MEMBRANAS BIOLOGICAS

Estructura Propiedades Fsicas Sistema modelo

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Bacterias Gram negativas

Bacterias Gram positivas

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MEMBRANAS BIOLOGICAS
fosfolpidos

ceramida

colesterol

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ganglisidos

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PROPIEDADES DE MEMBRANAS -Transiciones de fase

-Tipos -Definiciones -Regulacin

- Importancia biolgica de los dominios

-dominios en membranas biolgicas -forma de caracterizarlos

-Propiedades dinmicas
-difusion lateral - formas de medirla

MEMBRANAS:
Letra mayscula para determinar el tipo de red:

TIPOS DE FASES
Subndices

Nomenclatura

I: topologa L = lamelar
normal ( aceite en agua)

II: topologa H = hexagonal

invertida ( agua en aceite)

Letras: Indican la conformacin de la cadena Q = cbica

c cristalina fase gel ordenada fase lquida coexistencia de fases gel y lquida

MEMBRANAS:
Fase cristalina: orden a largo y corto alcance
en tres dimensiones

TIPOS DE FASES

Fase gel: cadenas hidrocarbonadas ordenadas, en

conformacin trans pero con capacidad de rotacin sobre el eje longitudinal en una escala de tiempo de 100ns

Fase Lquida: cadenas

en conformacin lquida, expansin del rea interfacial por molcula ( aprox 15-30%) y rpida difusin lateral de las molculas (D trans 10-11 m2 sec-1).

MEMBRANAS:

TIPOS DE FASES

MEMBRANAS:
3 Tipos principales

TRANSICIONES DE FASES

1.- Transiciones entre fases lamelares ordenadas:

cristal-cristal cristal-gel gel-gel

2.- Transiciones entre fases lamelares y fases no lamelares

ej. fase lamelar-solucin micelar

3.- Transiciones entre fases fluidas

cambio de simetra o topologa, ej. lamelar hexagonal:

MEMBRANAS:

TRANSICIONES DE FASES

Variables termodinmicas intensivas que pueden inducir cambios de fase: temperatura y presin Condiciones biolgicas: temperatura y presin constantes Otros factores que pueden inducir cambios de fase: cambios en la hidratacin cambios en el pH cambios en la concentracin de sales campos elctricos composicin qumica

MEMBRANAS:

TRANSICIONES DE FASES

Efecto de la estructura qumica: Cadena hidrocarbonada La temperatura de transicin Tt aumenta monotnicamente con el aumento en la longitud
El incremento para las diacil.fosfoetanolaminas es:

de la cadena debido a que las entalpas y entropas de la transicin Ht St aumentan con cada grupo CH2 adicional.

La presencia de dobles enlaces cis o trans reduce drsticamente la temperatura de

transicin gel-fluido ( tpicamente 60 0 C un enlace cis ). El efecto mximo se consigue con el doble enlace en el centro de la cadena

Uniones de tipo eter entre la cadena y la cabeza polar aumentan la temperatura de transicin
entre 1-5 0 C , inducen la formacin de fases gel interdigitadas

MEMBRANAS:
Cabezas polares
Son importantes:

TRANSICIONES DE FASES

la polaridad la carga electrosttica el volmen de la cabeza polar las interacciones entre cabezas Ej. fosfatidiletanolaminas pueden formar puentes de hidrgeno entre ellas, lo que aumenta la temperatura de transicin

Efectos del soluto Los iones presentes en la solucin interaccionan con los lpidos cargados reduciendo
las repulsiones electrostticas El efecto del pH es complejo: el pK de los grupos ionizables en la superficie puede diferir hasta en 3 unidades de pH con respecto al pK de los grupos en solucin el cambio en la ionizacin de los grupos afecta tanto a las interacciones electrostticas como al estado de hidratacin la formacin de puentes de hidrgeno entre las cabezas tambin es sensible al pH

MEMBRANAS:

TRANSICIONES DE FASES

Efecto del colesterol: Difumina la transicin gel-fluido: fluidiza la fase gel y ordena la fase fluida Solventes no polares Se distribuyen preferentemente en el interior hidrofbico Facilitan la formacin de fases invertidas
Ej.: alcanos, gases inertes, compuestos aromticos, anestsicos, algunos pptidos

MEMBRANAS:

TRANSICIONES DE FASES

Efecto de la posicin de la insaturacin en la cadena en la temperatura de transicin

Efecto del tipo de cabeza polar y de la longitud de la cadena en la temperatura de transicin

MEMBRANAS:

TRANSICIONES DE FASES

Efecto del pH del medio en la temperatura de transicin

Efecto de la fuerza inica del medio en la temperatura de transicin

MEMBRANAS:

