.Toxicity of copper lead and zinc Ceriodaphniadubia and Daphnia carinata. Ecotoxicol. Environ. Saf. 72, 15231528. mixtures to

Lajmanovichet al. 2003. En: Lajmanovich, R.C.; Peltzer, P.M.; Attademo, A.M.; Cabagna, M.C. y Junges, C.M. (2012) Los agroqumicos y su impacto en los anfibios: un dilema de difcil solucin. Revista Qumica Viva N 3, ao 11. pp 184198. [online] http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v11n3/lajmanovich.htm Lajmanovichet al. 2005. En: Lajmanovich, R.C.; Peltzer, P.M.; Attademo, A.M.; Cabagna, M.C. y Junges, C.M. (2012) Los agroqumicos y su impacto en los anfibios: un dilema de difcil solucin. Revista Qumica Viva N 3, ao 11. pp 184198. [online] http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v11n3/lajmanovich.htm Lajmanovichet al. 2009. En: Lajmanovich, R.C.; Peltzer, P.M.; Attademo, A.M.; Cabagna, M.C. y Junges, C.M. (2012) Los agroqumicos y su impacto en los anfibios: un dilema de difcil solucin. Revista Qumica Viva N 3, ao 11. pp 184198. [online] http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v11n3/lajmanovich.htm Lajmanovich, R.C.; Peltzer, P.M.; Attademo, A.M.; Cabagna, M.C. y Junges, C.M. (2012) Los agroqumicos y su impacto en los anfibios: un dilema de difcil solucin. Revista Qumica Viva N 3, ao 11. pp 184- 198. [online] http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v11n3/lajmanovich.htm McCarthy, J.F., Shugart, L.R. (Eds.), 1990. Biomarkers of Environmental Contamination.Lewis Publishers, FL. Muoz, E. y Palacio, J. (2010) Efectos del Cloruro de Mercurio (HgCl 2) sobre la Sobrevivencia y Crecimiento de Renacuajos de Dendrosophusbogerti. Actu Biol. vol.32, n.93 pp 189-197. [online] http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S030435842010000200006&lng=en&nrm=iso>. ISSN 0304-3584. Prez, A. y Rodrguez, A. (2008) Indice fisicoqumico de la calidad de agua para el manejo de lagunas tropicales de inundacin. Rev biol trop 56(4). pp 1905-1918. [online] http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77442008000400026&script=sci_arttext&tlng=en Riley, P., Cotter, J., Contiero, M. y Watts, M. (2011). Tolerancia a herbicidas y cultivos transgnicos. Greenpeace International, Greenpeace Research Laboratories y GM Freeze. Argentina. (2): 2-58. Ryan, M.J. (1985). The Tngara Frog: A Study in Sexual Selection and Communication. University of Chicago Press, Chicago. Santos, M.H.S., da Cunha,N.T.,Bianchini,A.,2000. Effects of copper and zinc on growth feeding and oxygen consumption of Farfantepenaeuspaulensis post-larvae DecapodaPenaeidae.J.Exp.Mar.Biol.Ecol.247,233242. Santos-Barrera, G., Sols, F., Ibez, R., Wilson, L.D.,Savage, J., Bolaos, F., Lee, J., Chaves, G.,Searis, C., Acosta-Galvis, A. y Hardy, J. 2010. Engystomopspustulosus. En: UICN 2012. Lista

Roja de Especies Amenazadas. Versin 2012.2. < www.iucnredlist.org >. Consultado el 27 de mayo 2013. Trano, Z. (1998). ''Cover and ambient light influence nesting preferences in the Tngara Frog Physalaemuspustulosus.'' Copeia, 1998(1), 250-251.

