Tema 7

El cultivo in vitro y la Mejora de plantas

CULTIVO IN VITRO

INVESTIGACIN BSICA SOBRE FISIOLOGA VEGETAL

INVESTIGACIN APLICADA ORIENTADA A PRODUCCIN Y MEJORA VEGETAL

-Cultivo de pices caulinares -Cultivo de yemas axilares -Morfognesis adventicia -Semilla artificial -Cultivo de meristemos -Microinjerto

P R O D U C C I O N

-Reproduccin vegetativa

-Saneamiento del material vegetal

-Cultivo de anteras -Cultivo de microsporas M E J O R A

-Obtencin de lneas puras (diplo-haploides)

-Polinizacin y fertilizacin in vitro -Cultivo de embriones -Hibridacin sexual -Hibridacin somtica

Aprovechamiento de la variacin extraespecfica

-Seleccin somaclonal

Aprovechamiento de la variacin somaclonal (intraespecfica)

METODOS PARA GENERAR VARIABILIDAD 1. Variacin somaclonal 2. Cruzamiento Hibridacin sexual Fertilizacin asistida Rescate de embriones Hibridacin somtica

METODOS PARA ACELERAR PROGRAMAS DE MEJORA 3. Obtencin de dihaploides a partir de microsporas y anteras

1. Variacin somaclonal

Definicin
Es la variacin gentica que surge como consecuencia del cultivo in vitro y, ms concretamente, de los procesos de regeneracin por va indirecta, es decir, los que implican una fase de callo ms o menos larga.

Se describe por vez primera en la caa de azcar y la patata (vegetativas) y actualmente tambin en cereales (trigo, maz, avena y arroz) y dicotiledneas (tabaco, tomate, zanahorias, apio, leguminosas y plantas ornamentales como Petunia y Pelargonium).

Causas de la variacin somaclonal

Variacin somaclonal debida al explante -Variacin preexistente en el explante de partida (mixoploida) -Quimieras naturales: plantas que contienen sectores que proceden de capas meristemticas con distinta constitucin gnica -Existencia de mutaciones somticas en los explantes de partida Variacin somaclonal a lo largo del cultivo -Debida al estrs que representa el cultivo in vitro -cambios en el metabolismo (produccin de sustancias mutagnicas) -aceleracin de los procesos de replicacin -anormal duplicacin de los bloques de heterocromatina -alteracin de los planos de divisin celular -cambios gnicos: mutaciones puntuales, cambios estructurales y numricos) -cambios en el genoma del cloroplasto y de la mitocondria -cambios epigenticos

Genotipo -diferencias a nivel de especie e incluso variedad, cultivar o lnea Nivel de ploida > vs en poliploides Va de regeneracin -embriognesis < organognesis???

Formacin de callo, periodo de cultivo y nmero de subcultivos -el crecimiento desorganizado en el callo genera desrdenes metablicos y cromosmicos, que se traducen en variacin

Medio de cultivo -auxinas: aumento de la frecuencia de metilCitosina -deficiencia de oxgeno -excesos o deficiencias en minerales

Niveles de deteccin de la VS
DETECTAR para: seleccionar caracteres de inters Abordar estudios bsicos acerca de la variacin y el posible control CMO? Usando Marcadores

Tipos de marcadores
Marcadores morfolgicos Marcadores fisiolgicos
Resistencia a enfermedades Tolerancia a herbicidas Tolerancia a salinidad o pH extremos

Estudio del cariotipo:

Cambios en nmero y estructura del cromosoma
Translocaciones Inversiones Deleciones Duplicaciones Otras tcnicas: Bandeo cromosmico, Hibridacin in situ

Tipos de marcadores

Bioqumicos
Sistemas isoenzimticos
Son productos de genes (alelos) expresados cuya regulacin puede estar afectada por factores ambientales o fisiolgicos Slo se transcribe y traduce una pequea proporcin del genoma

Tipos de marcadores
Moleculares
Secuencia de ADN semejante en todas las clulas, independientemente del estado fisiolgico o de desarrollo de las mismas
RAPD AFLP Microsatlites