DIAGRAMAS DE FASES

MEMBRANAS
Importancia biolgica de los dominios: La presencia de dominios: contraresta la cooperatividad de los lpidos y permite
acomodar asimetras y zonas especializadas

Los dominios tienen distintas propiedades fsicas

Membrana en fase slida: no se puede estirar lateralmente, solo se puede doblar en una direccin ( como una hoja de papel) Membrana en fase fluida: permite deformaciones laterales que se relajan mediante el flujo lateral , por lo que se pueden doblar en dos dimensiones y formar segmentos esfricos ( como un globo)

DOMINIOS EN MEMBRANAS BIOLOGICAS

Coexistencia de dominios slidos y fluidos Dominios fluidos: muchos procesos importantes de invaginacin, evaginacin a
escalas micromtricas requieren curvaturas de dominios fluidos

Dominios slidos ( Rafts ):

fracciones de membrana resistentes a la extraccin con detergentes y enriquecidas en colesterol y esfingomielina. Tamao alrededor de 50 nm. Enriquecidos en algunos tipos de protenas (caveolina, por ejemplo)

Dominios de protenas: Agregacin de protenas de membrana:

receptores de sinapsis qumicas ( anclados por interaccin a protenas citoplasmticas) agregacin de receptores inducida por interaccin con ligandos

DOMINIOS EN MEMBRANAS BIOLOGICAS

GM1 = glicoesfingolpido PLAP = placental akaline phospatase TfR = transferin receptor

MEMBRANAS: PRESENCIA DE PROTEINAS

La presencia de protenas tambin puede generar fases laterales gobernadas por:

interacciones entre protenas interacciones de las protenas de membrana con protenas del citoesqueleto composicin lipdica de la membrana ....

MEMBRANAS: TENSION LATERAL

La tensin lateral regula la curvatura de la bicapa y puede regular la funcin de las protenas Perfil de tensin lateral de la bicapa En el equilibrio la tensin lateral neta (la integral del perfil a travs de la membrana) es igual a cero

MEMBRANAS:
y muy complejos

COEXISTENCIA DE FASES

Los dominios en membranas biolgicas son importantes para la funcin, dinmicos

Estudios tericos y experimentales en modelos sencillos ( mezclas de lpidos )

permiten conocer y cuantificar los parmetros que determinan la segregacin de fase, la forma de los dominios ( determinada por la tensin de lnea y la interaccin entre los dipolos de las molculas en los dominios), las propiedades fsicas de las membranas, ......

Existen mltiples formas de reconstitucin de protenas de membrana en sistemas

lipdicos ( liposomas, liposomas gigantes, membranas ancladas,...) de composicin conocida que permiten estudiar ms en detalle la importancia de la interaccin lpido-protena en la funcin biolgica

MEMBRANAS:

COEXISTENCIA DE FASES

Formas de estudiar y/o visualizar los dominios lpdicos: Calorimetra: permite medir cantidades termodinmicas Mtodos espectroscpicos: fluorescencia, resonancia magntica nuclear,
resonancia de spin electrnico

Microscopa electrnica Microscopa de fuerzas atmicas Difraccin de rayos X

MEMBRANAS:

COEXISTENCIA DE FASES

Microscopa de fluorescencia

MEMBRANAS:
Microscopa electrnica

COEXISTENCIA DE FASES

MEMBRANAS:

COEXISTENCIA DE FASES

Microscopa de fuerzas atmicas

MEMBRANAS: PROPIEDADES DINMICAS

Movimientos inducidos por agitacin trmica:

1.- Movimientos conformacionales de las cadenas 2.- Difusin rotacional de las molculas de lpidos 3.- Difusin lateral 4.- Movimiento de las cabezas 5.-Vibraciones fuera del plano del centro de masa de los lpidos 6.- Ondulaciones colectivas de la bicapa

MEMBRANAS: PROPIEDADES DINMICAS

Comportamiento dinmico abarca un amplio espectro de escalas espaciales y temporales:
Tiempos de correlacin de 10-11 s a 10 4 s Movimientos conformacionales de las cadenas Difusin rotacional de las molculas de lpidos Movimiento de las cabezas ESPACIO

TIEMPO

Se pueden estudiar por mtodos espectroscpicos: resonancia magntica nuclear ( 10-5 s 10 4 s) resonancia de spin electrnico ( 10-8 s 10 7s) fluorescencia ( 10 9 s )

Movimientos que ocurren a escalas microscpicas < nm

MEMBRANAS: PROPIEDADES DINMICAS

Difusin lateral TIEMPO ESPACIO Coeficientes de difusin lateral: Lpidos: Fase ordenada: D t 10-11 - 10-16 cm2 sec-1 Fase desordenada D t 10-8 - 10-7 cm2 sec-1