Tejeda, M., &Fieques, F. (2003). Evaluacin de los efectos del vertido txico de las minas de aznalcllah sobre la comunidad de anfibios del Ro Guadiamar. Ciencia y Restauracin del Ro Guadiamar. Consejera de Medio Ambiente. Espaa. pp. 156-169. Tyler,P.A.,Buckley,R.T.,2007.PollutionofaTasmanianriverbymineeffluentsI.Chemical evidence.Int.Rev.GesamtenHydrobiol.58,873883

ANEXOS

Figura 1. Posicin de las cajas Petri con sus respectivas concentraciones, tratamientos y replicas

Figura 2. Individuo muerto hallado en el tratamiento 3 en la rplica 2

Figura 3. Observacin del canibalismo por parte de los individuos del tratamiento 3 en la rplica 2. .

Figura 4. Observacin de un individuo sano al comienzo del montaje del tratamiento 5 en la rplica 2.

Figura 5. Observacin de un individuo con pigmentacin clara a las 94 horas del tratamiento 5 en la rplica 2.

Tabla # 1 Fecha: 25/04/13 Hora:9.00 pm Temperatura:22.2C Estado predominante: 23 V (vivos), NE (nado erratico), NN (nado normal), PC (pigmentacion clara), PN (pigmentacion normal) D (movimiento pasivo (P) o activo (A)), CA (cola atrofiada), CN (cola normal), M (muertos), ME (evicerados), MN (no evicerados) #V 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 5-1 5-2 5-3 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #NE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #NN D #CA 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #CN 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #PC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #PN 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #ME 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #MN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 del cambio para obtener el primer montaje podran estar afectando laconcentracin de las soluciones en los diferentes tratamientos. OBSERVACIONES GENERALES En todas las muestras se cambiaron individuos pequeos por individuos grandes. Las partculas de agua destilada al momento

Tabla # 2 1 observacin--12 Hrsdespues. Fecha: 26/04/13 Hora:9.15 am Temperatura:23.0C Estado predominante: 23 V (vivos), NE (nado erratico), NN (nado normal), PC (pigmentacion clara), PN (pigmentacion normal) D (movimiento pasivo (P) o activo (A)), CA (cola atrofiada), CN (cola normal), M (muertos), ME (evicerados), MN (no evicerados) #NE #NN D #CA #CN #PC #PN 1-1 20 0 20 A 0 20 0 20 1-2 20 0 20 A 20 20 0 20 1-3 20 0 20 A 0 20 0 20 2-1 20 2-2 20 2-3 20 3-1 20 3-2 20 3-3 20 4-1 20 4-2 20 4-3 20 5-1 20 5-2 20 5-3 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #V #M OBSERVACIONES GENERALES #ME #MN 0 0 0 No hay ningun cambio en los tratamientos. Probablemente esto se deba a que 0 0 0 la concentracion inicial se haya modificado por los restos de agua destilada 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla # 3 2 observacin--24 hrsdespues. Fecha: 26/04/13 Hora:9.15 pm Temperatura:23.7C Estado predominante: 23 V (vivos), NE (nado erratico), NN (nado normal), PC (pigmentacion clara), PN (pigmentacion normal) D (movimiento pasivo (P) o activo (A)), CA (cola atrofiada), CN (cola normal), M (muertos), ME (evicerados), MN (no evicerados) #V 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 5-1 5-2 5-3 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #NE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #NN D 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A 20 A #CA 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #CN 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #PC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #PN 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #ME 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #MN OBSERVACIONES GENERALES 0 Se realiz el primer recambio. 0 Ningn individuo muerto Ninguna alteracinmorfolgica ni en el 0 comportamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla # 4

3 observacin--43 hrsdespues.

Fecha: 27/04/13 Hora:9.15 pm Temperatura:21.3C Estado predominante: 23 V (vivos), NE (nado erratico), NN (nado normal), PC (pigmentacion clara), PN (pigmentacion normal) D (movimiento pasivo (P) o activo (A)), CA (cola atrofiada), CN (cola normal), M (muertos), ME (evicerados), MN (no evicerados) #V 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 5-1 5-2 5-3 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #NE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 11 7 #NN 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 D A A A A A A A A A A A A #CA 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #CN 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 #PC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 9 8 #PN 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 8 11 12 #M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #ME 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 #MN OBSERVACIONES GENERALES