Aplicacin de VS en Mejora
Ventajas
Rapidez Econmica Altas tasas de mutacin Menor nmero de cambios no deseados xito para eliminar uno o pocos caracteres en cultivares bien adaptados til con especies de propagacin sexual y asexual

Aplicacin de VS en Mejora
Desventajas
Variantes sin inters prctico Prdida de capacidad morfognica Inestabilidad de los somaclones, especialmente los originados por variacin epigentica Presencia de alteraciones no deseables como esterilidad, aneuploidas No se tiene control del tipo de variacin ni de los factores

NO INTERESA VS
PROPAGACIN CLONAL Y SANEAMIENTO ESPECIES DE COSECHA Y CICLO LARGO SEMILLA ARTIFICIAL CONSERVACIN DE GERMOPLASMA OBTENCIN DE DIHAPLOIDES TRANSFORMACIN GNICA

Requisitos de una VS desde un p.v. productivo y comercial

Involucrar caracteres agronmicos tiles Nivel de expresin del carcter superior al de sus progenitores El carcter mejorado debe estar combinado con el resto de caracteres agronmicos importantes para el cultivo Variacin heredable

Seleccin de variantes tiles

-Seleccin celular imponiendo presin selectiva en el cultivo celular -Seleccin somaclonal identificando los genotipos deseables a nivel de planta

Corolario

De todo lo dicho, se deduce que el cultivo in vitro acta como un simple amplificador del suceso mutacional ya que, por un lado se aprovechan las mutaciones preexistentes en los materiales de partida, as como las que aparecen de novo a lo largo del cultivo celular.

2. Cruzamiento

CRUZAMIENTO=INCORPORACIN DE GENES

MEJORA CLASICA

CULTIVO IN VITRO

Via sexual Va asexual

HIBRIDACIN SEXUAL HIBRIDACIN SOMATICA

Hibridacin sexual
-Fertilizacin in vitro -Rescate de embriones

La hibridacin sexual concentra en un individuo caracteres distribuidos entre miembros diferentes de una especie o de diferentes especies. La fertilizacin implica la germinacin del grano de polen sobre el estigma, su avance por el estilo hasta llegar al vulo, descargando dos espermtidas para formar zigoto y endospemo. Es un proceso controlado. BARRERAS A LA FERTILIZACIN EN LA HIBRIDACIN SEXUAL
A. Pre-fertilizacin Incapacidad del polen a germinar sobre estigma extrao Fallo del tubo polnico para alcanzar el vulo Estilo muy largo Crecimiento del tubo lento Aborto del tubo polnico dentro del estilo B. Post-fertilizacin El embrin no alcanza la madurez

RESCATE DE EMBRIONES

FERTILIZACION IN VITRO

1. Fertilizacin in vitro
La doble fertilizacin en plantas superiores es un proceso muy complejo en comparacin con lo que ocurre en el resto de los seres vivos y ha siso muy complicado realizarlo in vitro.

La fertilizacin ASISTIDA implica la polinizacin controlada y artificial de la hembra con el polen de un macho seleccionado.

POLINIZACION IN VITRO (Test-tube fertilization): - ESTIGMTICA (se aplica el polen al estigma) - PLACENTAL (se aplica el polen al vulo ligado a la placenta) - OVULAR (se aplica el polen al vulo aislado)

1. Fertilizacin in vitro
Para lograr el xito se deben precisar: a) Los tiempos de antesis, dehiscencia de anteras y polinizacin b) Receptividad del estigma c) El momento adecuado para la polinizacin d) El tiempo adecuado para recoger el polen

2. Cultivo de vulos completo y Rescate de embriones

El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los vulos de una planta y cultivarlos en un medio estril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Relativamente fcil con embriones maduros

2. Rescate de embriones
-Sortear barreras de autoincompatibilidad -Rescate de embriones abortivos derivados de la hibridacin interespecfica o intergenrica debido a incompatibilildad con el endosperma -Superar problemas de abscisin precoz del fruto -Recuperar embriones de cruzas interespecficas que conducen a la obtencin de haploides -Acortar el periodo de dormicin -Fallos en el endosperma -Especies leosas que tienen dificultad en la germinacin de sus semillas o escasa produccin de semillas -La posibilidad de cultivar embriones ex-vulo proporcion una excelente oportunidad para llevar a cabo estudios de nutricin y de la capacidad de regeneracin de las partes del embrin.