Ocurre a escalas microscpicas, nanoscpicas y macroscpicas

Vibraciones fuera del plano del centro de masa de los lpidos Ondulaciones colectivas de la bicapa ESPACIO micras

TIEMPO

segundos

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL

lpidos Difusin lateral:

Puede regular la interaccin entre componentes de la membrana

protenas

Procesos de agregacin de protenas Procesos de sealizacin Procesos que dependen de la interaccin entre protenas de membrana

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL

Teoras
Difusin en medios homogneos 1.- Modelo hidrodinmico continuo: para el estudio de difusin de partculas de tamao mucho mayor que el tamao del solvente ( protenas movindose en la bicapa) 2.- Modelo del volumen libre. Considera la discrecionalidad de la bicapa y es apropiado para el estudio de la difusin de lpidos

Difusin en medios no homogneos Se puede estudiar en 2 tipos de sistemas: Membranas con lpidos y protenas Membranas con distintos lpidos segregados en fases Aparece una nueva variable: la conectividad lateral entre las fases

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL

Difusin en medios no homogneos Existen dos posibilidades: a) Que una fase est interconectada a lo largo del plano de la membrana (la fase percola): b) Que la fase est constituida por dominios discontinuos ( la fase no percola) Basicamente se trata de entender el comportamiento de un sistema que consta de una fase fluida que percola y de una fase minoritaria que actan como obstculos para la difusin de las molculas en la fase fluida Situaciones que se han estudiado terica y experimentalmente: 1) Difusin de lpidos en sistemas donde coexisten lpidos en fase slida y lquida 2) Difusin de lpidos en sistemas donde coexisten lpidos y protenas 3) Difusin de protenas sistemas donde coexisten lpidos y protenas

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL

Tcnicas utilizadas para medirla: 1.- Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) 2.- Single Particle Tracking (SPT) 3.- Mtodos basados en reacciones bimoleculares ( blanqueo de fluorescencia o transferencia de energa) Cada tcnica mide difusin en distintos dominios del espacio: 1 y 2 a escalas mucho mayores que el dimetro molecular 3 a escalas del orden del dimetro molecular

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL

1.- Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP

MEMBRANAS: DIFUSION LATERAL

2.- Single Particle Tracking (SPT)

Se marca una protena o un lpido con partculas de oro coloidal y se sigue su movimiento con un microscopio ptico. Tamao de las partculas de oro: 40 nm El movimiento se sigue durante 2-10 segundos registrando la posicin cada 100 microsegundos - 1 segundo

http://www.biophysics.org/btol/
BTOL VOLUMES Bioenergetics Channels, Receptors & Transporters Computational Biology & Theory Electrophysiology Intermolecular Forces Membranes Muscle & Cell Contractility Nucleic Acids Proteins Supramolecular Assemblies NMR Separations & Hydrodynamics Sequence Analysis Single Molecule Techniques Spectroscopy Thermodynamics Becoming a Biophysicist Teaching Biophysics - BJ articles BJ Supplements/Computer Programs

LDB - The Lipid Data Bank

http://www.ldb.chemistry.ohio-state.edu/

LIPIDAT Lipid Phases and Phase Transitions Database LIPIDAG Lipid Miscibility/Phase Diagram Database Lipid Molecular Structures Database LMSD Other sites An extensive listing of related websites and databases Miscellaneous CMC Database, Crystallization Screens Database,

SISTEMAS MODELO
Sistemas modelo para el estudio de membranas biolgicas:
Permiten estudiar interacciones lpido-lpido, interacciones lpido-protena, formacin de dominios, ...)

Liposomas ( SUV, LUV, GUV) Monocapas Bicapas ancladas

LIPOSOMAS

LIPOSOMAS

Preparacin de proteoliposomas

MONOCAPAS
Que son ? Como se caracterizan? Para que se usan?

MONOCAPAS
Permiten organizar molculas individuales en estructuras ordenadas Se empezaron a estudiar sistemticamente hace 70 aos
"Today...1 propose to tell you of a real twodimensional world in which phenomena occur that are analogous to those described in 'Flatland.' I plan to tell you about the behavior o molecules and atoms that are held at the surface of solids and liquids." - l. Langmuir, Science 1936,84,379.

