CARBOHIDRATOS DETERMINACIN

Clasificacin de los Carbohidratos Los carbohidratos son clasificados en tres. grupos: monosacridos, llamados tambin azcares simples, oligosacridos y polisacridos 1.-Monosacridos Son compuestos cristalinos solubles en agua, generalmente son aldehdos o cetonas alifticas que contienen un grupo carbonilo y uno o ms grupos hidroxilos tambin son definidos como poli-hidroxi aldehdos, cetonas, cidos, alcoholes, aminas y sus derivados simples. Esos compuestos pueden ser clasificados adems como aldosas y cetosas. Dependiendo de su nmero de tomos de carbono un monosacrido es conocido como triosa, tetrosa, pentosa, hexosa y as sucesivamente. Naturalmente la mayora de los monosacridos que aparecen en la naturaleza son pentosas o hexosas. Los centros reactivos de los monosacridos son los grupos carbonilos e hidroxilos. Los carbohidratos que reducen el reactivo de Fehling(o Benedict) o Tollens son conocidos como azcares reductores. Cuando un compuesto orgnico pura que no es un azcar reductor se disuelvo en un solvente usualmente contendr un solo compuesto. Sin embargo, cuando un azcar reductor se disuelve en agua, la solucin que se obtiene puede contener hasta por encima de seis compuestos: las dos pranosas, las dos rafinosas y las formas carbonlicas aciclicas y sus hidratos. Esas formas a menudo son referidas como Tautmeras, los cuales son compuestos distintos que difieren de las otras formas en sus propiedades fsicas, qumicas y biolgicas. Los monosacridos ms importantes en Anlisis de Alimentos son: la L-arabinosa (pentosa), D-glucosa (dextrosa), D-fructosa (levulosa) y D-Galactosa. De menor importancia son la D-galactosa y las pentosas D-ribosa y D-xilosa. Arabinosa: Es una pentosa ampliamente distribuida en los vegetales y en cierto grado en tejidos animales, por lo general en forma de sus anhidnidos o pentosanas; las cuales por hidrlisis producen arabinosa (mezclada con xilosas). El anlisis y determinacin de las pentosas se consigue con facilidad sometiendo el material que las contiene a la accin de cidos fuertes como el HO! o H 2S04 que por deshidratacin convierten las pentosas en furfural. Glucosa (dextrosa). Existe una forma anhidra (Pf = 1 46 OC) e hidratada (Pf =86 0C). Es comn encontrarla en muchos productos que contienen azcar, ya que se obtiene por hidrlisis. Reduce fcilmente la solucin de Fehling y es fermentada por las Levaduras. Existe en la forma (donde el OH del C-1 va a la derecha) y una (donde el 0H del C-1 va a la izquierda en forma lineal o Fischer y haca abajo en Haworth). Tambin en la forma D(OH del C-5 a la derecha o hacia abajo) y L(0H de C-5 a la izquierda). Existe la d que gira el plano de luz polarizada a la derecha (dextrorrotatoria) y la (Levorrotatoria) Fructosa (levulosa o azcar de frutas): Se encuentra comnmente en las frutas. Es Levorrotatoria y se encuentra en cantidades apreciables en la miel y en el azcar invertido y se puede producir enzimticamente a partir de jarabe de glucosa. La temperatura influye marcadamente en la rotacin especfica de la fructosa. 2.-Oligosacridos Los oligosacridos aparecen naturalmente en plantas, animales y microorganismos. Esos compuestos pueden ser sintetizados enzimticamente (por transferasas) o hidrlisis cida. Los oligosacridos comprenden unidades de D-glucosa, D-fructosa y D-Galactosa, los cuales son las ms importantes en Anlisis de Alimentos. Entre ellos tenemos: disacridos y trisacridos.

Disacridos: Son relativamente polmeras de bajo peso molecular (340 16OO daltones) que producen monosacridos por hidrlisis y estn covalentemente unidos por enlaces glicosidicos con prdidas de agua. Los disacridos ms importantes son: sacarosa, maltosa y lactosa. Sacarosa: Est formada por la unin de una molcula de glucosa y una de fructosa a travs de un enlace glucosdico (l ->2). Es un azcar no reductor (unin anomrica 1 ->2). Se hidroliza en medio cido y por la enzima invertasa, para producir glucosa + fructosa Su dulzor se tom como 100, y es la referencia para a determinacin del dulzor de los dems Es dextrorrotatoria (+ 66,50) (-20) Al Hidrolizarse, el poder levorrotatorio de la fructosa (-92) es ms fuerte que el de la glucosa (+52,5) por lo que al final, el hidrolizado tiene un poder levorrotatorio de -2O. (inversin). Es el nico disacrido no reductor de importancia en Anlisis de Alimentos. El azcar invertido es ms dulce que a sacarosa debido al valor de dulzor de la fructosa. Promediando e! valor de la glucosa y el de la fructosa se obtiene un total de 123,65 para la inversin, el cual es superior al de la sacarosa.(100).