Influencia del medio de cultivo -Cambio de heterotrofa a autotrofa -Importancia de la fuente de carbono como nutriente y como osmtico (el embrin in situ est rodeado de un fluido de alta osmolaridad). A medida que desarrolla el embrin necesita medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa

Problemas -Germinacin precoz Formacin de la plntula sin haber completado el desarrollo embriognico normal.

Hibridacin somtica
-Fusin de protoplastos

Introduccin. La transferencia de material gentico entre individuos se logra por cruzamiento. El cultivo de protoplastos abre una nueva va a la introduccin en una clula vegetal de nuevo material gentico, lo que unido a su capacidad de regeneracin de planta completa, es considerado un mtodo til en mejora. Protoplasto=Una clula vegetal desnuda, rodeada por la membrana plasmtica, potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse. Historia. Cocking (1969) aisla protoplastos en grandes cantidades por mtodos enzimticos. Explante=Normalmente, se usan clulas del mesfilo de hojas jvenes totalmente expandidas Enzimas fngicas -Actividad celulasa, pectinasa y hemicelulasas

Protocolo del cultivo de protoplastos

1. Obtencin, preparacin y desinfeccin del material vegetal 2. Eliminacin de la pared celular mediante enzimas lticos en una solucin con potencial osmtico ligeramente hipertnico (0,30,8 M) para evitar la lisis del protoplasto y sales de CaCl2 que incrementan la estabilidad de la membrana.

3. Eliminacin del material sin digerir, lavado de enzimas y purificacin en un gradiente de densidad.

4. Cultivo en un medio adecuado para promover la divisin celular REGENERACIN DE LA PLANTA

Factores que inciden en el cultivo de protoplastos

Naturaleza del material de partida Hojas de tejidos jvenes y cutcula fina, verdes. Estado metablico y de diferenciacin -Tejido de reserva-latente -Hojas de mesfilo-fotosntesis -Suspensiones celulares-divisin activa

Medio de cultivo A definir para cada especie e incluso para distintos explantes Concentracin de osmtico que forme una solucin levemente hipertnica, que favorezca la plasmolisis o separacin del protoplasto de la pared celular, (y evite que exploten) y que luego ira decreciendo gradualmente.

La eficacia de placa proporcin de protops. que se dividen; depende de la densidad del cultivo (104-5x105 ml-1).

Fusin de protoplastos
Los protoplastos, al estar desprovistos de la pared celular, son aptos para varias tcnicas de manipulacin gentica, entre ellas la fusin de diferentes tipos de protoplastos. Especialmente importante en cultivos donde la reproduccin sexual sea dbil o ausente: caa de azcar, patata, banana, etc.

HETEROCARIONTE

CIBRIDOS

HIBRIDO

HIBRIDOS PARCIALES

Mecanismos de fusin
Mtodos qumicos -sales tipo nitrato sdico -compuestos de alto peso molecular polietilenglicol -en presencia de Ca++ y pH (8-10)

tipo

Electrofusin -dielectroforesis: los protoplastos se comportan como dipolos -alineamiento (collar de perlas) -pulsos cortos de corriente que rompen las membranas, formando poros -las membranas en contacto se fusionan

Identificacin de hbridos somticos

1. Marcadores morfofisiolgicos En ciertos casos es posible diferenciar los callos hbridos de los parentales 2. Seleccin por complementacin (lneas resistentes a herbicidas o antibiticos). el mutante A crece en el medio A (agente selectivo A)
el mutante B crece en el medio B (agente selectivo B) los hbridos A+B crecern en el medio A+B