0 En las placas 5.1-5.2 y 5.3 se observa nado errtico. 0 Se presenta una dinmica activa - pasiva, es decir, algunos individuos 0 0 responden al contacto de manera activa y otros de manera pasiva. E n la placa 5.1, 12 de los individuos presentan despigmentacin. En las placas

0 5.2 y 5.3, 9 y8 respectivamente. Se realiz el segundo recambio. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 A-P 9 A-P 3 A-P

Tabla # 5 4 observacin--67 hrsdespus. Fecha: 28/04/13 Hora:4.00 pm Temperatura:23.2C Estado predominante: 23 V (vivos), NE (nado erratico), NN (nado normal), PC (pigmentacin clara), PN (pigmentacin normal) D (movimiento pasivo (P) o activo (A)), CA (cola atrofiada), CN (cola normal), M (muertos), ME (evicerados), MN (no evicerados) #NE #NN 1-1 20 0 20 1-2 20 0 20 1-3 20 0 20 2-1 20 2-2 20 2-3 20 3-1 20 3-2 20 3-3 20 4-1 20 4-2 20 4-3 20 5-1 20 5-2 20 5-3 20 0 0 0 0 0 0 8 13 9 16 17 15 20 20 20 20 20 20 #V D A A A A A A A A A #CA #CN #PC #PN 0 20 0 20 20 20 0 20 0 20 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 14 15 20 20 20 20 20 20 20 20 20 2 6 5 #M OBSERVACIONES GENERALES #ME #MN 0 0 0 Se realiz el tercer recambio. En las placas 4.1-4.2 y 4.3 comienza a observarse 0 0 0 nadoerrtico en 8,9 y 13 individuos respectivamente. En las placas 5.1-5.2 y 0 0 0 5.3 el nado errtico se hace ms notable en la mayora de los individuos. 0 0 0 En los tratamientos 5.1-5.2 y 5.3 se observa una clara despigmentacin. 0 0 0 los individuos de las placas 4.1-4.2 y 4.3 presentan baja respuesta al tacto pero 0 0 0 el nado errtico los hace tener una dinmica activa. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Los individuos que presentan nado normal en las palcas 5.1-5.2 y 5.3 presentan 0 baja respuesta al tacto. 0 0 0 0 0 0 0

12 A-P 7 A-P 11 A-P 4 A-P 3 A-P 5 A-P

Tabla # 6 observacin--94 hrsdespues. Fecha: 29/04/13 Hora:7.45 pm Temperatura:23.4C Estado predominante: 23 V (vivos), NE (nado erratico), NN (nado normal), PC (pigmentacion clara), PN (pigmentacion normal) D (movimiento pasivo (P) o activo (A)), CA (cola atrofiada), CN (cola normal), M (muertos), ME (evicerados), MN (no evicerados) #V 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 5-1 5-2 5-3 #NE #NN 20 0 20 20 0 20 20 0 20 20 20 19 20 20 20 17 17 16 20 19 19 0 0 0 0 0 0 3 3 4 0 1 1 20 20 19 20 20 20 D A A A A A A A A A #CA #CN #PC #PN 0 20 0 20 20 20 0 20 0 20 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 20 19 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 8 12 9 19 17 19 20 20 19 20 20 20 12 8 11 1 3 1 #M OBSERVACIONES GENERALES #ME #MN 0 0 0 1 individuo muerto en la rplica 2.3. Se observa canibalismo 0 0 0 El individuo muerto no es asociado a la concentracin de la solucin. 0 0 0 En las rplicas de los tratamientos 4 y 5 los individuos con nado normal 0 0 0 presentan respuesta baja al tacto. Los individuos con nado errtico 0 0 0 presentan dinmica activa luego estimularlos(tacto), esto ltimo en la 1 0 0 mayora de los individuos en las rplicas del tratamiento 5. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 En las rplicas del tratamiento 4 aparece la pigmentacin clara o 0 despigmentacin en algunos de sus individuos; 8, 12 y 9 para las replicas 0 4.1-4.2 y 4.3 respectivamente. 0 0 0 0 0 0

20 A-P 20 A-P 20 A-P 20 A-P 20 A-P 20 A-P