Maltosa: Este azcar se encuentra presente en plantas, hojas y semillas y en la malta. Formada por dos molculas de glucosa Presenta el fenmeno de mutarrotacin Es un azcar reducto Se hidroliza por H+ y la maltosa, produciendo 2 molculas de glucosa Es parte constitutiva de los jarabes de maz No es tan dulce como la glucosa No cristaliza fcilmente

Lactosa: Constituida por una molcula de galactosa y una de glucosa El carbono anomrico de la glucosa est libre Es un azcar reductor Presenta el fenmeno de mutarrotacin Es menos soluble y dulce que la sacarosa y maltosa Se usa en la industria alimentaria como absorbente para retener sabores artificiales, aromas y colores. Se funde a 203C Rotacin especfica de 55,4

Trisacridos: Entre ellos: la rafinosa, estaquiosa y verbascosa. Normalmente abundan en leguminosas (soya). Su importancia estriba en que son productores de gases en el intestino humano, es decir su consumo causa flatulencia. Debido a que no son absorbidos pasan a al intestino grueso, es por ello que su digestin produce gases ya que son fermentados all. Primero son hidrolizados microbiolgicamente (Cl. Perfringens) produciendo sus respectivos monosacridos y anhdrido carbnico. La formacin de gases irrita las paredes intestinales. La rafinosa se encuentra en el jugo de la remolacha y en la cubierta o salvado de las semillas de algodn. No reduce el reactivo de Fehling. Por hidrlisis fuerte produce glucosa, galactosa y fructosa. A continuacin podemos observar la estructura de la rafinosa. El iodo reacciona con la amilosa produciendo un fuerte color azul caracterstico debido al complejo que se forma entre una molcula de este elemento con cada 7- 8 molculas de D-glucosa. Se requiere un mnimo de 40 molculas para desarrollar bien el color azul.

3.Polisacridos Son carbohidratos que tienen muchos monosacridos unidos a travs de enlaces qlucosdicos. Son