3. Citofluorgrafo. -Se marcan las poblaciones de clulas con diferentes marcadores fluorescentes (fluorescena y rodamina)

4. Pruebas moleculares -anlisis de isoenzimas -anlisis de DNA nuclear -anlisis de DNA mitocondrial

Aplicaciones de la fusin de protoplastos

INTRODUCCIN DE GERMOPLASMA DE CULTIVOS AGRCOLAS DE CARACTERES CON UTILIDAD AGRONMICA, PRESENTES EN ESPECIES SALVAJES QUE SON SEXUALMENTE INCOMPATIBLES

3. Obtencin de dihaploides

Definicin Haploide Individuo que posee la mitad del nmero cromosmico normal contenido en las clulas somticas de la especie

Identificacin de haploides
Morfologa
suelen ser plantas ms pequeas

Poliembrionia
La presencia de poliembrionia facilita la deteccin de embriones haploides

Genes marcadores
Cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean fcilmente distinguibles y posean manifestaciones fenotpicas claras en semilla o en plntula y as hacer una seleccin ms econmica en tiempo y esfuerzo.

Antecedentes
Se conocen desde 1922, cuando se observ la produccin espontnea de los mismos. Actualmente, hay ms de cien especies vegetales capaces de producirlos in vivo si bien la frecuencia es muy baja (0,001-0,01%) Guha & Maheswari (1964,1966) Cultivo de anteras en Datura innoxia in vitro. Frecuencia de induccin del 100% y un rendimiento de ms de 100o plntulas por antera en condiciones ptimas.

Ventajas del uso de haploides en Mejora

Los consumidores quieren el esprrago macho

Planta dioica: XX-XY: 50% XY

Obtencin de haploides
Ginognesis
Desarrollo de un gameto femenino no fecundado

Andrognesis
Cultivo de anteras Cultivo de microsporas

A partir de alguna clula haploide del saco embrionario distinta del gameto femenino (sinrgidas o antpodas) Cruzamientos interespecficos o intergenricos con eliminacin cromosmica
El cigoto diploide pierde cromosomas en las sucesivas mitisis

Cultivo de anteras
Se cultivan anteras inmaduras en un medio de induccin donde las micrsporas competentes originarn callos, que sern transferidos a un medio apropiado para la regeneracin de plantas Factores que influyen:
Genotipo % albinismo Condiciones de crecimiento de las plantas donantes
Anteras de las primeras floraciones

Estado de desarrollo de las microsporas

Microspora uninucleada

Pretratamientos
Bajas temperaturas, calor, choque osmtico

Composicin del medio de cultivo

Medios de induccin y de regeneracin

Condiciones de incubacin

Protocolo de obtencin de haploides

Eliminacin de yemas florales (Brassicas) o espigas (cebada) en la etapa seminucleada, es decir, antes de la divisin de la microspora para formar los ncleos vegetativo y generativo. Se supone que estn en condiciones aspticas. Pretratamiento de las flores o espigas como permanecer 4-28 das a 415 C en oscuridad. Se cortan las anteras, se cultivan en un medio con niveles elevados de fuente de carbono y aditivos como aminocidos, reguladores del crecimiento inductores de embriognesis (2, 4 D) y carbn activo (absorbe sustancias inhibidoras) Al cabo de 4-8- semanas, las microsporas se dividen dando callo o directamente embriones somticos. Germinacin para dar un haploide

Inconvenientes Alto nivel de manejo y experiencia Elevada incidencia de albinismo, especialmente en cereales

Protocolo de obtencin de dihaploides

Duplicacin cromosmica
La planta haploide, sin duplicar, es estril por lo que no podra producir semillas
Duplicacin espontnea Sustancias qumicas
Colchicina, entre otras

Puede aplicarse a plntulas, plantas adultas, semillas, microsporas y anteras Tratamiento

Sumergir las races en una solucin acuosa

Microinyeccin
Tratamiento de callos con colchicina antes de ponerlos en el medio de regeneracin Cultivo de micrsporas y anteras en medio de induccin con el agente duplicador

Produccin de haploides por hibridacin distante

Hordeum vulgare 2n=14 VV Hordeum bulbosum 2n=14 BB

VxB Zygoto

V Zygoto

Rescate de embriones

Cultivo

Duplicacin cromosomas

Homozigoto frtil

GRACIAS POR SU ATENCIN