En los ltimos aos 15 se ha reactivado el inters en ellas: Como sistemas modelo de superficies biolgicas Para preparacin de pelculas orgnicas de inters en electrnica molecular Es un rea de trabajo muy interdisciplinar

MONOCAPAS
Balanza de Langmuir

MONOCAPAS
1= presin lateral ( N/m) Es una variable termodinmica que refleja el cambio en la energa libre de la superficie cuando se aumenta el rea ( julios m-2) Para medir la presin lateral de una monocapa En la interfase agua- aire se utiliza siempre como referencia la energa superficial del agua: 0 = 73 mJ m-2 = 0 - 1

MONOCAPAS
Diagrama de fases

MONOCAPAS

Efecto de la temperatura en la isoterma presin-rea

Efecto de la concentracin de colesterol en la isoterma presin-rea

MONOCAPAS
Formas de caracterizarlas:
Termodinmicamente: Hay que asumir que el sistema est en equilibrio.....( que no hay evaporacin, que la solubilidad de los lpidos en la subfase es despreciable....) Mediante las isotermas presin/rea Compresibilidad isotrmica Expansividad trmica

MONOCAPAS
Microscopa de fluorescencia Elipsometra Microscopa de ngulo de Brewster Dispersin de luz Difraccin de rayos X Espectroscopa de infrarojo

MONOCAPAS
Caracterizacin estructural Microscopa de fluorescencia

MONOCAPAS: SISTEMAS BIOLGICOS

Interaccin de la fosfolipasa A2 con monocapas

La enzima ataca fundamentalmente las zonas entre dominios Se forman dominios de protena Recompresin induce nuevamente la formacin de dominios slidos

BICAPAS ANCLADAS
Permiten utilizar distintas tcnicas para su:
caracterizacin estructural, caracterizacin de propiedades mecnicas seguir procesos dinmicos estudiar interacciones

Desarrollo de biosensores
la interfaz entre los sistemas biolgicos y los sistemas de deteccin electrnicos u optoelectrnicos requiere de inmovilizacin protenas, membranas, protenas de membrana, DNA o incluso clulas completas

BICAPAS ANCLADAS
Son de especial inters las que permiten caracterizar la superficie sumergida en solucin

Microscopa de fluorescencia de molculas individuales Microscopas de campo cercano estudios estructurales propiedades mecnicas protenas Microbalanza de cuarzo y resonancia de plasmn superficial cuantificacin de interacciones entre ligandos solubles y ligandos anclados a una superficie Tcnicas electroqumicas

BICAPAS ANCLADAS
Preparacin de bicapas ancladas: Transferencia de monocapas a un sustrato slido Fusin de vesculas sobre un sustrato Fusin de vesculas sobre un sustrato recubierto de un polmero espaciador

BICAPAS ANCLADAS
Pelculas de Langmuir- Blodgett

BICAPAS ANCLADAS
Incorporacin de bicapas lipdicas sobre superficies slidas

E.Sackmann and M.Tanaka; Supported membranes on soft polymer cushions: fabrication, characterization and applications. Trends in Biotechnology, 2000, 18, 58-64 J.Wong; J.Majewski; M.Seitz; C.Park; J.Israelachvili; G.Smith, Polymer-cushioned bilayers. I. A structural study of various preparation methods using neutron reflectometry. Biophys.J. 1999, 77, 1445-1447.

BICAPAS ANCLADAS
Incorporacin de bicapas lipdicas con patrones laterales

Steven Boxer Molecular transport and organization in supported lipid membranes Current Opinion in Chemical Biology, 2000, 4: 704-709

SURFACTANTE PULMONAR
Monocapa que recubre los alveolos pulmonares Es una mezcla de lpidos y protenas que reduce la tensin en la interfase aire-alveolo Previene el colapso de los alveolos Su ausencia o disfuncin provoca disfuncin respiratoria

SURFACTANTE PULMONAR

SURFACTANTE PULMONAR

PROPIEDADES MECNICAS
Una superficie blanda se dobla Dos mdulos elasto-mecnicos:
stretching Shearing(nulo si la superficie es fluida) bending

bending modulus k

Energa por unidad de rea para producir una curvatura H Energa por unidad de rea para deformar DA Relacin entre mdulos siendo dL el espesor de la superficie

area compressibility modulus K

k = dL2K

PROPIEDADES MECNICAS
Longitud de persistencia: escala espacial en la que la superficie es plana

k
Se puede medir observando fluctuaciones

K se puede medir tensando la membrana

PROPIEDADES MECNICAS

Energa total en equilibrio en funcion de parmetros geomtricos ( A y V) parmetros del material, radio preferente R0 y diferencial de rea DA

DA = Ainterior - Aexterior DA0 = A0interior - A 0exterior

PROPIEDADES MECNICAS

PROPIEDADES MECNICAS

Forma de los eritrocitos depende de la composicin lipdica, presin osmtica, pH, nivel de ATP, ) Forma depende del citoesqueleto y la membrana Prediccin de la forma posible considerando tambin las propiedades elsticas del citoesqueleto