coloides, no forman verdaderas soluciones corno los monosacridos no tienen color ni sabor y su peso molecular puede llegar hasta varios millones. Actualmente se emplea el trmino hidrocoloide para referirse a los polisacridos, ya que debido a su gran capacidad para retener agua, forman partculas coloidales altamente hidratadas. Los polisacridos son considerados productos de la policondensacin de monosacridos unidos glucosdicamente con la eliminacin de agua formando cadenas lineales o ramificadas que pueden estar constituidas por un solo tipo de monosacridos (HOMOPOLISACAPIDOS), como el almidn, la celulosa, glicgeno, dextrinas, o bien, estar formadas por diferentes monosacridos (HETEROPOLISACRIDOS), como es el caso de la mayora de as gomas, pectinas, hemicelulosa. Los distintos monmeros estn unidos en las cadenas en una forma regular, con una secuencia repetitiva, representando polmeros con un alto orden estructural. Almidn. Qumicamente, el almidn es una mezcla de dos polisacridos muy similares: amilosa y amilopectina. La amilosa, producto de la condensacin de hexosas (D-glucosa) forma cadenas largas lineales que pueden tener de 200 a 2500 unidades, con pesos moleculares que pueden legar hasta un milln de Daltones. Los monosacridos estn unidos a travs de enlaces glucosdicos -D(1-4), es decir, la amilosa es un -D(1-4)Glucano, siendo la &-D Maltosa la unidad repetitiva d~ esta estructura similares: amilosa y amilopectina. La amlosa, producto de la condensacin de qumica. La amilopectina es otro D-Glucano, que se diferencia de la amilosa por la presencia de ramificaciones -D-(1-6) cada 15 a 25 unidades de molculas de glucosa. En trminos generales, los almidones contienen aproximadamente 17 a 21% de amilosa y el resto de amilopectina. El peso molecular de la amilopectina es mucho mayor que l, de la amilsa, pero tambin es menos soluble en agua que la amilosa. La importancia del almidn radica en que forma parte de la dieta del hombre. Se usa como adhesivo y en la elaboracin de papel. Es utilizado en forma modificado, hidrolizado y en estado natural en la produccin de glucosa. Dextrinas: Son productos de la hidrlisis parcial del almidn y se obtienen generalmente al aprovechar el efecto combinado de cidos, enzima y calor. Las dextrinas tienen un comportamiento reolgico y absorben agua de forma muy diferente a los almidones de los cuales provienen. Celulosa: Este compuesto al igual que el almidn, es un homopolisacrido formado por molculas de glucosa, y es el carbohidrato ms abundante en la naturaleza, ya que forma parte integral de todas las paredes do los tejidos vegetales. Es un polmero lineal formado por unidades de D-Glucopiranosa con un grado de polimerizacin muy alto, lo cual hace que su teso molecular pueda llegar hasta unos millones. La alta resistencia fsica que tiene la celulosa se debe fundamentalmente a sus enlaces -D-(1-4) y a su tendencia a formar puentes de hidrgeno intermoleculares entre cadenas adyacentes. La celulosa es poco soluble en la mayora de los disolventes, con excepcin de los cidos minerales concentrados que causan rpidamente su depolimerizacin es higroscpica y se hincho pero no se disuelve. Pectinas: El trmino sustancias pectcas, se usa generalmente para referirse a un grupo de polisacridos vegetales, en los cuales el cido D-Galacturnico es el principal componente. Lignina: Es un constituyente en un 25% de las paredes celulares de las plantas, junto con la celulosa y hemicelulosa. Es una sustancias aromtica, que contiene grupos -OH libres y del 15 al 20% de grupos metoxilos, a los que se debe la formacin de alcohol metilico en la destilacin seca de la madera. Junto con la hemicelulosa y pectinas, aporta mayor fuerza en el empaque de las fibras de colulosa es decir acta como material aglutinante. La composicin de la lignina permanece an sin resolverse. Bohunski, 1978), es altamente compleja ya que posee estructura tridimensional. Se considera muy inerte, insoluble y resistente a la digestin. Mtodos de Anlisis (monosacridos y oligosacridos) La extraccin de azcares simples (monosacridos y oligosacridos) de atonales alimenticios sin la remocin de polisacridos se logra empleando alcohol al O%(Suzanne, 1994). Seria deseable, antes de hacer la determinacin cuantitativa de carbohidratos en un alimento, conocer previamente cules de ellos se encuentran presentes. Las caractersticas del alimento por si mismo, frecuentemente dan una respuesta clara a esta interrogante.

Se dispone de pruebas cualitativas para la identificacin de carbohidratos, sin embargo, es necesario tener presente que el azcar debe separarse en forma pura para la aplicacin de dichas pruebas, en algunos casos, tal como sucede, en la conocida reaccin del lodo con cl almidn, se puede aplicar con xito en presencia de otras sustancias, otras pruebas como la basada en la accin reductora sobre las soluciones de cobre, dan resultados errneos, a nienos que se eliminen las sustancias interferentes. Los anlisis de carbohidratos de una materia prima bruta y de alimentos procesados pueden usarse para proveer una amplia riqueza de informacin. Los oligosacridos patrones pueden ser usados para detectar la adicin de un material alimenticio a otro (adulteracin de alimentos). Adems, los productos de carbohidratos destruidos pueden ser usados para determinar si un alimento ha sido irradiado. En la determinacin de los azcares, los principales agentes clarificantes utilizados son: Ferricianuro de zinc, crema de almina, acetato bsico de plomo, acetato neutro de plomo, wolframato de sodio, cido fosfowolfrmico, carbn activado, etc. De ellos el acetato de plomo es el ms usado, ya que la resma intercambiadora sobre todo cuando se trata de un catin fuerte podra resultar una hidrlisis de oligosacridos resultando la formacin de una variedad de compuestos de hexosas que podra tambin interactuar con dichas resinas. Mtodos Qumicos La mayora de los mtodos qumicos para anlisis de carbohidratos estn basados sobre la reaccin de reducir azcares con reactivos qumicos para producir precipitados (como xido cuproso) o un complejo coloreado (como la reaccin de antrona). El estado final de esos mtodos envuelve anlisis gravimtrico a espectrofotomtrico a una longitud de onda especfica (complejos coloreados). De gran importancia es el hecho de que parte de esos mtodos son solamente utilizados para azucares reductores y para los no reductores es necesario hacer una hidrlisis antes del anlisis. Un mtodo alternado consiste en realizar la reaccin antes de la hidrlisis y despus de ella, para determinar la cantidad de azcares reductores y no reductores en la muestra. Adems, la reaccin entre el reactivo qumico y el carbohidrato es dependiente de la estructura de este ltimo. Por lo tanto se usan curvas estndares o(tablas especficas (AQAC. 1990). En muestras donde estn presentes una variedad de carbohidratos como en la miel esos mtodos pueden producir resultados todos inexactos. Entre los mtodos qumicos ms utilizados se tienen; Lane y Eynon; Murison y Walker; Nelson ..Smogyl; Ferricianuro alcalino, cido fenol- sulfrico, Antrona y Mtodos colorimtricos. Mtodo de Lane-Eynon: La solucin de Fehling es una mezcla de partes iguales de dos soluciones (A: CuSO4. 5H20 y B: solucin alcalina de tartrato doble de sodio y potasio C 4H4KNaO6 4H20) esta solucin tiene doble papel: Suple iones Cpricos (Cu ) que son reducidos a cuprosos ( Cu ). Debido a la alcalinidad, las molculas de azcares son rotas en fragmentos reactivos, los cuales son fcilmente oxidados y causan la reduccin de los iones Cprico a cuproso. Tan pronto como el Cu(OH) 2 que est en solucin es removido, el cobre deja el complejo para restaurar el equilibro. La pequea cantidad de Cu(OH)2 que est en solucin, est ionizada y existe en equilibrio con iones OH y Cu. La determinacin con Fehling puede hacerse por volumetra y gravimetra. Este mtodo no puede ser usado para distinguir entre diferentes azcares reductores. -Es dependiente del tiempo de calentamiento, la temperatura y la concentracin de los reactantes. Es usado rutinariamente para determinar azcares reductores en mieles y otros azcares altamente reductores como Syrups. Mezcla reaccionante. Existen molculas biolgicas que pueden interferir. Adems, este mtodo carece de la habilidad para distinguir carbohidratos y requiere un conocimiento cuidadoso sobre el tipo y concentracin del carbohidrato en la muestra antes del anlisis (porque los carbohidratos difieren en su habilidad para reducir la solucin de cobre). Una modificacin de este mtodo envuelve el uso de un exceso de extracto de cobre alcalino en lugar de tartrato con carbonato de sodio(como una base). Siguiendo la reduccin, el exceso do citrato de cobre se hace reaccionar con exceso de Kcl y cl2 liberado es titulado con tiosufa!to de sodio. La ventaja de este mtodo modificado es que la glucosa, fructosa y azcares invertidos se pueden determinar usando las mismas tablas do referencia.

Mtodo de Nelson y Somogyi. Es una modificacin del mtodo de Munson y Walker y Lane - Eyon; los cuales son aplicables para muestras que contienen pocas concentraciones de carbohidratos (0.3 - 3 mg/alcuota probada). El mtodo est basado sobre la raccin de xido cuproso con arsenomo(ibdato el cual os preparado por reaccin entre el molibdato do amonio. [ ( NH 4)6 Mo7O24 ] y el arsenato de sodio (Na2HAsO7) en cido sulfrico. La reduccin del cobre por azcares reductores con la concomitante reduccin del complejo arsenomclibdato produce un intenso color azul en la solucin debido al complejo reducido que es muy estable. La absorbancia de esta solucin es determinada a 500 o 520 nm. Este mtodo requiere la preparacin de una curva estndar(usando D-Glucosa a niveles de 50, 100 y 150 ppm). Mtodo del Ferricianuro Alcalino. Este mtodo est basado sobre el principio de que los carbohidratos en una solucin bsica (pH> 10.5) pueden reducir el ferricianuro a ferrocianuro. Este lLmo puede reaccionar cori los iones frricos para producir azul de Prusia, cl cual puede leerse espectrofotomtrcamente a 700 nrn. El color azul resultante es completamente estable y la reaccin obedece a la ley de Beer. Mtodo cido Fenol-sulfrico. Es una prueba simple, rpida y universal para medir la cantidad total de carbohidratos en alimentos debido a que el cido sulfrico es usado en este mtodo, eso implica que se pueden determinar ambos tipos do azcares, reductores y no reductores. Este mtodo est basado sobre la reaccin de carbohidratos con fenol en presencia de un cido fuerte(el cual produce calor) seguido por calentamiento (25 - 3000 por 20 mm.). Bajo esta condicin, a deshidratacin de los carbohidratos puede suceder, para formar furfural y metil hidroxifurfural. Esos productos entonces se condensan con fenol. La reaccin total resulta en la formacin de un color amarillo anaranjado que puede ser ledo espectrofotomtricamente a 490 nm(hexosa) y 480 nm (pentosa). Se deben preparar curvas de referencia estndar para azcares individuales y sus respectivos blancos. Mtodos Fsicos Existen muchos mtodos disponibles para determinar la concentracin de carbohidratos en alimentos. Los ms fciles y rpidos son aquellos basados en las propiedades fsicas de los carbohidratos. Esos mtodos incluyen: polarimetra, refractometra y gravedad especifica,( picnmetros, balanza westphal e hidrmetros) los cuales fueron discutidos en el captulo III de este libro. Cada uno de estos mtodo5 sugiere de carbohidratos puros, mieles, y syrups de dextrosa y necesitan soluciones clarificadas y de tablas de conversin para obtener los resultados exactos. Mtodos enzimticos Las enzimas son protenas con actividad cataltica debido a su poder do activacin especfica. Debido a que son protenas, estn sujetas a la desnaturalizacin (prdida de actividad catalitica) por pH, temperatura y otros factores ambientales. En muchos casos las enzimas que son usadas con propsitos analticos tienen un mximo rango de temperatura de 20~G0oC y un valor de pH de 4-10. Debido a su alta especificidad y sensibilidad las enzimas de ensayos son ideales para el anlisis do carbohidratos en alimentos. Los ensayos pueden hacerse en una alcuota del alimento mismo sin separacin total o parcial de los carbohidratos antes del anlisis. Esas reacciones enzimticas son usualmente realizadas a temperatura muy cercana a la ambiental, a pH neutro, y en minutos (< 20 mm.), as se minimizan os cambios en los compuestos durante el anlisis. Hay dos mtodos que so utilizan en el anlisis de alimentos con enzimas: a) Mtodo de cambio total y b) Mtodo cintico o ensayo de la velocidad. En el primero, se aade suficiente enzima para convertir todo el sustrato de la muestra en producto en perodo corto de tiempo. La cantidad de sustrato en la muestra os entonces determinada del cambio total en la muestra as como desaparicin del sustrato o como formacin del producto. En cl mtodo cintico se determina la velocidad inicial de la reaccin enzima sustrato, y de esta relacin se puede determinar a concentracin de enzima sustrato activador o inhibidor. Estos mtodos son usados para monosacridos y oligosacridos y consisten en usar enzimas

especificas para producir compuestos corno cido nicotinanlideadenina dinucletido fosfato (NADPH) cido nicotinamideadenina dinucletido (NADI-]) los cuales son medidos por espetrofotometa a 334; 340 365 nm. y comparados estequiomtricamente con la cantidad de D-glucosa, D-fructosa, lactosa y rafinosa respectivamente segn el carbohidrato utilizado en la muestra original. Entre esos mtodos tenemos: OG lucosa/D-Fructosa/D-Sorbitol, Lactosa/O- Galactosa, Maltosa/-Sucrosa/D-Glucosa, Rafinosa y oxidasa, los cuales se encuentran en la seccin 10.2.4 de Suzanne S. 1994.

Mtodos Modernos de Anlisis En los ltimos 25 aos los anlisis de carbohidratos han experimentado cambios dramticos, con la ventajosa aplicacin y optimizacin de tcnicas tales como cromatografa lquida de alta presin, cromatografa de gas, espectroscopia de resonancia magntica nuclear, espectroscopia de masa, separacin, identificacin y cuantificacin de carbohidratos en alimentos (a niveles do partes por billn),.que se han convertido en rutina. Nuevas tcnicas poderosas tales como inmunoquimica, cromatografa de fluido supercrtico, e!ectroforesis capilar y cromatografa lquida de alta resolucin garantizarn una evolucin rpida, precisa y exacta de los anlisis de carbohidratos. Cromatografa lquida de alta presin (HPLC). Este tipo do cromatografa es se logra sobre un amplio rango de concentracin de las muestras, inc1uyendo niveles trazas, con alto grado de exactitud y precisin. Es capaz de generar columnas altamente eficientes. La altura de los platos son muy pequeas en comparacin con la tcnica de cromatografa lquida convencionales; por lo tanto es posible un gran nmero de platos tericos para dar una columna larga corrientemente el mtodo ms fcil, reproducible, exacto y sensible para el anlisis de carbohidratos en alimentos. Es en general el mtodo de preferencia. Hay razones principales para el uso de este mtodo. La HPLC provee una reduccin significante en cl tiempo de anlisis en comparacin con las tcnicas convencionales de cromatografa lquida (capa fina, papel). esta reduccin La HIPLC es distinta a la cromatografa de gas, no requiere la muestra para tener una apreciable presin de vapor. Puede ser aplicada para a separacin de monosacridos, oligosacridos y polisacridos Los tres parmetros ms importantes en la separacin y cuantificacin de carbohidratos por HPLC son: a) la fase estacionaria; b) la fase mvil y c) el detector. Se ha utilizado un cierto nmero de fases estacionarias en el anlisis de carbohidratos: fase normal; fase invertida, intercambiadora de catin, intercambiadora de anin y otros. Entre los sistemas detectores para HPLC tenemos: ndice refractivo, ultravioleta, electroqumica y masa. Indice Refractivo: El detector ms comn empleado para anlisis de carbohidratos es el ndice refractivo (IR); cuyas medidas son lineales sobre un amplio rango de concentracin de carbohidratos y pueden ser aplicadas universalmente a todos los carbohidratos. El ndice de refraccin es sensible a los cambios de presin y temperatura, con los modernos equipos HCPL con temperatura controlada, los problemas que surgen de esos cambios son mnimos. El factor limitante ms significante con el detector RI es que la aplicacin del gradiente de elucin no es realmente factible. Sin embargo el programa de gradientes que usa PI ha sido ejecutada para correr ese programa antes de la adicin de la muestra. Con instrumentos controlados por computadoras, el resultado de la seal electrnica puede ser sustrado del gradiente de elucin de la muestra actual. Este mtodo no es especfico por lo tanto otros compuestos diferentes a los carbohidratos pueden co-eluir: con ellos causando resultados inexactos. Adems, la refractividad no es bastante sensible para detectar muestras menores de 10 nmol. METODOLOGA Preparacin de la muestra. i Se tom 25 ml de bebida gaseosa y se llev a un matraz aforado de 100 ml i Se afor con agua destilada.

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Se agreg solucin clarificante (1 ml) hasta precipitacin. Se dej en reposo para obtener una solucin transparente (solucin clarificada). Se tom el lquido sobrenadante de la solucin clarificada y se llev a un baln aforado de 250 ml. Se agreg una pizca de oxalato de sodio para eliminar el exceso de plomo. Se enras el baln con agua destilada y se filtr para eliminar exceso de oxalato de sodio.

Estandarizacin de la solucin de Fehling. i En una fiola de 125 ml se agreg 2 ml de solucin B y 2 ml de solucin A exactamente medidas (por duplicado). i Se diluy con 20 ml de agua destilada. i Se enras la bureta con solucin de glucosa al 0.5%. i Se coloc la fiola que contena la solucin de Fehling en una plancha de calentamiento hasta ebullicin. i Se titul en caliente hasta el cambio de color. i Se dej hervir durante 2 minutos y se agregaron 2 a 3 gotas de azul de metileno. i Se contino titulando hasta decoloracin del indicador (color rojo ladrillo). Determinacin de azucares reductores. i Se enras la bureta con solucin clarificada. i En una de 125 ml se agregaron 2 ml de solucin B y 2 ml de solucin A (Fehling) con 20 ml de agua destilada. i Se llev a la plancha de calentamiento hasta ebullicin. i Se procedi a titular en caliente hasta el cambio de coloracin. i Se dej ebullir por dos minutos y pasado este tiempo se agreg 2 gotas del indicador. i Se continu titulando sin dejar de calentar hasta que la coloracin azul desaparezca. i Se anot el volumen gastado. Determinacin de azucares totales. i Se midi 75 ml de la solucin clarificada y se llev a un matraz aforado de 100 ml. i Se agreg 5 ml de Hcl en relacin 1:1. i Se llev a bao de Mara a una temperatura de 70oC durante 5 minutos. i Se enfri a temperatura ambiente. i Se neutraliz con NaOH al 10%, usando 3 gotas de fenolftalena. i Se enras el balon con agua destilada. i Se enrasa la bureta y se repite el mismo procedimiento anterior para la titulacin. Bibliografa F.L. HART y H.D. FISHER, Anlisis Moderno de los Alimentos. De la edicin en lengua espaola, Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Anlisis Qumico de Alimentos de Pearson. Primera Edicin. Compaa Editorial Continental, S.A de CV. Mxico. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutricin y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa).